SESIÓN 1 “El microscopio óptico” I.‐ Introducción:
El microscopio es un instrumento óptico mecánico destinado a examinar objetos
muy pequeños, ampliando considerablemente su imagen. Existen microscopios simples o
lupas constituidos por una sola lente convergente y microscopios compuestos (o
simplemente microscopio) formados por tres sistemas de lentes convergentes:
condensador, objetivo y ocular.
1611 Kepler sugirió la manera de construir un microscopio compuesto 1655 Hooke utilizó un microscopio compuesto para describir unas pequeñas
celdillas en los cortes de corcho a las que denominó "células".
1674 Leeuwenhoek informó sobre su descubrimiento de protozoos. Nueve años
más tarde observó por primera vez bacterias.
1833 Brown publicó sus observaciones microscópicas de las orquídeas, y describió claramente el núcleo celular.
1838 Schleiden y Schwann propusieron la teoría celular, afirmando que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y los animales. 1857 Kolliker describió las mitocondrias de las células musculares.
1876 Abbé analizó los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y mostró la manera de optimizar el diseño de los microscopios. 1879 Flemming describió con gran claridad el comportamiento de los cromosomas
durante la mitosis de las células animales
1881 Retzius describió muchos tejidos animales con una precisión que aún no ha sido superada por ningún especialista en microscopía óptica. En las dos décadas siguientes, tanto él como Cajal y otros histólogos, diseñaron métodos de tinción y establecieron las bases de la anatomía microscópica. 1882 Koch utilizó colorantes de anilina para teñir microorganismos e identificó las
bacterias que causan la tuberculosis y el cólera. En las dos décadas siguientes, otros bacteriólogos, como Klebs y Pasteur, identificaron los agentes causantes de otras muchas enfermedades examinando al
1886 Zeiss hizo una serie de lentes, siguiendo las leyes de Abbé, que permitieron a los especialistas en microscopía la resolución de estructuras situadas en los límites teóricos de la luz visible.
1898 Golgi observó por primera vez el aparato llamado "de Golgi", impregnando células con nitrato de plata.
1924 Lacassagne y sus colaboradores desarrollaron la primera técnica autorradiográfica para localizar el polonio radiactivo en las muestras biológicas.
1930 Lebedeff diseñó y construyó el primer microscopio de contraste
interferencial. En 1932, Zernicke inventó el microscopio de contraste de fases. Estos dos adelantos permitieron observar por primera vez células vivas no teñidas en detalle.
1941 Coons utilizó anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para detectar antígenos celulares.
1952 Nomarski ideó y patentó el sistema de contraste interferencial para el microscopio óptico., que aún lleva su nombre.
1981 Allen e Inoué perfeccionaron la microscopía óptica de contraste video‐
amplificada.
Tabla 1: Reseña histórica de la microscopia óptica (MO)
II.‐ Componentes del microscopio de Campo Claro u Óptico Corriente:
Existen dos factores importantes en microscopía y son: MAGNIFICACION y RESOLUCION. MAGNIFICACION (o aumento) se define como las veces que un objeto se agranda en relación a su tamaño real.
RESOLUCION es una medida de la distancia mínima que existe entre dos puntos para ser distinguidos como dos puntos separados. Por ejemplo, lo que pareciera ser una estrella cuando se mira al cielo puede ser en realidad dos estrellas con ayuda de un telescopio. Por lo tanto, el telescopio tiene mayor capacidad de resolución.
Sin embargo, así como el ojo humano es limitado, el poder de resolución de un microscopio o telescopio también es limitado. Los microscopios pueden diseñarse para magnificar objetos tanto como sea posible, pero la luz del microscopio nunca podrá
resolver detalles más finos que 0.2 μm, el tamaño de una pequeña bacteria o de una mitocondria. Esta resolución no se puede mejorar, está limitada por la LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ VISIBLE usada para iluminar el espécimen. Los microscopios de luz sólo pueden magnificar objetos efectivamente hasta 1500 veces, más magnificación implicaría que el objeto se viera borroso. Lo que se ha ido mejorando en microscopía de luz es el CONTRASTE de aquellos objetos que puedan ser resueltos por el microscopio en uso. La mayoría de las estructuras subcelulares, u organelos, son muy pequeños para ser resueltos con el microscopio de luz. La biología celular avanzó rápidamente desde la década del 50 con la introducción del microscopio electrónico. En vez de usar luz visible, el
MICROSCOPIO ELECTRONICO enfoca un haz de electrones a través del espécimen.
