EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ACEITES VEGETALES A VACAS PASTOREANDO CON/SIN SISTEMA SILVOPASTORIL INTENSIVO CON LEUCAENA SOBRE LOS ÁCIDOS GRASOS EN

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EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ACEITES

VEGETALES A VACAS PASTOREANDO CON/SIN SISTEMA

SILVOPASTORIL INTENSIVO CON LEUCAENA SOBRE LOS

ÁCIDOS GRASOS EN LA LECHE Y LA PRODUCCIÓN DE

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EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ACEITES VEGETALES A VACAS PASTOREANDO CON/SIN SISTEMA SILVOPASTORIL INTENSIVO CON LEUCAENA SOBRE LOS ÁCIDOS GRASOS EN LA LECHE Y LA PRODUCCIÓN DE

METANO IN VITRO

ESPERANZA DEL PILAR PRIETO MANRIQUE

Estudiante

Tutora

LILIANA MAHECHA LEDESMA

Co-tutor

JOAQUIN ANGULO ARIZALA Comité tutorial

LILIANA MAHECHA LEDESMA JOAQUIN ANGULO ARIZALA JULIO ERNESTO VARGAS SANCHEZ JAIME RICARDO ROSERO NOGUERA

DOCTORADO EN CIENCIAS ANIMALES UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

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Agradecimientos

Mis más sinceros agradecimientos a la Universidad de Sucre que financió mis estudios, a Colciencias, a la Universdad de Caldas y a la Universidad de Antioquia quienes financiaron el proyecto de investigación. A todos los docentes que acompañaron mi proceso de formación de doctorado, especialmente a la D. Agri. Liliana Mahecha Ledesma y a los profesores Joaquín Angulo Arizala, Julio E Vargas Sánchez y Ricardo Rosero Noguera, miembros de mi comité tutorial por su orientación. Al M.Sc. Julio Vargas Sánchez - profesor Universidad de Caldas y líder del proyecto de investigación. Al DR. Gerardo Gagliostro – investigador INTA, por sus enseñanzas sobre el tema. A Luis Edwin Avila, Juan Carlos Gómez, Juan Pablo Vélez, David Mayorga, Carlos Mario Bohada, Alejandro Montoya, Elsa Tequín y demás estudiantes de la Universidad de Caldas que participaron en la ejecución de la fase de campo y de laboratorio del proyecto. A mis compañeros de UDEA Fredy Ramírez, Elizabeth Correa y Omar Ceballos por su acompañamiento y apoyo en la fase in vitro. A José Alfredo Jiménez Fonseca, Asistente técnico de Fedegan, por su valioso apoyo en las fincas de Guajira. A Juan Carlos Pérez y Henry Cuello, estudiante y egresado de la Universidad de Sucre, quienes apoyaron la fase de campo en Guajira. A los ganaderos Carlos Alberto Gómez Buendía (Finca Asturias), Milciades Salas (Finca Pradera ), Andrés Jaramillo Bernal (Finca Maracaibo), Roberto Gutiérrez (Fincas Vargas y Japón), Claudia Patricia Arcila (Finca Esperanza), Juan José Molina y Flia (Finca Hatico), Salvador Raad (Finca Salsipuedes), Abraham Ovalle (finca Campo Alegre) , a los administradores Juan Fernando Suárez (Finca Lucerna), José Fernando Cardona (Finca San Felipe), Alirio Nieto (Finca La Pradera) y a sus trabajadores quienes muy gentilmente, apoyaron el desarrollo de este trabajo. A mi compañero de trabajo DR. René Patiño, por su constante tutoría, al DR. Mario Cerón Muñoz - profesor de la Universidad de Antioquía y a dos grandes sucreños: DR. Oscar Vergara Garay – profesor Universidad de Córdoba -

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y M.Sc. Wilson Barragán – Investigador de Corpoica -, quienes me acompañaron en el procesamiento estadístico.

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Dedicatoria

Dedico este trabajo a mi familia y especialmente a mi amado esposo y a nuestro hijo Juan Andrés, para quienes la ganadería forma parte de su cotidianidad. A mis estudiantes de la universidad de Sucre que en poco tiempo serán los profesionales encargados de contribuir con el desarrollo de la ganadería y al sector ganadero, especialmente al sector lechero.

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Tabla de Contenido

Efecto de la suplementación lipídica sobre la concentración de ácido linoleico conjugado (CLA-c9t11) en leche de vaca y la producción de metano: Revisión ... 14

RESUMEN ... 15

INTRODUCCIÓN ... 16

ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO ... 18

ORIGEN DEL CLA-c9t11 EN RUMIANTES ... 19

Formación de CLA como consecuencia de la bio-hidrogenación ruminal (BHR) de ácidos grasos. .... 19

Síntesis endógena en la glándula mamaria ... 27

ESTRATEGIAS PARA AUMENTAR CLA-c9t11 Y ATV EN LECHE ... 28

EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE CLA-c9t11 Y ATV ... 29

EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE PRODUCCIÓN Y COMPOSICIÓN DE LA LECHE ... 38

EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE LA PRODUCCIÓN DE METANO ... 39

CONSIDERACIONES FINALES ... 44

REFERENCIAS ... 45

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Caracterización de la grasa y ácidos grasos en la leche de vacas de los sistemas doble propósito y lechería tropical, pastoreando con /sin sistema silvopastoril intensivo con

leucaena ... 62 RESUMEN ... 63 INTRODUCCIÓN ... 65 MATERIALES Y MÉTODOS ... 68 Localización ... 68 Análisis estadístico ... 77 RESULTADOS ... 78 Lechería Tropical ... 78

Sistema Lechería Tropical SSPi ... 83

Sistema Doble Propósito ... 87

Sistema Doble Propósito SSPi ... 90

DISCUSIÓN ... 93

Contenido de grasa en leche ... 93

Consumo de alimento ... 93

Concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y de sus precursores en la dieta... 95

Concentración de CLA, TVA y otros AGCL en la leche y número de partos... 102

Concentración de CLA, TVA y otros AGCL en la leche y tercio de lactancia ... 102

CONCLUSIONES ... 103

REFERENCIAS ... 104

| Capítulo 3 ... 114

Ácidos grasos, fermentación ruminal y producción de metano in vitro, de forrajes de silvopasturas intensivas con leucaena ... 114

RESUMEN ... 115

ABSTRACT ... 116

MATERIALES Y MÉTODOS ... 119

Localización ... 119

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Determinación de metano, pH, ácidos grasos volátiles y perfil de ácidos grasos (ALC, ATV y AGCL)

... 126

Estimación de la biohidrogenación ... 128

Análisis estadístico ... 128

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 129

Ácido linoleico conjugado, trasvaccénico y otros ácidos grasos de cadena larga después de la fermentación ruminal ... 129

Parámetros de fermentación y producción de metano ... 137

AGRADECIMIENTOS ... 143

REFERENCIAS ... 144

Efecto de la inclusión in vitro de aceites vegetales a dietas de base forrajera con/sin sistema silvopastil intensivo con leucaena, sobre ácidos grasos, fermentación ruminal y producción de metano ... 155

RESUMEN ... 156

MATERIALES Y MÉTODOS ... 160

Localización ... 160

Determinación de la cinética de fermentación y degradación in vitro ... 165

Determinación de metano, pH, ácidos grasos volátiles (AGV) y perfil de ácidos grasos (CLA-c9t11, ATV y AGCL) ... 166

Análisis estadístico ... 168

RESULTADOS ... 169

Concentraciones de CLA-c9t11 , ATV y otros AGCL producto de la fermentación ruminal ... 169

Parámetros de fermentación y producción de metano ... 173

DISCUSIÓN ... 175

Perfil de ácidos grasos producto de la fermentación ruminal ... 175

Parámetros de fermentación ... 178

Producción de metano ... 180

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REFERENCIAS ... 184

Efecto de la suplementación con aceite de girasol sobre el perfil de ácidos grasos de la leche de vacas en sistemas de lechería tropical y doble propósito manejadas con y sin sistema silvopastoril intensivo con leucaena ... 193

