Microorganismos intestinales: estudio de Bacillus cereus en modelos de interacción con el hospedador

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

TRABAJO DE TESIS DOCTORAL

Microorganismos intestinales: estudio de

Bacillus cereus

_{en modelos de interacción con}

el hospedador

Ivanna Sabrina Rolny

Director: Dr. Pablo Fernando Pérez

E

,

PARA OPTAR AL GRADO DE

D

F

C

E

C

I

D

C

MICROBIOLOGÍA, BAJO LA

A las personas que más quiero:

mis papás, mis hermanas

y Mariano

TzÜtwxv|Å|xÇàÉá

A la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de la Plata por la formación profesional otorgada y en especial al Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo para la realización de este trabajo de tesis.

A la ANPCyT y al CONICET, por haberme otorgado las respectivas becas para el desarrollo de este trabajo de tesis.

A la Dra. Cristina Añon y a la Dra. Noemí Zaritzky por abrirme las puertas del CIDCA y permitirme trabajar allí.

A la Dra. Graciela De Antoni, porque me brindó la posibilidad de iniciarme en este camino.

Al Dr. Pablo Pérez, mi director, por su estímulo, por el aporte de sus conocimientos, que nunca dudo en transmitirme y por el apoyo en todos estos años.

A la Dra. Jessica Minnaard. Jessi, gracias por acompañarme desde el inicio, inclusive antes de iniciar la tesis. Por haberme enseñado tantas cosas, por estar todas y cada una de las veces que te necesité, más allá del trabajo en el laboratorio. Por acompañarme en los experimentos. Gracias por escucharme siempre, y sobre todo por convertirte en mi amiga.

A la Dra. María Serradell y la Dra. Patricia Bolla. María y Patito, por acompañarme más allá del laboratorio, por las charlas interminables y los mates compartidos a lo largo de todos estos años, por ofrecerme su amistad.

A la Dra. Silvia Racedo. Sil, una parte muy importante de esta tesis fue gracias a tu participación. Gracias por enseñarme tantas cosas a nivel

laboratorio que compartimos.

A mis compañeros del CIDCA y de la Cátedra, porque me acompañaron a diario durante todos estos años y siempre que necesite algo de ellos estuvieron presentes. Porque es muy valioso trabajar con gente que uno disfruta ver también por fuera del ámbito laboral. A Fernando, Martín, Mica, Aye, Ale, Fer, Marina, Judith, Caro, Lucía, Luciana, Pablo, Analía, Grace, Patricio, Angela, Raúl y Robert. Gracias a todos por los buenos momentos compartidos.

A Puli, Esteban, Eli, Mauricio, Marcelo, Ceci y de nuevo a Jessi, María y Pato que me acompañan o acompañaron a diario en el laboratorio, y que hicieron del lugar de trabajo, un lugar increíble! Por estar en las buenas y en las malas. Gracias por todos esos momentos compartidos, y sí, también muchas gracias por la paciencia, sobre en este último tiempo.

A la gente de la cátedra de Microbiología, con quienes tengo la suerte de compartir muchas horas, dentro y fuera del laboratorio. Sobre todo gracias a Moni, Pity, Tere, Vane y Juan, por dejar de ser solo compañeros ocasionales, por esas charlas interminables, con muchos mates de por medio.

A Vanina Perez y Diana Lauff por la ayuda con las microscopías confocales. Por hacer que tantas horas compartidas no lo parezcan tanto.

A los chicos del Lysin porque siempre atendieron mis consultas y por incluirme como una más al grupo en los congresos compartidos. En especial a David por la ayuda en las RT-PCR y a Nico por las consultas de citometría atendidas.

A la Dra. Mariela Bollati, por recibirme en su laboratorio y permitirme realizar mi trabajo. A mis compañeras del IPMont, en especial a Inés y Jose, por hacerme sentir como una más en el laboratorio. Por ayudarme en los experimentos y análisis.

A la Dra. Eugenia Rodríguez y su grupo de trabajo por cedernos una gran cantidad de reactivos y conocimientos.

No quiero dejar de agradecer a tantos amigos por fuera del laboratorio y a mis suegros que de alguna manera, y a lo mejor sin saberlo, me ayudaron para llegar hasta acá.

No puedo dejar de emocionarme al llegar al punto de agradecimiento a mis padres, Mónica y José. Gracias! Porque sin sus sacrificios no podría haberme formado profesionalmente, porque siempre me apoyaron para seguir adelante, y aunque muchas veces no comprendieron mis horarios de laboratorio, siempre estuvieron a mi lado. Gracias por enseñarme todas las cosas que me ensañaron por fuera de lo profesional, gracias por su amor, por la paciencia y por el apoyo incondicional. Gracias por haberme dado dos hermanas. Los amo.

A mis hermanas, Nadia y Daiana. Gracias por todo lo compartido en la vida, por estar en las buenas y en las malas. Gracias por estar siempre!

A mi cuñadito Fran por el tiempo compartido, a Dai y Coco por el diseño de la tapa. A Na por ayudarme a ordenar la biblio.

A mis abuelos, Blanca, Ildemar, Bruno y Dirce, porque siempre me estimularon a seguir formándome. Por todos los años que compartimos, aunque nunca es suficiente el tiempo. Se que estarían orgullosos. Siempre los recuerdo y los llevo en mi corazón. Fueron, son y serán una parte mucho más que importante en mi vida.

A vos mi amor, por tu contención en todos estos años a mi lado. Por tu amor incondicional, por ser el amor de mi vida. Por que éste es también un logro tuyo. Por bancarte mis crisis. Por ayudarme y estar a mi lado día a día, en las buenas y en las malas. Te amo con todo mi corazón.

