Búsqueda de péptidos antimicrobianos nuevos en
secreciones de piel de ranas
TESIS PRESENTADA AL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DE LA UNIVERSIDAD DE LOS ANDES COMO REQUISITO PARCIAL PARA
OPTAR AL TÍTULO DE DOCTOR EN CIENCIAS-BIOLOGÍA
CAROLINA MUÑOZ CAMARGO
Directora: HELENA GROOT, Directora del Laboratorio de Genética Humana,, Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia.
Co-director: EDUARDO MITRANI, Universidad Hebrea de Jerusalén. Jerusalén, Israel.
Universidad de los Andes
Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Genética Humana
Bogotá, D.C.
AGRADECIMIENTOS
A mi familia
A la Dra. Helena Groot,
Eduardo Mitrani,
Ester Boix
Vivian Salazar
A los evaluadores
Al grupo del Laboratorio de Genetica Humana
Martha Vives
A las fuentes finaciadoras
Fundación Bolivar Davivienda, Labbrands, Facultad de Ciencias, proyecto semilla, fondo de Helena Groot.
Búsqueda de péptidos antimicrobianos nuevos en secreciones de piel de ranas
AGRADECIMIENTOS ... 2
Resumen ... 7
1. Introducción ... 9
2. Planteamiento del problema y justificación ... 12
3. Estado del arte y marco teórico ... 14
3.1. Situación de resistencia de microorganismo patógenos a los antibióticos .. 14
3.2. Generalidades de péptidos antimicrobianos ... 16
3.3. Clasificación de los péptidos antimicrobianos ... 17
3.4. Mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos ... 19
3.4.1. Modelo de barril ... 20
3.4.2. Modelo de poro toroidal ... 21
3.4.3. Modelo de alfombra ... 21
3.4.4. Blancos intracelulares ... 21
3.5. Mecanismos de resistencia a PAM en bacterias ... 22
3.5.1.Remodelamiento de superficie ... 22
3.5.2. Biofilms ... 23
3.5.3. Degradación proteolítica ... 23
3.6. Péptidos antimicrobianos de anfibios ... 24
3.6.1. Estructura de las glándulas granulares o serosas ... 24
3.6.2. Estructura génica de los PAM de anfibios ... 25
3.7. Obtención de secreciones de piel de ranas in vivo ... 26
3.8. Obtención de secreciones in vitro ... 27
3.9. Estrategias para identificación de péptidos ... 27
4.Objetivo General ... 29
4.1.Objetivos Específicos ... 29
5. Capítulo 1 ... 30
5.1 Resumen ... 30
5.2.Conclusiones capítulo 1 ... 31
6. Capítulo 2 ... 32
6.1. Resumen ... 32
6.4.Conclusiones capítulo 2 ... 33
7. Conclusiones Generales ... 34
8. Referencias ... 35
9. Anexo 1. Tabla de especies de ranas colectadas ... 43
10. Productos adicionales ... 44
10.1 Codirección de trabajos ... 44
Búsqueda de péptidos antimicrobianos nuevos en
secreciones de piel de ranas
Resumen
La piel de las ranas es la primera línea de defensa contra patógenos y depredadores. Las secreciones que produce la piel de estos organismos son una fuente de péptidos con amplio espectro de actividades antimicrobianas que pueden ser desarrollados en agentes con potencial terapéutico. En este grupo de investigación se ha utilizado la técnica de cultivo de micro-órganos (MOs) para la obtención in vitro de las secreciones de piel de 49 especies de ranas, la cual ha demostrado ser una forma efectiva de obtener cantidades suficientes de secreciones para el análisis de actividad, la identificación y la caracterización de péptidos antimicrobianos. Al utilizar estas sustancias secretadas en el medio de cultivo, denominadas Medios Condicionados (MC), se encontró actividad contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, y contra el virus de la fiebre amarilla, sin ser tóxicos para células somáticas. A partir de estos resultados y por medio de técnicas como MS/MS, RACE-PCR, y métodos bioinformáticos, se seleccionaron siete péptidos candidatos nuevos y la buforina II, todos ellos identificados a partir de los MC y MOs de varias especies de ranas colombianas. Se sintetizaron los siete candidatos y la buforina II, y se realizó una caracterización biológica de estos en mezcla para determinar su efecto citotóxico en diferentes líneas celulares, y su actividad antimicrobiana contra cepas de bacterias de referencia de Escherichia coli, Sthaphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (PA01y PA14). En cuanto a su actividad individual, se encontró que tres de los ocho péptidos candidatos inhiben el crecimiento de las cepas evaluadas y los otros cinco péptidos candidatos presentaron una baja actividad antibacteriana. A partir de estos resultados se realizó la caracterización biofísica de los dos candidatos nuevos, el primero, se identificó a partir de MOs de la rana Phyllomedusa bicolor y relacionado con la familia de las Dermaseptinas (AL). El segundo, se identificó a
partir de MOs de la rana Sphaenorhynchus lacteus, relacionado con péptidos pertenecientes a las frenatinas y denominado Frenatina 2.3 S (F 2.3S). Éste fue reportado por primera vez por nuestro grupo de investigación (Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de los Andes), en el Genbank (número de acceso: AGB51284. El tercero, la buforina II se identificó previamente en una rana del genero Bufo y en éste trabajo se identificó a partir de MOs de la rana
Sphaenorhynchus lacteus. Para los dos candidatos nuevos se confirmó la estructura de α-hélice con dicroísmo circular. En cuanto a la buforina II, reportes
previos, indican que inhibe el crecimiento de las bacterias E. coli, S. aureus, y su
mecanismo de acción no involucra rompimiento de membranas citoplasmáticas, lo
cual también pudimos confirmar en este trabajo. Para el péptido F2.3S se encontró
que presenta mayor actividad que la buforina II contra bacterias Gram negativas y
su mecanismo de acción está relacionado con la despolarización de la membrana
citoplasmática y posterior lisis. Por último, el péptido AL resultó ser menos potente
que el péptido frenatina 2.3S y la buforina II, y su mecanismo de acción al parecer
no despolariza ni rompe la membrana de forma significativa.
En resumen en éste trabajo se determinó que el cultivo de MOs, es una herramienta útil para obtener secreciones de piel de ranas (Medios Condicionados), determinar su actividad antimicrobiana y a partir de estas caracterizar los péptidos antimicrobianos presentes. A partir de MOs y Medios Condicionados de las especies con mejores resultados antimicrobianos, se identificaron ocho péptidos, siete de estós candidatos nuevos para la ciencia y la buforina II reportada anteriormente. Para estos ocho péptidos se encontró que en combinación presentan actividad potente contra cepas de referencia de
Pseudomonas aeruginosa.Además, tres de los ocho péptidos evaluados de forma individual fueron activos contra bacterias Gram+ y Gram-.
1. Introducción
Los anfibios ocupan un amplio rango de hábitats y condiciones ecológicas para lo cual fueron necesarias diferentes adaptaciones fisiológicas, morfológicas, bioquímicas y de comportamiento. La piel de los anfibios representa una de estas adaptaciones y sobresale como un órgano complejo con funciones físico-químicas vitales para estos organismos. Entre las más importantes están la respiración, osmorregulación y defensa1.
Por esta razón, la piel de los anfibios tiene unas características especiales, como el presentar varios tipos de glándulas, entre ellas las mucosas y las granulares. Las glándulas mucosas se encargan de evitar la desecación por pérdida de agua y prevenir daño mecánico. Las glándulas granulares, por su parte, generan gran interés porque son las encargadas de sintetizar un amplio rango de moléculas que protegen la rana de los depredadores y de la invasión de microorganismos2.
Esta protección se basa en la producción de aminas biogénicas (anestésicos, paralizantes), alcaloides (la mayoría en dendrobátidos o ranas venenosas), esteroides (bufogeninas y bufotoxinas) y péptidos antimicrobianos (PAM, en inglés “AMPs”)1,2. Los últimos, son codificados en el genoma, pueden almacenarse en altas concentraciones y estar disponibles para actuar inmediatamente exista contacto con microorganismos3.