RESUMEN ... 194 INTRODUCCIÓN ... 196 MATERIALES Y MÉTODOS ... 199 Localización ... 199 Análisis estadístico ... 208 Análisis económico ... 209 RESULTADOS ... 210

Ensayo 1. Sistema Lechería Tropical ... 210

Ensayo 2. Sistema Lechería Tropical SSPi ... 213

Tabla 5.12. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día) a partir del consumo total utilizando cromo como marcador, en los diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical SSPi ... 213

Ensayo 3. Sistema Doble Propósito SSPi ... 216

DISCUSIÓN ... 225

Consumo de forraje ... 225

Producción y composición de la leche ... 227

Perfil de ácidos grasos ... 230

Análisis económico ... 232

CONCLUSIÓN ... 233

REFERENCIAS ... 234

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viii Formato 013 Coordinación de Posgrado Facultad de Ciencias Agrarias

Lista de tablas

Pag Tabla 1.1. Porcentaje de ácidos grasos presentes en aceite de diferentes semillas... 30 Tabla 1.2. Variación en el porcentaje de CLA , ATV , AG insaturados, saturados del

total de grasa de la leche, % grasa, producción de leche y rendimiento en grasa , en la leche de vaca suplemetadas con diferentes fuentes de AG ... 36 Tabla 2.1. Localización y características generales de las fincas en estudio... 69 Tabla 2.2. Suplementacón ofrecida en las fincas en estudio……….. 70 Tabla 2.3. Composición química y ácidos grasos de los forrajes de los sistemas de

producción en estudio... 72 Tabla 2.4. Composición química y ácidos grasos de los suplementos... 73 Tabla 2.5. Consumo estimado de forraje y de ácidos grasos oleico, linoleico y linolénico... 74 Tabla 2.6. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema lechería

tropical... 79 Tabla 2.7. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema lechería

tropical SSPi... 85 Tabla 2.8. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema doble

propósito... 88 Tabla 2.9. Contenido de grasa y de ácidos grasos en la leche en el sistema doble

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Tabla 3.1. Composición nutricional y perfil de ácidos grasos de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril, utilizados en la evaluación in vitro, antes de la incubación por

veinticuatro horas... 121 Tabla 3.2. Ácidos grasos (g de AG/100 g de AG Totales) obtenidos en la fermentación

ruminal in vitro de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril, después de la incubación por veinticuatro

horas... 132 Tabla 3.3. Biohidrogenación obtenida en la fermentación ruminal in vitro de los ácidos

grasos insaturados C18 de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril, después de la incubación por

veinticuatro horas... 134 Tabla 3.4. Cinética de fermentación, producción de metano, concentración y proporción

de ácidos grasos volátiles (AGV) producto de la fermentación ruminal in vitro de los forrajes y sus combinaciones más adición de concentrado, propios de lecherías sin y con sistema silvopastoril... 138 Tabla 4.1. Ácidos grasos de los aceites... 161 Tabla 4.2. Composición nutricional y perfil de ácidos grasos de los tratamientos

utilizados, en la evaluación in vitro, antes de la incubación de las dietas... 162 Tabla 4.3. Ácidos grasos (g de AG/100 g de AG Totales) obtenidos en la fermentación

ruminal in vitro de las dietas con adición de diferentes aceites a nivel del 2% y 4% de la MS, después de la incubación por 24 horas... 170 Tabla 4.4. Cinética de fermentación, producción de metano, concentración y proporción

de ácidos grasos volátiles (AGV) producto de la fermentación in vitro de las dietas con

adición de diferentes aceites a nivel del 2% y 4% de la MS... 174 Tabla 5.1. Localización de los ensayos realizados... 200

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Tabla 5.2. Características de los sistemas de producción de leche... 200 Tabla 5.3. Manejo alimenticio dado en los diferentes sistemas... 201

Tabla 5.4. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos,

en el sistema lechería tropical (LT) ………... 202 Tabla 5.5. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos,

en el sistema lechería tropical SSPi (LTSSPi) ………... 202 Tabla 5.6. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos,

en el sistema doble propósito (DP) ………... 203 Tabla 5.7. Composición química y perfil de ácidos grasos de los alimentos consumidos,

en el sistema doble propósito SSPi (DPSSPi) ………... 203 Tabla 5.8. Perfil de ácidos grasos del aceite de girasol utilizado... 204 Tabla 5.9. Consumo estimado de MS y cantidad de aceite suministrado en cada uno de

los sistemas... 204 Tabla 5.10. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día), en los

diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical…... 210 Tabla 5.11. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema lechería tropical………... 211 Tabla 5.12. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día), en los

diferentes tratamientos en el sistema lechería tropical SSPi... 213 Tabla 5.13. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema lechería tropical SSPi... 214 Tabla 5.14. Consumo estimado de grasa y ácidos grasos (kg/animal/día), en los

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Tabla 5.15. Consumo de forraje, producción, composición y perfil de ácidos grasos de la leche en el sistema doble propósito SSPi... 218 Tabla 5.16. Análisis económico sin precio de venta del litro de leche diferencial por

contenido de CLA... 222 Tabla 5.17. Análisis económico con precio de venta del litro de leche diferencial por

contenido de CLA... 224

Lista de Figuras

Pag.

Figura 1.1. Tipos comunes de lípidos de almacenamiento y de membrana... 19 Figura 1.2. Vías de biohidrogenación de los ácidos (A) linolénico, (B) linoleico y (C) oleico. ... 21 Figura 1.3. Papel de Butyrivibrio spp. , Propionibacterium acnes y Butyrivibrio

proteoclasticum sobre el metabolismo de los ácidos grasos insaturados linoleico y

oleico... 23 Figura 1.4. Vías metabólicas para la biosíntesis de CLA y compuestos relacionados de ácido linoleico por bacterias del rumen (B) y protozoos (P)... 24 Figura 1.5. Vías para la síntesis ruminal y endógena de CLA cis9, trans-11 en

vacas lecheras y estrategias para aumentar el contenido CLA en la grasa de la

leche... 29 Figura 2.1. Concentración de CLA-c9t11 en la grasa láctea de los sistemas LT, DP, DPSSPi (3 tercios de lactancia) y LTSSPI (2 tercios de lactancia)... 81 Figura 2.2. Concentración de ATV en la grasa láctea de los sistemas LT, DP,

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Lista de Abreviaturas

AG Ácidos grasos

AGCL Ácidos grasos de cadena larga ATV Ácido trans-vaccénico

BHR Biohidrogenación ruminal

CLA Ácido linoleico conjugado (Conjugated linoleic acid) FA Fatty Acids

LDL Lipoproteínas de baja densidad (Low density lipoproteins) LCFA Long chain fatty acids

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Resumen General

El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la suplementación con aceites vegetales (comerciales) sobre la concentración de ácido linoleico conjugado C18:2 c9t11 (CLA-c9t11), el ácido transvaccénico C18:1 t11 (ATV), otros ácidos grasos de cadena larga (AGCL), la fermentación ruminal y la producción de metano in vitro y sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche producida en ganaderías de lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP), cuyos animales pastorean en solo gramíneas de pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala).

Inicialmente se evaluó el efecto del plano alimenticio, número de partos y tercio de lactancia sobre CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche producida en estas ganaderías. Seguidamente, mediante un estudio in vitro, se determinó el efecto de los forrajes propios de estas ganaderías, sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL, fermentación ruminal y producción de metano.

El perfil de ácidos grasos de los alimentos y de la leche, así como el de la digesta de los estudios in vitro, se obtuvo por cromatografía de gases. Los estudios in vitro se realizaron mediante la técnica de producción de gas y el consumo de leucaena se determinó mediante la técnica de desaparición de forraje.