Índice

Í

INTRODUCCIÓN GENERAL

Bacillus cereus ₁

Microbiota intestinal: composición y funciones 6

Control de la microbiota intestinal 8

Microorganismos benéficos 11

BIBLIOGRAFÍA 15

OBJETIVOS 29

CAPÍTULO 1

INTERACCIÓN DE BACILLUS CEREUS CON CÉLULAS FAGOCÍTICAS MURINAS

INTRODUCCIÓN 31

MATERIALES Y METODOS

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento 39

Cepas de Bacillus cereus ₃₉

Condiciones de crecimiento 40

Células eucariotas

RAW264.7 40

Marcación de los microorganismos 41

Ensayo de infección en macrófagos 43

Cuantificación de la asociación por microscopía de fluorescencia 44 Análisis de la fagocitosis de B. cereus _{por citometría de flujo 45} Cinética de muerte de B. cereus _{en macrófagos peritoneales 46}

Estudio de necrosis celular 46

Estudio de localización de B. cereus _{en compartimentos tardíos de} la vía endocítica

LAMP-1 47

Compartimentos ácidos 50

RESULTADOS

Marcación de los microorganismos 53

Efecto del agregado de azul tripán 54

Asociación de B. cereus _{con células fagocíticas 55}

Fagocitosis por citometría de flujo 57

Efecto de la infección con B. cereus _{sobre la viabilidad de los} macrófagos peritoneales

60

Viabilidad de B. cereus _{dentro de macrófagos 62}

Localización de B. cereus _{en diferentes compartimentos celulares 63} Localización de B. cereus _{en compartimentos tardíos de la vía endocítica. 64}

Localización de B. cereus _{en compartimentos ácidos. 68}

Estudio de endosomas de la vía de reciclaje 77

Expresión de MHC-II y CD86 en la superficie de macrófagos 79

DISCUSIÓN 81

BIBLIOGRAFÍA 93

CAPÍTULO 2

EFECTOS DE OTROS MICROORGANISMOS SOBRE LA INTERACCIÓN DE

B. CEREUS CON CÉLULAS EUCARIOTAS

INTRODUCCIÓN 103

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento 107

Cepas 107 Condiciones de crecimiento 108 Células eucariotas 109 RAW264.7 109 HT-29 109 HT-29 (NF-κB-GFP) 110 Células Dendríticas 110

Opsonización de los microorganismos 111

Marcación de los microorganismos 111

Índice

Cuantificación de bacterias asociadas a los macrófagos por microscopía 113

Ensayo de fagocitosis por citometría de flujo 114

Expresión de marcadores de la superficie celular 115

Evaluación de la activación del factor de transcripción de NF-κB en células HT-29

116

Asociación de Bacillus cereus _{a las células HT-29 117}

Estudio de la respuesta ante la infección en un sistema de co-cultivo de células eucarióticas

118

Caracterización de las células dendríticas por citometría de flujo 120 Análisis de interacción de B. cereus _{con enterocitos y CD 122}

Medición de citoquinas 122

Análisis estadístico 124

RESULTADOS

Marcación de los microorganismos 125

Interacción de lactobacilos y bifidobacterias con macrófagos

Ensayos de microscopía 126

Ensayos por citometría de flujo 128

Expresión de moléculas coestimulatorias 131

Evaluación de la activación del factor de transcripción NF-κB por B. cereus _y Lactobacillus _{en células HT-29}

132

Asociación de Bacillus cereus _{a las células HT-29 y expresión de IL-8 135} Análisis de la respuesta generada por la infección en co-cultivos de células

epiteliales intestinales y células dendríticas

Caracterización de las células dendríticas por citometría de flujo y análisis de marcadores de superficie

138

Análisis de adhesión de B. cereus _{a células epiteliales y dendríticas 140}

Medición de citoquinas 141

DISCUSIÓN 145

CAPÍTULO 3

DESARROLLO DE UN MODELO MURINO DE INFECCIÓN CON BACILLUS CEREUS

INTRODUCCIÓN 165

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales empleados 173

Cepa y condiciones de crecimiento 173

Infección con B. cereus _{B10502 174}

Determinación de los efectos de la infección en la estructura histológica 175

Determinación de células productoras de mucus 177

Estudio del acceso de B. cereus _{a diferentes tejidos 177}

Localización de B. cereus ₁₇₇

Caracterización de poblaciones celulares en respuesta a la infección

Obtención de las poblaciones celulares 180

Caracterización de diferentes poblaciones celulares Análisis por citometría de flujo

181 182 Estudio de citoquinas en la infección con B. cereus _{B10502 184}

Análisis estadístico 185

RESULTADOS

Infección con B. cereus ₁₈₇

Efectos macroscópicos de la infección con B. cereus ₁₈₇

Efectos de la infección en la estructura histológica 189

Células caliciformes 190

Análisis de localización de B. cereus

Efecto de la infección sobre el balance de poblaciones celulares Estudio de células CD4+ y CD8+

Estudio de células B220+ y de la expresión de MHC

192 194 194 196 Expresión de MHC-II en la población macrofágica

Estudio de la población de células dendríticas y de la expresión de CD86 198 202

Estudio de la expresión de citoquinas por RT-PCR 204

Índice

BIBLIOGRAFIA 221

CONCLUSIONES GENERALES 227

Abreviaturas

ABREVIATURAS

ºC Grados centígrados

BHIG Caldo cerebro-corazón adicionado con glucosa

CD Célula dendrítica

Ces Cereulide

CF Citometría de flujo

CFDA-SE 5(6) succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína

CPA Célula presentadora de antígeno

CytK Citotoxina K de Bacillus cereus

DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s minimum Essentials medium

