Hidrólisis enzimática de la tusa de palma africana para la producción de azúcares reductores, con mezclas de enzimas celulasas

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(1)HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA TUSA DE PALMA AFRICANA PARA LA PRODUCCIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES, CON MEZCLAS DE ENZIMAS CELULASAS. DIANA CATALINA BELTRÁN SABOGAL. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C. JUNIO DE 2008.

(2) IQ-2008-I-8 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA TUSA DE PALMA AFRICANA PARA LA PRODUCCIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES, CON MEZCLAS DE ENZIMAS CELULASAS. DIANA CATALINA BELTRÁN SABOGAL. Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniera Química. ASESORA. ISABEL CRISTINA JIMÉNEZ USECHE. Ingeniera Química M. Sc. Ingeniería. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C. JUNIO DE 2008. 2.

(3) IQ-2008-I-8 AGRADECIMIENTOS. Primero a Dios por estar siempre a mi lado y poner personas maravillosas en mi camino que me ayudaron a conseguir de una u otra manera este logro.. A mis padres, por su apoyo incondicional, su amor, confianza y ánimo. A mis hermanos y cuñadas, por su cariño, ejemplo, acompañarme y apoyarme siempre. A mis sobrinitos por la alegría y las sonrisas que me han traído.. A mi familia más cercana por estar conmigo, por la confianza que siempre me han dado y han depositado en mí.. A mis amigos porque sin ellos este camino habría sido más duro, gracias por estar siempre conmigo.. A Isabel Jiménez por su acompañamiento y aportes durante todo el proyecto.. A Diana Díaz por su gran participación en este proyecto, sus consejos y su tiempo.. A Luz Dary Rugeles y José María Robles, por su colaboración constante en el laboratorio.. A mis compañeros del laboratorio, por su compañía en todo el semestre.. 3.

(4) IQ-2008-I-8 CONTENIDO RESUMEN ...................................................................................................................8 JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................10 1.. INTRODUCCIÓN...............................................................................................11. 2. OBJETIVOS .......................................................................................................13 2.1 Objetivo General ...................................................................................................13 2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................13 3. MARCO TEÓRICO ............................................................................................14 3.1 La palma de aceite.................................................................................................14 3.1.1 Residuos producidos durante el proceso de producción de aceite de palma ........................................................................................................................15 3.1.2 La palma africana en Colombia ...............................................................16 3.2 Compuestos lignocelulósicos.................................................................................17 3.3 Azúcares reductores ..............................................................................................18 3.4 Producción de azúcares reductores a partir de compuestos lignocelulósicos...........18 3.4.1 Pretratamiento.........................................................................................18 3.4.2 Hidrólisis de la celulosa ..........................................................................19 3.5 Hidrólisis enzimática a partir de diferentes residuos lignocelulósicos.....................19 3.5.1 Cascarilla de trigo ...................................................................................19 3.5.2 Madera de olivo ......................................................................................20 3.5.3 Tusa de maíz ...........................................................................................20 3.5.4 Tusa de palma africana............................................................................20 3.6 Mezclas de enzimas celulasas para obtener azúcares reductores.............................24 3.7 Enzimas utilizadas.................................................................................................24 3.7.1 Celluclast ®1.5 L ....................................................................................25 3.7.2 Cellubrix ® L..........................................................................................25 3.7.3 Viscozyme ® L .......................................................................................26 3.8 Furfural .................................................................................................................26 4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................27 4.1 Materiales y equipos..............................................................................................27 4.2 Diseño experimental..............................................................................................27 4.3 Métodos ................................................................................................................28 4.3.1 Pretratamiento.........................................................................................28 4.3.2 Hidrólisis enzimática...............................................................................30 4.3.3 Determinación de la cinética de las enzimas ............................................30 4.3.4 Técnicas analíticas ..................................................................................31 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..........................................................................36 5.1 Análisis lignocelulósico de la tusa .........................................................................36 5.2 Evaluación del pretratamiento con Viscozyme ® L ...............................................37 5.3 Cuantificación de furfural......................................................................................39 5.3.1 Furfural en el pretratamiento ácido..........................................................39 5.3.2 Furfural en el pretratamiento con Viscozyme ® L ...................................42 5.3.3 Análisis de varianza ANOVA..................................................................42 5.4 Análisis de los pretratamientos estudiados .............................................................44 4.

(5) IQ-2008-I-8 5.5 Hidrólisis enzimática con mezcla de enzimas ........................................................44 5.5.1 Porcentaje de rendimiento de azúcares reductores totales ........................45 5.5.2 Porcentaje de rendimiento de glucosa......................................................47 5.6 Determinación de la cinética de las enzimas ..........................................................48 6.. CONCLUSIONES...............................................................................................50. 7.. RECOMENDACIONES......................................................................................52. 8.. REFERENCIAS ..................................................................................................53. 9. ANEXOS ............................................................................................................56 Anexo 1. .....................................................................................................................56 Anexo 2. .....................................................................................................................57. 5.

(6) IQ-2008-I-8 ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 1. Usos de los residuos de la extracción de aceite de palma................................16 Tabla 2. Composición lignocelulósica de tusa con y sin pretratamiento, en estudio de Umikalsom (a) et al, 1997. ..........................................................................................22 Tabla 3. Composición lignocelulósica de la tusa con el uso de diferentes tipos de pretratamientos en estudio de Umikalsom (b) et al, 1998. ............................................23 Tabla 4. Datos reportados de hidrólisis con mezclas de enzimas. Adaptado de Zacchi (e), 2007......................................................................................................................24 Tabla 5. Condiciones empleadas en la hidrólisis enzimática ........................................30 Tabla 6. Proporciones empleadas para la determinación de la cinética de las enzimas..31 Tabla 7. Material lignocelulósico presente en la tusa de palma africana .......................36 Tabla 8. Porcentaje de azúcares reductores obtenidos con Viscozyme sin pretratamiento ácido. ..........................................................................................................................39 Tabla 9. Contenido de furfural a diferentes temperaturas y concentraciones de ácido sulfúrico......................................................................................................................40 Tabla 10. Concentración de furfural encontrada a diferentes condiciones de pretratamiento .............................................................................................................41 Tabla 11. Comparación del rendimiento de azúcares y contenido de furfural con los dos tipos de pretratamiento ................................................................................................44 Tabla 12. Valores de la cinética de Michaelis-Menten para los sustratos trabajados.....48 ÍNDICE DE IMÁGENES. Imagen 1. Palma africana. Tomada de Fedepalma. ......................................................14 Imagen 2. Balance de masa de los racimos de fruta fresca durante la extracción. Tomado de Bernal, 2001. ..........................................................................................................15 Imagen 3. Estructura de la celulosa. Tomada de: <http://es.wikipedia.org/wiki/Celulosa> ......................................................................17 Imagen 4. Actividad óptima reportada respecto a pH y temperatura para Celluclast. Tomada de: Ficha técnica, Novozymes........................................................................25 Imagen 5. Actividad óptima reportada respecto a pH y temperatura para Cellubrix. Tomada de: Ficha técnica, Novozymes........................................................................26 Imagen 6. Tusa empleada en el proyecto .....................................................................27 Imagen 7. Shaker.........................................................................................................29 Imagen 8. Filtración al vacío .......................................................................................29 Imagen 9. Reacción generada con DNS en presencia de azúcares reductores. Tomada de Tena et al. ...................................................................................................................32 Imagen 10. Montaje para el DNS.................................................................................32 Imagen 11. Reacción detectada con el kit de glucosa. Tomada de: Biosystems Reagents & Instruments. ............................................................................................................33 Imagen 12. Muestras tratadas con kit de glucosa .........................................................33 Imagen 13. Muestras para realizar la curva de calibración de furfural. .........................34 Imagen 14. Muestras en la centrífuga ..........................................................................34 Imagen 15. Coloraciones de las muestras de pretratamiento a 105 y 125°C en las concentraciones de ácido sulfúrico estudiadas. ............................................................40 Imagen 16. Estabilidad de las enzimas Cellubrix y Celluclast con incrementos en la temperatura (Novozymes). ..........................................................................................46 6.