En la fase inicial, la concentración de CLA-c9t11 en la leche osciló entre 1.02 y 2.22 g/100g de AG. En los sistemas LT, LTSSPi y DP, la alta participación de la grasa de los suplementos (51 a 84%) en el total de grasa consumida (entre 1.63 a 4.44% de la MS) y la composición de la grasa de los suplementos, llevó a variaciones en el perfil de AG.

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En el sistema DPSSPi a base de solo forraje, solo varió la concentración de ATV, siendo menor cuando el forraje se cosechó a mayor edad. Sin embargo, en los sistemas LT, DP y DPSSPi, el índice de aterogenicidad no fue afectado por el plano alimenticio manteniendo un valor entre 2.16 y 2.89, mientras que en el sistema LTSSPi, si hubo efecto y el mayor consumo de ácido oleico, en una de las tres fincas evaluadas, redujo el índice de aterogenicidad a 1.69 vs 2.12, 2.70. El número de partos y el tercio de lactancia demostraron poca influencia sobre el contenido de CLA-c9t11 y el perfil de ácidos grasos en la leche, cuando se compara frente a los factores dietarios.

En el ensayo in vitro inicial, no se encontró efecto de los forrajes, sobre el contenido de CLA-c9t11 en la digesta. La inclusión de 14% de leucaena aumentó el contenido de ácido linoleico y linolénico en el alimento, y de ATV, esteárico, linoleico y linolénico en la digesta, no afectó la cinética de fermentación, digestibilidad de la materia seca (MS), pH, total y proporción de ácidos grasos volátiles (AGV), ni redujo la producción de metano.

La suplementación con aceite de girasol al 2 y 4% de la MS en las dietas de los diferentes sistemas, en el estudio in vitro, resultó en un mayor aumento en el contenido de ácido linoleico, CLA-c9t11 y de ATV en la digesta, con respecto a aceite de palma y lino. Ninguna suplementación afectó la cinética de fermentación, pH, concentración total de AGV, proporción de AGV, ni redujo la producción de metano. En base a estos resultados, se seleccionó el aceite de girasol para evaluar bajo condiciones de campo.

A nivel de campo, no se pudo desarrollar el estudio en la finca del sistema DP porque se presentó rechazo del aceite por parte de las vacas. En los otros sistemas (LT, LTSSPi y DPSSPi), la proporción de CLA-c9t11 y ATV aumentaron linealmente con los dos niveles de suplementación y los AG aterogénicos disminuyeron, obteniéndose una leche con mayor cantidad de AG insaturados y menor índice de aterogenicidad. El

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ingreso neto adicional fue mayor a nivel de suplementación de 4%, si la leche se mercadea con un valor diferencial por contenido de CLA- c9t11.

Los resultados del presente estudio, muestran que la suplementación con aceite de girasol a vacas en pastoreo, permite aumentar en la leche los AG benéficos para la salud humana. No obstante, el nivel de inclusión de leucaena (14 a 16%) observado en los animales en condiciones de campo y la cantidad de aceite adicionado, no fueron suficientes para reducir la producción de metano in vitro. Esta investigación mejoró el conocimiento de la leche producida en Colombia, como “producto funcional”, constituyéndose en una herramienta para mercadear nuestros productos lácteos con un valor diferencial.

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Abstract

Aim of this investigation was to evaluate the effect of dietary supplementation with vegetable oils (commercial) on concentration of c9t11 C18:2 conjugated linoleic acid (c9t11 CLA), t11 C18:1 transvaccenic acid (TVA) and other long-chain fatty acids (LCFA), ruminal fermentation and methane production in vitro, and on concentration of c9t11 CLA, TVA and other LCFA in the produced milk of specialized tropical dairy (LT) and double-purpose cattle (DP) which herds graze in cord grass Estrella (Cynodon

plectostachyus) and/oder Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania), and in intensive

livestock farming systems (SSPi) with Leucaena (Leucaena leucocephala).

Initially, the effect of dietary level, parity and third of lactation on the production of c9t11 CLA, TVA and other LCFA was evaluated in the produced milk of these herds. Thereafter, the effect of own forage on the concentration of c9t11 CLA, TVA and others LCFA, ruminal fermentation and methane production was assessed by an in vitro study. Fatty acid profiles of food and milk, as well as the digesta of in vitro studies were assessed by gas chromatography. In vitro studies were performed by gas production technique. Leucaena consumption was estimated by herbage disappearance.

In the initial phase, concentration of c9t11 CLA in the produced milk ranged from 1.02 - 2.22 g/100g FA. In LT, LTSSPi and DP systems, the amount of fat supplements (51 - 84%) on total fat consumed (1.63 - 4.44% of DM), and the fat composition of these supplements led to changes in the fatty acid profile. In the DPSSPi system based on single fodder, only TVA concentration varied being lower when the fodder was harvested later in life. Atherogenic index was not affected in LT, DP, or DPSSPi systems by dietary levels conserving values between 2.16 - 2.89. But in LTSSPi system, the increased consumption of oleic acid reduced the rate of atherogenicity in one of the

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three tested farms to 1.69 vs 2.12, 2.70 in the remaining two farms. Parturition and lactation have little influence on content of c9t11 CLA and profile of fatty acids in milk, when compared against dietary factors.

In the initial in vitro assay, no effect of forage was found on the content of c9t11 CLA in the digesta. Inclusion of 14% leucaena increased content of linoleic and linolenic acids in the food, and of TVA, stearic, linoleic and linolenic acids in the digesta, did not affect fermentation kinetics, digestibility of dry matter (DM), pH, total and ratio of volatile fatty acids or methane production.

Supplementation with sunflower oil (2 - 4% DM) in the different dietary systems, in vitro, increase more the content of linoleic acid, c9t11 CLA and ATV in the digesta compared to palm or flax oil supplementation. Any of the tested supplementations affect fermentation kinetic, pH, total VFA concentration, VFA ratio or reduced methane production. Based on these results, sunflower oil was selected to be evaluated under field conditions.

At the field level, the study could not be performed on the DP system farm due to a high incidence of oil rejection by cows. In the other systems (LT, LTSSPi and DPSSPi), the proportion of c9t11 CLA and ATV increased linearly with the two levels of supplementation whilst the content of atherogenic FA decreased. This resulted in milk containing greater amount of unsaturated FA and lower atherogenic index. Additional net income was higher at supplementation level of 4%, when milk is marketed with a differential value based on the c9t11 CLA content.

The results of this study show that supplementation with sunflower oil to grazing cows can increase content of fatty acids in milk, which are beneficial to human health. However, inclusion levels of leucaena (14 -16%) in animals under field conditions, and the amount of oil added, were not sufficient to reduce methane production in vitro.

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Altogether, this research improved the knowledge of milk produced in Colombia as "functional product", becoming a tool to market our dairy products with added value.

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Introducción General

Ante la inminente apertura de mercados se ha generado el reto de transformar la producción ganadera colombiana, mejorando su productividad y su competitividad. La producción de leche en Colombia es de gran importancia para la economía del país con una participación del 10% en el PIB Agropecuario y del 24% en el PIB Pecuario. La política para el sector lácteo colombiano busca mejorar la competitividad de este sector mediante el desarrollo de conglomerados productivos en zonas, con ventajas competitivas para la producción de leche, estableciendo las bases para incentivar una mayor inversión y las condiciones óptimas para su desarrollo (CONPES, 2010). Se estima que el país cuenta con 3.2 millones de vacas en ordeño, responsables por una producción diaria de 15.7 millones de litros de leche, distribuidas en 395.215 unidades productoras (CNL, 2010). Se presumen grandes oportunidades para el sector lácteo en el contexto internacional por el incremento de la demanda en algunos países de oriente y la posibilidad de una desactivación gradual de subsidios existiendo la voluntad del gobierno para buscar mercados para los productos lácteos y de establecer futuras negociaciones con países deficitarios en leche (CNL, 2010).