FSC Foward Scatter

GALT Tejido linfoide asociado a intestino

HBL Hemolisina BL de Bacillus cereus

HIyII Hemolisina II de Bacillus cereus

hs Horas

IL Interleuquina

INF-γ Interferon- γ

LLO Listeriolisina O

MALT Tejido linfoide asociado a mucosas

MAMPs Microbe-associated molecular patterns

MDI Multiplicidad de infección

MHC Complejo mayor de histocompatibilidad

Min Minutos

ml Mililitro

MQ Macrófagos

NHE Enterotoxina no hemolítica de Bacillus cereus

NHEA Componente A de la NHE

NK Célula natural killer

NLM Nódulos linfáticos mesentéricos

NRLs Receptor tipo Nod

PAMPs Pathogen-associated-molecular patterns

p/p Peso en peso

p/v Peso en volúmen

PBS Buffer salino fosfato

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PE Ficoeritrina

PLC Fosfolipasa C

PP Placas de Peyer

PRRs Pattern recognition receptors

SFB Suero fetal bovino

SSC Side Scatter

TLRs Receptor tipo Toll

TNF-α Factor de necrosis tumoral α

UFC Unidades formadoras de colonia

v/v Volúmen en volúmen

µg microgramo

µl microlitro

Introducción General

Introducción General

I

G

BACILLUS CEREUS

El grupo Bacillus cereus (Bacillus cereus sensu lato) contiene siete especies relacionadas: Bacillus anthracis, Bacillus cereus (sensu stricto), Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus weihenstephannensis y Bacillus medusa (Bavykin et al, 2004). La homogeneidad del grupo en cuanto a pruebas bioquímicas y características fenotípicas, y la transferencia horizontal de información genética hacen muy difícil la identificación. Muchas características (o ciertos marcadores) de este grupo se hallan codificadas en plásmidos (Sergeev et al, 2006; Helgason et al, 2000; Cardazzo et al, 2008; Kolsto et al, 2009). Cualquier movimiento de este elemento genético, ya sea la pérdida o adquisición del mismo, hace indistinguible las especies del grupo (Slamti y Lereclus, 2005). Algunos autores como Helgason y colaboradores, sostienen que son una misma especie, siendo B. cereus la más antigua de todas (Helgason et al, 2000).

Bacillus cereus (sensu stricto) es un bacilo largo Gram positivo, catalasa positivo, puede encontrarse suelto o formando cadenas, y es móvil por flagelos peritricos. Esporula rápidamente en condiciones normales y la germinación es altamente dependiente de adecuadas condiciones ambientales (Kotiranta et al., 2000). Puede desarrollar aeróbicamente y crece en un amplio rango de temperaturas que abarca desde los 10°C y alcanza los 55ºC. Esta característica explica el desarrollo de B. cereus en temperaturas de refrigeración. Ambas formas del microorganismo, la forma vegetativa y la esporulada, se encuentran en un amplio rango de ambientes. Es un microorganismo que no posee requerimientos nutricionales complejos, lo que hace posible encontrarlo en diversos lugares, como en tierra, aguas naturales y vegetación. También lo podemos hallar en varios tipos de alimentos, sobre todo

2

(Kramer y Gilbert, 1992). Por otro lado, Bacillus cereus, es habitante de la microbiota intestinal de muchos invertebrados, y aunque no sea muy frecuente, si las bacterias comienzan a multiplicarse rápidamente, se pueden producir infecciones en el hospedador, ya sea en vertebrados como en invertebrados (Jensen et al, 2003).

Este microorganismo constituye un grave problema para la industria alimentaria ya que los esporos, además de la resistencia que ofrecen al calor y a las radiaciones ionizantes, tienen propiedades hidrofóbicas que les permiten adherirse a distintas superficies inanimadas, muy comunes en las líneas de producción (Husmark y Rönner, 1990; Wiencek et al, 1991). Además la formación de biofilm protege a los esporos y formas vegetativas de la acción de agentes desinfectantes (Stenfors Arnesen et al, 2008).

Bacillus cereus esta implicado en patologías tanto intestinales como no intestinales. En lo que respecta a las extraintestinales, se incluyen las endoftalmitis (Beecher y Wong, 19941_{; Moyer et al, 2008; Durand, 2013), endocarditis (Thomas et} al, 2012, Barraud et al, 2012), osteomielitis, infecciones en la cavidad oral (Kotiranta

et al, 1998), septicemias, peritonitis, neumonia y meningitis (Rowan et al, 2001, Lede

et al¸2011; Wright et al, 2011; Miyata et al, 2013). En el caso de las endoftalmitis, es capaz de producir el desprendimiento de la retina y necrosis, provocando una perdida de la visión permanente (Beecher et al, 1995; Callegan et al, 2007; Novosad

et al, 2011). Estas infecciones no intestinales se dan principalmente en pacientes inmunocomprometidos, adictos o pacientes en convalecencia de una cirugía (Rasko et al, 2005; Slamti y Lereclus, 2005; Schoeni y Lee Wong, 2005; Bottone, 2010). Dos tipos de síndromes se atribuyen al consumo de alimentos, el síndrome diarreico y el síndrome emético. El síndrome emético se asocia al consumo de alimentos como el arroz, leche y derivados, pastas y fórmulas infantiles (Szabo et al,

1991) y presenta un cuadro similar al de la intoxicación con Staphylococcuus aureus

(Schraft y Griffiths, 2006). Se identificó en 1970 asociado al consumo de arroz frito (Gilbert et al., 1974), luego, en 1995 se aisló la toxina emética, y fue llamada cereulide. La misma se encuentra estrechamente relacionada a la valinomicina (Agata et al, 1995). Este cuadro se caracteriza por un proceso rápido de náuseas y

Introducción General

vómitos (ocasionalmente diarreas) que se inician entre los 30 minutos y las 5 horas luego de ingerido el alimento contaminado, la duración del cuadro esta entre las 6 y 24 horas (Stenfors Arnesen et al, 2008). El alimento debería contener entre 105 y 108 células por gramo de alimento para que se produzca el cuadro clínico.

