Identificación y caracterización antagónica de hongos aislados de la cuenca del río Tietê

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AISLADOS DE LA CUENCA DEL RIO TIETÊ

RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO Bucaramanga,

Colombia Diciembre 3 de

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AISLADOS DE LA CUENCA DEL RIO TIETÊ

RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

Informe técnico de grado Presentado como requisito parcial para optar el título de

Bacteriólogo y Laboratorista clínico

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO Bucaramanga,

Colombia Diciembre 3 de

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Gracias a Dios y a mamita María por

darme fortaleza y sabiduría en los

momentos de dificultad.

A mis padres por su amor, dedicación,

apoyo y entrega lo cual me ayudo a

culminar esta etapa de mi vida

incondicional.

A mis hermanos por confiar en mí y

siempre estar ahí dándome una mano.

(5)

Agradezco a Diana Carolina Duque Castaño por sus conocimientos,

comprensión, apoyo, dedicación y cariño.

Profesor Welintong Luiz de Araujo por su valiosa gestión para facilitar la

realización de este trabajo y su valiosa orientación.

A la Universidad De Santander UDES, este lugar tan particular, tan difícil de

(6)

1. INTRODUCCIÓN ... 1

2. OBJETIVOS ... 3

2.1 Objetivo general ... 3

2.2 Objetivos específicos ... 3

3. JUSTIFICACIÓN ... 4

4. METODOLOGÍA ... 5

4.1 Muestras y preservación de las muestras ... 5

4.2 Extracción y manipulación del ADN genómico ... 5

4.3 Amplificación de la región its1-5,8s-its2 del ADN ribosómico ... 5

4.4 Actividad antagónica ... 6

5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS ... 7

5.1 Extracción y manipulación del ADN genómico ... 7

5.2 Amplificación PCR ... 7

5.3 Análisis genómico de los hongos aislados de la cuenca del rio Tiete ... 8

5.4 Actividad antagónica ... 11

6. DISCUSIÓN ... 12

7. CONCLUSIONES ... 14

(7)

Índice de figuras

Figura 1. ADN genómico de alto peso molecular.. ... 7

Figura 2. Amplificación de la región ITS1-5,8S-ITS2.. ... 7

Figura 3. Clasificación de los hongos por Orden. ... 8

Figura 4. Clasificación de los hongos por género.. ... 8

Figura 5. Hongos por calidad del agua de donde fueron aislados.. ... 9

Figura 6.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con óptima calidad de agua. 9 Figura 7.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con buena calidad de agua.. ... 10

Figura 8.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con pésima calidad de agua.. ... 10

Figura 9.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con mala calidad de agua.. 10

(8)

Índice de anexos

Anexo A Secuencias ... 1

Anexo B. Antagonismo ... 1

(9)

RESUMEN

TÍTULO: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ANTAGÓNICA DE HONGOS AISLADOS DE LA CUENCA DEL RÍO TIETÊ

AUTORA: RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

KEY WORDS: Microorganismo, control biológico, antagonismo, caracterización de hongos, factores físico químicos.

DESCRIPCIÓN: Los rápidos cambios en el factor ambiental y la falta de estudios sobre la diversidad y el antagonismo de los hongos presentes en el ambiente acuático, son uno de los elementos que motivan este estudio. Como objetivo principal, se propone la evaluación de la capacidad antagónica de hongos aislados de la cuenca del río Tietê, cuyo análisis permita proponer métodos alternativos de control biológico que posibiliten una minimización de las problemáticas económicas y ambientales causadas a la industria biotecnológica. Además de lo anterior, se plantea una contribución en la optimización de buenas prácticas agrícolas y de aplicación y manejo biotecnológico.

Como vemos, en el estudio realizado se involucran las disciplinas de la Ecología Microbiana y la Genética de Microorganismos, con el fin de caracterizar la diversidad microbiana en el Río Tietê. Para lograr lo anterior, se preservaron 50 hongos de la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP). Estas cepas fueron recuperadas y aisladas, eliminando su contaminación con bacterias, hongos y levaduras.