Por otra parte, existe una tendencia internacional de mejorar la calidad de la alimentación, lo que implica el incremento de consumo de proteína animal dentro de lo cual están los productos lácteos. Así mismo, en Colombia hay una cultura de consumo y hay diversificación de la oferta, desde el consumo de leche cruda hasta productos lácteos funcionales. Con el objetivo de incrementar la productividad, profundizar y diversificar los mercados interno y externo y aprovechar las oportunidades y ventajas comparativas que tiene el sector lácteo, este busca entre otras características, el aumento de la oferta de productos lácteos funcionales y la producción amigable con el medio ambiente y socialmente responsable (CNL, 2010).

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Los ácidos grasos (AG) insaturados como el ácido linoleico conjugado c9t11 (CLA-c9t11) o ácido ruménico, el ácido transvaccénico (ATV) , algunos AGCL n-3 de la leche bovina, se relacionan con beneficios para la salud humana (Harris, 2008; Shingfield et al., 2013). En la leche bovina CLA y ATV resultan del consumo de AG poliinsaturados y de la extensión de la biohidrogenación ruminal (BHR), mientras que los AG n-3, provienen de la dieta y su presencia en la leche depende de su capacidad para escapar a la BHR (Chilliard et al., 2003; Palmquist, 2007). La magnitud de las cantidades presentes en la leche está determinada principalmente por factores dietarios (Palmquist, 2005).

A diferencia de otros AG, el CLA-c9t11 no es sólo una molécula energética que interviene en procesos metabólicos de obtención y almacenamiento de energía, sino que, además, posee una actividad biológica e interviene en otros procesos funcionales de la célula (Weiss et al., 2004a).En efecto, el CLA ha demostrado potenciales beneficios para la salud, observados experimentalmente sobre todo en modelos animales, como agente anti arteriosclerótico, antiinflamatorio, antidiabético y sobre todo, anti carcinogénico (inhibe la mutagénesis), así como potenciador del sistema inmune (Belury, 2002; Pariza, 2004; Khanal, 2004; Weiss et al., 2004a). Aunque estos efectos no han sido comprobados de forma concluyente en la especie humana, los alimentos ricos en CLA-c9t11, podrían ser considerados dentro del grupo de los llamados "alimentos funcionales", siendo el CLA-c9t11 el "ingrediente funcional". El estudio de los factores que afectan el contenido de este AG en la leche, es uno de los temas de investigación dentro del ámbito de la nutrición de los rumiantes (Angulo et al., 2013; Renna et al., 2010; Castro et al., 2009; Lee et al., 2009; Prandini et al., 2009; Chilliard et al., 2003; Chilliard y Ferlay, 2004), ya que permite obtener información sobre la posibilidad y mecanismo que aumenten dicho contenido.

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El ATV, es el mayor AG trans en la grasa de rumiantes, siendo además el precursor de CLA-c9t11 en los tejidos (Field et al., 2009). En algunos estudios ha mostrado además efectos anticancerígenos (Miller et al., 2003; Sauer et al., 2004). Los AGCL n-3 reducen en el suero las lipoproteínas de baja densidad, contribuyendo a una disminución en el riesgo a incidencia de enfermedad cardiovascular humana (Shingfield et al., 2008). El ácido oleico C18:1 cis-9, en los seres humanos, puede prevenir aumento de la lipoproteína de baja densidad en la sangre y puede disminuir la presión arterial (Dhakal et al., 2014). En contraste, existen evidencias que los AG saturados presentes en la leche tales como láurico C12:0, mirístico C14:0 y palmítico C16:0, aumentan las lipoproteína de baja densidad (Givens, 2010), con efecto aterogénico (Ulbritch y Southgate, 1991) e hipercolesterolémico (Givens, 2010) cuando los mismos son consumidos en exceso. En este contexto, toda disminución en la presencia de estos AG y el aumento de ATV, AGCL n3 y otros insaturados, permitirá ofrecer una leche mas saludable.

De otra parte, el metano es un potente gas de efecto invernadero que tiene un potencial de calentamiento 21 veces mayor que el dióxido de carbono (IPCC 2007). A la producción agrícola se le atribuye 40% de la producción de metano originado en actividades humanas. La producción de metano entérica, principalmente de la ganadería, constituye la mayor fuente individual y alcanza de 15% a 20% de la producción global de gases efecto invernadero de origen antrópico (Sheehle and Kruger 2006, Moss 2000, Lassey et al. 1997). La producción ruminal de metano constituye una pérdida de eficiencia nutricional que alcanza del 6% al 8% de la energía bruta consumida, pero puede incluso llegar hasta 12% de la misma (Johnson and Johnson 1995). Estas razones sugieren, que la búsqueda de tecnologías que permitan reducir la producción de metano en condiciones comerciales, deba ser un importante tema de estudio.

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En Colombia, el 45% de la leche se produce en lechería especializada con un mayor nivel tecnológico y uso de insumos y el 55% bajo el sistema doble propósito (CONPES, 2010). Los dos sistemas en su expresión tradicional tienen una base forrajera de solo gramíneas. No obstante, otros productores utilizan sistemas más adecuados a las condiciones medio ambientales con una base forrajera silvopastoril (SP), que permite aumentar la oferta de forraje, en particular durante el periodo seco, mejorar la calidad de la dieta a lo largo del año y mejorar la conservación y el reciclaje de nutrientes (Murgueitio, 1999; Pagiola et al., 2005; Pagiola et al., 2007). Hay evidencia de que ciertos metabolitos secundarios presentes en plantas forrajeras no gramíneas, pueden limitar la biohidrogenación ruminal y disminuir el metano (Khiaosa-Ard et al., 2009; Soliva et al., 2005; Soliva et al., 2008). De igual forma, la suplementación con lípidos reduce la emisión de metano (Beauchemin et al., 2007), disminuyendo la cantidad de materia orgánica fermentada en el rumen, la actividad de las bacterias metanogénicas y el número de protozoos y a través del mayor uso de hidrógeno durante el proceso de biohidrogenación (Johnson et al., 1995). A nivel del país existen pocos estudios de caracterización de niveles de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y sobre la utilización de aceites poliinsaturados como estrategia para aumentar la presencia de los nutrientes funcionales y disminuir la producción ruminal de metano.

El desarrollo de capacidad para elevar recomendación sobre suplementación de las dietas propias de la ganadería colombiana con AG poliinsaturados, como estrategia para aumentar los ácidos grasos benéficos en la leche y disminuir la producción ruminal de metano, exige contar con una previa evaluación de los resultados de la utilización de dicha estrategia bajo las condiciones de alimentación específicas del país. Dichas condiciones varían de acuerdo al sistema de producción lechería tropical y doble propósito. Asimismo, para poder entender y luego provocar los cambios deseados, es necesario abordar el estudio de los procesos de fermentación ruminal bajo las condiciones de alimentación propias de estos sistemas de producción.

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El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la suplementación con aceites vegetales (comerciales) sobre los ácidos grasos (CLA-c9t11, ATV y otros AGCL), la fermentación ruminal y la producción de metano, mediante técnicas in vitro y sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche producida en ganaderías de lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP), cuyos animales pastorean en solo gramíneas de pasto Estrella (Cynodon plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala).

Esta tesis consta de 6 capítulos. El primero incluye la revisión de literatura y los siguientes 4 capítulos presentan el análisis de los datos y su respectiva discusión. El último capítulo presenta las conclusiones generales.