(7) IQ-2008-I-8 ÍNDICE DE GRÁFICAS Gráfica 1. Rendimiento de azúcares reductores (AR) con Viscozyme sin pretratamiento ....................................................................................................................................37 Gráfica 2. Rendimiento de glucosa con Viscozyme sin pretratamiento ........................37 Gráfica 3. Efecto de la concentración de ácido y de la temperatura sobre la producción de furfural. ..................................................................................................................42 Gráfica 4. Interacción concentración de ácido-temperatura.........................................43 Gráfica 5. Porcentaje de Rendimiento de azúcares reductores (AR) contra temperatura para cada proporción ...................................................................................................45 Gráfica 6. Porcentaje de Rendimiento de glucosa contra temperatura para cada proporción...................................................................................................................47. 7.

(8) IQ-2008-I-8 RESUMEN En este proyecto se evaluó la producción de azúcares reductores a partir de la tusa de palma africana, el cual es el residuo que se obtiene en mayores proporciones en el proceso de producción de aceite de palma, y es el que tiene mayor contenido de celulosa (polímero de glucosa), frente a los otros dos residuos principales del proceso: cuesco y fibra. Se obtuvieron los azúcares reductores a partir de una hidrólisis enzimática con mezcla de enzimas celulasas comerciales.. La tusa se recibió secada, molida y tamizada. Para conseguir el objetivo del proyecto se realizó un pretratamiento químico con ácido sulfúrico al 1%, a 115°C por 30 minutos, condiciones que se establecieron en un estudio anterior (Díaz, 2007). En este paso se pretendía hidrolizar la hemicelulosa, pues esta impide el acceso directo a la celulosa que contiene las cadenas de glucosa de interés. Así mismo se evaluó otra alternativa de pretratamiento con la enzima Viscozyme ® L, pues ésta es un complejo enzimático que hidroliza la hemicelulosa. Se encontró que aunque convierte la hemicelulosa a azúcares fermentables, no supera los resultados obtenidos con el pretratamiento ácido. Enseguida se continuó con la hidrólisis enzimática, en la cual se quería evaluar el efecto de utilizar una mezcla de enzimas celulasas Celluclast ®1.5 L y Cellubrix ®L, distribuidas en Colombia por la empresa Coldanzimas Ltda. Se estableció el pH de trabajo óptimo de las enzimas como 5, dado por especificaciones de los productores de las mismas (Novozymes). Se evaluaron tres proporciones Celluclast:Cellubrix (1:1, 1:2, 2:1) y tres temperaturas (50, 60, 65°C), encontrando los mejores resultados a 50°C, sin encontrar cambios significativos al variar la proporción de enzimas.. Por otra parte se determinó la cantidad de furfural producido después del pretratamiento químico, pues este es un inhibidor de la posterior fermentación necesaria para producir el bioetanol y es importante cuantificar su presencia después de haber hidrolizado la hemicelulosa. Se encontró que a las condiciones de pretratamiento la producción es de 10 ppm, y además se encontró que al elevar tanto la temperatura como la concentración de ácido sulfúrico, se incrementa la producción de furfural.. 8.

(9) IQ-2008-I-8 Se determinó así mismo la cinética de Michaelis-Menten de la proporción 1:1 de la mezcla de enzimas Celluclast ®1.5 L y Cellubrix ®L, frente a un sustrato soluble (CMC: carboximetilcelulosa) y uno insoluble (tusa).. .. 9.

(10) IQ-2008-I-8 JUSTIFICACIÓN En la búsqueda de energías renovables, los biocombustibles se han convertido en una alternativa viable a nivel mundial, para disminuir el uso de combustibles fósiles y reducir las emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera (Zacchi (c) et al, 2003).. Actualmente se producen biocombustibles a partir de la biomasa de diferentes cultivos como palma africana, girasol, maíz, soya, trigo, yuca, entre otros, aprovechando algunos residuos que se generan durante sus procesos de producción.. Colombia se ha convertido a nivel Latinoamericano en uno de los mayores productores de aceite de palma, teniendo un 35.9% de la producción en América (Mesa-Dishington et al, 2007), por lo que sus productores podrían beneficiarse con el estudio de mecanismos para aprovechar parte de los residuos del proceso, enfocados a la producción de biocombustibles. Fedepalma (Federación Nacional de cultivadores de palma de aceite) proyecta que para el 2020, se tendrán cultivadas en Colombia 743,000 hectáreas de palma africana, teniendo así una gran oportunidad de uso de sus residuos, que en el año 2003 únicamente de tusa fueron 541,686 toneladas (Rodríguez et al). La tusa es el residuo del fruto de la palma, de la cual actualmente se está estudiando la posibilidad de uso para obtener azúcares reductores, que posteriormente se podrían vincular al proceso de producción de bioetanol.. Es por esto que es importante estudiar alternativas de producción de los azúcares, a través de procesos como la hidrólisis enzimática a partir de mezcla de enzimas celulasas, de la que no se conocen hasta ahora las condiciones más adecuadas de trabajo para este residuo. De obtener altas concentraciones de glucosa en este proceso, se estaría aprovechando este residuo vegetal de muchas industrias colombianas y se justificaría el uso del mismo para producir bioetanol.. 10.

(11) IQ-2008-I-8 1. INTRODUCCIÓN Los biocombustibles son combustibles de origen vegetal, que tienen como materia prima productos o subproductos agrícolas. Uno de los subproductos con más potencial es la biomasa (también denominada residuos lignocelulósicos), la cual en la fotosíntesis almacena la energía solar en la materia orgánica de los vegetales y se puede transformar y utilizar como metanol, etanol o biogas (Silverstein et al, 2007). Entre las ventajas que presenta el uso de la biomasa, se encuentra su bajo costo y fácil acceso. Se han estudiado diferentes cultivos de los que se pueden aprovechar sus residuos como cascarilla de trigo (Saha et al, 2005), cascarilla de arroz (Karimi et al, 2006), residuos del árbol de olivo (Cara et al, 2006), cascarilla de la soya (Xu et al, 2006), residuos del maíz (Lloyd et al, 2005), cebada (Zacchi (a) et al, 2007), entre otros.. Para poder hacer uso de estos, se requiere generalmente de un pretratamiento, seguido por una hidrólisis, de la que se obtendrán azúcares fermentables necesarios para poder producir los biocombustibles. Las condiciones a las cuales se lleva a cabo este proceso son específicas de cada residuo, por lo cual resulta importante determinarlas para cada material lignocelulósico.. Colombia actualmente es el primer productor y exportador de palma africana en América, en el 2007 se tenían 326,000 hectáreas de palma plantadas, que se esperan duplicar para el 2020, según las proyecciones de Fedepalma (Mesa-Dishington, 2008). Por lo que los residuos producidos seguirán en crecimiento y se hace necesario su aprovechamiento en el país.. En estudios anteriores de Loboguerrero (2007), Díaz (2007) y Moncada (2007), se comprobó que la tusa es el residuo de la palma con mayor potencial para la producción de azúcares reductores, y que con hidrólisis ácidas y enzimáticas es posible obtenerlos.. Por lo anterior en este proyecto se determinará la efectividad de usar una mezcla de enzimas celulasas comerciales para producir azúcares reductores a partir de la tusa de palma africana. Para esto es necesario un pretratamiento de la materia prima y una hidrólisis enzimática. Se evaluarán dos tipos de pretratamiento, uno con ácido diluido y otro con un complejo enzimático; de la posterior hidrólisis enzimática, se estudiarán. 11.

(12) IQ-2008-I-8 diferentes proporciones de la mezcla de enzimas celulasas seleccionada a diferentes temperaturas. Además se cuantificará el furfural que puede generarse después de realizar el pretratamiento, pues este es un inhibidor de la posterior fermentación necesaria para obtener bioetanol y se determinará la cinética de la mezcla de enzimas frente a un sustrato soluble y la tusa como sustrato insoluble.. 12.

(13) IQ-2008-I-8 2. OBJETIVOS. 2.1 Objetivo General Obtener azúcares reductores a partir de la tusa de palma africana, por medio de la hidrólisis enzimática con mezcla de enzimas celulasas.. 2.2 Objetivos Específicos -. Evaluar la enzima Viscozyme ® L como pretratamiento para la hidrólisis enzimática.. -. Caracterizar las enzimas Celluclast ®1.5 L y Cellubrix ®L, determinando su cinética y rango de temperatura de trabajo.. -. Encontrar las condiciones más adecuadas de temperatura y proporción de la mezcla de enzimas celulasas, para llevar a cabo la hidrólisis enzimática.. 13.