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ABSTRACT

TITTLE: IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION ANTAGONIST OF ISOLATED FUNGI FROM THE RIVER BASIN TIETÊ

AUTHORS: RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

KEY WORDS: Microorganism, biological control, antagonism, chharacterization of fungus, physical chemical factor.

DESCRIPTION: The fast changes in the environmental factor and the shortage of studies about diversity and antagonism of fungus present in the aquatic circles are one of the elements that motivate this study. As a principal objective, it is proposed the evaluation of the antagonistic ability of the isolated fungi from the river basin Tietê whose análisis permit propose alternating method to biological control that make posible a minimization of the economic and environmental problems caused to the biotechnological industry. As well as, it is posed a contribution in the optimization to good farming practices and the application and biotechnological use.

As we see, in the study completed the disciplines of microbial ecology and the genetics of microorganisms are involved in order to characterize the microbial diversity in the river Tietê. To achieve the above, 50 fungi were preserved from the collection of the Laboratory of Molecular Biology and Microbial Ecology of the University of Sao Paulo (LABMEM/USP).These strains were recovered and isolated, eliminating their contamination with bacteria, fungi and yeast.

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1. INTRODUCCIÓN

El Río Tietê es uno de los más conocidos de América Latina y del mundo, con enorme importancia económica para la región Sudeste de Brasil y principalmente para el estado de São Paulo (Grupo Opersan, 2016), desempeña un importante papel en el abastecimiento y producción de energía eléctrica para la población (König de Oliveira, 2014). Es el más extenso del territorio Paulista, nace limpia y crista en Salesopolis. (Ickiwaki, 2017), pasa por Biritiba-Mirim, donde ya es posible ver los primeros signos de contaminación de las aguas causadas por fertilizantes y agrotóxicos. (König de Oliveira, 2014). En la ciudad de Mogi das Cruzes, se inicia el lanzamiento de las alcantarillas domésticas e industriales sin ningún tratamiento. (Vera, 2015). En Guarulhos, en el tramo de São Paulo, el índice de contaminación alcanza su nivel más alto. (Ickiwaki, 2017).

Los microorganismos representan la mayor biodiversidad de la tierra y por eso están presentes en todos los ambientes terrestres desarrollando innumerables procesos (Vera, 2015). En aguas dulces, los microorganismos actúan en la descomposición de materia orgánica y equilibrio ambiental, pudiendo ser sensibles a los cambios ocurridos en el medio ambiente, alterando su estructura. (Bucci, Szempruch, Caldwell, & Ellis, 2014).

Algunos microorganismos desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de los ambientes de agua dulce, reciclando compuestos orgánicos y actuando en los ciclos biogeoquímicos de estos ecosistemas (Ickiwaki, 2017). La biodiversidad de estos ambientes puede ser fácilmente impactada por contaminantes como herbicidas, plaguicidas, metales pesados, exceso de materia orgánica e incluso por la introducción de bacterias no nativas al ambiente (Sadowsky, 2013). Estos factores pueden modificar significativamente la estructura de la comunidad microbiana, tanto en la columna de agua como en el sedimento de los ríos, alterando la presencia de microorganismos en este ecosistema (Bucci, Szempruch, Caldwell, & Ellis, 2014).

Existen pocos estudios sobre la biodiversidad de microorganismos del Río Tietê, lo que implican escaso conocimiento (Díaz Cárdenas & Baena, 2015) sumado a la falta de datos de secuencias moleculares, que complica los estudios comparativos de microorganismos, especialmente hongos acuáticos (Cunha, et al. 2011)

(12)

de hongos y cómo las variaciones ambientales pueden afectar a esta comunidad en los ecosistemas acuáticos. (Vera, 2015)

(13)

2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general

 Evaluar la capacidad antagónica de los hongos aislados de la cuenca del

Río Tietê con el fin de buscar nuevas alternativas en control biológico en cultivos.