Microscopios electrónicos modernos pueden alcanzar una resolución de
aproximadamente 0.2 nanómetros (nm), mil veces mejor que el microscopio de luz. Los biólogos usan el término ULTRAESTRUCTURA CELULAR para referirse a la anatomía celular resuelta por un microscopio electrónico. Una foto obtenida con un microscopio de luz a veces se llama FOTOMICROGRAFIA, y una foto que resulte del microscopio electrónico se
llama MICROGRAFIA ELECTRONICA DE TRANSMISION o de BARRIDO según sea el
microscopio electrónico que se use.
Existen dos tipos de microscopio electrónico: el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE
TRANSMISION (TEM) y el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO (SEM). El TEM dirige
un haz de electrones a través de una sección muy delgada del espécimen, similar a lo que sucede en un microscopio de luz. Sin embargo, en vez de usar lentes de vidrios, los cuales son opacos a los electrones, el TEM usa electroimanes. Los electroimanes actúan como lentes que enfocan y magnifican la imagen cambiando la dirección de los electrones cargados. La imagen últimamente se enfoca en una pantalla para examinarla o en un film fotográfico para tener un registro permanente. Para aumentar el contraste en la imagen, secciones muy delgadas del espécimen se tiñen con átomos pesados de metales, los cuales se adhieren a ciertos lugares en las células.
Los biólogos celulares usan el TEM principalmente para estudiar la ultraestructura interna de las células. El SEM es especialmente útil para el estudio detallado de la superficie del espécimen. El haz de electrones cubre (o barre) la superficie de la muestra, la cual generalmente está recubierta con una pequeña lámina de oro. El haz de electrones excita electrones sobre la superficie de la muestra, y estos electrones secundarios se colectan y se enfocan en una pantalla, formando una imagen de la topografía del espécimen. Un atributo importante del SEM es su gran profundidad de penetración, la cual resulta en una imagen tridimensional.
El microscopio electrónico revela muchos organelos, imposible de resolver con el
microscopio de luz. Sin embargo, el microscopio de luz ofrece muchas ventajas,
especialmente para el estudio de células vivas. Una desventaja del microscopio
electrónico es que los métodos químicos y físicos usados para preparar el espécimen no sólo mata células, sino que también introduce artefactos, estructuras físicas que se ven en la micrografía que no existen en la célula viva.
En este laboratorio usaremos el microscopio compuesto. Las principales partes de un
microscopio compuesto son:
Sistema Mecánico
a. Pié: es la base de sustentación. b. Columna: región articulada del pié.
c. Platina: plataforma horizontal que sustenta al espécimen o preparación. d. Tubo: lleva en su extremo superior la lente ocular y en el inferior el objetivo. e. Revólver o tambor: pieza giratoria que lleva los objetivos.
f. Tornillos de focalización: al rotarlos cambian el enfoque del microscopio, lo cual lo logran variando la distancia entre el objetivo y la platina. Existen dos movimientos, macrométrico (enfoque aproximado y grueso), micrométrico (enfoque de precisión).
Sistema de iluminación
a. Fuente luminosa: puede ser natural o artificial. Si es natural se utiliza un espejo de cara plana. Si es artificial puede o no haber espejo, si hay espejo se utiliza por el lado cóncavo. b. Condensador: dispositivo formado por un sistema de lentes que concentra los rayos luminosos en el espécimen. Su mayor utilidad la presta cuando se encuentra a una distancia de ~2 cm del espécimen. Ubique el mejor punto por ensayo y error.
c. Diafragma: está ubicado en el condensador y sirve para regular la cantidad de luz que llega a la preparación. Su diámetro se puede variar por medio de una placa horizontal que se cierra o abre a voluntad del operador.
d. Anillo porta filtro: generalmente se utiliza un filtro de color verde pues así descansa más la vista. La longitud de onda modificada con el uso del filtro influye en la resolución del microscopio (ver “resolución” más adelante).
Sistema de amplificación
a. Lentes oculares: son sistemas ópticos ubicados en la parte superior del tubo, próximo al ojo del observador. Los oculares están formados por dos lentes planas, convexas, simples o compuestas separadas por un diafragma interno. El lente inferior se llama lente de campo, su propósito no es aumentar la imagen sino recoger la mayor cantidad de rayos divergentes que vienen del objetivo. Este tiene su foco en el diafragma y ahí la imagen es
aumentada por la parte superior. Los oculares más usados tienen un aumento de 6X, 8X, 10X, 16X, 20X.
b. Lentes objetivos: sistemas de lentes acomodadas en el revólver. En el objetivo está inscrita la magnificación y la apertura numérica.
