Clonaje molecular: estrategias: plásmidos, bacterias, plantas, animales

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(1)CIONAJE}OLBCI'LAR. ESTRAIEGIAS: PLASMIDOS, BACITRIAS,PLANIAS, ANII''ALES * Alvaro. Alegrla x*. 1. IltrT.oDu@rorl EI tltulo de esta Conferencia plantea todos 1os siatemaa; p1áeuidos, bacterlas, plantas y anfnalea, Lo cual ae hace extremadatrente aJtp1ia, aln enbargo, nirando 1as cosae de una nanera gener61, puede hacerae La eatructura del naterial genético, ADN una descripción eencllla. Y RNAestá basada en 1oe nucleótidoa, que son nonóneroe de trea componentea, una base, una purina o una pirimidina, adenina, guani¡a, citocina o ti-Eina o uracilo en el caso -deJ. RNA, una azúcar en eI cuatr se for¡na un nucleócido y que puede'ser ribosa o desoxiribosa y foefato, es decir, éstos son los elenentos básicos. Los ácidos nucléicos son cadenas de estos nonóneros en las cuales los az{rcares y 1os fosfatos se alternan en una I columna vertebralt y lÉs bases están pendientes de una Eanera lateral sobre Ia cadena. Tanbién en el caso del ADN, existen apareamientos específicos así: adenina se apafea con tinina con base en sus enlaces de hidrógeno. los enlaces de hidrógeno tienen cierta importancia porque en los expefi.qentos ' !rde. separaci ón.r de cadenas de* ácidos nüéIéicoe mientrats táE* ádÉnioá ' y timina haya, más fácil la separación, mientras más guanina y gitoclIa separación, de nodo que alguna inportancia se na, nás difícil 1e dá a esto respecto a 1a temperatura a La cual se le deben hacer 1as hibridaciones de cadenas. En la estructura del ADN las dos cadenas de ribosa y fosfato de oxiribosa van en Ia parte periférica, 1as bases colocadas perpendicularnente a1 eje en la parte central la nanteniendo 1os principios de hidrofobicidad e hidrofil-icidad, parte hidrofílica en eI área exterior, la parte hidrofóbica en e1 interior de la molécula, es decir, una estructura enroLlada flectonémicanente, es decir, una banda alrededor de la otra en dirección opuesta por 1o que se dice que son antiparal-elas. la infornación que egta nolécul-a contiene se debe a su secuencía de modo que en 1a medida en que se pueda nanipular esta secuencia, se estará alterando la ínformación que Ia molécula contiene,. x Contribución Departanento de Biología, #Médico Ph.D. Departa-nento de Biología, Apartado Aéreo 25360. Ca1i, Color¡bia.. Universidad de1 Va1le. Universidad de1 Valle..

(2) II.. LA CELITLAPR'OCARI0TA. La BiotecnologLa noderna se basa en un microorganisno que es el ser viviente nejor estudiado, la bacteria Escherichia coli. En un corte de una célula orocariótica cono este bac1lo, se aprecia que el naterial está en contacto íntimo genético del interior nuclear; en este -tipo con el citoplasna pues membrana hay una no -Ia genético de Ia célula de céluIas i-nclrporación de Eáterial ea evidentemente nás sencilla porque la ausencia de nembrana nuclear facilita muchlsino cualquier moviniento¡ prácticamente todas para las células procarióticas tiLnen una habtlidad fantástica captar nateriál genético; Bscherichia tiene una pared fetioblica relativanente dellada qtre' aJ-ñEEfr6-F un doble pared. Su naterial genético e" un. molécula de 2.5O0 nillones de peso nolecular ' "-o1" es decir, una estructura única bas de información. En el caso de E rias, se ha encontrado una serie cialnente por interés acadénico pc de modificación y restricción, genético y 1o narcan con los células t..oroa"i su propio nateriat geneSrupos Eetilos; cuando una céIu1a tiene un ADN sin modificar' marca replicando ialmente una de las dos cadenas cuando ee está ADN que el dice Se el ADN de tal nanera que 1o pueda reconocer. busca célul'a colocar un ADN la está nodificado cuando al int;ntar las narcas y si no las encuentra degrada entonces este ácido nucléico. Este aspecto es inportante en todos los experirnentos de ingerla genética, sin enbargo, a veces no se tiene en cuenta ya que generálmente el ADN tiená irr. conpatible con el aParataJe enzi".t nático de la célula. Mediante una serie de enzinas especlficas denoninadas endonucleasas Yara de restricción que se recoÍoce eI ADNen dichas narcas ' endonuclea1as el caso de ingeníerla genétíca se usan básicamente sas de restriición dei tipo 2, dependiendo de la información que estas secuencias específicá" t.ng"o;- pueden estar cerca o pueden cener estar lejos 1as unas de 1as otras y se caracterizán por rotanos y la una sineirla cle 180 grados, Por ejenplo si es AAG 180o sobre el otro 1ado. cendrernosAAG que es Io que se conoce como un pallndrome, es decir, una secuencia que se 1ee tanto en un sobre 1a señai, Ia netilación sentído como en ef otto.- lhott, "i no esa base existe, entonces la ándonucleasa de restricción netiLación de las señales funciona, pero po. .f contrario "i. 30.