(14) IQ-2008-I-8 3. MARCO TEÓRICO. 3.1 La palma de aceite La palma africana de aceite, Elaeis guineensis, es un vegetal perenne, es decir que perdura largo tiempo. Para fines comerciales tiene un promedio de vida útil entre 24 y 28 años, pues después de este tiempo puede alcanzar más de 30 metros, altura que dificulta la recolección de los frutos.. Es un cultivo tropical que expresa su mejor potencial de producción a temperaturas altas, con buena radiación solar, altas precipitaciones y humedad relativa. Los racimos de frutos que produce, aparecen a los dos años de sembrada la palma y alcanzan alrededor de 4.2 toneladas durante su vida productiva. Luego de retirar el fruto oleaginoso de los racimos, quedará el raquis o tusa, que se utilizará en el presente proyecto (Bernal, 2001).. La palma de aceite es un cultivo energético, demostrado por el aporte de sus aceites a la fabricación de diferentes productos para la alimentación humana y animal, además del uso directo del aceite crudo y de algunos de sus subproductos para la producción de biocombustibles (biodiesel a partir del aceite de palma y bioetanol a partir de sus residuos) o para generar energía por la quema de sus residuos en calderas (Fedepalma, 2007).. Imagen 1. Palma africana. Tomada de Fedepalma.. 14.

(15) IQ-2008-I-8 3.1.1 Residuos producidos durante el proceso de producción de aceite de palma Los residuos durante la producción de aceite de palma son principalmente tres: cuesco, fibra y tusa. En la Imagen 2 se presentan las cantidades producidas de cada uno de estos a partir del racimo de fruta de la palma.. Imagen 2. Balance de masa de los racimos de fruta fresca durante la extracción. Tomado de Bernal, 2001.. De la Imagen 2 se puede observar que la mayor parte de los residuos del proceso se representan en tusa, por lo cual se tiene a disposición grandes cantidades de este residuo que se podría incorporar a la producción de bioetanol.. Se han identificado diversos usos para los residuos resultantes de este proceso, en la Tabla 1 se listan algunos de ellos.. 15.

(16) IQ-2008-I-8 Tabla 1. Usos de los residuos de la extracción de aceite de palma Usos Como cenizas luego de incinerarlas o llevándolas al campo sin ninguna Tusa o transformación para que se incorporen racimos vacíos al suelo Combustible para calderas Aunque no es muy usual por su bajo contenido calorífico y alta humedad Para elaborar pulpa de papel Por su contenido celulósico Producción de etanol Hidrolizando la celulosa Abono Residuo. Autor. Fertilizante. Fibra. Cuesco. Fabricación de tablas Combustible. Carbón activado y vegetal Combustible Ácido piroleñoso. Pues su configuración fibrosa consistente, provee buena superficie de contacto para el oxígeno, esencial para la combustión completa Por degradación térmica Alta valor calorífico. Garcés, 1996. Fedepalma, 2007. Posschelle G, 1990. Garcés, 1996. Se observa la versatilidad de los residuos y cuán necesaria se hace la investigación para reconocer el uso más rentable y conveniente para la industria colombiana, de cada uno de ellos.. 3.1.2 La palma africana en Colombia La palmicultura es una de las actividades agrícolas más prometedoras para contribuir al desarrollo nacional (Fedepalma, 2006), pues desde que se establecieron los cultivos comerciales de la especie hace 50 años en el país, esta agroindustria viene creciendo de manera sostenida en siembras y producción (Fedepalma, 2007). El cultivo de palma cubre más de 300,000 hectáreas en Colombia, localizadas en 76 municipios en 16 departamentos. A nivel nacional los departamentos que poseen más área sembrada de palma en orden son: Meta, Cesar, Santander, Magdalena, Nariño, Casanare, Bolívar, Cundinamarca y Norte de Santander (Fedepalma, 2006).. En cuanto a la responsabilidad con el medio ambiente, el cultivo de palma contribuye en la medida en que se establece sin talar árboles nativos, sino ocupando territorios donde antes habían actividades agropecuarias. Además se están incorporando estos cultivos al programa de MDL (Mecanismos de desarrollo limpio), al disminuir las emisiones de gas metano, capturarlo y utilizarlo como fuente de energía en las plantas de producción de aceite, por medio de lagunas. 16.

(17) IQ-2008-I-8 metanogénicas. Este programa de MDL responde a los objetivos del Protocolo de Kyoto con el cual los países industrializados se ven obligados a reducir sus emisiones de gases de efecto invernadero para el 2012, y una manera de cumplir con esta reducción es colaborando a países en vía de desarrollo con proyectos que involucren reducción de emisiones (Fedepalma, 2006).. Es así como se hace evidente el crecimiento de este sector de la agroindustria colombiana, y la necesidad de identificar los usos más adecuados para los residuos generados en el proceso, encontrando una alternativa en el uso de la tusa para producir energías limpias y renovables como los biocombustibles.. 3.2 Compuestos lignocelulósicos Los materiales lignocelulósicos contienen celulosa, hemicelulosa y lignina en su pared celular.. La celulosa es el compuesto de carbono más abundante en el planeta. Es un polisacárido y homopolímero lineal de estructura cristalina con unidades de D-glucosa unidas por enlaces glicosídicos β-1,4, altamente resistentes a la hidrólisis ácida, requiriendo ácido mineral fuerte para producir D-glucosa; su hidrólisis parcial produce el disacárido reductor celobiosa.. La celulosa forma una estructura de cadenas paralelas unidas. transversalmente por puentes de hidrógeno (Conn, 1996).. Imagen 3. Estructura de la celulosa. Tomada de: <http://es.wikipedia.org/wiki/Celulosa>. La hemicelulosa es un polisacárido ramificado que a diferencia de la celulosa, no contiene únicamente glucosa sino también otros azúcares como manosa, galactosa, arabinosa y principalmente xilosa (Xu et al, 2006).. 17.

(18) IQ-2008-I-8. La lignina es una matriz poliaromática tridimensional que rodea a la celulosa, producida a partir de tres alcoholes aromáticos: cumarílico, coniferílico y sinafílico (Xu et al, 2006).. 3.3 Azúcares reductores Los carbohidratos se pueden clasificar en azúcares reductores y no reductores. Los azúcares reductores son los más comunes, tienen la capacidad de funcionar como agentes reductores debido a que en su molécula están presentes grupos aldehídos libres, que son oxidados fácilmente a ácido carboxílico en pH neutro por enzimas y agentes oxidantes moderados. Esta propiedad se utiliza para detectar y cuantificar monosacáridos especialmente glucosa. Los grupos aldehído y cetona de los monosacáridos y de algunos disacáridos, pueden reducirse por medios no enzimáticos como hidrógeno o con enzimas para producir alcoholes a partir de azúcares. Algunos ejemplos de azúcares reductores son: glucosa, fructosa, lactosa, maltosa y celobiosa. (Conn, 1996).. 3.4 Producción de azúcares reductores a partir de compuestos lignocelulósicos. 3.4.1 Pretratamiento El pretratamiento es esencial antes de la hidrólisis enzimática (Saha et al, 2005), se espera que mejore la producción de azúcares, evite la degradación y pérdida de carbohidratos, así como la formación de inhibidores de la hidrólisis y de la fermentación posterior (Cara et al, 2006). Además aumenta el área superficial de acceso a la celulosa para favorecer su conversión a glucosa (Xu et al, 2006), facilita el acceso a la celulosa (Zacchi (b) et al, 2003), y disminuye la cristalinidad de la celulosa (Zacchi (c) et al, 2006). Existen diferentes maneras de realizar un pretratamiento entre ellas, exponer las muestras a un ácido diluido. En este caso, se pueden llegar a generar compuestos no deseados, inhibidores de procesos posteriores como la hidrólisis o la fermentación.. 18.