2.2 Objetivos específicos

 Extraer DNA genómico de los hongos de la cuenca del Río Tietê.

 Realizar la identificación molecular de los hongos de la cuenca del Río Tietê

mediante ITS.

 Evaluar la actividad antagónica contra el hongo fitopatógeno Ceratocystis

paradoxa.

(14)

3. JUSTIFICACIÓN

Estudios realizados en el Rio Tietê, han evaluado la diversidad microbiana, con el fin de buscan caracterizar la diversidad de hongos y bacterias por diferentes métodos que son independientes de cultivo. Este estudio ha sido la base inicial para el desarrollo de investigaciones para el control de plagas y enfermedades (de la Cruz Leyva, Zamudio Maya, Corona Cruz, González de la Cruz, & Rojas Herrera, 2014). El manejo biológico de los cultivos, se presenta como una alternativa ecológica y eficaz frente a los numerosos y crecientes problemas causados por hongos patógenos presentes en la cuenta del rio que no han sido identificados (Pereira Chaves, 2013). Por lo tanto, el presente trabajo forma parte de un amplio estudio que involucra las áreas de Ecología Microbiana y Genética de Microorganismos, que buscan caracterizar la diversidad microbiana en el Río Tietê. Las bacterias y hongos aislados en estos estudios son mantenidos en la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP).

El presente estudio busca mejorar la identificación de algunos de los hongos de la colección del LABMEM/USP aislados del Rio Tietê y realizar una caracterización de su potencial uso como agentes de control biológico contra un hongo fitopatógeno, con el propósito de proponer alternativas para el manejo de la pudrición de las plantas en los cultivos, contribuyendo a la optimización de Buenas Prácticas Agrícolas y manejo biotecnológico.

El principal objetivo del estudio consiste en desarrollar y promover estrategias para el manejo integrado de plagas y enfermedades dentro de un enfoque efectivo y ecológicamente seguro basado tanto en una combinación de prácticas de control como el uso de agentes biocontroladores (Ceballos, 2009), por lo que la ejecución de este trabajo de investigación es de gran importancia ya que por medio del aislamiento y caracterización de los hongos aislados de la cuenca del rio Tiete

actúen como agentes biocontroladores de Ceratocysti paradoxa. Por lo tanto se ha

(15)

4. METODOLOGÍA 4.1 Muestras y preservación de las muestras

Se preservaron 50 hongos de la colección del Laboratorio de Biología Molecular y

Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP). Estas cepas fueron recuperadas y aisladas, eliminando contaminación con bacterias, hongos y levaduras. El método de Castellani, garantiza la preservación adecuada de los hongos filamentosos (Panizo y Colaboradores en 2005), es un método simple y eficaz que da estabilidad y supervivencia por largos periodos de tiempo a los diferentes géneros de hongos aislados. (Bueno y Gallardo en 1996).

Cada aislado fue preservado usando dos métodos: conservación a metabolismo reducido en agua desionizada conocida como “proceso de Castellani” y criopreservación en glicerol al 30%. Para ambas técnicas se tomaron en torno a 6 fragmentos cuadrados de aproximadamente 0.5 cm de lado del cultivo axénico en el medio BDA y se depositaron en microtubos con agua desionizada, para el proceso de Castellani y con una solución acuosa de glicerol al 30% v/v, para la criopreservación. Los microtubos del proceso de Castellani fueron almacenados a 4 °C, los microtubos criopreservados fueron almacenados a -20 °C. Todos los

preservados fueron conservados en la colección del Laboratorio de Biología

Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP).

4.2 Extracción y manipulación del ADN genómico

Los fragmentos de micelio de cultivos de 7 a 15 días crecidos en medio BDA a 28 °C, fueron inoculados sobre membranas de celofán esterilizadas en autoclave y colocadas en la superficie de placas con medio BDA. El cultivo fue incubado por 7 a 15 días a 28 °C. Después del cultivo, el micelio fue triturado en nitrógeno líquido y el ADN genómico fue extraído con "Wizard® Genomic DNA Purification Kit" (Promega) y la calidad de la muestra fue evaluada en gel de agarosa (1% p / v) con "SYBR® "Safe DNA Gel Stain" (Thermo Fisher Scientific).