El número y diversidad de los PAM en las secreciones de piel de las ranas es sorprendentemente alto y de acuerdo con esto en el 20034 se proyectaba que 5000 especímenes de ranas existentes podrían producir aproximadamente 100000 PAM diferentes. Teniendo en cuenta esta hipótesis y de acuerdo con los PAM de ranas reportados (1050 secuencias) en la base de datos “Collection of Antimicrobial Peptides” (CAMP)5 la investigación en este campo es todavía incipiente. En Colombia, por ejemplo, en donde se reporta el 10% del total de anfibios del mundo67 es un área de investigación poco explorada que tiene un alto potencial para aplicación en diferentes campos de la salud. Especialmente en el relacionado con búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos, teniendo en cuenta
el desarrollo de resistencia a medicamentos, no solo de bacterias sino también de virus, parásitos y hongos 8.
En este grupo de investigación se implementó una metodología9,10para obtener las secreciones de la piel de las ranas. Esta técnica está basada en la preparación de fragmentos de órganos, que preservan el microambiente encontrado por las células epiteliales in vivo, con una geometría y dimensiones del fragmento de piel que aseguran la apropiada difusión de nutrientes y gases entre las células cultivadas. Estos fragmentos se llaman micro-órganos (MOs), para distinguirlos de otros tejidos que no presentan la estructura y función de un órgano verdadero en una escala microscópica.
La aproximación metodológica de este trabajo se divide en cuatro capítulos. El primero comprende la implementación de la técnica de micro-órganos de piel (SMOs del inglés skin micro-organs), para obtener las secreciones de varias especies de ranas y la posterior confirmación de que éstos transcriben genes de PAM. Así mismo, se evaluó la actividad de estas secreciones contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, al igual que con diferentes líneas celulares somáticas.
En el segundo capítulo, se muestran los resultados de la actividad protectora de las secreciones de diferentes especies de ranas contra la cepa vacunal del virus de la fiebre amarilla (YFV), resultados que indican que las secreciones de la rana
Sphaenorhynchus lacteus, confieren una alta protección contra la entrada del virus de la fiebre amarilla. Por esta razón, se realizó una caracterización de las secreciones de ésta rana por medio de la técnica de RACE-PCR, con la cual se identificó un péptido antimicrobiano nuevo (Número de acceso: AGB51284.1), relacionado con la familia de las frenatinas. Finalmente, se evaluó la actividad citotóxica y antiviral de este péptido.
En el tercer capítulo, se presentan los resultados de la identificación de siete péptidos candidatos nuevos y la buforina II. Éste último péptido identificado anteriormente a partir de tejido estomacal en Bufo bufo gargarizans11 y en este
trabajo por primera vez identificado en piel de S. lacteus. Estos péptidos fueron obtenidos por espectrometría de masas MS/MS, a partir de las secreciones de las ranas con mejores resultados experimentales contra bacterias y escogidos por sus características por medio de un análisis bioinformático a partir de una lista original de 70 candidatos. Así mismo, se evaluó la actividad citotóxica de estos ocho péptidos, en combinación y por separado, para determinar y comparar su efecto en células somáticas. Además, se determinó su actividad contra bacterias de cepas de referencia (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa).
Por último, en el cuarto capítulo, se muestran los resultados de la caracterización biofísica de los péptidos candidatos más potentes: buforina II, F2.3S y AL. Se realizaron ensayos de despolarización de la membrana citoplasmática de E. coli,
rompimiento de membrana y modelos de membranas basadas en liposomas para estos tres péptidos. Además, se determinó la capacidad de agregación de estos candidatos con el uso de metodologías como actividad mínima aglutinadora y agregación por dispersión dinámica de luz; y su estructura secundaria por medio de dicroísmo circular.
2. Planteamiento del problema y justificación
Desde el origen de las bacterias hace aproximadamente 3500 millones de años, estas han co-evolucionado con antibióticos naturales presentes en su ambiente. Contrario a la creencia común de que la exposición a estos está confinada a la era de los antibióticos, existen evidencias que sugieren que los genes de resistencia han estado presentes en las bacterias desde antes de la era antibiótica12. Por ejemplo se han encontrado trazas de tetraciclina en esqueletos humanos que datan de los años 350-550 EC (era común). Este hecho solo puede ser explicado después de la exposición a materiales que contienen tetraciclina en la dieta de estas personas antiguas. El hallazgo de tetraciclina en los huesos se explica porque éste es el único antibiótico que es un agente quelante y que además se incorpora en el conocido mineral de los huesos, hidroxiapatita, presente también en los dientes. Por esta razón rastrear otros antibióticos en poblaciones antiguas es mucho más difícil12.
Por su parte, en el establecimiento de la era antibiótica se introdujo el uso de la penicilina en 1940, descubierta dos décadas antes por Alexander Fleming, quien advirtió del potencial desarrollo de resistencia a la penicilina si era utilizada en pocas cantidades y por corto tiempo13. La penicilina es el ejemplo más común de un antibiótico, cuya definición es la de una droga capaz de matar o detener el crecimiento bacteriano14. El periodo entre 1950 y 1970 fue la época dorada en el descubrimiento de nuevos antibióticos, pero desde entonces esta área de investigación se ha centrado en la modificación de las clases existentes de antibióticos para combatir las infecciones producidas por patógenos emergentes y re-emergentes 15. El problema de la resistencia y multi-resistencia bacteriana a los antibióticos disponibles es a nivel mundial, los datos para los Estados Unidos, indican que cada año, se infectan con bacterias resistentes 2 millones de personas y mueren 23000 por causa directa de estas infecciones14. A esto se suma, el sobrecosto que genera al sistema de salud, el cual se estima es de 1.5 billones de dólares cada año12. De acuerdo con esto, las opciones de tratamiento para infecciones existentes o multiresistentes son limitadas y como resultado aumentan
las tasas de morbilidad y mortalidad.
Las alternativas que se contemplan como promisorias para enfrentar este problema de salud pública, son la fagoterapia16 y la exploración de compuestos producidos por plantas y animales17. En este sentido, los esfuerzos de este grupo de investigación están centrados en la búsqueda de péptidos antimicrobianos (PAM) secretados por la piel de ranas. Según datos oficiales del Instituto Von Humbolt 6,7,Colombia posee el 10% de la biodiversidad de especies de anfibios del mundo y se ha reportado por diversos autores que las secreciones secreciones de estos organismos son una fuente importante de PAM, que actúan en conjunto confiriéndole a la rana protección contra bacterias, hongos y virus 18,19. Teniendo en cuenta esto, existen altas probabilidades de encontrar nuevas moléculas con actividad antimicrobiana, que ayuden a contrarestar el problema creciente de la resistencia a los antibióticos convencionales.
La línea de investigación enfocada en la búsqueda de antimicrobianos secretados por la piel de diferentes especies de ranas colombianas, tuvo su inicio con el convenio entre el Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de los Andes, y el Laboratorio Cell and Developmental biology de la Universidad Hebrea de Jerusalén. En el marco de esta colaboración se implementó la técnica de cultivo de micro-órganos, descrita por el profesor Eduardo Mitrani10, para la
obtención de las secreciones de piel de ranas in vitro. La utilización de esta técnica con piel de ranas, ha demostrado ser una forma efectiva de obtener cantidades suficientes de secreciones para análisis de actividad, identificación y caracterización de PAM.