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Objetivos

Objetivo General

Conocer el efecto de la suplementación alimenticia con aceites vegetales (comerciales) sobre los ácidos grasos CLA-c9t11, ATV y otros AGCL, la fermentación ruminal y la producción de metano, mediante técnicas in vitro y sobre la producción de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche, de ganaderías de lechería tropical especializada (LT) y doble propósito (DP), que pastorean en solo gramíneas en pasto Estrella (Cynodon

plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsus maximus cv. Tanzania) y en sistemas

silvopastoriles intensivos (SSPi) con Leucaena (Leucaena leucocephala).

Objetivos Específicos

1. Evaluar el efecto de las condiciones alimenticias propias de cada finca, número de partos y el tercio de lactancia sobre el porcentaje de grasa, la concentración de CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche.

2. Determinar mediante un estudio in vitro, el efecto de los forrajes sobre CLA-c9t11, ATV, otros AGCL, fermentación ruminal y producción de metano, de ganaderías que pastorean en solo gramíneas (Cynodon plectostachyus y/o Megathyrsus maximus cv.

Tanzania) y en sistemas silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala).

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3. Evaluar mediante estudio in vitro, el efecto de la adición de aceites vegetales saturados (Palma) e insaturados (Girasol y Lino) y su nivel de inclusión, a la base forrajera propia de ganaderías que pastorean en solo gramíneas de Estrella (Cynodon

plectostachyus) y/o Guinea (Megathyrsusmaximus cv. Tanzania) y en sistemas

silvopastoriles intensivos con Leucaena (Leucaena leucocephala), sobre la concentración de CLA-c9t11, ATV, otros AGCL, la fermentación ruminal y la producción de metano y seleccionar el aceite y nivel de inclusión, que presente mejor concentración de CLA-c9t11, ATV, AGCL y menor producción de metano.

4. Establecer el efecto de la suplementación alimenticia con el mejor nivel de inclusión del aceite más destacado en la prueba in vitro sobre la concentración de: CLA-c9t11, ATV y otros AGCL en la leche y sobre la relación beneficio-costo en las ganaderías en estudio.

Hipótesis

En ganaderías de producción lechera tropical especializada y de doble propósito, que pastorean en solo gramíneas y en sistemas silvopastoriles, la suplementación con aceites vegetales, afecta el patrón de ácidos grasos de cadena larga (CLA-c9t11 y ATV) en la leche y también en la digesta ruminal en sistemas experimentales de fermentación in vitro, al tiempo que disminuye la producción de metano sin disminuir la eficiencia de dicha fermentación.

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Capítulo 1

Efecto de la suplementación lipídica sobre la

concentración de ácido linoleico conjugado

(CLA-c9t11) en leche de vaca y la producción de metano:

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EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN LIPIDICA SOBRE LA CONCENTRACION DE ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO (CLA-c9t11) EN LECHE DE VACA Y LA

PRODUCCION DE METANO: REVISIÓN

RESUMEN

Existe una tendencia internacional en mejorar la calidad de la alimentación humana, lo que implica el incremento de consumo de proteína animal, dentro de lo cual están los productos lácteos saludables y ricos en CLA-c9t11 ("ingrediente funcional", por sus potenciales beneficios para la salud humana). Igualmente, se desea una producción amigable con el medio ambiente y socialmente responsable, razón por la cual, se búscan tecnologías que permitan reducir la producción de metano. La suplementación con AG insaturados ha mostrado ser eficiente en la búsqueda de estos objetivos. Este documento presenta una revisión sobre el efecto de la suplementación con lípidos sobre la concentración de CLA-c9t11, AG insaturados en la leche bovina y la reducción en la emisión de metano, abordando inicialmente el concepto y origen del CLA-c9t11 en rumiantes, junto con los factores que lo afectan, información de gran utilidad cuando se va a aplicar este tipo de tecnologías a nivel de finca de productor.

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INTRODUCCIÓN

En los últimos años, existe una tendencia internacional en los consumidores orientada a la mejora en la calidad de la alimentación con el uso de alimentos benéficos para la salud humana, entre los cuales se incluyen los llamados alimentos funcionales. Así mismo, es evidente la mayor conciencia y compromiso del consumidor con las producciones amigables con el medio ambiente y socialmente responsables (CNL, 2010).

Como alimentos funcionales se consideran aquéllos alimentos y/o componentes de los mismos que poseen propiedades adicionales sobre la salud, que superan el beneficio clásico de un aporte de nutrientes (Milner, 1999). También son considerados como funcionales aquéllos alimentos en los que se encuentra reducida alguna fracción que resulta no saludable para el ser humano. En el caso de la leche y en el contexto del presente trabajo, toda reducción en el contenido de los ácidos láurico, mirístico y palmítico resulta de interés funcional por sus potenciales efectos aterogénicos (Ulbritch y Southgate, 1991) cuando los mismos son consumidos en exceso.

Durante esta última década, estudios con ácido linoleico conjugado (CLA), han revelado funciones benéficas sobre la salud. El CLA C18:2 cis9, trans11 también conocido como CLA-c9t11 ó ácido ruménico (AR), ha mostrado potenciales beneficios para la salud, observados experimentalmente sobre todo en modelos animales, como agente anti arteriosclerótico, antiinflamatorio, antidiabético y, sobre todo, anti carcinogénico (inhibe la mutagénesis), así como potenciador del sistema inmune ( Belury, 2002; Pariza, 2004; Khanal, 2004; Weiss et al., 2004a, Shingfield et al., 2008, Salter, 2013). Además, se ha reportado que el CLA trans10,cis12 inhibe la síntesis de ácidos grasos, reduciendo la acumulación de grasa corporal en individuos con sobrepeso (Weiss et al.,

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2004b) aunque estos efectos adegazantes no han sido comprobados de forma concluyente en la especie humana.

En general, las concentraciones totales de CLA en la leche de los rumiantes oscilan entre un 0.3 y un 2.0% del total de ácidos grasos de la grasa de leche dependiendo del sistema de alimentación (pastoril o estabulado) y de la suplementación practicada. Entre las distintas especies productoras, es la leche de vaca la que presenta los contenidos más altos de CLA (0.2 – 3.7 g CLA/100 g de grasa) seguida de la de cabra (0.59 – 3.24 g/100 g de grasa) y la oveja (1.17 – 2.97 g/100 g de grasa) (Parodi, 2003). En la leche bovina, el CLA resulta del consumo que los animales hacen de AG poliinsaturados y de la extensión de la biohidrogenación ruminal (BHR) (Chilliard et al., 2003). Por otra parte, la magnitud de las cantidades presentes en la leche está determinada principalmente por factores dietarios (Palmquist, 2005). El estudio de los factores que afectan el contenido en CLA de la leche es uno de los temas de investigación de interés actual, dentro del ámbito de la nutrición de los rumiantes (Renna et al., 2010; Castro et al., 2009; Lee et al., 2009; Prandini et al., 2009; Chilliard et al., 2003; Chilliard y Ferlay, 2004), ya que permite obtener información sobre la posibilidad y mecanismo de modulación natural de la presencia de este AG benéfico en los lácteos.

De otra parte, uno de los mayores contaminantes del medio ambiente es el metano, potente gas de efecto invernadero que tiene un potencial de calentamiento 21 veces mayor que el dióxido de carbono (IPCC 2007). A la producción agrícola se le atribuye 40% de la producción de metano originado en actividades humanas. La producción de metano entérica proveniente de la actividad ganadera, constituye la mayor fuente individual y alcanza de 12% a 18% de la producción global de gases efecto invernadero de origen antrópico, dependiendo del método de estimación (FAO 2006; Westhoek et al., 2011). La producción ruminal de metano constituye una pérdida de eficiencia

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nutricional (energética) que alcanza de 6% a 8% de la energía bruta consumida, pero puede incluso llegar hasta 12% de la misma (Johnson and Johnson 1995). Estas razones justifican la búsqueda de tecnologías que permitan reducir la producción de metano en condiciones comerciales de producción.