(19) IQ-2008-I-8 Entre estos se encuentran ácidos alifáticos, derivados del furano o compuestos fenólicos (Zacchi (b) et al, 2003).. 3.4.2 Hidrólisis de la celulosa Con la hidrólisis se rompe la pared celular de la biomasa, y así se pueden extraer la celulosa y hemicelulosa principalmente, las cuales contienen en su estructura química azúcares que se obtendrán al final del proceso.. Algunos factores que afectan el rendimiento de la hidrólisis son: tamaño de partícula, tipo y concentración del ácido utilizado, temperatura y tiempo de reacción. Así mismo depende de la configuración de la cadena de la celulosa, y de cómo está asociada la celulosa a la pared que la protege compuesta por hemicelulosa, lignina, proteínas, pectina y algunos compuestos minerales. Sin embargo estas variables son diferentes para cada tipo de material lignocelulósico y por tanto no se pueden generalizar las condiciones de un residuo a otro, pues tienen distintas condiciones óptimas (Karmilla et al, 2006).. 3.5 Hidrólisis enzimática a partir de diferentes residuos lignocelulósicos La hidrólisis enzimática con pretratamiento ácido, se ha empleado para producir azúcares a partir de diferentes sustratos insolubles.. 3.5.1 Cascarilla de trigo Entre los residuos que se han utilizado se encuentra la cascarilla de trigo, que en base seca contiene de celulosa 48.57 ± 0.3% y 27.7 ± 0.12% de hemicelulosa. Se obtuvo un rendimiento de 565 ± 10 mg de azúcar por cada gramo de cascarilla, después de un pretratamiento con ácido sulfúrico diluido al 0.75% v/v a 121.8°C, seguido por hidrólisis enzimática a 45.8°C, pH 5, por 72 horas, a 100 rpm. Las enzimas empleadas fueron celulasa, β-glucosidasa, xilanasa y esterasa; de cada una de ellas se utilizaron 2 ml/100 g en base seca de cascarilla de trigo. Una ventaja de las condiciones a las que se llevó a cabo el estudio, es que no hubo producción de furfural ni de HMF (hidroximetil furfural), los cuales pueden llegar a inhibir la posterior fermentación (Saha et al, 2005).. 19.

(20) IQ-2008-I-8 3.5.2 Madera de olivo También se han realizado estudios de hidrólisis enzimática con previo pretratamiento por otros métodos diferentes al ácido como la explosión de vapor. Utilizando la madera del olivo (34.4 ± 0.6% de celulosa y 20.3 ± 0.5% de hemicelulosa, en base seca), se realizó una hidrólisis en un reactor batch. En el pretratamiento se expone la biomasa a presión y después se reduce esta en muy corto tiempo, aumentando el acceso a la celulosa. La hidrólisis enzimática se llevó a cabo con la celulasa Celluclast provista por NOVO, Dinamarca a pH de 4.8, 150 rpm, 50°C por 72 horas, tomando muestras cada 24 horas. El contenido de azúcar se determinó por HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), encontrando que el máximo contenido de glucosa fue 52.6%, a 230°C, siendo estos 28.8 g de azúcares de 54.7 g disponibles en 100 g de madera de olivo. (Cara et al., 2006).. 3.5.3 Tusa de maíz Entre otras pruebas se ha comparado la acción de la mezcla comercial de enzima Celluclast 1.5 L- β-glucosidasa (mezcla comercial), con un complejo enzimático de celulosa compuesto por tres celulasas y una xilanasa; este estudio se llevó a cabo con la tusa del maíz. Se realizó un pretratamiento con SO2 al 2% y con vapor saturado a 200°C por 5 minutos. Para la hidrólisis enzimática, la mezcla se llevó a la temperatura óptima correspondiente de cada enzima (48°C para Celluclast y 55°C para el complejo enzimático). Se determinó el contenido de glucosa después de la hidrólisis, observando que al cabo de 16 horas, se obtenía la mayor concentración para cada mezcla de enzimas; para la mezcla comercial se obtuvo 26.6 g/L de glucosa y para el complejo de celulosa 40.3 g/L. Esta diferencia se pudo deber a una mayor actividad enzimática del complejo de celulosa, o a una menor producción de inhibidores (Zacchi (e) et al., 2007).. 3.5.4 Tusa de palma africana Se ha estudiado este residuo principalmente en Malasia, pues este país es de los primeros productores de palma en el mundo; entre los usos de la tusa se ha encontrado la producción de biocombustibles.. 20.

(21) IQ-2008-I-8 En un caso se estudió la producción de xilosa, glucosa y furfural después de realizar un pretratamiento con ácido sulfúrico en el rango de 2 a 6% a 120°C, tomando muestras a lo largo de un intervalo de 90 minutos. La materia prima tenía un tamaño de partícula inferior a 1 mm; para las pruebas realizadas se utilizaba 1 g de tusa por cada 8 g de ácido sulfúrico, en erlenmeyers de 125 ml. Xilosa y glucosa se analizaron por cromatografía líquida (HPLC) y el furfural por cromatografía gas-líquido (GLC). Con la hidrólisis ácida con ácido sulfúrico al 6% se produjo la mayor cantidad de glucosa al cabo de 90 minutos siendo esta 4.1 g/L, con 2% de ácido se produjo 1.8 g/L y con 4% de ácido 3.2 g/L. En cuanto al furfural se observó que a medida que se aumentaba la concentración de ácido, también se incrementaba la concentración de furfural llegando hasta 3.3g/L con ácido al 6%; evidenciaron que el incremento en furfural correspondía a una reducción en la cantidad de xilosa (Rahman (a) et al, 2006).. Buscando la optimización del proceso descrito anteriormente Rahman et al, ampliaron el rango de temperatura para la hidrólisis ácida entre 100 y 130°C, tomando muestras entre los 30 y 90 minutos de hidrólisis; utilizaron una metodología RSM (response surface methodology) que les serviría para optimizar la hidrólisis. Encontraron una producción de glucosa de 7.61 g/L al realizar la hidrólisis a 130°C, por 90 minutos con ácido sulfúrico al 6% (Rahman (b) et al, 2007).. Se han realizado otros estudios donde se comienza el proceso desde la producción de enzimas celulasas a partir de Chaetomium globosum, para después incorporarlas al proceso de producción de azúcares fermentables. En este caso se realizó una hidrólisis a 50°C y 200 rpm, utilizando tusa de palma y acetato de sodio como buffer 0.05M a pH 5. Se estudió si un pretratamiento con HNO3 0.5% v/v, permitiría reducir la hemicelulosa y lignina y dejar más disponible la celulosa. Este pretratamiento consistió en dejar en remojo la tusa 4 horas con HNO3 0.5% v/v, y autoclavar a 121°C por 5 minutos (Umikalsom, 1997). Se obtuvieron los siguientes resultados respecto al contenido lignocelulósico de la tusa:. 21.

(22) IQ-2008-I-8 Tabla 2. Composición lignocelulósica de tusa con y sin pretratamiento, en estudio de Umikalsom (a) et al, 1997. Pretratamiento Composición (%) Celulosa Hemicelulosa Lignina Cenizas con HNO3 No 50.4 21.9 10 0.8 Sí 78.7 5.8 5.6 1.1. Además se evaluó la producción de azúcares reductores después del pretratamiento propuesto, realizando una hidrólisis enzimática con la celulasa producida a partir de Chaetomium globosum y con una enzima comercial producida a partir de T. viride. La hidrólisis se llevó a cabo durante una semana, pero se observó que la producción de azúcares reductores se estabilizó a partir del quinto día. La máxima concentración de azúcares se obtuvo con la enzima comercial y fue 0.75 g de azúcares reductores por gramo de tusa, correspondiente a una conversión del 68% sobre los azúcares reductores disponibles en la tusa.. En esta misma línea de estudio Umikalsom et al, continuaron buscando maneras de optimizar la conversión de celulosa a azúcares reductores, por medio del estudio de diferentes pretratamientos y con una posterior hidrólisis enzimática con una enzima celulasa producida a partir de Chaetomium globosum (Umikalsom (b) et al, 1998). Primero se evaluaron diferentes pretratamientos químicos en los cuales se remojaban 50 g de tusa de 2 cm de largo, en 500 ml de distintas soluciones 0.5% v/v como NaOH, HNO3, HCl, EDA (etilendiamina), y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) a 30°C por 4 horas; así mismo se analizó el efecto de autoclavar, después del pretratamiento a 121°C por 5 minutos para reducir la cantidad de lignina presente; la composición lignocelulósica de esta etapa se presenta en la Tabla 3. Se lavó con abundante agua destilada, se filtró y secó la tusa a 95°C por 2 días. Después de esto se redujo el tamaño de partícula de 2 cm a 2 mm, usando un molino.. 22.