El síndrome diarreico se describió en detalle, por primera vez, por Hauge (1955) quien evaluó un brote de gastroenteritis debida al consumo de postre de vainilla en un hospital; este postre contenía un alto número de B. cereus (más de 108

UFC/ml). El síndrome se produce por la ingestión de microorganismos contenidos en productos lácteos, vegetales o carnes. Los esporos ingeridos con los alimentos germinan en el intestino delgado y, durante la fase exponencial de crecimiento del microorganismo, se producen los factores extracelulares entre los que se encuentran las enterotoxinas causantes del síndrome diarreico (Griffiths, 2010). Los períodos de incubación en este caso, se encuentran entre las 8 y 16 horas, y se resuelven entre las 12 y 24 horas (Kramer y Gilbert, 1992). Se pueden presentar nauseas, pero es muy raro que se produzca el vómito. Varios factores extracelulares intervienen en el cuadro y por eso es importante un estudio integral de los mismos. Sumado a estos datos, hay investigaciones que demuestran que las células vegetativas son capaces de resistir las condiciones ácidas del estómago (Wijnands et al, 2009); esto aumentaría aún más las probabilidades de que B. cereus

acceda al intestino. La dosis de infección se encuentra entre las 105 y108 células o esporos, pero se sabe que con dosis de 103 _{células se han producido enfermedades}

(Kramer y Gilbert, 1992). Por otro lado, se ha tenido en cuenta a la capacidad de adhesión al enterocito como factor de virulencia (Andersson et al, 1998; Rowan et al, 2001; Minnaard et al, 2004)

La patogénesis del síndrome diarreico, se asoció por primera vez a una enterotoxina en 1972 (Spira y Goepfert, 1972) usando un sistema de asa ligada en conejo. Sumado a estos ensayos biológicos, los ensayos sobre líneas de cultivo celular como células CHO (Buchanan y Schultz, 1994), Caco-2 (Minnaard et al

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utilizados al momento de estudiar la toxicidad de cepas de B. cereus. Las toxinas asociadas al cuadro se nombran en la tabla 2.

La afección cursa generalmente de forma benigna, con diarreas acuosas sin evidencia de invasión de los tejidos o leucocitos en la materia fecal, sin embargo, puede resultar severa en niños de corta edad y en ancianos (Beecher y Wong, 19942). El cuadro diarreico suele autolimitarse, y en casos severos puede necesitarse la reposición de líquidos. En el caso del cuadro emético, pueden encontrarse episodios más severos de enfermedad. Mahler y colaboradores describieron el caso de un joven de 17 años de edad que presentó síntomas del cuadro emético por B. cereus y luego murió por falla renal (Mahler et al, 1997).

Toxina Características Referencia

Hemolisina BL (HBL)

Enterotoxina de tres componentes: B (38,0), L1 (38,5) y L2 (43,2) asociada a diarrea y a infecciones necróticas

Beecher y Wong, 19942 Beecher y Wong, 1997 Fagerlund et al, 2010 Esbelin et al, 2012 Enterotoxina no hemolítica (NHE)

Enterotoxina de tres componentes: NheA (41,0), NheB (39,8) NheC (36,5).

Lund y Granum, 1996 Granum et al, 1999 Fagerlund et al, 2010 Didier et al, 2012 B. cereus enterotoxina T (BcET)

Enterotoxina. Único componente (41). La bibliografía indica que esta proteína no produce diarreasa. Agata et al, 1995 a. Choma y Granum, 2002 B. cereus enterotoxina (EntFM)

Enterotoxina. Único componente (45)a. También llamada CpwFMb_{. Es una} peptidasa de la pared celular

a. Asano et al, 1997 b. Tran et al, 2010

Enterotoxina S Enterotoxina (45). Su gen, entS,

contiene una identidad en la secuencia de 97% con entFM.

Ghelardi et al, 2002

Tabla 1. Toxinas relacionadas con B. cereus. En la tabla se resumen algunas características de enterotoxinas y la toxina emética. Entre paréntesis se detalla el tamaño de las proteínas en kDa.

Introducción General

Citolisina K (CytK) Enterotoxina. Único componente (34). Relacionada con enteritis necrótica. Similar a las proteínas formadoras de poro presentes en S. aureus y C. perfringens

Lund et al, 2000 Fagerlund et al, 2010

Hemolisinas Hemolisina IIb,d, Hemolisisna III

formadora de poros transmembranac _y Hemolisisna IVc _{con fuerte efecto sobre} la membrana plasmáticad_.

a. Shinagawa et al, 1991 b. Baida y Kuzmin, 1996 c. Beecher y Wong, 2000 d. Sineva et al, 2012

Cereolisina O Citolisina tiol activada que se une al colesterol. Hemolisina sensible al calor.