Algunos estudios encontraron, que la suplementación con lípidos de origen animal (Chouinard et al. 2001; Shingfield et al., 2003, 2006; Abu-Ghazaleh et al., 2003, 2004a) y de origen vegetal (Stanton et al., 2003; Khanal and Olson, 2004), permite aumentar la concentración de CLA-c9t11 en la leche y reducir la emisión de metano (Johnson et al., 1995; Beauchemin et al., 2007).

Este documento presenta una revisión sobre el efecto de la suplementación con lípidos sobre la concentración de CLA-c9t11 en la leche bovina y la reducción en la emisión de metano, abordando inicialmente el concepto y origen del CLA-c9t11, en rumiantes.

ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO

El acrónimo CLA (“Conjugated linoleic acid” en inglés) es un término que engloba una mezcla compleja de isómeros posicionales y geométricos del ácido linoleico (C18:2 cis9,cis12) con dos dobles enlaces, que se encuentra de forma natural en la grasa de alimentos derivados de rumiantes como la carne y fundamentalmente en los productos lácteos. Aunque se han detectado distintos isómeros posicionales (7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14) y geométricos (cis-trans, trans-cis, trans-trans y cis-cis) del CLA en la grasa de la leche, más del 70% del contenido en CLA corresponde al isómero C18:2 cis9, trans11 o ácido ruménico (AR) (Bauman et al., 2003a), al que se atribuyen la mayoría de sus propiedades biológicas saludables (McCrorie et al., 2011). Otro isómero del CLA que está siendo también objeto de investigación por su implicación en la inhibición de la síntesis de grasa en mamíferos, es el C18:2 trans10, cis12; pero su

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contenido en la grasa láctea es muy bajo (menos del 0.1% sobre el total de ácidos grasos y menos del 1% sobre el total de CLA), aunque se han encontrado valores de 2.9% del total de CLA cuando las vacas lecheras fueron suplementadas con aceite de girasol más alga marina (Angulo et al, 2012a). No obstante, sus efectos sobre la salud humana son cuestionados por la comunidad científica (McCrorie et al., 2011).

ORIGEN DEL CLA-c9t11 EN RUMIANTES

Formación de CLA como consecuencia de la bio-hidrogenación ruminal (BHR) de ácidos grasos.

Los lípidos consumidos por los animales están formados por triglicéridos en el caso de las semillas oleaginosas y por fosfolípidos y galactolípidos, en el caso de los forrajes y otros alimentos de origen vegetal (Figura 1.1)

Figura.1.1. Tipos comunes de lípidos de almacenamiento y de membrana. Todos los tipos de lípidos mostrados tienen ya sea glicerol o esfingosina como la columna vertebral, a la que están unidos uno o más grupos alquilo de cadena larga y un grupo de cabeza polar. En triglicéridos, glicerofosfolípidos, galactolípidos, y sulfolípidos, los grupos alquilo son ácidos grasos en enlace éster. Tomada de Nelson y Cox (2004).

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En el rumen, estos lípidos sufren dos procesos metabólicos: lipólisis y bio-hidrogenación. Durante la lipólisis, los enlaces éster entre los AG y el glicerol o la galactosa se rompen por medio de diversas enzimas microbianas (por ejemplo, lipasas, galactosidasas, fosfolipasas). El glicerol y la galactosa son fermentados formándose ácidos grasos volátiles propiónico y acético, respectivamente. La lipólisis ruminal de los tri y di-glicéridos es consecuencia de la actividad de la bacteria Anaerovibrio lipolitica, la cual es muy sensible a variaciones en el pH del rumen y en condiciones de acidosis la lipólisis se ve significativamente reducida. Así mismo, Butyrivibrio fibrisolvens lipasa hidroliza fosfolípidos (Dehority, 2003) y diferentes galactosidasas y fosfolipasas (e.g.,

fosfolipasa A y fosfolipasa C), producidas por los microbios del rumen, catalizan la

hidrólisis de fosfolípidos y galactolípidos de las plantas (Jenkins,1993). Los protozoos ciliados poseen actividad lipasa, pero no los hongos (Dehority, 2003), aunque su contribución es más baja que la de las bacterias.

Después de la lipólisis, los AG insaturados son biohidrogenados por los microorganismos del rumen (isomerasas y reductasas). Este proceso (Figura 1.2) convierte los AG insaturados en AG saturados, vía isomerización a AG intermediarios trans, seguido por hidrogenación de los dobles enlaces (Harfoot y Hazlewood, 1997).

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Figura 1.2. Vías de biohidrogenación de los ácidos (A) linolénico, (B) linoleico y (C) oleico. Adaptado de Harfoot y Hazlewood (1988).

Así, la BHR consiste en una primera isomerización: la forma geométrica cis de los dobles enlaces pasa a la forma trans (más estable en el rumen). De esta forma, el doble enlace en posición 12 del ácido linoléico, es transferido con configuración trans al carbono 11, para dar lugar a CLA cis9, trans11, con un porcentaje en torno a 30% en vacas (Piperova et al., 2002) y a proporciones variables de diferentes isómeros conjugados y no conjugados (trans9, cis11; trans10, cis12; etc) (Jenkins, 2008). A continuación, tiene lugar una hidrogenación progresiva de los dobles enlaces y se produce entonces, una rápida hidrogenación del enlace cis9 para formar ácido transvaccénico (C18:1 trans11) (TVA) y una segunda sobre el enlace trans11 para dar lugar finalmente a ácido esteárico (C18:0). Sin embargo, en función de diversos

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factores, la hidrogenación ruminal podría quedar incompleta, dando lugar a un flujo al duodeno de ácidos grasos insaturados y determinados metabolitos intermedios (Stanton et al., 2003), que podrían llegar a absorberse en el intestino y aparecer en los productos finales (leche y carne).

La BHR del ácido linolénico (C18:3 cis9, cis12, cis15) comienza igualmente con la isomerización del enlace cis12 a trans11, posteriormente se produce ATV pero a partir de C18:2 trans11,cis15 (Loor et al., 2002, 2004). Existe discrepancia si durante este proceso se forma CLA-c9t11; Lee y Jenkins (2011), demostraron en cultivos continuos de fermentación, que los microorganismos ruminales en mezcla, obtenidos de rumen de ganado, son capaces de formar isómeros C18:3 y diferentes CLA, incluido el CLA-c9t11; aunque en proporción menor al 15%, indicando que las vías de biohidrogenación del ácido linolénico son más complejas que las reportadas previamente.

En el caso del ácido oleico, no ocurre solamente la biohidrogenación a ácido esteárico sino que, además, se forman numerosos isómeros trans (Mosley et al., 2002) y parte del ácido oleico, es transformado en los ácidos 10-hidroxiesteárico y 10-cetoesteárico, como demostraron Jenkins et al., (2006). Cuando se suplementan las dietas de ganado vacuno con grasas ricas en ácido oleico (AG mono-insaturado), también se han observado incrementos en los niveles de CLA-c9t11 (Secchiari et al. 2003; Collomb et al., 2004a), aunque estos aumentos son menos importantes que cuando se utilizan aceites vegetales ricos en ácidos grasos poli-insaturados.

Según Bauman et al. (1999), la velocidad a la que el ATV es reducido a ácido esteárico es más lenta que los pasos previos; en consecuencia, la acumulación de ATV, facilita que una parte del mismo, escape del rumen y sea disponible para la absorción intestinal. El CLA-c9t11 junto a diferentes ácidos grasos trans mono-insaturados,

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fundamentalmente el ATV, serían los intermediarios más destacados, de este proceso de hidrogenación.

La biohidrogenación se realiza por acción de diversas enzimas (isomerasas y reductasas) microbianas. Entre las bacterias ruminales responsables de la biohidrogenación de los ácidos grasos, Butyrivibrio fibrisolvens (Kepler y Tove, 1967; Fukuda et al., 2006; Wallace et al., 2006a) en los pasos iniciales y Butyrivibrio

proteoclasticus (Moon et al., 2008) en el paso final (reducción a ácido esteárico),

jugarían el papel más relevante (Figura 1.3), aunque se sabe que otras bacterias como

Ruminococcus, Eubacterium , Fusocillus (Palmquist et al., 2005; Wallace et al., 2006a)

y Propionibacterium acnés (McKain et al., 2010), pueden estar también implicadas.