4.3 Amplificación de la región its1-5,8s-its2 del ADN ribosómico

La región ITS1-5,8S-ITS2 del ADN ribosómico fue amplificada con los primers

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30 segundos; 30 segundos a 55 °C; 1 minuto a 72 °C y una extensión final de 10 minutos a 72 °C en termociclador (VERITI 96-WELL THERMAL CYCLER, 0.2ML, Applied Biosystems). Los productos de PCR se analizaron en gel de Agarosa (1% p/v) con "SYBR® Safe ADN Gel Stain" (Thermo Fisher Scientific), junto con el marcador de peso molecular "1 Kb Plus DNA Ladder" (Thermo Fisher Scientific)). Y posteriormente, fueron purificados utilizando "Wizard® SV Gel y PCR Clean-Up System" (Promega). Las muestras fueron enviadas para secuenciación por el método de SANGER.

4.4 Actividad antagónica

Se desarrollaron pruebas de antagonismo usando la metodología de confrontación

en placa, se empleó medio BDA para evaluar a los hongos de la colección del

Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana contra el hongo

fitopatógeno Ceratocystis paradoxa. Se colocó un disco de 7mm de diámetro del

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5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS 5.1 Extracción y manipulación del ADN genómico

Se realizó la extracción de ADN genómico de los 50 hongos. Se obtuvo ADN de alto peso molecular, apto para realizar la amplificación de la región ITS1-5,8S-ITS2 utilizada en la identificación (figura1).

Figura 1. ADN genómico de alto peso molecular. Extracción de algunas de las cepas de hongos aislados del Río Tietê. Se usó gel de agarosa al 1% con Sybersafe.

5.2 Amplificación PCR

Se amplifico de la región ITS1-5,8S-ITS2 de 40 de los hongos utilizados en el análisis, también se realizó purificación de estas. (Figura2).

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5.3 Análisis genómico de los hongos aislados de la cuenca del rio Tiete

Para el análisis de los datos de secuenciación se usaron las bases de datos The

Ribosomal Database Project (RDP), National Center Biotechnology Information

(NCBI) empleando la herramienta BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y UNITE. De los 40 hongos 20 correspondieron al orden Pleosporales, 6 Eurotiales, 5 Hypocreales, 2 Sordariales, 1 Xylariales, 1 Saccharomycetales, 1 Polyporales, 1 Diaporthales, 1 Coniochaetales y 1 Chaetothyriales. (Figura3.) En la clasificación

preliminar de los hongos por género, Penicillium fue el más frecuente, seguido de

Microsphaeropsis, Pyrenochaeta, preussia, Gliomastix, Ochrocladosporium, Fimetariella, Didymella, Paraconiothyrium y Gibberella(Figura4.)

Figura 3. Clasificación de los hongos por Orden. Las barras indican el número de hongos aislados de la cuenca del Río Tietê.

Figura 4. Categorización de los hongos por género. Secuencias de los hongos aislados de la cuenca del Río Tietê. (NCBI).

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Los hongos aislados de la cuenca del Río Tietê, fueron obtenidos de puntos de muestreo con diferente calidad de agua (CETESB). De los 40 aislados identificados18 fueron aislados de puntos con buena calidad de agua, 12 de puntos con calidad pésima, 7 con calidad mala y 3 con calidad óptima (Figura 5).

Figura 5. Hongos por calidad del agua de donde fueron aislados. Número de hongos aislados según la calidad del agua en el punto de muestreo.

Figura 6.Ordenes de hongos de puntos de colecta con calidad óptima de agua. Se identificaron hongos de los órdenes Pleosporales, Capnoidales y Eutoriales

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

BUENA PESIMA MALA OPTIMA

0 1 2

(20)

Figura 7.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con buena calidad de agua. Se encontraron en mayor número Pleosporales y Hypocreales.

