36+37 PRUEBAS BQ I MetabHidroc

(1)

PRUEBAS BIOQUÍMICAS I

METABOLISMO

HIDROCARBONADO

IES Miguel de Cervantes IES Miguel de Cervantes Laboratorio de Diagnóstico Clínico Laboratorio de Diagnóstico Clínico Fundamentos y Técnicas de Análisis Microbiológicos Fundamentos y Técnicas de Análisis Microbiológicos Profesor: José Ángel Pina Alburquerque Profesor: José Ángel Pina Alburquerque

(2)

METABOLISMO

 Conjunto de reacciones químicas que tienen _{Conjunto de reacciones químicas que tienen}

(3)

METABOLISMO: Clasificación



FUENTE DE CARBONO:

_{FUENTE DE CARBONO:}

 Bacterias autótrofasBacterias autótrofas

 Bacterias heterótrofas.Bacterias heterótrofas.



FUENTE DE ENERGÍA:

_{FUENTE DE ENERGÍA:}

 Bacterias fototrofasBacterias fototrofas

(4)

(5)

METABOLISMO:



CATABOLISMO:

_CATABOLISMO:

 Degradación: Moléculas mayores a menores.Degradación: Moléculas mayores a menores.

 Producción de energía (ATP).Producción de energía (ATP).



ANABOLISMO:

_ANABOLISMO:

 Síntesis de moléculas mayores a partir de Síntesis de moléculas mayores a partir de

otras menores (biosíntesis). otras menores (biosíntesis).

 Precisan aporte de energía (ATP).Precisan aporte de energía (ATP).

(6)

(7)

Ir a DP 14

Ir a DP 21

(8)

METABOLISMO

 RUTA BIOQUÍMICA: Serie de reacciones _{RUTA BIOQUÍMICA: Serie de reacciones}

químicas

químicas catalizadascatalizadas enzimáticamenteenzimáticamente que que tienen lugar en una célula.

(9)

Recuerda:



CATALIZADOR

_CATALIZADOR

: Sustancia que puede

_{: Sustancia que puede}

acelerar una reacción química, sin sufrir

ella misma modificaciones.



ENZIMA

_ENZIMA

: Proteínas que actúan como

_{: Proteínas que actúan como}

catalizadores biológicos en los seres

vivos. Cada enzima actúa

específicamente sobre un sustrato que se

(10)

CATABOLISMO DE HIDRATOS

DE CARBONO



Oxidación de azúcares para la obtención

_{Oxidación de azúcares para la obtención}

de la

energía

necesaria para la vida

celular.



La

_La

glucosa

_glucosa

es el hidrato de carbono más

_{es el hidrato de carbono más}

utilizado.



Dos mecanismos:

• Respiración

_Respiración

(11)

CATABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO

 Glucólisis o ruta de Embdem-Meyerhof_{Glucólisis o ruta de Embdem-Meyerhof}  Ruta de las pentosas fosfato_{Ruta de las pentosas fosfato}

 Ruta de Entner-Doudorof_{Ruta de Entner-Doudorof}  Respiración aeróbica: _{Respiración aeróbica:}

 C.A.T. o Ciclo de KrebsC.A.T. o Ciclo de Krebs

 Cadena de transporte de electronesCadena de transporte de electrones  Respiración anaeróbica_{Respiración anaeróbica}

 Fermentación._{Fermentación.}  LácticaLáctica

(12)

GLUCOLISIS



Glucosa (6C) 2 Ac. Pirúvico (3C)

_{Glucosa (6C) 2 Ac. Pirúvico (3C)}



Se reducen 2 NAD

++

2 ₂

NADH

_NADH

2



Se producen 2 ATP

_{Se producen 2 ATP}

(13)

GLUCOLISIS:

GLU 2 PIR

2 ADP 2 ATP

2 NAD

2 NAD++ 2 NADH_{2 NADH} 2

2

(Volver a DP 28

(14)

RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO

 Se pueden _{Se pueden}oxidar pentosas_{oxidar pentosas} (procedentes de _{(procedentes de}

ácidos nucleicos, ATP, NAD, etc.) hasta

ácidos nucleicos, ATP, NAD, etc.) hasta fructosa- fructosa-6-P y gliceraldehido-3-P

6-P y gliceraldehido-3-P que terminan de que terminan de oxidarse en la glucólisis.

oxidarse en la glucólisis.