(23) IQ-2008-I-8 Tabla 3. Composición lignocelulósica de la tusa con el uso de diferentes tipos de pretratamientos en estudio de Umikalsom (b) et al, 1998.. De los datos de la Tabla 3, los autores observaron que no hay una diferencia significativa en el contenido lignocelulósico de la tusa sin pretratar y la tusa con pretratamiento químico sin autoclavar. A diferencia de la tusa pretratada químicamente y autoclavada donde aumentó el porcentaje de celulosa y disminuyeron los porcentajes de hemicelulosa y lignina. Se obtuvo la mayor cantidad de celulosa en esta etapa utilizando un pretratamiento con HNO3 al 0.5% y autoclavando posteriormente, a las condiciones indicadas. Después de las diferentes etapas de pretratamiento, se llevó a cabo la hidrólisis enzimática con la celulasa producida a partir de C. globosum, a 50°C, 200 rpm; se usaron 2 ml de celulasa, 18 ml de buffer y 1 gramo de tusa en cada hidrólisis. Se determinó el contenido de azúcares reductores por DNS, glucosa y celobiosa por HPLC, después de este proceso de hidrólisis enzimática. Con el pretratamiento de NaOH 0.5%, se obtuvo el mejor rendimiento de la hidrólisis enzimática, seguido por HNO3, HCl, EDA y EDTA; se evidenció además que tanto el pretratamiento como el proceso en la autoclave, son muy importante para optimizar la producción de azúcares reductores, pues de no utilizarlos se baja el rendimiento del proceso en general. Se observó que la cantidad de azúcares reductores producida con la celulasa proveniente de Chaetomium globosum, llegó a ser de 0.0102 g por cada gramos de tusa en una hora (Umikalsom (b) et al, 1998).. 23.

(24) IQ-2008-I-8 3.6 Mezclas de enzimas celulasas para obtener azúcares reductores Se han reportado algunos ensayos para producir azúcares reductores con mezclas de enzimas, a partir de residuos del cultivo de maíz. Se comparó el efecto de dos mezclas de enzimas; una consistía en Celluclast y Novozyme 188 de la compañía Novozymes, Alemania, y un complejo termoactivo de tres celulasas y una xilasa producido por Roal Oy, Finlandia. Se realizó un pretratamiento con vapor seguido por una hidrólisis y fermentación simultaneas (SSF: Simultaneous Saccharification and. Fermentation),. encontrando que la mezcla de enzimas de Novozymes produjo la menor concentración de azúcares reductores después de una prehidrólisis realizada en un fermentador de 2 L (en el que se llevó a cabo todo el proceso), pero el mayor rendimiento de etanol al final de la fermentación (Zacchi (e) et al, 2007). También se estudió el efecto de las enzimas sin prehidrólisis. Los datos reportados se resumen en la Tabla 4.. Tabla 4. Datos reportados de hidrólisis con mezclas de enzimas. Adaptado de Zacchi (e), 2007. Mezcla de enzimas. Novozymes. Roal Oy. Tiempo de Glucosa después de la Productividad de etanol Rendimiento global de prehidrólisis (h) prehidrólisis (g/L) en las primeras 24 h (g/( L h)) etanol (%) 16 26.6 0.85 75 4 5.4 0.72 75 0 0.7 76 16 40.3 0.96 69.5 4 22.7 0.86 70.6 0 0.83 76.8. 3.7 Enzimas utilizadas Las enzimas celulasas en general son de tres tipos según como hidrolicen la molécula de celulosa: endoglucanasas, exoglucanasas y β-1,4 glucosidasas. Las endoglucanasas rompen los enlaces de la estrucutra aleatoriamente, las exoglucanasas lo hacen en los extremos liberando moléculas de glucosa y celobiosa; y las β-1,4 glucosidasas hidrolizan los enlaces glicosídicos β-1,4, generando moléculas de glucosa (Zhang, 2006). A continuación se presentan las enzimas comerciales utilizadas distribuidas por la empresa Coldanzimas Ltda.. 24.

(25) IQ-2008-I-8 3.7.1 Celluclast ®1.5 L La enzima Celluclast ® 1.5 L es una celulasa líquida producida a partir de una cepa seleccionada del hongo Trichoderma reesei. Su efecto se basa en romper la celulosa en glucosa, celubiosa y polímeros de alta glucosa. Se pude utilizar siempre que el objetivo sea romper el material celulósico para la producción de azúcares fermentables, entre otros. Las condiciones óptimas son alrededor de 50-60°C (presentando un máximo rendimiento a 65ºC) y pH entre 4.5 y 6; su actividad enzimática está registrada como 700 EGU1/g (Novozymes, 2002). A continuación se presentan los rangos reportados de actividad óptima para pH y temperatura:. Imagen 4. Actividad óptima reportada respecto a pH y temperatura para Celluclast. Tomada de: Ficha técnica, Novozymes.. 3.7.2 Cellubrix ® L Cellubrix ® L es una celulasa líquida producida por fermentación de Trichoderma reesei. Cataliza el rompimiento de celulosa en polímeros de alta glucosa y luego por la actividad de la celubiosa en glucosa. Las condiciones óptimas de operación de temperatura son de 50 a 60°C (presentando un máximo rendimiento a 60ºC) y de pH entre 4 y 6; su actividad se reporta como 700 EGU/g (Novozymes, 2007). A continuación se presentan los rangos reportados de actividad óptima para pH y temperatura:. 1. EGU=Endo-Glucanase Units.. 25.

(26) IQ-2008-I-8. Imagen 5. Actividad óptima reportada respecto a pH y temperatura para Cellubrix. Tomada de: Ficha técnica, Novozymes.. 3.7.3 Viscozyme ® L Viscozyme ® L es un complejo multienzimático que contiene una mezcla de arabinasa, celulasa, β-glucanasa, hemicelulasa y xilanasa. Se produce a partir de una cepa de Aspergillus aculeatus. Sus condiciones óptimas de operación son de 25 a 55°C de temperatura y PH entre 3.3 y 3.5; su actividad enzimática es calculada como 100 FBG2/g (Novozymes, 2002).. 3.8 Furfural A partir de algunos productos industriales de desecho como tusas de maíz, cáscara de arroz y avena, entre otros se produce furfural, el cual es un inhibidor de procesos fermentativos para producir bioetanol. Los residuos lignocelulósicos contienen hidratos de carbono poliméricos conocidos como pentosanos. La hidrólisis ácida de estos materiales de desecho produce pentosas, las cuales se ciclan y deshidratan para producir furfural con elevado rendimiento (Pine, 1998). Además el furfural es un compuesto tóxico por inhalación e ingestión, y puede tener efectos cancerígenos. En el ambiente puede resultar tóxico aun diluido, por lo que contamina el agua, llegando a afectar a comunidades animales (MSDS).. 2. FBG=Fungal Beta-Glucanase Units. 26.

(27) IQ-2008-I-8 4. MATERIALES Y MÉTODOS. 4.1 Materiales y equipos La tusa que se utilizó durante el proyecto la suministró el SENA, proveniente de un cultivo de palma del departamento de Meta. Fue recibida después de un pretratamiento realizado por Díaz (2007), quien la había secado, molido y tamizado previamente. Para los procedimientos realizados se empleó ácido sulfúrico al 0.6, 1 y 1.4%, buffer de acetato de sodio 0.1 M a pH 5, enzimas Celluclast ®1.5 L, Cellubrix ® L y Viscozyme ® L, de la empresa Coldanzimas Ltda., y furfural. En cuanto a equipos se requirió el uso de un Shaker con nueve puestos, filtro al vacío, vortex, horno y un espectrofotómetro.. Imagen 6. Tusa empleada en el proyecto. 4.2 Diseño experimental Para llevar a cabo el proyecto, se realizaron diferentes procedimientos que se presentan a continuación.. Primero fue necesario realizar un pretratamiento químico con ácido sulfúrico. Así mismo se evaluó en esta etapa el efecto de la enzima Viscozyme ® L, para complementar la hidrólisis de la hemicelulosa. Con este pretratamiento se esperaba degradar la hemicelulosa, para tener un acceso más fácil a la celulosa con la posterior hidrólisis enzimática.. Se cuantificó el furfural producido después de este proceso de pretratamiento, pues este es un inhibidor de la posterior fermentación requerida para conseguir la producción de bioetanol. Por tanto es necesario evaluar si las condiciones a las que se llevó el 27.