Figura 8.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con pésima calidad de agua. El orden Hypocreales fue el más común entre estos aislados.

Figura 9.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con mala calidad de agua. El orden Pleosporales fue el más común entre estos aislados.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Pleosporales Hypocreales Xylariales Eurotiales

0 1 2 3 4

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

(21)

5.4 Actividad antagónica

Cada confrontación en placa se registró solamente como positivo, si ejerció algún grado de inhibición sobre el crecimiento del hongo; o como negativo, si no ejerció ninguna inhibición

FNBA 10-3 (Aspergillus creber)

Positivo

FNBA 25-01 (Phoma sp.) Positivo

FNBA 27-03 (Dothideomycetes sp.)

Positivo

FNBA 19-03 (Coniochaetahoffmannii)

Positivo

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6. DISCUSIÓN

En el presente trabajo fueron identificados hongos del Río Tietê, aislados en el estudio de Ortiz Vera (2015), cuya identificación no había sido satisfactoria. Los hongos identificados pertenecen al filo Ascomycota y Basidiomycota (anexo1). Estos resultados son congruentes con el de Ortiz Vera, ya que el cual el 94% de los hongos aislados pertenecen al filo Ascomycota y el 6% al filo Basidiomycota.

Algunos de los géneros más comunes en la clasificación preliminar de aislados de

ambientes limpios son Penicillium y Aspergillus. Estudios evaluaron que la

diversidad y riqueza de la comunidad fúngica del agua de la Cuenca del Río Tietê específicamente los ambientes acuáticos altamente contaminados alteran aquellos géneros presentes (de Carvalho, 2016), siendo principalmente aislado el género

Davidiella, seguido por Ascomycota, Penicillium y Pleosporales (Vera Ortiz,

2015),En la clasificación preliminar de los hongos por género en este estudio el más

frecuente es Penicillium, seguido de Microsphaeropsis, Pyrenochaeta, preussia,

Gliomastix, Ochrocladosporium, Fimetariella, Didymella, Paraconiothyrium y Gibberella.

La clasificación de la calidad de agua establecida por la compañía ambiental del

estado de São Paulo (CETESB) (tabla1.), se basa en los parámetros de: demanda

bioquímica de oxigeno (D.B.O), fósforo total, nitrógeno amoniacal, nitrógeno total, oxígeno disuelto (O.D.), pH, temperatura, conductividad, nitrato y turbidez. (Vera

Ortiz, 2015). La calidad del agua de los puntos de muestreo del Río Tietê donde se

aislaron las muestras del presente estudio obedece a esta clasificación (anexo1).

La mayoría de las muestras secuenciadas pertenecen a ambientes de calidad buena, seguido de ambientes de calidad pésima. Sin embargo, se pudo observar que el orden más frecuente en estos ambientes pertenece al orden Pleosporales.

Tabla1: Informes de Calidad de las aguas superficiales en el Estado de São Paulo

Categoria

Ponderación

OPTIMO 79<IQA≤100

BUENA 51<IQA≤79

REGULAR 36<IQA≤51

MALA 19<IQA≤36

PESIMA <IQA≤19

Los resultados de la evaluación de la actividad antagónica de las cepas de

hongos aisladas frente al hongo fitopatogénico Ceratocystis paradoxa, (anexo 2 y

(23)

Algunos artículos establecen que es difícil establecer la actividad antagónica mediante la evaluación cualitativa, para incrementar la exactitud de las mediciones de estos ensayos es preferible reportar el crecimiento radial de la inhibición

mediante el uso de micrómetros. (Macedo Castillo, Martínez Hernández, & Lara

Reyna, 2010), este tipo de medición, asume que el crecimiento radial es una variable constante en todas sus direcciones. El uso de abordaje cuantitativo podría ser el paso a seguir en la caracterización de la actividad antagónica de estos hongos.