(3) no existen, entonces Ia enzina entra a cortar por donde es!án dÍchas seña1es, es decir, en este caso 1a enzina de restriccíón está dando unos extremos de cadena única y la única base conplenentaria que permanece eera la A en el ejenplo y forma parEe de 10 que 11aman los extrenos 'pegajososr. E:risten cientos de enzinas que se utilizan como herramientas en ingenierla genética, 1a nomenclatura es básicanente Ia no¡¡enclatura de la bacteria, cono por ejenplo en Eco R-I que quiere decir Escherichia coli R-I, 1o crral signif ica que en eI plá*rido R está it-ffiE-!ñá-Ii primera enzíma de restricción. Hay Eco R-I], Ilincl-D II por ejenplo Hae¡rophilus B-2, B-3, Haenophilus ellirus, eLc., es decir, que ]Irflglcee 1os nonbres indican de donde se obtuvo la enzirna los enzima de restricción. En e1 caso de1 Eco R-I 1a secuencia esoecífica es diferente a 1a de Eco R-II 1o que significa que cada una reconocerá Ia suya. En un caso por ejenrplo, La ¡netilación está en 1a adenina y en el, otro Ia metilación está en la citocina, 1as secuencias además son diferentes por el hecho de que la una no tiene un nucleótido en e1 centro. Hin-D II es una enzina de restricción que es menoÉ¡ exiSente, aquí eolanente se requiere que haya una purina ya sea adenina o guanina y al frente lógicamente una pirirnidina; algo interesante es que este tipo de enzi-na de restricción corta aEbas 'pegajosost cadenas por e1 nisno sitio, es decir no dá extremos tromost, trasl-apables sino que dá 1o que se llama extremos es decir,corta ambas cadenas de un solo ttiieretazo' nivel. a1 mismo En algunos casos el AIN extraído de ciértos organismos no e6tá cortado y hay que romper eI ADN por nedios físicoJ. En el laboratorio del Dr. Manuel Patarroyo se hÍzo una genoteca de Mycobacteríug pero hubo oue romper e1 ADN mecánicamente, es decir ? !qle;_c_u_1,o¡¡e usénoo ur¡ mérooo Íi.srco porqué era diflcil ronperlo con enzimaB de restricción debido posiblemente a la presencia de mucfrosgrupog netílados por lo que no se pudo hacer La hidrólisis. Algunos de los extremos que se producen son nuy interesantes coltro en el caso del Eco R-I y Haemophilus R-3 que dá 1os extremos ronos, es posible entonces, nediante eI uio de estas enzimas de restrÍccíón rornper cualquier Este genoma en fragnentos especificos. es e1 punto crítico pues siempre ronperán el ADN por e1 nisrno sitio, sienpre y cuando las condiciones sean adecuadas. Las enzimas de restricción pueden utilizar$e para hacer rnapas genéticos, los cuales no se basan tanto en la locallzacíón de caracterlsticas de tipo genotípico sino que se basan fundanentalmente en 1os fragDentos que son obtenibles Dor 1as enzimas de restricción, es decir, que práctj.camente todos 1o= rapas de 1os organismos biológicos se hacen ahora con enzi-masde restricción, 1o cual es muy ventajoso porque nos obliSa a conocer eL segmento específico de DNA. I-,06 fragnentos se pueclen secuenciar a través de un secuenciador, los reactivos son costosos porque hay que comprarlos en las casas donde fabrican el instrunento, pero es posible entonces hacer Senes nediante esLe inst.rumenLo; hay diferentes estrategias, por ejenPlo si se quiere. se pueden hacer genes usando pedacítos unieodo 1os extrernos traslapabl,es con 1lgasa o si se quieren aprovechar 1as posibilidades se usan cadenas sencitlas completándolas con. 31.