Figura 1.3. Papel de Butyrivibrio spp., Propionibacterium acnes y Butyrivibrio proteoclasticum sobre el metabolismo de los ácidos grasos insaturados linoleico y oleico.Tomado de McKain et al. (2010) y Wallace et al. (2006b).

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Los hongos del rumen, pueden biohidrogenar ácido linoléico obteniendo como producto final ATV, pero su biohidrogenación es más baja que la realizada por las bacterias del rumen, siendo Orpinomyces el hongo más activo (Nam y Garnswotrhy, 2007). Con respecto a los protozoos existe contradicción, Jenkins et al. (2008), en su revisión concluye que los protozoos no producen por si mismo CLA-c9t11, ni ATV; sin embargo, mediante ellos se pueden obtener estos ácidos, disponibles para el animal. No obstante, Or-Rashid et al. (2011) y Buccioni et al. (2012), plantean que los protozoos influyen en el contenido de intermediarios de la BHR por las isomerasas y que la mezcla de bacterias y protozoos, tiene una mayor capacidad para biohidrogenar ácido linoléico, que las bacterias solas (Figura 1.4).

Figura 1.4. Vías metabólicas para la biosíntesis de CLA y compuestos relacionados de ácido linoleico por bacterias del rumen (B) y protozoos (P). Flechas sólidas más gruesas son actividades bacterianas y protozoarias que conducen a la formación de isómeros de CLA y C18: 1, incluyendo C18:0, las flechas punteadas son la actividad bacteriana que conduce a la formación de los compuestos posibles y las flechas continuas delgadas representan las actividades bacterianas. Tomado de Or-Rashid et al. (2011).

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Las tasas de lipólisis y BHR dependen del tipo y la cantidad de grasa, entregada al rumen (Beam et al., 2000) y el pH ruminal (Van Nevel y Demeyer, 1996). El proceso de BHR no deja de ser un mecanismo de defensa de los microorganismos ruminales para reducir la toxicidad de los ácidos grasos insaturados. Los ácidos grasos de cadena larga inhiben el metabolismo microbiano, y esta actividad inhibitoria, es mayor cuanto mayor es su grado de insaturación, por lo tanto la BHR es modificada a través de toxicidad diferencial sobre las bacterias ruminales de los diferentes AG poliinsaturados, incluyendo los ácidos grasos omega tres del aceite de pescado eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA). Si se puede entender como la toxicidad selectiva de un AG, o incluso otros factores, afectan la fisiología de las bacterias biohidrogenantes del rumen, es posible que se puedan sugerir nuevas modificaciones en la dieta de los animales que finalmente conducirían a productos de rumiantes más saludables para el consumo humano (Maia et al., 2010).

La isomerización previa a la BHR requiere que el grupo carboxilo de la molécula esté libre, lo cual determina que la lipólisis pueda considerarse como la etapa limitante del proceso global y que todos los factores que repercuten sobre la lipólisis afecten también a la BHR (Bauman et al., 2003b). La eficacia de la BHR se relaciona negativamente con la proporción de concentrados en la dieta (Sauvant y Bas, 2001). De hecho, la BHR es más intensa en dietas con abundantes forrajes (Kucuk et al., 2001; Lee et al., 2006). Cuando disminuye la proporción de forraje, el flujo de isómeros C18:1trans totales hacia el duodeno puede duplicarse (Loor et al., 2004). Ello es debido, principalmente, a un incremento lineal del flujo del isómero C18:1trans-10, cuya proporción en dichas circunstancias puede pasar del 4 al 25% del total de isómeros del grupo (Piperova et al., 2002;Loor et al., 2004). En general, todas aquellas características de la dieta, como el pequeño tamaño de partícula, abundancia de concentrados, exceso de almidón degradable en rumen, ausencia de tampones, que reducen el valor medio diario de pH ruminal a menos de 6.25 (Sauvant et al., 1999) afectan negativamente a la eficacia de

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la BHR. Troegeler-Meynadier et al., (2006) comprobaron in vitro que un pH <6 inhibe la isomerización y la segunda reducción, lo cual puede relacionarse con el hecho que las bacterias celulolíticas, principales responsables de la BHR, son muy sensibles a valores de pH <6 (Slyter, 1986; Owens et al., 1998). Otros factores que afectan negativamente a la eficacia de la BHR, son la elevada concentración de los ácidos linoleico (Atkinson et al., 2006; Harvatine y Allen, 2006) y linolénico (Troegeler-Meynadier et al., 2006). También, la presencia en el medio ruminal de ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) inhiben la reducción del ATV (Chow et al.,2004; Lee et al., 2005), la de los ácidos oleico y linoleico (AbuGhazaleh y Jenkins,2004) y la suya propia (Dohme et al.,2003; Chow et al., 2004).

La BHR está fuertemente influenciado por metabolitos secundarios presentes en las plantas (PSM), que incluye Polifenol Oxidasa (PPO) y taninos (Lee et al.,2007a; Cabiddu et al., 2009, 2010). La Polifenol oxidasa aumentó la protección de los lípidos de la actividad lipolítica y disminuyó la BHR por 11-22% (Lee et al.,2007b, 2008). Sin embargo, no se puedo concluir definitivamente a partir de estos resultados si la protección fue debida a la inhibición de la lipasa, o si la protección de lípidos fue debida al complejo proteína-fenol y / o lípidos –fenol (Lee et al., 2010). Varios informes sobre la relación entre taninos y metabolismo ruminal mencionan los efectos negativos de la degradación de la proteína y la fibra sobre el desarrollo de la microflora ruminal. Sin embargo, hay poca información disponible sobre los efectos de los compuestos polifenólicos, sobre la actividad de la linoleico isomerasa (LA-I) en el rumen (Cabiddu et al., 2009, 2010). No obstante, Vasta et al. (2009a,b) informaron que los taninos no interfieren con LA-I, pero interfieren con la proliferación microbiana. Así, los taninos no inhiben la actividad de las enzimas microbianas, pero cambian la composición de la población microbiana ruminal.

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Buccioni et al. (2012), en su revisión sugieren que la lipólisis y BHR están directamente influenciadas por la asociación de PPO, tasa de pasaje, encapsulado en lípidos y otros metabolitos secundarios de las plantas (MSP), y esto a veces puede conducir a resultados que son aparentemente contradictorios. Por lo tanto, se necesita investigar sobre como las interacciones entre PPO, tasa de pasaje ruminal, encapsulado en lípidos y MSP influencian la lipólisis y la biohidrogenación y su respectiva jerarquía.

Síntesis endógena en la glándula mamaria

El CLA-c9t11 contenido en la leche, se origina de la absorción intestinal con posterior transferencia a la glándula mamaria de este AG producido en el rumen y de su síntesis endógena a partir de ATV por acción de la enzima Delta-9 desaturasa en la glándula mamaria (Bauman y Lock 2006). Esta última es la principal vía de acumulación de CLA-c9t11 en la leche bovina y se estima que más del 74% de CLA-CLA-c9t11 en la grasa de la leche es sintetizado a través de esta vía (Bichi et al., 2012).

Los estudios detallados sobre el posible origen endógeno de otros isómeros de CLA son muy escasos, quizá porque la mayoría de ellos contribuye con porcentajes muy pequeños a la grasa de leche de vaca y su significado biológico aún no ha sido clarificado. El trans7 cis9 es cuantitativamente el segundo isómero más importante de CLA, constituyendo entre el 3 y el 15% del total de los isómeros en grasa de origen lácteo. Corl et al. (2002) sugirieron que su síntesis era casi exclusivamente en la glándula mamaria por medio de la Delta-9 desaturasa a partir del C18:1 trans7 producido en el rumen por isomerización del ácido oleico.