El género de Aspergillus es de interés para uso como agente de biocontrol, ya que

puede controlar hongos causantes de enfermedades específicas de los cultivos, en sitios específicos causados por hongos fisiopatogénos. (Quiroz Sarmiento, Ferrera Cerrato, Alarcón, & Lara Hernández, 2008). Este género fue encontrado en la

identificación preliminar de los hongos con actividad antagónica contra Ceratocystis

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7. CONCLUSIONES

1. Los hongos utilizados en el presente estudio y preservados en la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP), fueron identificados mediante técnicas de biología molecular, con lo que se podrá aumentar el entendimiento sobre la diversidad de las comunidades de hongos del Río Tietê.

2. Se logro la caracterización de la actividad antagónica de los hongos contra

el fitotagógeno Ceratocystis paradoxa, es un paso inicial en la búsqueda de

(25)

8. LISTA DE REFERENCIAS

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VERA ORTIZ, Mabel Patricia. (2015). Caracterização da comunidade fúngica do

(27)

ANEXOS

Anexo A Secuencias

Classifier: RDP Naive Bayesian rRNA Classifier Version 2.10, Noviembre 2018 Taxonomical Hierarchy: UNITE Fungal ITS trainset 23/11/2018

Query File: resultados.fas Submit Date:

Confidence threshold (for classification to Root ONLY): 80%

CALIDAD DEL AGUA COD REINO % FILO % CLASE % ORDEN % FAMILIA % GENERO % ESPECIE % IDENTIDAD NCBI % COVERTURA % IDENTIDAD UNITE % SCORE BOM FNBA 17-27 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 95Pleosporales 86Sporormiaceae 32Preussia 28Preussia isomera 26Phoma sp. 99 Pleosporales 99.8

(28)

Anexo B. Antagonismo

FNBS 06-06 X Negativo x Negativo X Negativo

FNBS 06-16 X Negativo x Negativo X Negativo

FNBA 10-1 X Negativo x Negativo X Negativo

FNBA 10-3 x Positivo x Positivo (inhibe esporulación) X Negativo

FNBA 16-03 x Positivo x Negativo X Negativo

FNBA 17-12b X Negativo x Negativo X Negativo

FNBA 17-21 x Positivo x Positivo X Negativo

FNBA 17-27 X Negativo x Negativo X Positivo

FNBA 17-31 X Negativo x Positivo X Positivo

FNBA 18-04 x Positivo x Negativo X Negativo

FNBA 19-03 x Positivo x Positivo X Negativo

FNBA 19-04 x Negativo x Negativo X Negativo

FNBA 25-01 x Positivo x Positivo X Positivo

FNBA 27-03 X Positivo x Positivo X Positivo

FNBA 32-03 X Positivo x Negativo X Negativo

FNBA 33-6 X Positivo x Positivo X Negativo

(29)

Anexo C. Fotografías de los 50 hongos preservados y antagonismo.

COD. FOTO ANVERSO FOTO REVERSO ANTAGONISMO

FNBS 06-06

FNBS 06-16

FNBA 10-1

FNBA 10-3

FNBA 11-1

FNBA 12-1

FNBA 12-3

FNBA 12-5

(30)

FNBA 13-3

FNBA 13-04

FNBA 16-03

FNBA 16-05

FNBA 17-12b

FNBA 17-15

FNBA 17-21

FNBA 17-23

FNBA 17-24

FNBA 17-25

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FNBA 17-27

FNBA 17-31

FNBA 17-33

FNBA 18-01

FNBA 18-03

FNBA 18-04

FNBA 18-05

FNBA 19-01

FNBA 19-02

FNBA 19-03

(32)

FNBA 19-05

FNBA 20-01

FNBA 20-03

FNBA 20-04

FNBA 22-01

FNBA 22-02

FNBA 22-04

FNBA 23-7

FNBA 25-01

(33)

FNBA 25-05

FNBA 27-2

FNBA 27-03

FNBA 29-04

FNBA 29-06

FNBA 32-02

FNBA 32-03