(4) ADNpolinerasa, es decir, que en este ¡Bomentono hay ninguna barrera conceptual ni práctica a la posibilidad de hacer genes sintétipero La tecnologla e6tá disponible; cos con fines especlficos. En otras palabras 1o que se quiere es problena del investigador. hay información disponible para resolver problernas, pero éstos Es importante tener la posibilidad se los plantea e1 índividuo. de nodificar una secuencla para 1o cual existe tecnologla desarrollada. Si se quiere saber por ejenplo qué papel funcional desenpeña cada uno de los aminoácidos de la cadena bets de la molécula de henoglobina, se puede carnbiar cada uno de ellos por cualquiera de los otros 19. La tecnología exi-ste y una de las técnicas que más se usan es la llanada mutagénesis dlrigída a un sítÍo específico. A grandes rasgos 6e hace usando un gene clonado o injerto y entonces se construye Ia secuencla conplementaria excepto en se Le coloca La secuencia e} punto que hay que cambiar y alll que se quiere insertar, es decir, si se quiere que en vez de una adenina haya una tinina entonces se Ie coloca al frente 1a otra adenina, si se quiere una citocfna donde hay una guanína' se le introduce base coroplenentaria, Iógicanente en este sitio las dos cadenas no son conplenentarias ' se completa 1a molécula con elADN polimerasa, se liga, se cierra y se separan las dos cadenas con 1o cual se tendrá una cadena nornal y otra cadena mutada. Copiando Ia cadena ¡outada se coloca Luego dentro de l-a célula y entonces se aisla el gene y e1 gerie estará nutado en esa posición que era 1o qüe se buscaba. También es posible hacer síntesis de Protelnas por nétodos manuasi por ejenplo 1es. Hay muchísimos siste&aa en la literatura; tirosina es itDportanenzima residuo una un quiere si en saber se Si 1a enzina otro aminoácido. 1o cambia se en catálisis, te la Por Ahora viene un proporque i-nportante. no es es sigue trabajando para coleccióD de iniertos' se tiene una blema que es crítico; recoque formas: 1) existen dos interesa saber cuáI es e1 injerto nociéndolo con una secuencia conplenentaria para ese gene, 1as bacterias con .Los injertos adentro se ponen en un papel de nitroce1u1asa, se lisan para que e1 DNA se exPonga' se desnaturaliza' se ancla para qeu?no se vaya a desprender, 1o cual puede hacerse por calentaniento y luego sé agrega una secuencia conocida correspondiente a una de1 gene que interesa¡ se Earcan Las secuencias se híbridÍza' 2) por métodos no radioactivos, con radioactividad; compañera y su la secuencia conplenentaria reconoce es decir, y Estos segmentos nó. en otros en unos casos se fornará hlbrido tsondast, 1as cuales tienen secuencias de conocidos se llaman Por ejemplo, 8i se tiene un ARN conocido como reconociniento. se lisan 1as bacterias, se desnaturaliza henoglobina, e1 ARN para -se agrerál ARN el cual va a fornar un hlbrido con aquella e1 ADN, colonia que tenía e1 gene. Hay una técnica más moderna que inplica que se tenga alguna idea del producto de ese gene; por ejemplo una protelna' es posible entouces mediante el código genéLico y yendo a la inversa, predecir Solamente a que secuencia le corresponden ciertos nucleótidos. 2,J.