3. Estado del arte y marco teórico
3.1. Situación de resistencia de microorganismo patógenos a los antibióticos
La penicilina fue descubierta por Alexander Fleming en 1928, y en 1940, varios años antes de la introducción de esta como tratamiento contra infecciones, se identificaron las penicilasas, enzimas también llamadas β-lactamasas que disminuyen la eficiencia del antibiótico20. Lo interesante de estos hallazgos y que concuerda con recientes descubrimientos es que se ha demostrado la presencia de numerosos genes de resistencia a antibióticos y que además, ahora se encuentra que estos son componentes naturales de las poblaciones bacterianas. Lo cual es indicativo de que los genes de resistencia han estado presentes a lo largo de la evolución13. De acuerdo con esto, en la tabla 1 se muestra una compilación de antibióticos y sus mecanismos de resistencia.
En el caso de la estreptomicina, esta fue introducida especialmente para el tratamiento de tuberculosis en 1944, sin embargo, desde entonces se empezaron a reportar casos de resistencia y por ello fue necesaria la combinación de varios antibióticos (isoniazida, rifapentina, pirazinmide, estreptomicina o etambutol) para esta infección. A pesar de ello, Mycobacterium tuberculosis es uno de los patógenos comúnmente asociados con multiresistencia (multidrug resistsnt MDR) y que representa un problema grave en salud pública13.
Tabla modificada de 13,21,22,23,24,25
Con respecto a la resistencia el European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) en colaboración con el Centers for Disease Control and Prevention (CDC), han catalogado los microorganismos de acuerdo con su perfil de resistencia de la siguiente manera. Microorganismos multiresistentes (MDR) son aquellos que presentan resistencia a tres o más clases de antibióticos26. Resistencia extrema (extensively drug-resistant XDR), cuando el microorganismo presenta resistencia a todos los antibióticos de primera línea y al menos a tres de
la segunda línea y panresistencia (pandrug resistant PDR), cuando los mircoorganismos son resistentes a todos los antimicrobianos disponibles26.
Por otro lado, dentro de los patógenos considerados de alto interés en salud pública por su prevalencia están las bacterias Gram positivas como Enteroccocus
resistentes a vancomicina (VRE) y Staphyloccocus aureus resistentes a meticilina (MRSA) y las Gram negativos en la lista ESKAPE (Enterococcus faecium,
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii,
Pseudomonas aeruginosa y especies de Enterobacter) y representan un gran reto a la hora de su tratamiento27. En el caso de las bacterias VRE y MRSA recientemente se aprobó el uso de Synercid y daptomicina22. Sin embargo para las bacterias Gram negativas no se aprueban nuevos antibióticos hace décadas. Como consecuencia se han empezado a utilizar medicamentos como colisitin (polimixina) como de primera línea, aun cuando este medicamento fue catalogado como muy tóxico hace 40 años, cuando fue decubierto28. Además, datos de la
Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos entre el 2013 y el 2016 se han aprobado para su uso seis antibióticos (Ceftazidime+avibactam, dalbavancin, oritavancin, cestalozane+tazobactam, telavancin y bedaquiline), la mayoría antibióticos existentes (lipopeptidos) con modificaciones y otros combinaciones de cefalosporinas con inhibidores de β-lactamasas29.
3.2. Generalidades de péptidos antimicrobianos
Una amplia variedad de organismos producen péptidos antimicrobianos (PAM) como parte de su primera línea de defensa 30,31. Los PAM han sido aislados de microorganismos, hongos, insectos y otros invertebrados, plantas, anfibios, aves, peces y mamíferos, incluyendo humanos. En las bases de datos especializadas como Antimicrobial peptide database (APD)32 y Collection of antimicrobial peptides (CAMP)5,33 se reportan cientos de péptidos relacionados con el sistema inmune innato. Sus características más relevantes es que son cortos (12 a 100 aminoácidos), están cargados positivamente (carga neta de +2 a +9), son
anfipáticos (cara hidrofílica externa y cara hidrofóbica interna) y, en la mayoría de los casos, presentan una hidrofobicidad mayor al 30% 31.
La expresión de estos PAM puede ser constitutiva o inducible por estímulo de infección o un estímulo inflamatorio, como el generado por citocinas proinflamatorias, bacterias o moléculas de bacterias que inducen la innmunidad innata, por ejemplo lipopolisacáridos (LPS)31. Algunos de estos péptidos son potentes agentes antimicrobianos que actúan directamente contra el microorganismo y otros han sido descritos como moléculas efectoras del sistema inmune innato. Son capaces de promover fagocitocis, estimular la liberación de prostaglandinas, neutralizar los efectos sépticos de los LPS y promover el reclutamiento y acumulación de células que intervienen en la respuesta inflamatoria, promover angiogénesis e inducir cicatrización34.
Los PAM se sintetizan principalmente en tejidos epiteliales regularmente expuestos al ataque microbiano como la piel, intestino y pulmones. Si comparamos los PAM con las inmunoglobulinas se puede decir que los PAM se sintetizan cien veces más rápido que la inmunoglobulinas y a menor costo metabólico, pueden almacenarse a altas concentraciones, estar disponibles para actuar inmediatamente y se liberan o producen cuando células especializadas se estimulan por contacto con un amplio espectro de microorganismos 35.
3.3. Clasificación de los péptidos antimicrobianos
La gran mayoria de PAM son péptidos catiónicos, los cuales se dividen en tres clases. La primera clase compuesta por peptidos lineares α-hélice, la segunda clase compuesta por péptidos de un aminoacido específico (prolina, arginina y otros residuos) y la tercera clase que incluye a los péptidos que tienen residuos de
cisteinay forma puentes disulfuro y láminas β (Tabla 2).
3.3.1. Péptidos antimicrobianos α-hélice: para este grupo se han descrito PAM de
diferentes origenes entre ellos: las magaininas (rana), dermaseptinas (rana) y las cecropinas (plantas),. Estos PAM no contienen cisteína y en sistemas acuosos presentan una estructura desordenada pero adoptan una conformación α-hélice
en solventes orgánicos como trifluoroetanol R (reproduce las condiciones hidrofóbicas de la membrana), lo cual explica su acción a nivel de membrana. La hélice representa una superficie hidrofóbica y otra altamente positiva que permite la interacción con los lípidos de la membrana 36.
Tomado y modificado de 37,38
3.3.2. Péptidos antimicrobianos ricos en cisteína: un gran número de PAM
contienen residuos de pares de cisteínas que son oxidados para formar puentes disulfuro internos. Estos péptidos que contienen cisteiínas pueden formar estructuras de lámina-β en solución38. A este grupo pertenecen las defensinas (vertebrados, plantas e insectos), las cuales se agrupan en varias clases según la localización de los pares de cisteína, estructura tridimensional y similitud de secuencias. Dependiendo del número de residuos de cisteína (la mayoría entre 2 y 8) y sus pares estos péptidos pueden adoptar conformación de lámina-β con triple cadena (estructura de la mayoría de las defensinas de vertebrados) u Horquilla- β “β-hairpin like” (por ejemplo thanatinas en artrópodos, brevininas y esculetinas de anfibios) o la mezcla de la estructura hélice-α / lámina-β presente en defensinas
de invertebrados, defensinas de plantas y defensinas de algunos mamíferos 36,38 (Tabla 3).
3.3.3. Péptidos antimicrobianos con alto contenido de un aminoácido: tienen una
alta concentración del mismo aminoácido, el cual puede ser triptófano, prolina o histidina, como se presenta en las apidaecina, abaecina y otras. Su estructura presenta diferentes patrones de soluciones acuosas, pero se vuelven estables en presencia de fosfolípidos 38
3.4. Mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos
El mecanismo de acción clásico de los PAM involucra su habilidad para causar daño a nivel de membrana. Los PAM pueden interactuar con microorganismos por fuerzas electrostáticas entre la carga positiva de sus aminoácidos y las cargas negativas de la superficie de la membrana. Se ha sugerido que precisamente la composición de la superficie de las membranas es la encargada de dar la especificidad de los PAM. En este caso la sensibilidad de las células, tanto procariotas como eucariotas, está dada directamente por las propiedades fisicoquímicas de los lípidos que se encuentran en ambos tipos de membranas39.