(28) IQ-2008-I-8 pretratamiento son muy severas o no, y encontrar condiciones adecuadas para producir azúcares sin obtener productos no deseados como el furfural u obtenerlo en concentraciones que no afecten la producción del bioetanol.. La siguiente etapa del proceso consistió en la hidrólisis enzimática de los residuos del pretratamiento ácido, con mezcla de enzimas celulasas Celluclast ® 1.5 L y Cellubrix ® L, en diferentes proporciones y a diferentes temperaturas, para establecer las condiciones más adecuadas entre las estudiadas. Otro objetivo de esta etapa es comparar los resultados que había obtenido Díaz (2007) con el uso de un solo complejo enzimático comercial (Celluclast), con el uso de dos complejos enzimáticos de celulasas (Mezcla Celluclast-Cellubrix), para determinar si vale la pena tener en la hidrólisis una mezcla de enzimas comerciales de complejos enzimáticos.. Se estableció la cinética de la mezcla de enzimas Celluclast ® 1.5 L y Cellubrix ® L, en proporción 1:1, con un sustrato soluble y uno insoluble.. 4.3 Métodos. 4.3.1 Pretratamiento Se realizó un pretratamiento con el complejo enzimático Viscozyme ® L, para evaluar la hidrólisis de la hemicelulosa sólo con el uso de ésta. Para esta prueba se preparó una solución buffer con pH de 3.4, para trabajar al pH óptimo de la enzima (3.3-3.5), reportado en su ficha técnica (Novozymes, 2002). Este buffer se prepara con ácido clorhídrico 0.1 M, cloruro de sodio y glicina. En erlenmeyers de 250 ml, se colocaron 5 gramos de tusa, 100 ml del buffer y Viscozyme; la cantidad de enzima se trabajó a 1.5 ml y 2.5 ml, para observar su efecto. Los erlenmeyers se ponían en el Shaker con agitación constante a 150 rpm y 50°C, que se presenta en la Imagen 7.. 28.

(29) IQ-2008-I-8. Imagen 7. Shaker. Se adicionó antibiótico en cada muestra (40 µg de tetraciclina dos veces al día), para evitar la contaminación, evitar crecimiento microbiano (Zacchi et al (d), 2007). Se realizó seguimiento dos veces al día, por tres días, se analizaron azúcares reductores y glucosa. Al cabo de los tres días, se filtraron las muestras (como se presenta en la Imagen 8), se secaron los residuos sólidos en el horno a 110°C y se pesaron para. determinar la cantidad de tusa que realmente entra al proceso de hidrólisis enzimática.. Imagen 8. Filtración al vacío. En los pretratamientos químicos posteriores se utilizó solo ácido sulfúrico. Para esto se pesaron 5 gramos de tusa seca y a estos se le agregaron 100 ml de ácido sulfúrico al 1% peso/peso, se autoclavaron por 30 minutos a 115°C; estas condiciones se habían establecido en el estudio previo de Díaz (2007). Después de este proceso, se filtraron las muestras. El líquido que se obtenía era neutralizado con hidróxido de sodio y era analizado con DNS (ácido dinitrosalicílico) para determinar la cantidad de azúcares totales presentes, y con el kit de glucosa para cuantificar la glucosa presente en los 29.

(30) IQ-2008-I-8 azúcares encontrados. Además se analizaba el contenido de furfural en este líquido, con la metodología de la norma NTC 269. La tusa se lavaba con abundante agua destilada para evitar restos de ácido en la misma. Se llevaba a un proceso de secado en un horno a 110°C por aproximadamente tres horas.. 4.3.2 Hidrólisis enzimática Se utilizaron tres proporciones de la mezcla de enzimas Celluclast:Cellubrix, 1:1, 1:2, 2:1 y se evaluaron a tres temperaturas 50, 60 y 65°C que se establecieron al conocer las fichas técnicas de las enzimas y observar que este es el rango óptimo de temperatura al que deberían trabajar; se realizan dos réplicas de cada una. En la Tabla 2 se presentan las proporciones específicas de las enzimas empleadas en cada prueba. Tabla 5. Condiciones empleadas en la hidrólisis enzimática. Temperatura (°C) 50. 60. 65. Proporción de enzimas 1:1 1:2 2:1 1:1 1:2 2:1 1:1 1:2 2:1. Celluclast (ml) 0.75 0.5 1 0.75 0.5 1 0.75 0.5 1. Cellubrix (ml) 0.75 1 0.5 0.75 1 0.5 0.75 1 0.5. No. réplicas 2 2 2 2 2 2 2 2 2. En cada ensayo se utilizan 100 ml de buffer de acetato de sodio 0.1M a pH 5 por cada 1.5 ml de la mezcla de enzima, pues en ensayos anteriores de Díaz (2007), se determinó que una concentración superior de enzima, no incrementa el rendimiento de azúcares reductores en el proceso. Esta hidrólisis enzimática llevaba entre 3 y 4 días, a 150 rpm en un Shaker. Se agregaban 40 µg de tetraciclina dos veces al día, para evitar una posible contaminación microbiana y se hacía seguimiento dos veces al día, analizando azúcares totales y glucosa. 4.3.3 Determinación de la cinética de las enzimas Se determinó la cinética que rige el comportamiento de la mezcla de enzimas Celluclast y Cellubrix en proporción 1:1, a partir de la ecuación de Michaelis-Menten, utilizando. 30.

(31) IQ-2008-I-8 CMC (carboximetilcelulosa) 2% en buffer como sustrato soluble a seis concentraciones diferentes, buffer de acetato de sodio 0.05M a pH 5.5 y 0.5 ml de la enzima correspondiente en solución (1ml de enzima llevados a 100 ml con buffer). Así mismo se hizo la prueba usando un sustrato insoluble, la tusa. Para cada ensayo se realizaba una réplica. A continuación se presentan las concentraciones utilizadas en cada tubo de ensayo: Tabla 6. Proporciones empleadas para la determinación de la cinética de las enzimas. Tubo CMC 2% (ml) Buffer (ml). Blanco 0.1 1.9. 1 0.1 1.4. 2 3 4 5 6 0.3 0.5 0.7 0.9 1 1.2 1 0.8 0.6 0.5. Una vez preparados, se colocaban en un baño de temperatura controlada a 50°C durante 5 minutos y sin sacarlos de este se agregaban a todos los tubos con excepción del blanco, 0.5 ml de la enzima en solución y se agitaba. Se preparaban estas proporciones cuatro veces, y después de agregar la enzima se dejaban en el baño durante 2, 6, 10 y 30 minutos respectivamente, evaluando las mismas condiciones en el tiempo.. Al finalizar el tiempo de cada corrida, se agregaba a cada tubo 5 ml de DNS y se ponían en baño maría a ebullición por 15 minutos, se dejaban enfriar y se leía la absorbancia en el espectrofotómetro a 600 nm. A partir de estos resultados se calculaban los valores de la ecuación de Michaelis-Menten (velocidad inicial, velocidad máxima y concentración de sustrato).. También se determinó la cinética por medio del mismo procedimiento variando el uso de CMC (sustrato soluble), por la tusa (sustrato insoluble) y determinando así mismo los parámetros de la cinética de Michaelis.. 4.3.4 Técnicas analíticas Se realizan curvas de calibración de los métodos analíticos que se utilizan en la consecución del proyecto, DNS (ácido dinitrosalicílico), Kit de glucosa y determinación de furfural.. 31.

(32) IQ-2008-I-8 4.3.4.1 Ácido dinitrosalicílico Con el DNS se calculó la cantidad de azúcares reductores presentes en una muestra, pues los azúcares reducen el ácido 3,5-dinitrosalicílico de color amarillo, a 3-amino-5nitrosalicílico de color rojo ladrillo (Tena et al); por tanto un cambio en la coloración evidencia la presencia de azúcares reductores, que se confirma cuantitativamente con la lectura de la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 600 nm. La reacción que se da con esta técnica es:. Imagen 9. Reacción generada con DNS en presencia de azúcares reductores. Tomada de Tena et al.. Para utilizar DNS se hicieron diluciones de las muestras, tomando inicialmente 1 ml de muestra llevados a 20 ml con agua destilada. A partir de esto se tomaban 2 ml se agregaban 5 ml de la solución de DNS, se agitaban en el Vortex y se llevaban a un baño María a ebullición, se dejaban allí durante 15 minutos. Se enfriaban y se leía al espectrofotómetro a 600 nm, siendo el blanco 2 ml de agua destilada por 5 ml de solución de DNS, a las mismas condiciones de las demás muestras.. Imagen 10. Montaje para el DNS. 32.