Alouf, 2000

Henderson et al, 1999 Brillard and Lereclus, 2007 Fosfolipasa C Se conocen tres. Fosfatidilinositol,

Fosfatidilcolina y esfingomielinasa. Granum y Nissen, 1993 Beecher et al, 1995 Beecher y Wong, 2000 Cronin y Wilkinson, 2008 Oda et al, 2010

Proteasas Con roles que podrían estar asociados a

las patologías no intestinales.

Kotiranta et al, 2000

Cereulide Toxina asociada al síndrome emético

(1,2)

Agata et al, 1995 Andersson et al, 2007 Takeno et al, 2012

InhA1 Metaloproteasa bacteriana (73)

componente del exosporium. Interviene en la liberación del esporo de los macrófagos

Ramarao y Lereclus, 2006

IlsA Es una proteina de superficie rica en

leucina que regula la adquisición de hierro

Daou et al, 2009

Certhrax Es una mono-ADP-ribosiltranferasa

homóloga

6

metodologías. Existen métodos inmunoquímicos comerciales como el RPLA (del inglés: reverse passive latex agglutination) de Oxoid que reacciona con la subunidad L2 del complejo HBL, y bajo el formato de un ELISA, el kit BDE (del

inglés: Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin) de TECRA que detecta la proteína NheA que es parte del complejo NHE. Para la determinación directa en alimentos de las toxinas NHE y HBL Merck dispone de Duopath _{Cereus Enterotoxins. La}

confirmación final de que una cepa resulte enterotoxigénica, se puede obtener usando un ensayo de citotoxicidad sobre líneas celulares eucarióticas como se mencionó previamente. También se han utilizado ensayos de hemaglutinación (Gorina, 1975), y PCR (Mäntynen y Lindström, 1998).

Microbiota intestinal: composición y funciones

La comunidad microbiana intestinal del humano es compleja y la componen al menos 1000 especies bacterianas diferentes. Se ha estimado que la microbiota del tracto gastrointestinal es de 10 veces el número de células del cuerpo, llegando a pesar entre 1 y 2 kilos (Neish, 2009; Blaser y Musser, 2001). La composición de esta microbiota varía entre individuos, sin embargo permanece estable por largos períodos en cada sujeto (Day y Sherman, 1998; Yoshioka et al., 1983). Cerca del 80 % de las especies que se encuentran distribuidas a lo largo del tracto digestivo, no son cultivables (Hooper y Gordon, 2001), esto dejó de ser un inconveniente para la clasificación microbiana, principalmente sobre los microorganismos intestinales, gracias a la implementación de los métodos moleculares. Los métodos moleculares permitieron ganar conocimiento sobre la diversidad de la comunidad microbiana intestinal, incluso permitieron la identificación de nuevas especies bacterianas (Eckburg et al., 2005).

En la boca, se encuentran grandes cantidades de bacterias aerobias Gram (+), disminuyendo de manera importante en el estómago dada la acidez gástrica. Las bacterias dominantes tanto en estómago como en duodeno son microorganismos anaerobios facultativos tales como Lactobacillus spp., Staphylococcus

Introducción General

spp. y Streptococcus spp. La microbiota más abundante se encuentra en el colon, siendo los géneros predominantes anaerobios estrictos tales como Bifidobacterium

spp., Clostridium spp. y Bacteroides spp., y en menor proporción anaerobios facultativos Lactobacillus spp., Escherichia coli y Lactobacillus spp. (Eckburg et al., 2005; Ley et al, 2005; Young y Huffman, 2003). Una importante proporción de la microbiota intestinal se halla formada por bacterias potencialmente patógenas para el hospedador (Figura 1).

Una de las funciones de la microbiota intestinal es la de aumentar la eficiencia digestiva del hospedador, ayudando a metabolizar glicanos, degradando polisacáridos dietarios y sintetizando proteínas. Los microorganismos también proveen señales para el desarrollo intestinal, como por ejemplo la maduración de células epiteliales y el desarrollo de linfocitos. Otra función substancial de estos microorganismos es la de proteger al huésped de infecciones por patógenos. Dos

Figura 1. Distribución de microorganismos en el tracto gastrointestinal adulto. (Adaptado de Young y Huffman, 2003)

Ileum: 105_-1010 _UFC/ml Coliformes Bacteroides Bifidobacterium spp. Clostrdium spp. Estómago: <103 _UFC/ml Streptococcus spp. Staphylococcus spp. Lactobacillus spp. Helycobacter pylori Boca: 108_-109 _UFC/ml Bacteroides spp. Fusobacterium Duodeno: 103_-104 _UFC/ml Streptococcus spp. Staphylococcus spp. Lactobacillus spp. Colon: 1010_-1012 _UFC/ml Bacteroides sp., Bifidobacterium sp. Clostrdium sp., Enterococos sp.

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través de inhibiciones y de interferencias en la adhesión del patógeno y el efecto modulatorio, a través del cual, los microorganismos simbióticos estimulan la respuesta inmune contra los patógenos (Hopper y Macpherson, 2010).

Control de la microbiota intestinal

Una estrategia para mantener la homeostasis es minimizar el contacto entre las bacterias del lumen y la superficie de las células epiteliales. Esto se logra usando distintas barreras.

Las células caliciformes, son células epiteliales especializadas que secretan mucinas. Las mucinas forman una capa de gel viscoso llamado mucus que se extiende más de 150 µm de la superficie del epitelio intestinal, formando dos estructuras diferentes (Figura 2). Las bacterias abundan en la capa más externa de mucus, no siendo así en la más interna.