Por ejemplo, en membranas de mamíferos, los lípidos más comunes en la cara extracelular de la bicapa son fosfolípidos neutros, como la fosfatidilcolina y la
esfingomielina. En las bacterias en cambio, la membrana está esencialmente compuesta por lípidos de carga negativa, tales como fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina y zwiteriones como el fosfatidiletanolamina (PE)37.Además, las bacterias Gram negativas tienen lipopolisacáridos (LPS) en su membrana externa y las bacterias Gram positivas presentan polisacáridos ácidos (ácido teicoico y teicuronico) en la pared celular, que también están involucrados en la interacción con los PAM. Se ha demostrado que la carga total negativa de las membranas bacterianas tiene un papel importante en la unión de los PAM a estos microorganismos 37.
Aunque se desconocen muchos detalles sobre los mecanismos de acción de los PAM α-hélice, como las dermaseptinas, se considera que actúan directamente sobre la membrana celular y que su secuencia de aminoácidos es importante, ya que, si se sustituyen aminoácidos que alteren la polaridad del péptido, su actividad disminuye.39.
Los mecanismos por los cuales los PAM pueden atravesar las membranas microbianas no son comunes para todos los péptidos y dependen de propiedades moleculares tanto de los péptidos como de los lípidos de la membrana. Los PAM pueden inducir diferentes daños en las membranas, entre ellos, formación de poros, separación de fases, disrupción de la membrana lipídica y formación de micelas 40. Se han propuesto algunos modelos que pueden explicar la disrupción de membranas por la interacción con PAM, entre ellos el modelo de barril ( barrel-stave), el modelo de poro toroidal (toroidal pore) y el modelo de alfombra (carpet)37(Figura 1).
3.4.1. Modelo de barril
Este sugiere que los péptidos forman un poro transmebranal por la inserción directa en la bicapa lipídica. En este modelo los péptidos se unen a la membrana como monómeros, que luego se agregan y forman un poro transmembranal similiar a un barril sin fondo cuyas paredes son los péptidos helicoidales. El reclutamiento adicional de monómeros aumenta el tamaño del poro, permitiendo que el contenido citoplasmático se libere, ocurra pérdida del equilibrio osmótico y
pérdida del potencial de membrana que lleva finalmente a la muerte celular37. Los péptidos se agregan y se insertan en la bicapa de modo que las regiones hidrofóbicas de los péptidos se alinean con la región lipídica de la membrana, dejando regiones hidrofílícas hacia el lumen central. En este modelo, las estructura secundarias, tales como α-hélice y β-láminas39 son esenciales para la formación del poro.
3.4.2. Modelo de poro toroidal
Un toroide se define como una superficie generada por una curva cerrada al girar
alrededor de un eje contenido en su plano y que no la corta. En el modelo de poro
toroidal, los péptidos unidos se agregan y se insertan e inducen la monocapa de lípidos a curvarse a través del poro, de modo que las regiones polares de ambas capas de la membrana se unen. A diferencia del modelo anterior, se forma un canal mixto por las cabezas polares de los lípidos de membrana y por lo péptidos insertados en ella. Este tipo de mecanismo ha sido encontrado en péptidos como Magainina (rana) y Mellitina (abeja)40.
3.4.3. Modelo de alfombra
En este modelo, los péptidos se acumulan cubriendo la superficie de la membrana como una alfombra, afectando la arquitectura de ésta y actuando como un detergente. Los péptidos no se insertan en la membrana sino que se asocian con la cara externa y cuando alcanzan una concentración crítica, interrumpen la continuidad de la membrana mediante sus regiones hidrofóbicas y la desintegran formando micelas4,41.
3.4.4. Blancos intracelulares
Aunque la mayoría de los péptidos interactúan directamente con los lípidos de la membrana, recientemente se ha propuesto que pueden existir otros mecanismos diferentes a los de la disrupción de la membrana y lisis celular. Muchas evidencias indican que algunos PAM pueden intervenir directamente con blanco intracelular, lo cual afecta la viabilidad de las bacterias. Las bacteriocinas, son un ejemplo de lantibióticos que intervienen en la síntesis de la pared celular y la buforina II se ha visto interrumpe la síntesis de ADN y proteínas, sin romper la membrana37.
Figura 1. Resumen del amplio espectro de interacciones asociadas a los PAM.
Mecanismos de acción y de resistencia a PAM. Imagen tomada de y editada de40 .
3.5. Mecanismos de resistencia a PAM en bacterias
Aunque menos frecuente que los antibióticos convencionales ya se reporta resistencia de bacterias patógenas a PAM, se ha visto que estas bacterias han desarrollado estrategias naturales e inducidas de resistencia a AMP como resultado de la co-evolución de los PAM y las bacterias42.En general, una bacteria resistente a un PAM ha desarrollado múltiples estrategias que normalmente son controladas por respuestas coordinadas de estrés y reguladas por operones. Las más comunes involucran el cambio en la superficie celular de la bacteria y el bloqueo de la entrada del PAM39 A continuación los diferentes mecanismos de resistencia reportados para PAM.
3.5.1.Remodelamiento de superficie
Esto ocurre cuando las bacterias Gram negativas y Gram positivas modifican los componentes de la pared celular para reducir la carga neta negativa de la superficie. Las bacterias Gram negativas enmascaran la carga negativa de lípido
LPS adicionando un grupo amino y las bacterias Gram positivas utilizan la D-alanilación para modificar los ácidos teicoicos43. En este tipo de mecanismo se encuentra rigidez de la membrana S. aureus44 y su reacción a concentraciones sub-letales de PAM como Magainin y Gramicidin; además de la formación de cápsulas de polisacáridos K. pneumonie45 que le confieren resistencia a PAM como defensin, lactoferrin y polimixin B. Otro ejemplo de resistencia es el que se presenta en P. aeruginosa a polimixina B e indolicin mediado por sistemas reguladores.
3.5.2. Biofilms
Los biofilms son comunidades microbianas que consisten en células adheridas a superficies bióticas o abióticas, embebidas en una matriz exo-polimérica. La resistencia de estas estructuras a diversos químicos y a agentes antimicrobianos y físicos es bien conocida y es una de las principales causas de infecciones persistentes 39.
Se ha encontrado que uno de los componentes mayoritarios de la matriz exopolimérica es ADN y éste, a su vez, se ha relacionado como un agente quelante de cationes que induce resistencia en aminoglucósidos y PAM en P. aeuroginosa. Además, se ha reportado que esta matriz puede generar cambios conformacionales y agregación de los PAM46.
3.5.3. Degradación proteolítica
En este mecanismo se ha observado que tanto bacterias Gram positivas como Gram negativas producen peptidasas y proteasas que degradan PAM. Los péptidos lineares son el principal blanco de este tipo de enzimas, debido a que los sitios proteolíticos están más expuestos a clivaje39. Un ejemplo de este mecanismo de resistencia lo presentan las bacterias patógenas P. aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, S. aureus y Staphyloccus pyogenes39.
3.5.4. Bombas de eflujo
Las bombas de eflujo son transportadores dependientes de energía que evitan la entrada de compuestos tóxicos y es uno de los principales mecanismos de
resistencia de bacterias patógenas a diferentes clases de antibióticos. Este tipo de mecanismo se ha reportado para S. aureus frente a el PAM tPMP-139.
3.6. Péptidos antimicrobianos de anfibios
3.6.1. Estructura de las glándulas granulares o serosas
La estructura de la piel de los anfibios les confiere unas características especiales comparadas con otros animales. De forma general, la piel está compuesta por dos capas: la epidermis y la dermis. En la epidermis o “stratum corneum” se encuentran localizadas varias capas de células encargadas del revestimiento; en la dermis (capa interna) se localizan diferentes estructuras importantes como las glándulas mucosas encargadas del equilibrio osmótico y respiración (evitan la desecación)35. Las glándulas granulares neuroendocrinas (Figura 2) sintetizan y almacenan componentes con actividad biológica entre ellos los PAM que tienen función de defensa contra microorganismos y grandes depredadores47. El contenido de estos péptidos puede ser liberado por estrés, estimulación adrenérgica o cualquier herida, la liberación ocurre en la superficie de la piel de las ranas. En la dermis también se encuentran los cromatóforos y el estrato compacto35,38.