(33) IQ-2008-I-8 4.3.4.2 Kit de glucosa Con el Kit de glucosa producido por Biosystems, se cuantificó únicamente glucosa. El principio de esta prueba es que el reactivo A, contenido en el Kit contiene fosfatos, fenol, glucosa oxidasa, peroxidasa y 4-aminoantipirina, que al estar en contacto con glucosa produce una reacción donde se produce quinonaimina que es un compuesto coloreado la cual absorbe a 500 nm y que torna la muestra a tonalidades rosadas, y según la intensidad del color se identifica mayor presencia de glucosa (Biosystems). La reacción se presenta a continuación:. Imagen 11. Reacción detectada con el kit de glucosa. Tomada de: Biosystems Reagents & Instruments.. Para esta prueba se tomaba 1 ml del reactivo A del kit a temperatura ambiente y se agregaban 10 µl de la muestra, se agitaban, se dejaban reaccionar 10 minutos y se leía al espectrofotómetro a 500 nm, siendo el blanco el reactivo A del kit.. Imagen 12. Muestras tratadas con kit de glucosa. En los dos casos anteriores a partir de la curva de calibración de cada técnica y teniendo en cuenta las diluciones realizadas en el caso del DNS, se calculaba el porcentaje de azúcares reductores para el DNS y el porcentaje de glucosa para la otra prueba. Un ejemplo de los cálculos detallados en los dos casos se encuentra en el Anexo 1.. 4.3.4.3 Determinación de furfural De acuerdo a la Norma Técnica Colombiana NTC 269 (ICONTEC, 2007), se determinó la cantidad de furfural presente en las muestras después del pretratamiento químico con. 33.

(34) IQ-2008-I-8 ácido sulfúrico, así como en el pretratamiento con Viscozyme, realizando una aproximación a esta norma, pues está diseñada para determinar furfural en bebidas alcohólicas. Este proceso se realizó para las tres concentraciones de ácido que había manejado Díaz (2007) en su estudio, es decir 0.6, 1 y 1.4% de ácido sulfúrico, a 105, 115 y 125°C. Para esto fue necesario realizar una curva de calibración de furfural a diferentes concentraciones para tener un rango en el que se pudieran evaluar las muestras. Las concentraciones trabajadas, para realizar esta curva de calibración se encontraban en el rango de 0.9 a 11 mg de furfural por litro de etanol al 50%.. Imagen 13. Muestras para realizar la curva de calibración de furfural.. En este procedimiento es muy importante tener todo el equipo de seguridad por la toxicidad de la sustancia, se utilizó cámara de extracción, careta y guantes de nitrilo. Las muestras después del pretratamiento se filtraron, y se tomaron 25 ml del líquido filtrado. Este líquido se centrifugó para evitar trazas de tusa que pudieran afectar la posterior lectura en el espectrofotómetro.. Imagen 14. Muestras en la centrífuga. En un balón aforado de 50 ml, se pusieron los 25 ml de muestra centrifugada y se aforó a 50 ml con etanol puro; se agregaron 2 ml de anilina y 2 ml de ácido acético glacial,. 34.

(35) IQ-2008-I-8 como se propone en la norma NTC 269. Se llevaban a refrigeración por 5 minutos, se agitaban y se leía al espectrofotómetro a 510 nm. Con esta lectura y la curva de calibración, se estimó la cantidad de furfural presente.. 35.

(36) IQ-2008-I-8 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 5.1 Análisis lignocelulósico de la tusa El Centro de Investigación Corpoica Tibaitatá, analizó el contenido de material lignocelulósico en la tusa utilizada encontrando:. Celulosa: 49.52% Hemicelulosa: 19.94% Lignina: 15.5%. A partir de estos valores se puede determinar qué cantidad de azúcares reductores está disponible en la materia prima y con esto posteriormente calcular el rendimiento del proceso, es decir qué porcentaje de hemicelulosa y celulosa se degrada realmente en el pretratamiento y la hidrólisis enzimática.. Se compararon estos valores con los encontrados por Loboguerrero (2007) y Díaz (2007), determinando que los cálculos posteriores se realizarán con los valores reportados por Corpoica Tibaitatá. En la Tabla 7, se presentan los resultados obtenidos en estudios anteriores.. Tabla 7. Material lignocelulósico presente en la tusa de palma africana. Loboguerrero. Díaz. Celulosa. NR. 46.77 ± 5.39%. Hemicelulosa. 16.473 ± 1.312%. 17.92 ± 4.89%. Lignina. 23.471 ± 1.802%. 4.15 ± 0.53%. Otros. NR. 31.16 ± 4.55%. NR: No reporta. Entre los reportados, el contenido de celulosa y hemicelulosa es bastante cercano al determinado por Corpoica, a diferencia del contenido de lignina donde los datos están más alejados. Además Díaz reporta la presencia de otros componentes en la tusa correspondientes a cenizas insolubles y cutina, que no se presentan en Loboguerrero ni por parte de Corpoica.. 36.

(37) IQ-2008-I-8 5.2 Evaluación del pretratamiento con Viscozyme ® L Se comprobó el efecto de Viscozyme ® L en la hidrólisis de la hemicelulosa. En las Gráficas 1 y 2, se presentan los resultados obtenidos con 1.5 y 2.5 ml de la enzima, donde el porcentaje de rendimiento reportado corresponde a:. % rendimiento de azúcares reductores totales = (g de azúcar reductor en 100 ml)*100 5 g de tusa. (1). ó (2). % R en d im ie n to A R. % rendimiento de glucosa = (g de glucosa en 100 ml)*100 5 g de tusa. 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0. 10. 20. 30 40 Tiempo (h). 50. 60. 70. Viscozyme 1.5 ml/ 5 g sólidos Viscozyme 2.5 ml/ 5 g sólidos. % Rendim ien to g lucosa. Gráfica 1. Rendimiento de azúcares reductores (AR) con Viscozyme sin pretratamiento 6 4 2 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. Tiempo (h) Viscozyme 2,5 ml / 5 g solidos Viscozyme 1,5 ml / 5 g solidos. Gráfica 2. Rendimiento de glucosa con Viscozyme sin pretratamiento. 37.

(38) IQ-2008-I-8 Se puede ver que a diferentes cantidades de enzima sea 1.5 o 2.5 ml el azúcar obtenido varía, aumentando a mayor cantidad de enzima. Aunque utilizando 1.5 ml de la enzima se logra una mayor producción de azúcares en el tiempo, se observa que con 2.5 ml se alcanza la mayor degradación de la hemicelulosa en solo un día de hidrólisis. Esta degradación se reconoce al analizar que el porcentaje de glucosa obtenida es reducido respecto a los azúcares reductores totales obtenidos, proporción comparable con la estructura de la hemicelulosa, la cual se compone en su mayoría por pentosas y tiene un bajo contenido de hexosas entre estas la glucosa; entonces al identificar con el kit de glucosa un bajo contenido de este azúcar, con DNS observar una producción de azúcares reductores totales de aproximadamente 14% y recordar que el complejo enzimático Viscozyme tiene una alta proporción de hemicelulasas que hidrolizan la hemicelulosa, se puede decir que se está consiguiendo degradar la hemicelulosa presente en la tusa. Es así como se evidencia que se lograron romper las paredes de la hemicelulosa de la tusa y convertirla en azúcares reductores, sin tener incrementos significativos a lo largo de la hidrólisis, principalmente para el caso en que se utilizó mayor cantidad de enzima.. En cuanto a la glucosa que se obtuvo, se observa en la Gráfica 2 que su producción fue prácticamente constante en el tiempo, alrededor del 2%. Esto corresponde a 14.39% (en 68.75 horas) de los azúcares totales que se obtuvieron, por lo cual aunque se está perdiendo un poco de este azúcar (que se quiere obtener al final del proceso), se logra una degradación de la hemicelulosa importante dejando la celulosa más disponible para el posterior proceso de hidrólisis enzimática con la mezcla de enzimas celulasas.. Con las gráficas presentadas, se determinaron los azúcares reductores que no son glucosa, por diferencia entre los azúcares reductores totales determinados por DNS y el porcentaje de glucosa determinado con el Kit de glucosa, y con este valor se calcula el porcentaje de degradación o conversión, conociendo que la tusa contiene 19.94% de hemicelulosa en su estructura. El cálculo para la conversión es:. %Conversión hemicelulosa = (%Rendimiento Azúcar reductor total – %Rendimiento Glucosa)*100 19.94. (3). 38.