Figura 2: Mecanismos que limitan la interacción de las bacterias con el epitelio. En la figura se pueden ver las células caliciformes, que secretan mucinas; los enterocitos, que también pueden secretar proteínas antimicrobianas; células plasmáticas, que secretan IgA. (Adaptado de Hooper y Macpherson, 2010)

Introducción General

La capa más interna resulta resistente a la penetración bacteriana, limitando el contacto directo entre las bacterias y las células epiteliales. Algunos patógenos han desarrollado mecanismos mediante los cuales pueden penetrar las capas de mucus y alcanzar el epitelio. Por ejemplo, el Helicobacter pylori, si bien alcanza la capa de mucus gracias a su movilidad, facilita su llegada al mucus a través de una disminución de la viscosidad del mucus que lo rodea por medio de un aumento del pH, facilitando así su llegada a la pared estomacal. Salmonella sp. y Campylobacter jejuni, penetran en el mucus intestinal por movilidad.

La secreción de péptidos antimicrobianos está a cargo de las células intestinales epiteliales, incluyendo enterocitos, células caliciformes y células de Paneth. La expresión de estos péptidos antimicrobianos está regulada por diferentes mecanismos como la activación de receptores de reconocimiento de patrones de reconocimiento o por activación de NOD2.

Las defensinas, que son proteínas antimicrobianas, permanecen retenidas en la capa mucosa (Meyer-Hoffert et al., 2008; Mumy y McComick, 2005). Muchos patógenos intestinales han desarrollado mecanismos de resistencia para evadir estas proteínas. Listeria monocytogenes desacetila su propio peptidoglicano, evitando de esta manera el ataque por la lisozima, una enzima secretada por las células epiteliales que degrada la pared celular bacteriana (Boneca et al. 2007).

La secreción de IgA limita la asociación de las bacterias con la superficie celular del epitelio intestinal y dificulta la entrada de las bacterias endógenas a través del epitelio. La IgA específica para bacterias intestinales, se produce con la ayuda de células dendríticas que detectan a las bacterias del lumen. Estas células dendríticas, envían las señales apropiadas a los linfocitos B y T que se encuentran en las placas de Peyer, de esta manera se induce a los linfocitos B para que los mismos se diferencien a células plasmáticas productoras de la IgA adecuada (Figura 2). La IgA pasa a través de la monocapa de células epiteliales al lumen por transcitosis, donde se une a las bacterias limitando su asociación con el epitelio y

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Pese a que el mucus, las proteínas antimicrobianas y la IgA secretoria trabajan en conjunto para proteger a la barrera de células epiteliales intestinales del contacto directo con las bacterias, el gran número de bacterias intestinales lleva a pensar que un ocasional paso de las bacterias es inevitable. Es por esto que es necesario un reconocimiento y ataque inmediato de estos microorganismos que cruzan la barrera epitelial por parte del sistema inmune intestinal.

Las bacterias comensales que pasan la barrera epitelial, son rápidamente fagocitadas y eliminadas por los macrófagos de la lamina propria. Estos macrófagos se encuentran en gran número en el tracto gastrointestinal de los mamíferos y se hallan en contacto con el epitelio (Lee et al., 1985). La evasión de este mecanismo de defensa, ya sea por escapatoria o supresión de la fagocitosis, es frecuentemente usada por los patógenos intestinales. Ejemplos de estos patógenos son la Salmonella

sp., M. tuberculosis y Shigella sp. que inhiben los mecanismos microbicidas de los macrófagos, permitiendo a estos patógenos sobrevivir y replicarse en los tejidos del huésped. Las células fagocíticas alojadas en la mucosa cumplen un rol importante en el mantenimiento de las relaciones simbióticas con la microbiota, ayudando en la restauración de la integridad física de la barrera epitelial luego de los daños.

El sistema inmune adaptativo, en particular el compartimento de mucosas, esta profundamente modelado por la presencia de la microbiota comensal intestinal. Esto incluye el incremento del tamaño y número de los centros germinales en las placas de Peyer (Shroff et al., 1995) y en el número de células plasmáticas productoras de IgA (Benveniste et al., 1971). De los tejidos linfoides de mucosas, el asociado al tracto gastrointestinal es uno de los cuales contiene el mayor número de linfocitos, además de ser uno de los más caracterizados.

En un adulto, la mucosa intestinal contiene el 80 % de las células B activadas del cuerpo (Brandtzaeg, 2009). A este tejido linfoide, se lo suele encontrar nombrado como GALT, de su nombre en inglés, Gut-Associated Lymphoid Tissue. Anatómicamente, se puede dividir en dos compartimentos,

Introducción General

GALT organizado, que es el inductor de la respuesta inmunitaria intestinal; y GALT difuso, que es el efector de la respuesta.

El GALT organizado, esta constituído por folículos linfoides aislados, folículos linfoides asociados o placas de Peyer y ganglios linfáticos mesentéricos. Son los responsables de capturar los antígenos luminales y promover la respuesta inmunitaria.

El GALT difuso, esta integrado por poblaciones de linfocitos dispersos en el entramado epitelial o en la lamina propria. Las células inmunitarias se diferencian y ejercen su función.