Figura 2. Sección dorsal de piel de Rana esculenta teñida con haematoxilina-eosina. 1)
Epidermis, 2) Cromátoforo, 3) glándula granular o serosas, 4) glándula mucosa (Tomado de 35).
Las glándulas granulares son controladas por un mecanismo neurológico simpático de axones con terminaciones en el intersticio entre el mioepitelio y las
1
3
2
unidades secretoras. Estas unidades son intradérmicas y formadas por células sincitiales. En los anuros el citoplasma de las glándulas serosas es rico en gránulos y el lumen esta reducido a una pequeña y vacía cavidad. La contracción de los miocitos que rodean las glándulas causa una descarga sincronizada de su contenido por un mecanismo de tipo holocrino, además de liberación de fragmentos de citoplasma35.
3.6.2. Estructura génica de los PAM de anfibios
El grado de polimorfismo de los PAM está asociado con la actividad antimicrobiana que se requiera para el desarrollo de un anfibio en un entorno específico.
El patrón diversificante del locus de los péptidos antimicrobianos puede ser parte de una estrategia evolutiva desarrollada por los anfibios como resultado del cambio a nuevos nichos ecológicos donde los agentes depredadores en este caso los microorganismos tienen una tasa de mutación y cambio muy rápida. Este tipo de selección diversificante es similar a la que ocurre en otro genes relacionados con la inmunidad adquirida48.
Además, se ha determinado que la organización de las secuencias precursoras de PAM tiene componentes característicos que son: una pre-proregión N-terminal común, que es altamente conservada (incluso entre especies y familias), seguida por un dominio C-terminal con diferencias marcadas que corresponde al péptido maduro (Figura 3). La pre-proregión conservada se compone del péptido señal de 22 residuos, seguido por 16-25 residuos de la propieza ácida que termina con una típica señal procesadora Lisina-Arginina. La alta similitud de las pre-proregiones de precursores que dan origen a péptidos antimicrobianos muy diversos y en diferentes especies de ranas sugiere que esos genes pertenecen a una familia multigénica originada a partir de un ancestro común 49,50.
Figura 3. A) Esquema del gen codificante (ARNm) de Dermaseptina S de Phyllomedusa sauvegi. Se compone de una región conservada entre péptidos de diferentes familias, compuesta por el péptido señal (contenida en el primer exón) y la propieza ácida (contenida en el segundo exón). El péptido antimicrobiano se localiza en el segundo exón y es altamente variable, cuando se almacena en la glándula granular se separa de la señal péptidica. B) alineamiento de las secuencias aminoácidos obtenidos a partir de ADNc para las Dermaseptinas S1, S6, S8, S11, S12, S13 , S10 y S9 de piel de
Phyllomedusa sauvegi (Tomado y editado de 51).
De forma similar a lo que ocurre en otros PAM de origen animal, en los anfibios son sintetizados como largos productos inactivos que después se convierten en un producto final, por un proceso de clivaje proteolítico. Se ha demostrado que los PAM originados en las glándulas granulares del género Rana y Bombina son inducibles ya que se expresan en respuesta a exposiciones con microorganismos, además se ha demostrado que sus regiones promotoras están reguladas por
NF-kB/Ik Bα los cuales están altamente conservados a lo largo de los diferentes phyla desde insectos hasta mamíferos52.
3.7. Obtención de secreciones de piel de ranas in vivo
Las dos formas más utilizadas para obtener secreciones de piel de ranas son la electroestimulación2,3 y la estimulación adrenérgica por medio de inyección subcutánea53 para la liberación artificial del contenido de las glándulas a la superficie de la piel. Por ejemplo, utilizando inyección de norepinefrina en experimentos con Xenopus laevis se encontró que a mayor estimulación, mayor
cantidad de recuperación de péptidos54.Según estos autores, la recuperación y producción de PAM puede variar entre una y seis semanas dependiendo del método utilizado y la cantidad de estímulo recibido por la rana. Actualmente estás dos metodologías son las más utilizadas para la obtención de secreciones de piel de rana y su caracterización bioquímica.Sin embargo, para la confirmación de PAM y estudios genómicos es necesario sacrificar el espécimen.
3.8. Obtención de secreciones in vitro
3.8.1 Cultivo de micro-órganos y sus propiedades
Se ha observado que las interacciones específicas entre las células epiteliales y el estroma, además de ser conservadas a través de la evolución, son críticas en la determinación de la apropiada proliferación, diferenciación y función de cada tejido epitelial. Se ha demostrado que fragmentos de órgano mantenidos in vitro que mantengan un grosor (150 µm distancia entre células y medio de cultivo) que permita que estas interacciones se mantengan, presentan una función normal del órgano y fueron denominados como micro-órganos (MOs)10. En general, los MOs pueden permanecer viables por varios meses y cumplir con las funciones celulares del órgano del que son derivados. Por ejemplo, transcribir genes específicos, llevar a cabo funciones metabólicas, mantener la proliferación celular del tejido55,56 y capacidad de secretar proteínas al medio de cultivo57. Por otro lado, se adaptó la tecnología de cultivo de MOs de piel de rana para estudiar la actividad de las secreciones obtenidas in vitro. Se encontró que comparado con las secreciones obtenidas in vivo con inyección de norepinefrina las secreciones del cultivo de MOs fueron más activas contra diferentes bacterias. Además, para estudios tanto bioquímicos como genómicos se pueden utilizar las secreciones y los MOs almacenados en el banco de sustancias y tejido9.
3.9. Estrategias para identificación de péptidos
Para la identificación y caracterización de proteínas en mezclas complejas se han utilizado estrategias con tecnologías de alta resolución para la separación, entre ellas espectrometría de masas, geles de electroforesis 2D (Two Dimensional Electrophoresis), digestión con tripsina, fragmentación y secuenciación de
proteínas utilizando MS/MS (Tandem Mass Espectrometry) y posterior identificación interrogando bases de datos58. La peptidómica, por su parte es una disciplina derivada que recoge los principios básicos de la proteómica y está enfocada en la caracterización de péptidos de bajo peso molecular. Esta no requiere protocolos de fragmentación antes del análisis por MS, pero además difiere en que la separación inicial se realiza por 2D-HPLC (Two Dimensional High Performance Liquid Cromatography) en lugar de gel de electroforesis 2D. Sin embargo, una de las limitantes de estas técnicas es que se necesita cantidad considerable de muestra y no son eficientes en organismos con poca información en las bases de datos59.
Con el fin de superar estas limitantes, se empezaron a utilizar técnicas como: MS acoplada con sistemas acuosos como cromatografía líquida a nanoescala (nano Liquid Cromathography), ionización por electrospray (Electrospray Ionización, ESI) y el láser matriz asistida desorción/ionización (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization , MALDI) 59.
En el caso de identificación de PAM en secreciones de ranas se han integrado técnicas moleculares utilizando ADNc, nano UPLC MS/MS (Ultra Performance Liquid Chromatography) que permite la integración de tecnologías moleculares en ausencia de información en las bases de datos60. Ésta técnica requiere de nanogramos a picogramos de secreciones para un completo análisis, lo cual indica que con la secreción de una sola rana es posible hacer todo el estudio. Este punto no solo simplifica considerablemente el análisis sino además protege de una manera significativa a la biodiversidad del hábitat natural ocupado por estos animales.
4.Objetivo General
• Identificar nuevos péptidos antimicrobianos a partir de secreciones de piel de ranas y caracterizar su actividad biológica.