 Los _Losintermediarios_{intermediarios} de esta vía se utilizan para _{de esta vía se utilizan para}

síntesis

síntesis de ácidos nucleicos, síntesis de glucosa de ácidos nucleicos, síntesis de glucosa

en la fotosíntesis y algunos aminoácidos. en la fotosíntesis y algunos aminoácidos.

 Muchas bacterias oxidan la glucosa por esta vía _{Muchas bacterias oxidan la glucosa por esta vía}

además de por la glucólisis: Por transformación además de por la glucólisis: Por transformación

previa de la glucosa en pentosas:

previa de la glucosa en pentosas: Vía del Vía del fosfogluconato

(15)

RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO

(16)

RUTA DEL FOSFOGLUCONATO

(17)

RUTA DE ENTNER-DOUDOROF



Es una vía

alternativa a la

glucólisis y

pentosas-fosfato.



Solo algunos

microorganismos

gram negativos la

poseen:

 PseudomonasPseudomonas

(18)

C.A.T. y RESPIRACIÓN

 _{El Ac. Pirúvico}_{El Ac. Pirúvico}_{(procedente de la glucosa)}_{(procedente de la glucosa)}_{se termina de}_{se termina de}

oxidar en el C.A.T. completamente hasta CO

oxidar en el C.A.T. completamente hasta CO₂₂ y y H

H₂₂OO

 Se genera ATP por fosforilación oxidativa._{Se genera ATP por fosforilación oxidativa.}  _{Funciona una cadena transportadora de}_{Funciona una cadena transportadora de}

electrones desde los coenzimas reducidos electrones desde los coenzimas reducidos (NADH, NADPH, FAD) hasta una molécula (NADH, NADPH, FAD) hasta una molécula

inorgánica que puede ser: inorgánica que puede ser:

 Respiración AeróbicaRespiración Aeróbica: Aceptor terminal de electrones : Aceptor terminal de electrones

es el Oxígeno. es el Oxígeno.

(19)

RESPIRACIÓN AERÓBICA

1.

1. Las dos moléculas de PIRÚVICO que provienen Las dos moléculas de PIRÚVICO que provienen

de una de glucosa entran en el

de una de glucosa entran en el Ciclo de KrebsCiclo de Krebs donde se forman los nucleótidos reducidos.

donde se forman los nucleótidos reducidos.

2.

2. Los nucleótidos reducidos se oxidan de nuevo Los nucleótidos reducidos se oxidan de nuevo

cediendo electrones a una

cediendo electrones a una CADENA DE CADENA DE TRANPORTE DE ELECTRONES (o respiratoria)

TRANPORTE DE ELECTRONES (o respiratoria)

donde se produce ATP. donde se produce ATP.

3.

3. EL OXIGENO es el aceptor final de EL OXIGENO es el aceptor final de

electrones en la cadena respiratoria.

(20)

Ciclo de Krebs o C.A.T.



Ac. Pirúvico Acetíl-CoA

_{Ac. Pirúvico Acetíl-CoA}



El Acetil-CoA entra en el C.A.T.

_{El Acetil-CoA entra en el C.A.T.}



En el CAT se forman los coenzimas o

_{En el CAT se forman los coenzimas o}

nucleótidos reducidos (NADH y FADH)

que luego se oxidan en la cadena de

transporte de electrones.



Los tres átomos de carbono del pirúvico

_{Los tres átomos de carbono del pirúvico}

salen como CO

(21)

 _{CICLO DE}_{CICLO DE}

KREBS : KREBS :

 COCO₂₂

 CoEnz. _CoEnz.

Reducidos Reducidos

 _{Productos in}_{Productos in}

termedios

(22)

CICLO DE KREBS CICLO DE KREBS

(observar C en marrón a CO

(observar C en marrón a CO₂₂)) Balance energético:

(23)

Cadena de transporte de electrones

 _{Procariotas: En membrana plasmática.}_{Procariotas: En membrana plasmática.}

 _{Eucariotas: En membrana interna de las mitocondrias.}_{Eucariotas: En membrana interna de las mitocondrias.}

(24)

Cadena de transporte de electrones



Balance final desde glucosa hasta CO

₂₂

,

mediante glucolisis, CAT y Cadena Tr. e

-

- CC

6

6HH1212OO66 + O + O22 + 38 ADP + 38 P + 38 ADP + 38 P

6CO6CO₂₂ + 6 H + 6 H₂₂O + 38 ATPO + 38 ATP Cada NADH produce 3 ATP. Cada NADH produce 3 ATP.