Las placas de Peyer, son agregados de folículos linfoides principalmente ubicados en el intestino delgado, donde se encuentran las células M. Las células M (del inglés, microfold) son capaces de censar antígenos y microorganismos y pasarlos al dominio subepitelial por transcitosis. Estas células poseen una baja secreción de mucinas y presentan una superficie apical y basolateral modificada respecto al resto de las células del epitelio intestinal (Neutra et al, 1996; Artis, 2008). En las Placas de Peyer también se encuentran folículos y centros germinales de células B, que se encuentran rodeados por áreas que contienen predominantemente células T. En el GALT también encontramos sitios efectores, principalmente en la lamina propria de las vellosidades intestinales. Los linfocitos que se encuentran en la lamina propria

son principalmente células plasmáticas secretoras de IgA y células T de memoria (Nagler-Anderson, 2001, Brandtzaeg, 2009).

Microorganismos benéficos

Hace más de 100 años, Elie Metchnikoff sugirió que parte de esta microbiota tenía propiedades benéficas para la fisiología del epitelio intestinal y

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microorganismos con una peculiar morfología, la forma de Y, y el número de los mismos era bajo, sin embargo, estas bacterias eran abundantes en los niños sanos (Tissier, 1906). Estos trabajos fueron los primeros en sugerir el uso de bacterias como probióticos (del griego “pro bios”, por la vida), aunque el uso de la palabra probióticos comenzó en 1960 para referirse a las sustancias producidas por algunos microorganismos que promovían el crecimiento de otros microorganismos (Lilly y Stillwell, 1965). La referencia del término probiótico, fue cambiando a lo largo de los años, la definición más reciente, aunque probablemente no la última, es “microorganismos vivos, que al ser consumidos en cantidades adecuadas, confieren un efecto beneficioso en el huésped” (Guarner y Schaafsma, 1998).

El rol de las bacterias probióticas en la salud, se vincula con el mejoramiento nutricional de los alimentos que lo contienen, como por ejemplo la liberación de aminoácidos y vitaminas, relacionadas con la prevención de ciertos tipos de cáncer (Fernandes et al., 1987; O´Sullivan et al., 1992) y con el control de los niveles de colesterol en sangre (Lin, 2003). También son conocidos los beneficios de estos microorganismos frente a algunas infecciones intestinales (Fernández et al., 1987). Las bacterias probióticas pueden proteger el intestino también de otras maneras: por competencia de la adhesión al epitelio intestinal con los microorganismos patógenos, reforzando las uniones estrechas entre los enterocitos, modulando la producción de mucus, inducción de defensinas e IgA, mejorando la respuesta inmune de la mucosa frente a los patógenos (Winkler et al, 2007; O´Flaherty et al, 2010).

Varios científicos han demostrado que algunos microorganismos inactivados, e incluso sus componentes celulares, pueden ejercer un efecto beneficioso en la salud (Ouwehand et al, 1998, Isolauri et al, 2002), por lo que todos estos hallazgos deberán considerarse en futuras revisiones del concepto de probiótico.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, los probióticos son microorganismos que promueven la salud de quienes los ingieren, y para que puedan considerarse como tales es necesario que cumplan una serie de

Introducción General

características. Entre estas se incluyen, su origen, la tolerancia a las condiciones del tracto gastrointestinal, las cepas deben poseer tolerancia a las condiciones ambientales del tracto gastrointestinal, para garantizar que lleguen viables al intestino, para esto es preciso que resistan el pH gástrico, las enzimas digestivas y la acción detergente e inhibidora de las sales biliares, y que sean capaces de colonizar el intestino del huésped, para esto, deben de ser capaces de colonizar el intestino y adherirse a la mucosa intestinal para que tenga lugar la modulación de la respuesta inmune, así como la exclusión de microorganismos patógenos, si bien esto último puede deberse también a su capacidad de producir compuestos antimicrobianos.

En lo que se refiere al origen de las cepas, se requeriría ser de origen humano, ya que parecería, que las cepas aisladas de seres humanos sanos van a presentar una mayor facilidad para permanecer en el intestino humano y probablemente no sean patógenas, habiéndose utilizado para definir esta característica el acrónimo inglés “GRAS” (“generally recognized as safe”). Sin embargo, también se han utilizado probióticos de origen no humano, como

Saccharomyces cerevisiae, demostrándose su seguridad tras el consumo regular por el hombre.

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Objetivos

Objetivos .

O

OBJETIVO GENERAL

Determinar los mecanismos por los cuales los microorganismos intestinales interaccionan con las células del hospedador en especial en lo que respecta a aquellos eventos relacionados con su transporte dentro de células del sistema inmune y al antagonismo de los efectos de patógenos intestinales por microorganismos probióticos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar qué tipo de interacciones se establecen entre B. cereus _y

células fagocíticas. Determinación del destino intracelular y la supervivencia de este microorganismo.

2. Establecer la capacidad de otros microorganismos de interferir en la interacción de B. cereus _{con células epiteliales y células dendríticas. Estudio de la}

respuesta generada sobre estas células.

Capítulo I

Capítulo I

Interacción de

Bacillus cereus

con

Capítulo I Introducción

I

Un importante lugar de interacción entre un microorganismo intestinal y el hospedador, esta constituido por las células epiteliales de la mucosa intestinal. Sin embargo, los patógenos son capaces de atravesar esta monocapa e interaccionar directamente con células profesionales del sistema inmune. Tanto en la superficie de células epiteliales como fagocíticas, se producen receptores de reconocimiento de patrones (PRR, del inglés Pattern Recognition Receptors) que reconocen moléculas expresadas en la superficie de los microorganismos. Estas moléculas se nombraron en un principio, como “patrones moleculares asociados a patógenos” (PAMP, del inglés Pathogen-Associated Molecular Patterns), pero al conocerse la expresión de los mismos sobre microorganismos no patógenos se los comenzó a llamar “patrones moleculares asociados a microorganismos” (MAMP, del inglés Microbe-Associated Molecular Patterns). Los MAMP, se encuentran altamente conservados en microorganismos de la misma clase, y esto permite que los mamíferos puedan reconocer casi la totalidad de los mismos con un bajo número de PRR (Palm y Medzhitov, 2009; Rhee, 2011).