4.1.Objetivos Específicos
-Determinar la actividad antibacteriana de los medios condicionados obtenidos de micro-órganos de piel de ranas contra bacterias de interés clínico.
-Evaluar la actividad citotóxica de los medios condicionados de ranas en células somáticas.
-Evaluar la expresión del gen dermaseptina B4 en los cultivos de micro-órganos .de una especie para la cual se haya reportado previamente este gen.
-Determinar la actividad antiviral de los medios condicionados contra el virus de la fiebre amarilla.
-Identificar precursores génicos de péptidos antimicrobianos a partir de micro-órganos de las ranas con mejor actividad antimicrobiana.
-Identificar péptidos antimicrobianos con herramientas proteómicas y bioinformáticas de las secreciones de las especies con potente actividad antimicrobiana.
-Evaluar la actividad biológica de los candidatos identificados.
-Determinar las propiedades biofísicas de los candidatos con mejor actividad biológica.
5. Capítulo 1
Los micro-órganos de piel de ranas secretan potentes agentes antimicrobianos en cultivo.
Los resultados de la primera parte del trabajo quedaron consignados en la siguiente publicación: Skin micro-organs from several frog species secrete a repertoire of powerful antimicrobials in culture, Journal of antibiotics, 2012.
5.1 Resumen
En este artículo se describe la implementación de la técnica de cultivo de MOs para la obtención de secreciones de piel de ranas. Se muestra que la estructura histológica de la piel de las ranas permanece intacta en los MOs y que se mantienen la secreción de sustancias con potente actividad antibacteriana. Nuestra estrategia fue crear un banco de secreciones de piel de ranas de diferentes especies, denominadas como medios condicionados. Este banco está conformado por los medios condicionados de alrededor de 50 especies, algunas de ellas de particular interés por ser endémicas y otras por estar en peligro de desaparecer. Finalmente, mostramos los resultados antibacterianos de los medios condicionados de las especies más potentes sin que presenten toxicidad contra células somáticas.
ORIGINAL ARTICLE
Skin micro-organs from several frog species secrete
a repertoire of powerful antimicrobials in culture
Helena Groot1, Carolina Mun˜oz-Camargo1, Johanna Moscoso1, Gina Riveros1, Vivian Salazar1, Franz Kaston Florez2 and Eduardo Mitrani3
This work is an attempt to take advantage of the rich biodiversity that exists in Colombia in order to start a systematic analysis of antimicrobial substances that have emerged through amphibian evolution. For this purpose we have developed a technique to grow intact frog skin derived micro-organs (SMOs)in vitroin the absence of serum. We show that in SMOs, the skin glands remain intact and continue to secrete into the medium substances with potent antibacterial activity, for several days in culture. Our strategy has been to create a bank of substances secreted by amphibian skin from different species. This bank contains at present around 50 species and is of particular importance as some of the species are in danger of disappearing. We show that some of the species tested displayed very strong antibacterial activity without being toxic to somatic cell lines, even at 10-fold higher concentration.
The Journal of Antibioticsadvance online publication, 4 July 2012; doi:10.1038/ja.2012.50 Keywords: antibacterial activity; frog secretions; gene expression; skin culture
INTRODUCTION
In spite of significant advances in molecular biology, more than 40% of compounds used by modern medicine are derived from nature. In certain areas, such as antimicrobials, anticancer, antihypertensive and anti-inflammatory drugs, the numbers are even higher and constitute about 75% of the total.1,2Frogs and toads have developed a successful
strategy for surviving microbe-laden hostile environments, which rely heavily on the secretion of chemical cocktails from specialized skin glands.3 These secretions not only produce large amounts of biologically active peptides that are similar to mammalian neuropeptides and hormones, but they also contain a rich arsenal of broad-spectrum, cytolytic antimicrobial peptides.4,5 Their high
degree of chemical complexity is evidenced by the fact that they contain proteins, peptides, biogenic amines, alkaloids and other as yet uncharacterized biochemicals. Interestingly, peptides have o5 kDa molecular mass are the predominant molecules in the secretions of many frogs,6Five thousand living anuran frog species may produce
about 100 000 different antimicrobial peptides. Colombia hasB10% of the world’s biodiversity with more than 700 amphibian species representing a ‘natural treasure trove’ for novel discovery.7,8
We have adapted the micro-organ (MO) technology to study the
in vitrosecretions of frog skin derived MOs (SMOs) in serum-free defined-media. The technology is based on the fact that preservation of the basic epithelial–mesenchymal interactions allows for highly complexex vivofunction of epidermal cells. The approach is based on the preparation of organ fragments that preserve the basic
microenvironment encountered by epithelial cells in vivo but with geometry and dimensions that ensure appropriate diffusion of nutrients and gases to all cells in culture.9,10 Such fragments have
been termed MOs to distinguish them from other tissue fragments that do not encompass the true organ structure.9,11,12
In the present work we report the collection and initial character-ization of activities of frogs collected from highly varied habitats of Colombia. In addition we have collected DNA and RNA samples from each species for our records and for further analysis. We have obtained both in vivo and in vitro secretions and we further show that MOs prepared from frog skin (SMOs) can be successfully cultured for several daysin vitro. During that period the frog SMOs secrete into the serum-free medium a whole repertoire of substances with powerful broad-spectrum antibacterial activities. Activities obtained fromin vitro secretions were found, in most cases and the same concentrations, to be higher per gram of tissue than the actual secretions in vivo. More importantly, these active secretions were found not to be toxic to somatic cells even at 10-fold higher concentrations. We also confirmed that frog SMOs transcribe house-keeping genes when cultured for several days in serum-free medium.
MATERIALS AND METHODS Frogs specimens
We have created a bank of skin secretions from 50 species of frogs collected from different regions of Colombia including the Guajira, upper Magdalena Valley, Amazone region, Andes piedmont and at the base of the eastern
1Laboratory of Human Genetics, Department of Biological Sciences, Universidad de los Andes, Bogota´, Colombia;2Fundacio´n Nativa, Bogota´ D.C., Colombia and3Institute of
Life Sciences, Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem, Israel
Correspondence: Professor E Mitrani, Institute of Life Sciences, Hebrew University of Jerusalem, Silverman Building, Room 3-524, Givat Ram, Jerusalem 91904, Israel.
The Journal of Antibiotics (2012) 00,1–7
&2012 Japan Antibiotics Research Association All rights reserved 0021-8820/12
mountain range. Some of the species examined include:Hypsiboas lanciformis, Sphaenorhynchus lacteus, Hypsiboas boans, Dendrobates truncatus and Pipa pipa. The frogs were kept alive in a purpose-built amphibian facility at 25±11C under a 12-h light/dark cycle and fed with fruit flies three times per week.13All procedures involving frogs adhered to resolution 008430 of the
Ministry of Health for the use of animals in research and the guidelines of the ethical committee on animal research from the Andes University. All captures were performed under the collection license No. 2 of the 20th of January 2009, from the Ministerio de Medio Ambiente, Colombia.
In vivofrog skin secretions
In vivo skin secretions were obtained from dorso-lateral skin folds by first washing the live animals with sterile distilled water and then were softly dried. This washing was followed by a s.c. injection of 70ml (10mg ml1) of
norepinephrine3per gram of animal weigh. Four minutes after injection, the
secretions were collected by washing the frog with 1 ml cm2 of skin of a
solution containing 70% Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 30% H2O, over a period of 10 min and the solution obtained was then aliquoted and stored frozen at801C before analysis.