Figura 1: Esquema de un microscopio óptico (tomado de Spotorno y Hoecker, 1993)
III.‐ Principios físicos implicados en la función de aumento del objeto en el microscopio óptico.
El ojo humano sólo puede resolver estructuras de aproximadamente 0,1 mm (100 µm). La mayoría de las células son de dimensiones muchísimo menores, y requieren de todo el poder resolutivo del microscopio óptico para poder ser estudiadas.
El término poder de resolución (PR) expresa la capacidad de un sistema óptico de discriminar detalles muy finos, de distinguir o resolver dos puntos muy cercanos entre sí. El PR es inversamente proporcional al límite de resolución (d), que es la menor distancia que debe existir entre dos puntos para que puedan ser individualizados como unidades
separadas.
Si consideramos dos objetos luminosos muy pequeños e igualmente brillantes, cada uno nos proporciona una imagen, que no es puntual, sino un disco central brillante rodeado de uno o varios anillos difusos de luz, llamados “discos de Airy”. Si acercamos estos dos puntos, llega un momento en el cual se sobreponen. El punto exacto de sobreposición depende de varios factores, entre ellos la agudeza visual del observador. Se ha propuesto que los discos de Airy se resuelven como unidades separadas cuando la distancia entre los centros es superior al radio del primer anillo oscuro de difracción.
La difracción óptica se debe a la interferencia entre ondas que han viajado por caminos levemente diferentes, a través de un sistema óptico. Existe una fórmula, la ecuación de Abbé que expresa matemáticamente la magnitud del efecto de difracción y establece el límite de resolución de cualquier sistema óptico. Dos puntos se resuelven, si los centros de los discos de Airy están en una distancia igual o mayor que d.
Donde: d = límite de resolución
0,61 = constante, cuyo valor teórico depende de las condiciones del sistema, Influyendo coherencia de la luz, criterio de visibilidad y naturaleza del objeto. Delta = longitud de onda.
AN = abertura numérica.
n = índice de refracción del medio. sen alfa = semi ángulo de abertura.
La abertura numérica es función del ángulo del cono de luz que emerge del objeto, y que es captado por la lente objetiva. La AN se define matemáticamente como la resultante de la multiplicación del seno de la mitad del ángulo de abertura de la lente (alfa) por el índice de refracción del medio a través del cual pasa la luz (n).
AN = n x sen
d = 0,61 x
Como el seno de alfa no puede ser mayor que 1, y el aire tiene un n = 1, se utilizan objetivos de inmersión que emplean medios de mayor índice de refracción (n =1,5), con el objeto de aumentar la abertura numérica. La figura 2 se ha dividido en dos mitades. La mitad derecha de muestra que en lentes de AN baja, los índices de refracción del portaobjetos, cubreobjetos y del aire provocan un desvío de la luz incidente. Al colocar un medio de mayor índice de refracción, como el aceite de inmersión, entre el cubreobjeto y la lente frontal, se neutraliza el efecto de la refracción de luz, obteniéndose una imagen de mayor nitidez.
Figura 2: Ángulos de abertura del portaobjeto y de la lente (tomado de Spotorno y Hoecker, 1993)
El límite de resolución es directamente proporcional a la longitud de onda, e inversamente proporcional a la abertura numérica de la lente objetiva. Si se desea aumentar el poder de resolución y obtener mayor información, existen dos cambios: aumentar la apertura numérica o disminuir la longitud de onda. En relación a la primera posibilidad existen limitaciones, incluso mejorando el diseño de las lentes. Por esta razón el esfuerzo de los investigadores de principios del siglo XX, se centró en la segunda alternativa.
Si calculamos, aplicando la fórmula de Abbé, vemos que utilizando como fuente luminosa la longitud de onda de 20,52 um (520 nm) y una AN de 1,5, se alcanza un limita de resolución de 0,2 um (200 nm). Es decir, el microscopio óptico está limitado a resolver sólo partículas mayores que la mitad de la longitud de onda de la luz visible.
Sin embargo, es necesario recordar que ninguna lente es capaz de formar un punto imagen perfecto de una fuente puntual, debido a las llamadas “aberraciones de las lentes”. Las principales aberraciones producidas son: aberración esférica, cromática, astigmatismo, coma, distorsión, curvatura de campo.