Es importante tener en cuenta que, la producción de grasa de la leche depende del equilibrio entre el aumento en la transferencia de los AG de la dieta a la glándula

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mamaria y la disminución de la síntesis de novo que pueda tener lugar. Una disminución en la síntesis de AG dentro de la glándula mamaria se observa frecuentemente cuando se añaden fuentes suplementarias de AG a la dieta de vacas lecheras en lactación (Lock y Bauman, 2004).

ESTRATEGIAS PARA AUMENTAR CLA-c9t11 Y ATV EN LECHE

Se han propuesto estrategias para aumentar el CLA-c9t11 en la grasa de la leche, las cuales se centran en aumentar la cantidad de ATV producido en el rumen e incrementar la actividad de la Delta-9 desaturasa (Figura 1.5). El aumento de ATV que sale del rumen, se puede conseguir manipulando la dieta y el proceso de biohidrogenación mediante el incremento en el ingreso de ácidos poliinsaturados linoleico y linolénico (precursores de ATV) al rumen y al mantener la vía de formación de trans11 e inhibir el paso de ATV a ácido esteárico. Por lo tanto, el contenido de CLA-c9t11en la grasa de la

leche puede ser notablemente afectado por vía natural, seleccionando racionalmente la

combinación de alimentos, que afectan el suministro dietético de AG poliinsaturados y/o afectan el ambiente ruminal, con el fin de alterar la velocidad y la integridad de la

biohidrogenación (Bauman y Lock 2006). De otra parte, el aumento de la Delta-9

desaturasa se puede conseguir, mediante selección genética dada la alta variabilidad entre vacas para producir leche con alto CLA-c9t11, lo que exige avanzar en la obtención de marcadores moleculares indicativos de una alta capacidad individual de generación de CLA y el desarrollo de estudios destinados a cuantificar la expresión del gen responsable de la expresión de la enzima estearil CoA desaturaturasa o Delta-9 desaturasa (Gagliostro, 2004b).Se esperan futuros avances mediante el uso de selección asistida por marcadores para aumentar la frecuencia de genotipos favorables y la formulación de dietas, para aprovechar este potencial genético y mejorar la composición de los ácidos grasos de los alimentos producidos por los rumiantes (Shinfgield et al., 2013).

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Figura 1.5. Vías para la síntesis ruminal y endógena de CLA cis9, trans-11 en vacas lecheras y estrategias para aumentar el contenido CLA en la grasa de la leche. Adaptado de Bauman y Lock (2006).

EFECTO DE LA ADICIÓN DE LÍPIDOS SOBRE CLA-c9t11 Y ATV

Una comparación entre diferentes tipos de aceites de origen vegetal sugiere que aquéllos con contenidos más altos en los ácidos linoleico y linolénico (como los procedentes de semillas de soja, algodón, girasol, lino, cártamo y colza –Tabla 1.1) son los más idóneos para aumentar el CLA-c9t11 en leche (Stanton et al., 2003; Khanal y Olson, 2004). Además se ha comprobado que aquellos más ricos en ácido linoleico (girasol, soja) son los más efectivos (Kelly et al., 1998; Dhiman et al., 2000; Lock y Garnsworthy, 2002; Collomb et al., 2004b, Shingfield et al., 2006; Hervás et al., 2006). Este efecto es lineal ante la adición de cantidades crecientes de aceite a la ración

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(hasta 3-4% de la MS, al menos), con una respuesta de alrededor de 0,4% de los AG totales por punto de aumento de la concentración de lípidos de la ración para la soja, el girasol o el lino (Chilliard et al., 2007a). Este efecto se explica por un fuerte aumento en la producción de ATV en el rumen, el cual resulta luego capturado por la glándula mamaria y desaturado a CLA-c9t11 por la Delta-9 desaturasa. En cambio, un aceite rico en AG oleico (C18:1 c9) (oliva, colza) aumenta sólo débilmente la secreción de CLA-c9t11 (Chilliard et al., 2007b).

Tabla.1.1. Porcentaje de ácidos grasos presentes en aceite de diferentes semillas Aceite _{Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico} Autor

C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

Colza 4.5 1.4 61.2 23.0 9.9 Rego et al. 2009 Girasol 5.4 2.8 26.8 64.9 0.1 Rego et al. 2009 Lino 4.4 2.6 20.0 16.3 56.7 Rego et al. 2009 Girasol -- -- 15.31 65.23 0.21 Jacob et al. 2011 Soja -- -- 21.53 51.65 8.83 Jacob et al. 2011 Soja 9.6 5.3 26.0 50.5 5.5 Boerman y Lock, 2014 Soja -- -- 25.0 51.0 -- Vargas-Bello-Pérez et al. 2015 Semilla de algodón 19.9 2.4 17.1 58.4 0 Aprianita et al. 2014

La forma de incorporación de estos ácidos grasos insaturados en la dieta del ganado puede jugar un papel importante. La presentación en forma protegida como sales cálcicas o el empleo de semillas intactas sin procesar produce leves incrementos en los niveles de CLA en leche, ya que hay mínima interacción de estos ácidos grasos a nivel ruminal para la producción del principal precursor de CLA-c9t11. La adición de semillas sometidas a molienda, extrusión, micronización o calentamiento mejora los contenidos de CLA-c9t11 en leche (Chouinard et al., 2001; Dhiman et al., 2000; Secchiari et al., 2003). Las formas de suplementación más efectivas, para aumentar CLA-c9t11 en la leche, han sido la adición directa de aceite extraído de las semillas o las semillas sometidas a tratamiento térmico previo (Chilliard et al., 2007b). Un rápido y eficaz

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contacto del aceite con las bacterias ruminales, conduce a la acumulación ruminal del precursor ATV (Gagliostro, 2011). Este efecto es particularmente importante cuando las vacas se encuentran en alimentación bajo pastoreo, debido a que la tasa de pasaje resulta más rápida y la población microbiana involucrada en el proceso de biohidrogenación puede verse afectada (Kolver, 1997).

Además de los efectos del tipo de lípidos alimentarios, de su forma de presentación y de la cantidad, existen importantes interacciones con la naturaleza de los forrajes y con la relación forraje:concentrado de la ración (Chilliard et al., 2007b).

El efecto de la suplementación con semillas oleaginosas sobre la proporción de grasa en leche depende de la naturaleza de la semilla (lino, colza), de su forma (extruída, harina en frio, entera sin procesar) y de la interacción con el tipo de dieta basal (ensilaje de hierba, heno o pastura) (Lerch et al. 2012). Asímismo, el efecto de la suplementación con semilla de lino molida, sobre la proporción de AG de la leche, depende de la relación forraje:concentrado y del tipo de forraje de la dieta basal, siendo mayores los niveles de C18:1 trans10, C18:1 trans15, C18:1 cis15, C18:2 trans11,cis15 y C18:3 n-3 en la grasa de la leche, con dietas que contenían 5% de semilla de lino molida y relación forraje:concentrado de 35:65, comparada con niveles de 1 y 3% y relación F:C de 50:50 o 65:35 (Sterk et al. 2011).

En la mayoría de los estudios realizados se ha observado un aumento del contenido en CLA-c9t11 y ATV al emplear dietas en las que se aportan lípidos ricos en AG insaturados. La suplementación con isómeros sintéticos de CLA en forma protegida (Giesy et al., 2002; Perfield et al., 2002; Bernal-Santos et al., 2003) es biológicamente efectiva pero no es viable comercialmente debido al elevado precio de adquisición. Los aceites vegetales y el aceite de pescado son suplementos más asequibles. Se ha demostrado que la incorporación en la ingesta de suplementos con aceites de pescado