Frog skin MOs
Adult specimens were anesthetized and killed applying 100 mg MS222 (3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate salt, Sigma), directly to the tongue. Skin were removed immediately after the animals were killed and washed twice for 30 min with 70% DMEM supplemented with penicillin (1000 IU ml1), streptomycin (1000 IU ml1) and fungizone (1mg ml1). Skin
fragments from dorsal and ventral regions were cut into 4 mm width and 30 mm length flaps, and then transverse sectioned under sterile conditions parallel to the shortest dimension every 300 mm using a Mc Ilwain Tissue Chopper (Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA). The SMOs obtained (4 mm long 0.3 mm wide) were washed five times for 10 min with 70% DMEM supplemented with penicillin (1000 IU ml1)/streptomycin (1000 IU ml1)
and fungizone (1mg ml1), and then twice for 10 min in 70% DMEM
containing no antibiotics, nor antimycotic agents. Finally, 40 SMOs (0.5 cm2
of skin equivalent) were cultured per well in 500ml of serum-free 70% DMEM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). No exogenous growth factors were added to the medium. The cultures were kept at 261C in 5% CO2, in 24-well plates.9
Frog skin secretions
The media in which the SMOs were maintained in culture, denoted as conditioned media (CM), contained thein vitrosecretions derived from frog skin. The CM was collected every day and replaced by the same volume of fresh 70% DMEM. Medium collected at days 1, 2 and 3 were filtered (0.2mm pore size) and labeled CM1, CM2 and CM3, respectively, aliquoted and stored at 801C until required. Total concentration of skin peptides in each CM ranged between 300mg and 600mg ml1of CM, and was determined using a
nanodrop 2000 with the protocol of A205 custom method for protein and peptide quantification (Thermo Scientific, Austin, TX, USA). Also, we used bradykinin (RPPGFSPFR) (Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) to establish a standard curve.14
Histology
Histology was done by preparing 8 mm thick paraffin sections. SMOs were fixed for 30 min in phosphate buffered solution containing 4% paraformalde-hyde, rinsed, dehydrated and embedded in paraffin. Staining was done with hematoxylin/eosin according to routine histological methods.15
Antibacterial assay
The antibacterial activities of frog skin secretions were tested using growth inhibition assays against human pathogenic bacteria. Colonies of Staphylococ-cus aureus,Escherichia coli,Salmonella sp. andEnterobacter cloacae(all isolated from clinical cases) were selected from agar and incubated overnight at 371C on BHI media (Brain Heart Infusion). Following incubation, the bacterial
inoculum for the growth inhibition assay, plated in 96-well microtiter plates plus increasing amounts (0, 5 and 25% of CM. A total volume of 100ml was obtained by adding the required volume of 70% DMEM. The positive control wells received SMO culture media (serum-free 70% DMEM (Sigma-Aldrich) instead of CM and negative control wells received 2mg ml1of ampicillin.13
Each test was performed in duplicate for each experimental condition. Plates were incubated at 371C and the OD595was read at three different time points:
6, 8 and 24 h.
Growth inhibition was calculated using the following formula ((positive control ODsample OD)/(positive control OD))100 and expressed as a percentage.13
Cell culture
The cell lines used for the cytotoxicity of the CM, wereCricetulus griseusovary chinese hamster cells (CHO-K1 cell line ATCC CCL-61, ATCC, Manassas, VA, USA),Canis familiarisMadin-Darby canine kidney (MDCK cell line ATCC CCL-34) andCercopithecus aethiopsAfrican monkey kidney cells (COS-7cell line ATCC CRL-1651), respectively. The CHO-K1 cell line was grown as a monolayer culture in RPMI 1640 medium and MDCK and COS-7 in DMEM. Both media were supplemented with 10% FBS, (100 IU ml1)/streptomycin
(100 IU ml1) and fungizone (1mg ml1). The cultures were maintained at
371C in a humidified 5% CO2atmosphere.
Cytotoxicity assay
Cell toxicity was monitored by determining the effect of the CM dilution (10 and 50%) on cell viability. Each CM dilution was made by diluting the collected CM with culture medium and added it to confluent CHO-K1 cell monolayers (3105cells per ml) in flat-bottomed, 96-well, microtiter tray.
The cells with the CM dilutions were incubated at 371C in humidified 5% CO2 for 48 h.
The cytotoxicity was determined by colorimetric methods based on the reduction of tetrazolium salts by viable cells (MTT assay).16
Briefly, 10ml of MTT solution (2 mg ml1 phosphate buffered saline
solution) were added to each well of the microtiter tray after 48 h of incubation. The tray was then incubated at 371C for 4 h more. To dissolve the formazan crystals, 70ml of dimethylsulphoxide was added to each well. After shaking the tray for 10 min, whereby formazan crystals were completely dissolved, the absorbance of the wells was read in a computer-controlled microplate reader (Bio-Rad, Philadelphia, PA, USA) at 595 nm. The percentage of viable treated cells was calculated in relation to untreated controls (viability percentage¼OD-treated cells/OD control cells100%). The untreated control was taken as 100%.
RT-PCR analysis
For each sample, total RNA was extracted from five equal-sized SMOs, with acid-guanidine and phenol as described,17and reverse-transcribed (Promega
Corporation, Madison, WI, USA). RT-PCR was done by running parallel reactions for each set of primers. Dermaseptin B4 primers were designed based on the published sequence ofPhyllomedusa bicolor.18
Primer sets were as follows:
b-actin 50-CGGAACCGCTCATTGCC-30 50-ACCACAACTGTGCCCATCTA-30
Dermaseptin B4 50-GACCAGACATGGCTTTCCT-30 50-TTGCTCCCTTGATTTCCA-30
PCR products obtained were gel-purified, and sequenced using an ABI Prism 310 automated sequencer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). The sequence obtained was subjected to homology search using the BLAST tool available at the NCBI database.
Statistical analysis
Shapiro–Wilk normality tests were performed on all data and one-way analysis of variances were applied after the distributions of data were found to meet the assumptions for parametric tests. Student’st-tests were used to compare the significance of growth inhibition and Tukey tests were used to compare significance of cytotoxicity effects. All statistics were performed using the Frog skin micro-organs secrete antimicrobials
H Grootet al
RESULTS
XenopusSMOs remain viable for several days in culture
As a first step we usedXenopus laevisas a source of SMOs. We found thatXenopusSMOs remain viable for at least 1 weekin vitrowhen cultured in 70% DMEM in the absence of serum at 261C and 5%
CO2. Figure 1a shows one SMO stained with MTT (right) as
compared with an unstained SMO on the left after 8 days in culture. Figures 1b and c show standard hematoxilin eosin 8mm histology sections of Xenopus SMOs after 8 days in culture at different magnifications, to indicate that both the epidermis remains stratified and the glands retain their intact architecture.
Frog skin secretes antibacterial substances for several days when cultured as SMOs in serum-free mediumin vitro
In order to determine whether frog-derived SMOs secrete into the medium antibacterial activity, CM obtained as described in the methods section was tested against four strains of bacteria:S. aureus,
Salmonella sp.,E. cloacaeandE. coli. For each assay thein vivoskin secretions from each species was also collected as described above and tested in parallel to thein vitrosecretions. In some cases as the one shown in Figure 2, CM was more powerful than thein vivosecretion. In others (Figure 3), a more similar pattern of activity was observed from thein vivosecretions as compared with thein vitrosecretions. SMO cultures have been prepared from all species collected and CM has been systematically tested against the four bacterial strains as described in the previous section. On the whole, antibacterial activity was found in all species tested. Some of the species that showed more powerful antibacterial activities were tested further for their effect on somatic cell lines.
Figure 2Comparison of antibacterial activity fromin vivo(IV) (a) whole skin
secretions and (b) SMOs in vitro secretion of Sphaenorhynchus lacteus. Bacterial growth control—no CM added—(solid bar), increasing amounts of CM 5% (light bar) and 25% (gray bar) of CM. The data are presented as the mean of two replicate samples from two independent experiments. *Po0.05.