1.‐ Aberración esférica: este defecto se debe a la incapacidad de la lente de concentrar todos los rayos que la atraviesan en un foco común. Los rayos incidentes más próximos al eje, luego de refractarse, se cortan en un punto más distante que los rayos periféricos, produciéndose una imagen poco nítida.
2.‐ Aberración cromática: surge porque los ayos que componen la luz blanca se refractan diferencialmente, de acuerdo a la longitud de onda. Así, los de menor longitud se refractan más que los de mayor longitud de onda, dando puntos focales diferentes.
3.‐ Astigmatismo: este defecto se debe a la imposibilidad práctica de construir lentes perfectamente simétricas. Todas las lentes tienen una distancia focal en una dirección que es levemente diferente a la distancia focal en otra dirección, produciendo diferentes focos.
4.‐ Coma: es una aberración que ocurre en imágenes de objetos localizados lateralmente al eje óptico del lente, produciendo un alargamiento de la imagen. Así, la imagen de un punto toma el aspecto de una coma.
5.‐ Distorsión: es una aberración que modifica la forma de las imágenes, ya que las imágenes formadas por los rayos periféricos están en un plano diferente que las formadas por los rayos axiales.
6.‐ Curvatura de campo: se produce en imágenes de mayor aumento, las cuales tienden a ser curvas, lo que perjudica su calidad e impide que todo el campo se observe en foco
simultáneamente.
IV.‐ Formación de la imagen en el microscopio óptico
La lente objetiva forma una imagen real, invertida y aumentada del objeto. Esta imagen intermedia actúa como objeto para el lente ocular, y se encuentra situada de manera tal, que la imagen formada por el objetivo cae en la distancia focal (la distancia focal es la distancia que existe entre el foco principal de la lente y su centro geométrico). De esta forma, el ocular proporciona una imagen final que es virtual (dada por la proyección de los rayos), de mayor tamaño e invertida con respecto al objeto.
Figura 3: Formación de la imagen en el microscopio óptico (tomado de Spotorno y Hoecker, 1993).
OBJETIVOS
a) Distinguir las partes del microscopio. b) Familiarizarse con el uso del microscopio. Actividades del Alumno:
En esta actividad usted tendrá ocasión de utilizar el microscopio óptico facilitado por el profesor para observar tres preparados. Usted deberá observar con los aumentos lupa (4x), menor (10x) y mayor (40x) un preparado que contiene una letra recortada al igual que la segunda preparación de hilos entrecruzados de colores. Además, para tener la oportunidad de aprender a ocupar el lente inmersión (100x), usted observará un frotis de bacilos.
1.‐ Observación de: Letra
Material : cuadrado de papel de periódico Método : corte directo Tinción : sin tinción Forma : ... Observaciones: ..…... ... ... ...
‐ Enfoque la preparación con aumento menor y ubique una zona en donde se encuentre una letra.
‐ Pase a aumento mediano, mayor y observe el preparado
‐ Haga el esquema correspondiente en el círculo adjunto de lo observado en aumento
mediano
Pregunta:
1.‐ Si la muestra se mueve con el carro hacia adelante, hacia donde se mueve la imagen?¿y si se mueve de izquierda a derecha?. Señale las propiedades de la imagen a la que
corresponde este fenómeno
... ... ... ...
2.‐ Observación de: hilos entrecruzados de colores Material : hilo de cocer con color Método : pegado directo Tinción : textil Forma : ... Observaciones: ..…... ... ... ...
‐ Enfoque la preparación con aumento menor y ubique una zona en donde los hilos estén
sobrepuestos.
‐ Pase a aumento mediano, mayor y observe que es lo que va pasando con la imagen que se forma, en cuanto si puede ver texturas, tamaños, otros hilos, etc.
‐ Haga el esquema correspondiente en el círculo adjunto de lo observado en aumento
mediano
Pregunta:
1.‐ Qué poderes del microscopio aumentan y cuáles disminuyen?. Señale además el ejemplo de lo observado.
... ... ... ...
Bibliografía:
- López, M. L. (1993) “Métodos de estudio en Biología Celular” . En “Elementos de Biología Celular y Genética” Spotorno, A. y Hoecker, G. (Eds.) Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
- Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K and Watson, J. “Molecular Biology of the Cell” Garland Publishing, Inc. New York & London. 139‐149 pp.