(39) IQ-2008-I-8 Tabla 8. Porcentaje de azúcares reductores obtenidos con Viscozyme sin pretratamiento ácido.. Tiempo h 3.5 21.5 26.5 43.75 50.25 68.75. 1.5 ml Viscozyme 2.5 ml Viscozyme % Conversión de hemicelulosa % Conversión de hemicelulosa 37.022 58.187 32.781 49.763 44.034 56.697 43.230 59.659 40.024 57.182 51.010 60.568. Se puede observar que con el uso de esta enzima es posible convertir alrededor de un 60% de la hemicelulosa si se usan 2.5 ml de Viscozyme, y que un incremento en la cantidad de enzima aumenta la producción de azúcares reductores que se pueden llegar a obtener en el mismo tiempo.. Con los resultados obtenidos se sugiere que al cabo de tres horas, el pretratamiento con Viscozyme se puede detener, pues la obtención de azúcares reductores no aumenta con el tiempo en este caso.. 5.3 Cuantificación de furfural 5.3.1 Furfural en el pretratamiento ácido Se realizó la cuantificación de furfural a partir de la Norma Técnica Colombiana (NTC) 269. La curva de calibración mostró una relación lineal entre los miligramos de furfural por litro de etanol al 50% (eje Y) y la absorbancia de las muestras (eje X), que aumentaba al incrementar la concentración de furfural, relacionadas así: Y = 11.161X − 0.2701 R 2 = 0.9932. (4). Se analizó el efecto de la temperatura y la concentración del ácido sulfúrico en la producción de furfural, según los pretratamientos que propuso Díaz (2007). Los resultados obtenidos después del pretratamiento con ácido sulfúrico, se presentan en la Tabla 9:. 39.

(40) IQ-2008-I-8 Tabla 9. Contenido de furfural a diferentes temperaturas y concentraciones de ácido sulfúrico Concentración de furfural ppm (mg furfural/L EtOH 50%) Concentración H2SO4 (%). T=105°C. T=115°C. T=125°C. 0,6. 0,137. 2,297. 11,139. 1. 3,296. 9,779. 77,826. 1,4. 7,693. 15,640. 141,778. Se evidencia la producción de furfural durante la etapa del pretratamiento ácido, y su relación tanto con la temperatura como con la concentración del ácido sulfúrico, pues a medida que se aumentan estas dos variables, es decir se va volviendo el pretratamiento más severo, se incrementa también el contenido de furfural. A 125°C crece el contenido de este inhibidor de manera muy significativa, para las tres concentraciones de ácido trabajadas, por lo que no resultaría conveniente incrementar la temperatura del pretratamiento.. En la Imagen 15 se observan las coloraciones tomadas por las muestras a 105 y 125°C en cada una de las concentraciones de ácido. De izquierda a derecha se presenta el blanco, la muestra a 105°C y la de 125°C a 0.6% de ácido, seguidas por 105 y 125°C a 1% de ácido y finalmente 105 y 125°C a 1.4% de ácido sulfúrico. El color rojo salmón evidencia la presencia de furfural en las muestras, aunque en todas las muestras hay presencia de furfural así sea en bajas concentraciones.. Imagen 15. Coloraciones de las muestras de pretratamiento a 105 y 125°C en las concentraciones de ácido sulfúrico estudiadas.. En las condiciones de pretratamiento trabajadas en este proyecto, se producen cerca de 10 ppm de furfural, y se recomendaría seguir trabajando a estas condiciones, pues Díaz (2007) había estudiado el efecto de las tres temperaturas y concentraciones trabajadas en 40.

(41) IQ-2008-I-8 el rendimiento de azúcares reductores totales, y observó que 115°C y 1% de ácido sulfúrico se encuentran entre las condiciones con mayor rendimiento de estos azúcares. Además los valores más cercanos a este rendimiento según Díaz (2007), serían a 115°C y 1.4% de ácido, ó 125°C y 1 ó 1.4% de ácido, pero por el análisis de furfural realizado en este proyecto, se evidencia que estas otras opciones no son convenientes, pues se incrementa el contenido de furfural en las muestras, pudiendo llegar a afectar la etapa de fermentación de los azúcares obtenidos.. En otros estudios de producción de azúcares fermentables a partir de residuos lignocelulósicos, se ha reportado producción de furfural en cantidades más elevadas a las encontradas en este caso. En la Tabla 10 se reportan algunos de estos datos: Tabla 10. Concentración de furfural encontrada a diferentes condiciones de pretratamiento. Sustrato. Furfural 0.1 g/100 g olivo Biomasa del olivo 0.2 g/100 g olivo 0.5 g/100 g olivo 1.4 g/100 g olivo 1.3 g/L Tusa de palma 3 g/L africana 3.3 g/L Residuos de maíz 1.26 g/L. Condiciones 170°C, 0.2% H2SO4 170°C, 0.6 % H2SO4 170°C, 1% H2SO4 170°C, 1.4% H2SO4 120°C, 2% H2SO4 120°C, 4% H2SO4 120°C, 6% H2SO4 200°C, SO2, 5 min. Autor Cara et al (2007). Rahman et al (2006) Zacchi, (2007). A comparación de estos valores, la producción de furfural que se presenta con el pretratamiento utilizado en este proyecto es reducida, pues se trata de un pretratamiento más suave. Para 1% de ácido sulfúrico a 115°C, se produjeron 0.0216 g de furfural/ 5 g de material sólido; mientras Cara (2007) reporta 0.025 g de furfural/ 5 g olivo a 170°C. Las cifras reportadas por Rahman, no se podrían comparar directamente con los datos encontrados, pues la concentración de ácido es superior a la trabajada, y sobrepasa las condiciones de pretratamiento más severo empleadas. Se puede decir que se está produciendo menor cantidad de furfural que el promedio que muestran los otros estudios, los cuales no reportan inhibición posterior en el proceso, por lo que se puede decir que las condiciones de pretratamiento actuales no resultarían nocivas en la etapa de fermentación.. 41.

(42) IQ-2008-I-8 5.3.2 Furfural en el pretratamiento con Viscozyme ® L Para este caso se esperaba que no existiera furfural en las muestras, pues este inhibidor se produce por acción del ácido, pero se encontró que después de 29.5 horas a 50°C con Viscozyme, se produjeron 2.13 mg de furfural/ L etanol 50%; este valor es casi la quinta parte del producido con el pretratamiento ácido. Con este resultado se observa que se degradaron las pentosas contenidas en la hemicelulosa, produciendo el furfural.. 5.3.3 Análisis de varianza ANOVA Para determinar el efecto de las variables estudiadas (temperatura y concentración de ácido sulfúrico) sobre la variable de respuesta que es la producción de furfural, se realizó un análisis ANOVA con el programa Minitab ® v.15, por medio de un diseño factorial de 32, teniendo en cuenta los factores de estudio en este proceso.. Como hipótesis nula se plantea la igualdad de las medias para cada factor y para la interacción entre los factores, temperatura y concentración de ácido. Se determinaron entonces los valores p y al ser menores a 0.05, se rechaza la hipótesis nula con un 95% de confianza. Se estableció que las dos variables estudiadas, afectan de la misma manera el proceso pues reportan el mismo valor p.. Gráfica 3. Efecto de la concentración de ácido y de la temperatura sobre la producción de furfural.. 42.

(43) IQ-2008-I-8. De la Gráfica 3, se puede observar que a medida que aumentan tanto la concentración de ácido como la temperatura, se incrementa la producción de furfural. Esta relación ya había sido reportada por Cara (2007), quien confirmó también la relación entre producción de furfural, temperatura y concentración de ácido.. Gráfica 4. Interacción concentración de ácido-temperatura. Se puede observar que entre más pendiente es la gráfica más afecta la interacción, lo cual ocurre al usar el nivel más alto de concentración de ácido (1.4%), pues el efecto de la temperatura es mayor. Es decir si se utiliza 1.4% de ácido, hay una diferencia más notoria entre utilizar de 115 a 125°C, que al utilizar temperaturas inferiores.. Según este análisis, para obtener la menor cantidad de furfural, es recomendable utilizar un pretratamiento a 105°C con 0.6% de ácido sulfúrico, sin embargo para tener la mayor producción de azúcares reductores se recomienda trabajar a 115°C y 1% de ácido sulfúrico como lo comprobó Díaz (2007).. 43.