Frog skin micro-organs secrete antimicrobials H Grootet al
Secretions from SMOs in culture are not toxic to somatic cell lines even at 10-fold higher concentrations
As mentioned earlier, the major obstacle to the use of peptide-based anti-infective agents as useful drugs is their toxicities, particularly if they are to be administered systemically.19We were therefore interested
to determine the toxicity of in culture secretions of frog SMOs. To that extent CM from the same species were tested in parallel against three different vertebrate somatic cell lines: CHO-K1, COS-7 and MDCK. As shown in Figure 4, CM taken after 2 days (CM2 (A)) from SMO cultures ofH. boansinhibited bacterial activity even when only 5% of CM was added to the test system. Yet, as shown in Figure 4b CM2 even at a concentration 10 times higher was found to have no effect on cell growth of any of the cell lines tested. Similarly CM4 (data not shown) from the same species was found not to inhibit cell growth of the CHO-K1 cell line, but had a roughly 50% decrease in the number of COS-7 and MDCK cells as compared with untreated controls. Figure 5 shows that CM obtained from SMOs derived from D. truncatusafter 3 days in culture (CM3) (Figure 5a) inhibited bacterial activity in a dose-dependent manner. Yet no effect was observed with a 50% concentration of the same conditioned medium (CM3) in the viability of any of the somatic cell lines tested (Figure 5b). Comparison of Figures 6a and b show that CM obtained fromP. pipaafter 1 day in culture (Figure 6a) had a powerful antibacterial activity. This activity was found not only not to be toxic to the somatic cell lines tested but also to be stimulatory to MDCK cells (Figure 6b).
SMOs fromP. bicolortranscribe a dermaseptin gene
We were particularly interested in determining if the frog-derived
and in order to obtain a measure of integrity and viability of the cultures, SMO samples obtained fromP. bicolor.,S. lacteus,H. boans
andD. truncatus(data not shown), were cultured as described above, samples removed every 24 h and total RNA prepared. Viability was confirmed by the integrity of the RNA during 1 week in culture. All four species transcribed at steady levels the housekeeping gene actin for the whole culture period of 6 days (data not shown). Furthermore, Figure 7 shows that SMO cultures continue to transcribe mRNAs at sustained levels for a whole weekin vitro.
Using primers directed to highly conserved regions of Dermaseptin B4, bands were amplified, as expected, from SMOs derived from
P. bicolor.Interestingly, a band was also amplified in samples obtained fromS. lacteus. The identities of the bands obtained were confirmed by sequencing. Sequences from both species showed 98% identity on the conserved region. The sequence of the variable region obtained from P. bicolor was found to be 93% similar both in size and in sequence to those reported for the Phyllomedusinae subfamily as expected. However, the variable region obtained fromS. lacteuswas found to be considerably shorter and only 49% similar to that of the Phyllomedusinae subfamily (data not shown).
Patterns of bacterial inhibition do not seem to be related to specific habitats
Activities of the different species tested have been summarized in Table 1. The table shows concentration of conditioned medium required to bring about 50% inhibition of bacterial cell growth (bacterial inhibition LD50). Antibacterial activities are organized in
Table 1 by species and their habitat and site of origin. No specific
Figure 3Comparison of antibacterial activity fromin vivo(IV) (a) whole skin
secretions and (b) SMOsin vitrosecretion CM taken 1 day after culture of
Hypsiboas lanciformis. Bacterial growth control—no CM added—(solid bar), increasing amounts of CM 5% (light bar) and 25% (gray bar) of CM. The data are presented as the mean of two replicate samples from two independent experiments. *Po0.05, **Po0.001.
Figure 4 Secretion from SMOs ofHypsiboas boans (a) inhibited bacterial
activity, CM obtained after 2 days, (b) with virtually no effect (CM2) on cell viability. Bacterial growth control—no CM added—(solid bar), increasing amounts of CM 5% (light bar and 25% (gray bar) of CM in antibacterial assays, 10% (light bar) and 50% (gray bar) in cytotoxic assays. The data are presented as the mean of two replicate samples from two independent experiments. **Po0.001.
Frog skin micro-organs secrete antimicrobials H Grootet al
example, CM1 ofH. lanciformisfound in Leticia (Amazon) displayed an LD50of 5% inS. aureusandsalmonellaand of 25% inE. Cloacae.
Yet, 70% CM1 was required to bring about the same level of inhibition inE. coli. In contrast, a CM1 concentration of 35% was required from Hypsiboas hobssi, found in the same habitat as
H. lanciformisin order to achieve the same LD50in all four bacterial
species tested. CM1 derived from cultures of Scinax cruentommus
obtained from the same area on the Amazon basin was found to have a much weaker antibacterial activity on all bacterial species tested (data not shown). If we now look at species collected in other different and varied habitats we see that some likeCentrolene sp. were highly active in all species tested whileScinax rubershowed varied but generally lower activities. Only 5% of CM3 ofD. truncatus(from the same habitat) was required for an LD50for three of the species tested,
and more than 70% was required to bring about the same LD50in
E. cloacae.In contrast,P. pipaobtained in Leticia (Amazon) displayed high activity forS. aureus andE. cloacae, and intermediate activity againstSalmonellaand againstE. coli(see Table 1). Clearly, there does not seem to be any specific pattern that assigns specific activities to certain habitats.
DISCUSSION
We have shown in the past that preservation of the epithelial– mesenchymal interactions in mammalian SMOs allows keratinocytes to continue to proliferate, and to transcribe epidermal-specific genes for long periods when cultured in defined medium in the absence of serum or exogenous factors.9,12 SMOs were found to retain those properties irrespective of whether they were derived from new born or
the present work we show that in frog-derived SMOs, not only do epidermal cells continue to transcribe housekeeping and tissue-specific genes, but also that whole secretory glands remain functional for several days in culture. In fact we show that secretions from frog SMOs in culture were, in several cases, more powerful antibacterial agents than those obtained from in vivo secretions. These results taken together indicate that frog SMO culture can provide a powerful method to identify secretory molecules from frog skin. As the SMOs act as bioreactors, the amount of secretion that can be obtained per animal is amplified thus minimizing the number of specimens required for the characterization process.
Our strategy has been first to create a bank of substances secreted by amphibian skin from a variety species living in far and varied habitats of Colombia. This bank is of particular importance as some of the species are in danger of disappearing. It is has been suggested that every species harbors a unique, specific collection of antimicro-bial peptides, tuned to defend the organism against microorganisms that it is likely to encounter.13
As shown in Table 1, we do not seem to find any specific pattern, which assigns specific activities to certain habitats. In fact what seems to be the case is the opposite. On second thoughts, this may be understood on the bases that the habitats visited are extremely rich in microbial diversity. Around 8000 species of prokaryotes have been described but they form only a very small fraction of the true diversity.20Techniques based on analysis of environmental DNA let to
suggest that the total number of species of bacteria (as based on the current broad species definition) may be in the order of 109–1012.21
Thus, it is unlikely that amphibian species have become specialized
Figure 5Secretions from SMOs of Dendrobates truncatusCM3 (a) inhibit
bacterial in a dose-dependent manner and (b) are not toxic to somatic cell lines. Antibacterial assay—no CM3 added—(solid bar), increasing amounts of CM3 5% (light bar) and 25% (gray bar). Cytotoxic assays: 10% of CM3 (light bar), 50% of CM3 (gray bar). The data are presented as the mean of two replicate samples from two independent experiments. **Po0.001.
Figure 6 Secretions from SMOs ofPipa pipa(a) inhibited bacterial activity
while at the same time (b) stimulated growth of MDCK cells in culture. CM was taken after first day of SMO culture (CM1). Antibacterial assay: no CM1 added (solid bar), increasing amounts of CM1: 5% (light bar) and 25% (gray bar). Cytotoxic assay: 10% of CM1 (light bar), 50% of CM3 (gray bar). The data are presented as the mean of two replicate samples from two independent experiments. *Po0.05, **Po0.01.
Frog skin micro-organs secrete antimicrobials H Grootet al