Dos familias de receptores tienen un rol importante en la detección de los MAMP, los receptores del tipo Toll, y los receptores tipo NOD (de localización intracelular) (Winkler et al, 2007; Rosenstiel, 2013). En el caso de los receptores tipo Toll expresados sobre las células epiteliales, se sabe que las señales enviadas por los mismos, estimulan a los enterocitos a liberar citoquinas relacionadas con el reclutamiento de células dendríticas y neutrófilos, como así también a la liberación de ciertos productos antimicrobianos como las defensinas (Didierlaurent et al., 2005; Hooper y Macpherson, 2010).

Los macrófagos tienen un papel muy importante en la respuesta inmune, contribuyen tanto en la eliminación del patógeno, como en la presentación de

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directamente o a través de opsoninas. Luego de la unión del microorganismo a la célula fagocítica, ocurren una serie de eventos que permiten que el microorganismo sea internalizado. Estos pasos incluyen la invaginación de la membrana celular alrededor del microorganismo y la posterior maduración del fagosoma. Para que suceda la invaginación del microorganismo, debe ocurrir un remodelamiento de la actina de manera de permitir la elongación de seudópodos. En este proceso, se encuentran involucrados los lípidos fosforilados como componentes de vías de señalización.

Los lípidos fosforilados están implicados en la regulación de la transducción de señales en la superficie de células eucarióticas, en la arquitectura del citoesqueleto, en la dinámica de las membranas y las funciones de transporte de las mismas (Di Paolo y De Camilli, 2006; Bohdanowicz et al., 2010). La dinámica de los cambios de composición en los fosfolípidos de membrana define el estado de maduración del fagosoma. En los primeros momentos de formación del fagosoma, la membrana plasmática se encuentra transitoriamente enriquecida en fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PI(4,5)P2), luego disminuye su cantidad, desde la

base del fagosoma, y comienza a incrementarse la cantidad de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PI(3,4,5)P3), que persiste inclusive luego del sellado del fagosoma.

A tiempos tardíos, se acumula fosfatidilinositol-3-fosfato (PI(3)P). Este aumento resulta marcadamente notable en los fagosomas tempranos, pero al pasar a fagosomas tardíos se reemplazan por fosfatidilinositol-3,5-bifosfato (PI(3,5)P2),

que se mantiene en los lisosomas (Flannagan et al., 2012).

En la maduración, el fagosoma no sólo va cambiando la composición de lípidos de su membrana, sino también la de proteínas (Desjardins et al., 1994; Flannagan et al., 2009) adquiriendo marcadores de membrana específicos a lo largo de estos pasos, donde se va fusionando secuencialmente con endosomas tempranos, tardíos y finalmente con lisosomas.

Inmediatamente luego de la internalización del patógeno, comienza la metamorfosis del fagosoma y empiezan a alterarse las propiedades bioquímicas del mismo. Tanto los cambios en la membrana como los cambios internos son

Capítulo I Introducción

debidos a vesículas que van desde y/o hacia la vacuola; estos procesos son coordinados por las GTPasas Rab. Las proteínas Rab alternan su conformación entre una forma unida a GTP, la forma activa, y otra unida a GDP (Stenmark y Olkkonen, 2001). Una vez que se activan, estas proteínas se asocian a varias moléculas efectoras que se encuentran relacionadas, entre otras cosas, al tráfico vesicular, la fusión y fisión vesicular e inclusive, en la activación de otras proteínas Rab (Flannagan et al 2012). Los fagosomas tempranos adquieren Rab5 que, junto con la molécula efectora, el antígeno 1 de endosomas tempranos (EEA-1, del inglés Early Endosomal Antigen 1), coordinan el tráfico endocítico y son necesarios para la fusión del recientemente formado fagosoma con endosomas tempranos (Lawe et al., 2000; Sasaki et al., 2007; Flannagan et al., 2009). Cabe resaltar que los fagosomas tempranos tienen un pH de entre 6,1 y 6,5 y que, además, no tienen una importante actividad hidrolítica.

El proceso de maduración se continúa con la generación del fagosoma tardío. Este fagosoma está caracterizado por un pH más ácido que el del estadío anterior. En el fagosoma tardío el pH varía entre 5,5 y 6,0 debido a un aumento de la entrada de protones por la ATPasa vacuolar (Faim y Grinstein, 2012); además esta enriquecido en proteasas y proteínas de membrana asociadas a lisosomas (LAMP, del inglés Lysosomal Associated Membrane Proteins) que provienen del complejo de Golgi o de la fusión con endosomas tardíos. Comienza a ser reemplazado el Rab5 por Rab7, que es un marcador característico de esta organela y se sabe que media el tráfico entre fagosomas y endosomas tardíos o lisosomas (Flannagan et al., 2009; Faim y Grinstein, 2012).

En los fagosomas tardíos también se detecta la presencia del receptor de manosa 6 fosfato (M6PR, del inglés Mannose 6-Phosphate Receptor) y Rab9 entre otros (Vieira et al., 2002; Flannagan et al., 2012) (Tabla 1). Las proteínas LAMP están relacionadas al mantenimiento del bajo pH intralisosomal como también con la protección contra la autodigestión (Griffiths, 1996). Se ha demostrado que esta