(5) hay un proDlema y es que e1 código genético es rdegeneradot, es decir, a cada aninoácido Ie corresponden a veces más de una tripleta de nucl-eótidos, pero se pueden hacer todas las secuencias posibles, 2, 4, 6, I, L6, 32, 64 hasta míles e incluso usando un síntetizador para que éste tenga todas las secuencias posíbJ.ee' de nodo que de esa rnanera se han logrado aislar nuchísirnos genes. la otra posibilidad es hacer que este gene se exprese, para Lo cual hay que usar un vector de expresión. Estos son vectores que tienen un segmento donde se tpegat 1a RNA polimerasa para que haya transcripción y que se l1ama un promotor' e1 cual es rruy específico, es decir, los promotores de células aninales son diferentes a los bacteriales y a Ios promotores de células vegeta1es. En estos últimos casos, algunos responden a La LlJz y otros nó, por 1o que hay que tener cuidado con 1o que se trabaja. Se han hecho ya una gran cantidad de pronotores que se pueden uear, por ejenplo, en vegetalee cono e1 promotor de1 nosaico de la coliEl vector flor que entre otras cosas ee suprenanente potente. contiene entonces el promotor y el gen que se Le Ínjerta Para que pueda expresarlo. Con esta tecnológia se pueden hacer también reconociEientos por nétodos inmunológicoe. Sí se tiene un antisuero contra una pioteína se puede detéctar cuá1 es el clon que está produciendo esa proteina. Los vectores de expresión son i-nporLantes por ejenplo, para producir insulina en Escherichia gcli en vez de1 páncreas o el interferón, o 1a hornona de crecinÍenlo. Teórica:¡ente dentro de Escherichia coli se pueden próducir muchas sustancias que nornalnentE-EE producen en otro tipo de cél-ulas. III.. MEIDDG DE ITGENISRIAGEIIEIICAEN trNARIOIES. tiene una A diferencia la eucariótica de la cé1ula procariota menbrana nuclear pero posee tánbién capacidad para caPtar material genético. Tienen tanta que a veces son capaces de captar cronosomas enteros y luego hacér recombinacÍón con ellos en el núcleo. Para hacer ingeniería genética en estas células, hay diferentes tipos de métodos distintos a los usados en bacterias, puede hablarse entonces de diferentes tipos de sistemas: Sistena ouínico: oara eLlo se usan iones de CaLcío, Para fornar un precipitado de'fosfato de calcio, las células Io toman y surren ,ttta- tt.rrifotración, es un néloalo relaEivamente fáci1- para Ínclulr ADN en ciertas cé1u1as aninales, puede hacerse Lanbién nediante se un vector derivado de un virus como el SV-40. El DNA viral injerta, se liga y 1-as cé1u1as captan ADN de1 SV-40. E1 SV-4O es un virus onCogónico pequeño. El ADN está en la croriatína fornando nucleosonas. a este ADN segrnentos Es posible recortarle que tienen que ver con la oncogénesis y reemplazarlos con injertos' es decir, que puede hacerse un vector con un virus oncogenaco. Se tienen virus l1a¡naclos retrovirus, como el virus del SIDA y. JJ.

(6) e1 de la paraparesia* y otros nás. los retrovirus se están usando nucho como vectorea. En Ia estructura det genona de un retrovirus se tlenen unos elementos de control llamados repeticiones terminales largas que están en los extrenos y en la parte central están proteínas; y son Pocos' un Sene 1os genes para l-as dÍferentes un para 1a proteína de la cubierta, un gene de la polinerasa' y de señal RNA una para proteína que e1 la se asocia con Sene enpaquetamiento, es posíble entonces quitar todos los genes del virus y dejar solanente la seña1 de empaquetaniento y a ésta construcción colocarle el gene específico que se quiera utilizar. Mediante un vector de estls, es posible introducir genes en células ani-nales, inyectando de una vez el ADNal núcleo de la céIula. Un retrovirus se puede eoplear de ta1 manera que si se desea tener entonur¡ vÍrus con su cubierta y e1 ADN injertado en el interior' ces se nanipula una cé1ula de tal forma que ésta no tenga 1a señal' la célula hace un hibrido con 1a cubierta del virus y enpaqueta eI ADN que se sabe t.iene el gene que interesa incluír t 1u!e9 caPacídad una tienen se infecta con ese retrovirus.l.os retros fantástica para infectar, se puede l-nfectar e1 ciento por ciento de una población celular con un virus retro. Para hacer la nicroinyección, se tona una Preparación de ADN' se fija 1a cél,uta en la punta de un micro pipeta y se inyecta e1 ADN, ésta técnica se ha utilizado en numerosos casos. liposonas, ésEoe son estructuras Otra técnica consiate en utilizar de tlpo nenbranoso que se pueden L1enar de algún tlPo de naterial ' se usan Para acarrear drogas y tanbién Pueden usarse Para acarrear ADN, para el1o el ADN se coLoca dentro de la particula construyendo Ios' fiposonas en una solución de ADN, parte de1 ADN se CuedaJg arlentro, luego se fusionan, se unen 1as dos moléculas y el ADN entra a la célu!.a y finalmente va al núcleo. dicotiledóneas En plantas especialmente en ciertas utilizar Agrobacterium, bacteria, un plásmido, el cual tiene genes ción de unas agallas o tl¡Eores relacionados con Ia síntesis d€ tipo auxinas. En la estructura tlene que ver con la morfología para sintetizar Las auxinas, esta parte se elimina' * Paraparesia espastica tropical. (PET). 34. es. posible.

