Preparación y caracterización de películas de alcohol polivinílico embebidas con extracto de sangre de grado
Kety León
aketyleonp@yahoo.com, Julio Santiago
a,bjsantiago@ipen.gob.pe
a
Dirección de Investigación y Desarrollo, Instituto Peruano de Energía Nuclear, Lima 41, Perú
b
Facultad de Química e Ing. Química, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima 1, Perú
Resumen
Se han preparado películas de quitosano-alcohol polivinílico conteniendo extractos hidroalcóholico, alcóholico y acuoso de sangre de grado (Croton lechleri), y se evaluaron sus propiedades antimicrobianas frente a cepas bacterianas de S. aureus, E. coli y P. aeruginosa. Se encontró que estas películas, al igual que el látex, tienen actividad sólo frente a S. aureus. Estas películas tienen potencial aplicación en el tratamiento de heridas.
Abstract
Chitosan-polyvinyl(alcohol) films containing dragon’s blood (Croton lechleri) hydro alcoholic, alcoholic and aqueous extract have been prepared and their antimicrobial properties against S.
aureus, E. coli and P. aeruginosa have been evaluated. These films as well as the latex exhibit activity against S. aureus only and have potential application as wound healing material.
1 Introducción
El tratamiento de las heridas difíciles de cicatrización (quemaduras graves, úlceras o áreas sujetas a mucha tensión), son de mucha importancia clínica. Para su tratamiento se han desarrollado diferentes materiales en forma de esponjas o películas, que contienen medicamentos, nutrientes y biomoléculas con diferentes grados de éxito [1-3]. Estos materiales deben poseer propiedades similares a la piel normal: no poseer toxinas, proporcionar un ambiente que prevenga la resequedad de la herida, reducir la penetración de bacterias, evitar pérdidas de calor, agua, proteínas y glóbulos rojos además de promover una rápida cicatrización. Con esta finalidad se han empleado piel de cadáver (homoinjertos), piel porcina (xenoinjerto) y membrana amniótica humana, desarrollados específicamente para uso en heridas de quemaduras.
Los recubrimientos con hidrogeles (materiales poliméricos entrecruzados en forma de red tridimensional) están considerados entre los más avanzados en el tratamiento de heridas de difícil cicatrización [4]. Ayudan a mantener la zona afectada con una adecuada humedad,
facilitan el debridamiento autolítico y actúan como una barrera eficaz para evitar que las bacterias ambientales infecten la herida [5].
Los hidrogeles tienen la capacidad de absorber una gran cantidad de agua y cualquier sustancia disuelta en ella. De esta manera es posible introducir en los hidrogeles componentes activos que tengan reconocida actividad biológica para acelerar la cicatrización de las heridas.
Entre los polímeros más utilizados para la
preparación de hidrogeles para el tratamiento
de quemaduras tenemos el quitosano [6] y el
alcohol polivinílico (PVA) [7] debido a su
biocompatibilidad, biodegradabilidad y no
toxicidad. El quitosano es un polisacárido, que
se obtiene por deacetilación de la quitina
(obtenida a partir de los desechos de
crustáceos) y está compuesto de dos
subunidades, D-glucosamina y N-acetil-D-
glucosamina, unidas por un enlace glucosídico
β-(1,4). Posee carácter antimicrobiano debido
principalmente a la presencia de grupos amino,
cargados positivamente, que interaccionan con
la membrana celular de la bacteria, cargada
negativamente, provocando el deterioro de las
proteínas y de otros componentes de la
membrana de los microorganismos. Por su
parte, el alcohol polivinílico es un polímero
sintético, obtenido por hidrólisis ácida o básica
del acetato de polivinilo, muy utilizado en la preparación de películas por sus propiedades elásticas, mecánicas y permeabilidad.