(25)

Balance energético por cada

molécula de glucosa:

 Glucólisis:_Glucólisis:

 Por fosforilación a nivel de sustrato:Por fosforilación a nivel de sustrato: 2 ATP2 ATP  2 NADH:2 NADH: 6 ATP6 ATP  Ciclo de Krebs:_{Ciclo de Krebs:}

 2 GTP ... : 2 ATP2 GTP ... : 2 ATP

 De Pirúvico a Acetil-CoA: 2 NADH:De Pirúvico a Acetil-CoA: 2 NADH: 6 ATP6 ATP  En el Ciclo: 6 NADH:En el Ciclo: 6 NADH: 18 ATP18 ATP  En el Ciclo: 2 FADH:En el Ciclo: 2 FADH: 4 ATP4 ATP  TOTAL:TOTAL: 38 ATP38 ATP

En Eucariotas son 36 pues los 2 NADH de la glucólisis En Eucariotas son 36 pues los 2 NADH de la glucólisis

(26)

RESPIRACIÓN ANAERÓBICA

 Existe una cadena de transporte de electrones _{Existe una cadena de transporte de electrones}

con un aceptor final distinto del O con un aceptor final distinto del O₂₂

 El aceptor final de electrones puede ser:_{El aceptor final de electrones puede ser:}

 NONO

3

3- - NONO22- - o N o N22 ( (PseudomonasPseudomonas y y Bacillus)Bacillus)

 SOSO

4

4= = SHSH22 ((DesulfovibrioDesulfovibrio))

 COCO

3

3= = oo COCO2 2 CHCH44 (bacterias metanígenas) (bacterias metanígenas)

 Se libera ATP de forma variable según el _{Se libera ATP de forma variable según el}

proceso. (Ej.: para el NO

(27)

FERMENTACIÓN

 Se inicia a partir del Ac. Pirúvico_{Se inicia a partir del Ac. Pirúvico}  No requiere oxígeno, aunque _{No requiere oxígeno, aunque}

puede a veces ocurrir en su puede a veces ocurrir en su

presencia. presencia.

 No funciona el CAT ni Cadena de _{No funciona el CAT ni Cadena de}

Tr. Tr. ee-.-.

 El aceptor final de_{El aceptor final de}_e_e- - es una es una

molécula orgánica. molécula orgánica.

 Libera energía a partir de azucares _{Libera energía a partir de azucares}

o de otras moléculas orgánicas o de otras moléculas orgánicas

(A.A., Ac. Orgánicos, bases (A.A., Ac. Orgánicos, bases

(28)

Fermentación láctica y

(29)

(30)

(31)

(32)

Pruebas Bioquímicas:

 Investigan el _{Investigan el}

metabolismo de un metabolismo de un

microorganismo microorganismo

previamente aislado. previamente aislado.

 Sirven para identificar _{Sirven para identificar}

a los a los

(33)

Relación de las bacterias con el

oxígeno

 Se investiga el metabolismo de los hidratos de _{Se investiga el metabolismo de los hidratos de}

carbono en su relación con el oxígeno, según carbono en su relación con el oxígeno, según las rutas metabólicas que utilice: metabolismo las rutas metabólicas que utilice: metabolismo

oxidativo o fermentativo. oxidativo o fermentativo.

 Una prueba sencilla_{Una prueba sencilla}: Sembrando por picadura _{: Sembrando por picadura}

profunda en un tubo largo y estrecho con medio profunda en un tubo largo y estrecho con medio

sólido sin aceptores terminales de electrones sólido sin aceptores terminales de electrones

(oxígeno, nitratos, etc.) se obtiene: (oxígeno, nitratos, etc.) se obtiene:

 Aerobia: Crecimiento en la parte superior.Aerobia: Crecimiento en la parte superior.  Anaerobia: Crecimiento en la parte inferior.Anaerobia: Crecimiento en la parte inferior.

(34)

Prueba de Hugh y Leiffson u Oxido-fermentativa (O/F)

 _{Se usan dos tubos con un medio}_{Se usan dos tubos con un medio}

semisólido con un indicador de pH y un semisólido con un indicador de pH y un

hidrato de carbono (se pueden hidrato de carbono (se pueden

investigar varios, aunque si no se investigar varios, aunque si no se

especifica, se entiende que es glucosa). especifica, se entiende que es glucosa).

 Uno de ellos se sella con vaselina o Uno de ellos se sella con vaselina o

parafina estéril. parafina estéril.

 Puede haber un tercer tubo control Puede haber un tercer tubo control

sin sembrar. sin sembrar.