(7) l. I. ¡¡ i. 1. Pt-as{ulDot. ADN CROMOS('f/tt@. cRolvro6oMA. i. i. T DE LA @FONA *i¡,:'..'l : .1 .'...r. CEUJLA VEoETAL TRANSFORMADA. ::¡'.1t':l!. i. ñi,+. A.TIJMEFACIENS. :4:,/:.. rJ. :. f\ .'. t'.',1. ". ; i,. i. det a.tumefacicns (adaP'lododc chlttonl9a3) Fig.t - tnt roclt)ccióndcun g€n o una ploatoo traváe. se le quit Para hacer un injerto' se coloca cono Pasaiero el troz se inLroduce e1 gene a la bacler pasarlo a 1a cé1u1a Y finalnente planta, Una nota de cautela es que eI ADN en el material ¡ se va a incluír manera no especlfica, es decir, tliferentes cronosomas y no se sabt constituye uno de los Prot so, ésto haciendo todos los ;;: L." investiladores ""táo' hacer que el gene vaya a1 sitÍo se hace e1 reemPJ-azode un gent. han hecho cosas nuY interesantes de 1a Luciferina Luciferasa en de ATP 1a Planta alumbre. Se Puec bierta orotéica del virus Para cel cual se ha hecho Por ejemPlo con t. 35. esfuerzos. por.

(8) Hay un par de técnícas nás para introducir ADNque podrían llamarse nétodos físicos, y adenás de los nétodos quínicos, biológicos vectores viral-es. l,os né¿odos flsicos son ¡auy buenos porque implican en cierta foroa no tener que aer nuy específÍcos respecto a1 vector, Aprobacterl.un por eJenplo, tiene problemas pues no Lnfecta monocotiledóneas por 1o que hacer transformación genética en éstas ha sido diflcil. Se ha encontrado que el ADN puede entrar a 1as células con baee en un choque eléctríco sujetando las células a una descarga suflpor un necanisno no muy claro 1a nenbrana se cientemente altai vuelve porosa y el material genético entre a la célula, éste sistena se l1ana electroporación y aegurasente se va a poner de moda adenáe porque es un sistena barato y parece lruy efectivo. Consta sinplenente de una fuente de poder que produce descargas grandes por centirnetror la cubeta puede ser de pláetico 1,5 kllovatios desechable, los electrodos, con seña1es que desaparecen exponencialnente son mejores que 1as ondas cuadradas para introducir Eaterial genético. El otro sistena es introducir materj-a1 genético con 'balas' pues es posible cubrir pequeñas parLículas de tungsteno o de oro con ADN y mediante un sistena de disparo producir perforaciones en la nenbrana de 1a célu1a y de esa nanera introducir el ADN. Son nétodos poco específicos pero que pueden usarse en cualquier típo de células, con cualquier tipo de ADN y ya hay resultadoa con posibilidades genético nuy grandes, cóno introducir e1 naterial pero de 1a posiblenente dentro céIula, es 1a parte nás difícil, sln enbargo ee está aprendiendo a hacerlo. Cono conclusión se tiene que en nuestro país en algunos laboratorio6 ae va a hace¡ a nuy corto plazo ingenierla genétlca de plantae, dado que 1a tecnología está disponible y que hay nuchas cosas para hacer; es ya cuestión de los invest.igadores escoger cuáles son l-os problemas que quieren resolver mediante el uao de esta tecnologla. Mediante las técnicas que se acaban de presentar, Una planta es posible producir resistencia en una planta sensible. resistente tiene la particularidad de producir la protelna de 1a cubierta del virus del mosaico del tabaco, técnica que Parece va a ponerse de moda para produci-r variedades resistentee a ciettos virus.. JO.

(9) ry.. BIBLIOGRAFIA. l.. Ch1lton, M.D. vegetales.. 2.. Old, R.W. and Prineroee, S.B. 19g5. prlnciples of gene n6nipulation. puúIlcatlons. 3ra. Edltion. Btackwell Scientlflc 409 p.. 3.. !{arx, J.L.. f983. Un vector para Inveetigación y cien¿ia.. 1980.. 1334- 13_36. 4.. genea introducir en g3: 20_3I.. Gene Tranefer noves ahead, Science.. 2tO.. Dodds, J.H. and Jainee, J.M. 19g7. Crops plant Genetlc Engineering. Science Fictfon to Sclencé Fact. Out look on Agricultural Tine. 16(3): 111_116.. 37.

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