La formación de hidrogeles a partir de quitosano y PVA puede realizarse por métodos físicos o químicos. Los agentes químicos utilizados para el entrecruzamiento de las cadenas poliméricas son principalmente el glutaraldehído [8] y la genipita [9], un compuesto natural. Entre los métodos físicos se puede mencionar el de enfriamiento- calentamiento [10] y el que utiliza la radiación gamma [11]. De todos ellos, el que mejor se presta para la obtención de películas para aplicaciones biomédicas es el método de entrecruzamiento por radiación gamma, tanto por la estabilidad mecánica, grado de hinchamiento y por la ausencia de residuos tóxicos [12]. También se han preparado hidrogeles entrecruzando primero el PVA con radiación gamma y luego introduciendo una solución de quitosano [13].
Para incrementar las propiedades biológicas de las películas de quitosano-PVA se han introducido diferentes aditivos como hormonas de crecimiento [14] y fibroblastos [15].
También se ha utilizado extractos de plantas, principalmente del Aloe vera [16].
El látex de la sangre de grado (Croton lechleri) es muy utilizado en la medicina tradicional para el tratamiento de ulceras estomacales, gastritis crónicas, cirrosis al hígado y como cicatrizante de heridas internas y externas. El estudio fitoquímico del látex muestra que está constituido de alcaloides (taspina), lignanos, derivados de la catequina (epicatequina, gallocatequina y epigallocatequina), polifenoles, proantocianidinas, etc. A la taspina se le atribuyen las cualidades cicatrizantes, antiinflamatorias y citotóxicas en células tumorales. El proceso de cicatrización es coadyuvado por las proantocianidinas (efecto antioxidante) y los lignanos. Asimismo, el efecto antimicrobiano de los polifenoles coadyuva al efecto cicatrizante general de la resina, provocando la precipitación de las proteínas de las células, formándose una costra que cubre la herida. Adicionalmente, el contenido de la proantocianidina oligomérica
SP-303 presenta actividad antiviral [17].
La sangre de grado presenta actividad antimicrobiana frente a grampositivos, como:
S. aureus ATCC 6538 y S. epidermidis ATCC 12228; y a gramnegativos: Pseudomonas y Klebsiela FDA 602 [18]. Igualmente, se ha encontrado que la sangre de grado inhibe el crecimiento de Helicobacter pylori en concentraciones elevadas [19].
En este trabajo introducimos en el hidrogel de quitosano-PVA un extracto hidroalcohólico de sangre de grado y evaluamos in vitro las propiedades antimicrobianas de las películas obtenidas.
2 Parte Experimental 2.1 Materiales
El quitosano proviene de Fluka (viscosidad
>400mPa.s, 1% en ácido acético al 1%), mientras que el ácido acético glacial, agar EMB, agar Pseudomonas P, agar Baird Parker, agar Casoy, caldo Casoy y agar Muller Hinton, provienen de Merck. Las cepas bacterianas:
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 fueron adquiridas en el Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú. El látex de sangre de grado (Croton lechleri) fue obtenido en la ciudad de Tingo María, Perú.
En la preparación de las soluciones hidroalcóholicas se utilizó etanol de 70°
destilado previamente.
2.2 Preparación de las películas de quitosano-PVA
Se prepararon soluciones de quitosano al 1% en ácido acético 0,1M y de PVA al 10 % en agua destilada a 80ºC. Se mezclaron estas soluciones en una proporción de 4:6 (quitosano/PVA), se dispensaron 20 mL de esta solución en placas Petri (125mm de diámetro) y se empacaron en bolsas de polietileno para ser irradiadas a 15 kGy. Luego, las películas fueron enjuagadas con agua destilada y secadas a temperatura ambiente durante cuatro días.
2.3 Preparación de las películas de
quitosano-PVA conteniendo sangre de grado
Se pesó 0,1g de sangre de grado en polvo,
obtenido por secado a 40°C del látex de sangre
de grado (Croton lechleri), y se disolvió en 10 mL de solución hidroalcohólica al 10%
(alcohol de 70º en agua bidestilada). Se cortó la película de quitosano-PVA en cuadrados de 3 x 5 cm de lado y se introdujo en las soluciones de sangre de grado por espacio de 20 minutos.