 _{Metabolismo oxidativo: acidifica la}_{Metabolismo oxidativo: acidifica la}

superficie del medio superficie del medio

 _{Metabolismo fermentativo, acidifica todo}_{Metabolismo fermentativo, acidifica todo}

el medio. el medio.

 _{Producción de gas (solo en}_{Producción de gas (solo en}

(35)

Tubo Tubo abierto abierto Tubo Tubo cerrado cerrado

Si solo existe oxidación (Aerobio Si solo existe oxidación (Aerobio

estricto): estricto):

A

A VV

Si existe fermentación y oxidación Si existe fermentación y oxidación

(Anaerobio facultativo) o puede (Anaerobio facultativo) o puede

fermentar en presencia de oxígeno fermentar en presencia de oxígeno

(aerotolerante). (aerotolerante).

A

A AA

Si solo puede utilizar el azúcar sin Si solo puede utilizar el azúcar sin

oxígeno (Anaerobio estricto) oxígeno (Anaerobio estricto)

V

(36)

(37)

(38)

PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS

 _{Prueba de Screening (o de descarte): Primera}_{Prueba de Screening (o de descarte): Primera}

orientación para posteriormente realizar otras orientación para posteriormente realizar otras

pruebas más selectivas en caso de positividad. pruebas más selectivas en caso de positividad.

 _{Estudia la capacidad degradativa de un}_{Estudia la capacidad degradativa de un}

microorganismo sobre un determinado hidrato microorganismo sobre un determinado hidrato

de carbono. de carbono.

 _{Se usa un medio líquido (agua de peptona) con}_{Se usa un medio líquido (agua de peptona) con}

un indicador de pH y campana de Durham. un indicador de pH y campana de Durham.

 _{La producción de ácido se pone de manifiesto}_{La producción de ácido se pone de manifiesto}

por el viraje de color del indicador de pH. por el viraje de color del indicador de pH.

 _{La producción de gas se aprecia en la campana}_{La producción de gas se aprecia en la campana}

de Durham. de Durham.

(39)

PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS

(40)

Prueba de la

β

-Galactosidasa (ONPG)

_{-Galactosidasa (ONPG)}

 Los microorganismos que fermentan la lactosa _{Los microorganismos que fermentan la lactosa}

pueden poseer dos enzimas: pueden poseer dos enzimas:

 Lactosa permeasaLactosa permeasa: Transporta lactosa a través de la : Transporta lactosa a través de la

membrana. membrana.

 ββ_{-D-Galactosidasa}_{-D-Galactosidasa}_:_:_{Desdobla la lactosa en glucosa y galactosa.}_{Desdobla la lactosa en glucosa y galactosa.}

 _Los_Losfermentadores activosfermentadores activos_{de lactosa en}_{de lactosa en}_{24 h}_{24 h}

(fermentadores rápidos) posen los dos enzimas. (fermentadores rápidos) posen los dos enzimas.

 _Los_Losfermentadores tardíosfermentadores tardíos_{de lactosa poseen solo}_{de lactosa poseen solo}

β

-Galactosidasa, por lo que solo la fermentan en -Galactosidasa, por lo que solo la fermentan en 2 a15 2 a15 días

días y en condiciones de alta concentración (la lactosa y en condiciones de alta concentración (la lactosa pasa a través de la membrana lentamente sin

pasa a través de la membrana lentamente sin intervención de ningún enzima).

(41)

Prueba de la

β

-Galactosidasa (ONPG)

 Se utiliza para diferenciar enterobacterias (_{Se utiliza para diferenciar enterobacterias (}Proteus_Proteus

y

y SalmonellaSalmonella dan negativo esta prueba y dan negativo esta prueba y E. coliE. coli

positiva). positiva).

 _{La enzima β-Galactosidasa se pone de manifiesto}_{La enzima β-Galactosidasa se pone de manifiesto}

utilizando ONPG utilizando ONPG

(orto-nitro-fenil-β-D-galactopiranósido): galactopiranósido):

 _{ONPG (incoloro)}_{ONPG (incoloro)}ββ-Galactosidasa-Galactosidasa Ortonitrofenol _{Ortonitrofenol}_(amarillo)_(amarillo) + Galactosa

(42)

Prueba de la

(43)

Prueba de la

(44)

Prueba de la

β

-Galactosidasa (ONPG)

 Se suele _{Se suele}

presentar

presentar en en forma de

forma de

tabletas o discos

comerciales

comerciales..

 Los _Los

microorganismos microorganismos que se ensayan que se ensayan deben estar

deben estar

incubados en un

medio con

(45)