Finalmente, estas películas fueron secadas a temperatura ambiente.
2.4 Prueba de Actividad antimicrobiana Se realizó por el método de difusión en agar de Bauer-Kirby siguiendo las recomendaciones del Comité Nacional de Control de Normas de Laboratorio Clínico (NCCLS) [20]. Se incubaron las placas con agar Muller Hinton a 37ºC por 24h antes de su uso. El inóculo (preparado a una turbidez equivalente a 0,5 de la escala de MacFarland) fue aplicado sobre la placa con la ayuda de una torunda estéril, cubriendo totalmente la superficie de la placa sin dejar una zona libre. Se dejó secar de 3 a 5 minutos antes de depositar las películas embebidas cortadas en discos de 8mm de diámetro. Se colocaron los discos sobre el medio sembrado y se añadió por encima de las películas un poco de agua estéril, para evitar que se arruguen, y se incubaron a 37ºC por 24 horas.
2.5 Determinación de la concentración mínima inhibitoria
Las películas fueron embebidas en una solución hidroalcohólica de sangre de grado a diferentes concentraciones. Para ello se pesó 0,1g de sangre de grado en polvo y se disolvió en 10mL de solución hidroalcohólica. Se realizaron diluciones de tal modo que se cuenten con concentraciones de 0,05; 0,025 y 0,0125g/10mL. Las películas se embebieron con estas soluciones y se dejaron secar por espacio de 2 a 3 días. Luego, se cortaron discos y se procedió a realizar la prueba microbiológica por el método de disco difusión. Las placas fueron incubadas por 18 a 24 horas.
3 Resultados y Discusión
3.1 Preparación de las películas
Las películas obtenidas después de la irradiación con rayos gamma son transparentes con una tonalidad amarilla, lo que contrasta con las películas incoloras obtenidas sin irradiación.
Este cambio no se observa cuando se obtienen películas de PVA por radiación gamma, lo que sugiere que el color proviene de alguna modificación parcial de la estructura del quitosano. Sin embargo, estos cambios no producen modificaciones observables en el espectro IR [11].
Estas películas fueron enjuagadas con agua destilada para eliminar los restos de polímero no entrecruzado y se secaron a temperatura ambiente. Las películas así obtenidas presentaron mayor resistencia mecánica con respecto a las películas no irradiadas, facilitando las manipulaciones de lavados y su embebido con las soluciones de sangre de grado.
3.2 Embebido de las películas con soluciones de sangre de grado
Las películas embebidas en solución hidroalcohólica de sangre de grado aumentaron considerablemente de tamaño, casi el doble en menos de cinco minutos, adquiriendo una tonalidad rojiza (Figura 1a). Al cabo de cinco minutos de inmersión, la solución comenzó a volverse turbia, observándose partículas blancas muy finas. La presencia de estas partículas provoca que la absorbancia de la solución de sangre de grado resultante se incremente con el tiempo en lugar de disminuir, figura 2. Después de la inmersión y secado a temperatura ambiente, la textura del hidrogel fue lisa y brillante.
a) b)
Figura 1. Películas de quitosano-PVA secadas a temperatura ambiente, antes y luego de haberlas embebido por 5 minutos en: a) solución hidroalcohólica, y b) en alcohol de 70°.
Las películas PVA-quitosano también fueron embebidas en alcohol de 70º. En este caso, las películas tomaron una coloración marrón blanquecina pero no se observó aumento de tamaño. La absorbancia de la solución alcohólica de sangre de grado resultante disminuye con el tiempo durante 5 minutos.
Después de este lapso la absorbancia ya no
disminuye más (Figura 2b), indicando que la película utilizada ya se saturó. Luego del secado a temperatura ambiente, la película mostró una textura acartonada y sin brillo, figura 1b.
a)
400 500 600 700
0 1 2 3 4
Absorbancia
λ / nm
0 Min 5 Min
b)
400 500 600 700
0 1 2
Absorbancia
λ / nm
0 Min 5 Min