DR. PATRICE PELLERIN DIRECTOR TÉCNICO DE OENOBRANDS

68 

Texto completo

(1)

DR. PATRICE PELLERIN

(2)

Enzimas

ORIGEN

PRODUCCIÓN

LEGISLACIÓN

(3)
(4)

Clases de Enzimas: qué es el número EC?

• EC = “Enzyme commission” , parte de IUBMB

• 1

er

número describe el tipo de reacción

EC 1. oxidoreductasas

EC 2 Transferasas (acil metil, fosforil,..)

EC 3 Hidrolasas

EC 4 liasa = el enlace covalente se rompe sin

hidrólisis

EC 5 isomerasa : Glucosa en fructosa

EC 6 ligasas : crea un enlace covalente

(5)

Clases de Enzimas: qué hidrolasas ?

• EC 3 Hidrolasas

EC 3.1 hidrólisis de enlaces éster

EC 3.2 glicosidasas

EC 3.3 hidrolisis de enlaces éter

EC 3.4 hidrolisis de enlaces péptidos

13 en total

(6)

Clases de Enzimas : glicosilasas ?

• EC 3.2.1 rompe enlaces O- y S-glicosil

• El último dígito describe el sustrato

EC 3.2.1.1 . Alfa-amilasa

EC 3.2.1.4 Celulasa

EC 3.2.1.8 endo-xilanasa

EC 3.2.1.15 Poligalacturonasa

EC 3.2.1.21 beta-glucosidasa

(7)

Enzimas Industriales: orígenes?

• Hongos :

A. niger , A. aculeatus, A. oryzae

Trichoderma longibrachiatum, reseei, harzianum

Disporotrichum dimorphosporum

Talaromyces emersonii

…

(8)

Enzimas Industriales: orígenes?

• Bacterias:

Bacillus subtilis

Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus licheniformis

Escherichia Coli

…

(9)

Enzimas Industriales: orígenes?

• Levaduras:

S. cerevisiae

Kluyveromyces lactis

…

(10)

Enzimas Industriales: orígenes?

• Plantas:

Malta de cebada

Papaya

Piña

…

(11)

Enzimas Industriales: orígenes?

• Animales:

Clara de huevo

Pancreas de cerdo

Estómago del becerro

…

(12)

Producción de enzimas por fermentación:

cuáles son los principales procesos?

• Fermentación Sumergida (líquida)

• SSF : “solid state fermentation”: fermentación

en estado sólido

(13)

DSM Business Group

More than a century of enzyme technology

• En 1906...Una AMILASA de origen bacteriano es descubierta por un

alumno del Instituto Pasteur de Lille, Auguste BOIDIN, fundador de

RAPIDASE

…Es el origen de su empresa, y empieza a producir enzimas

en Seclin (Francia)

(14)

Fermentación Sumergida Líquida

(15)

PRODUCTION STRAIN PRE-CULTURE PHASE 1 PRE-CULTURE PHASE 2 STAGE 1 INOCULUM FERMENTATION MAIN

FERMENTATION BROTH FERMENTATION STORAGE

STAGE 2 SEPARATION SOLID-LIQUID (membranes filters) FILTRATE STORAGE CONCENTRATION (Ultra-Filtration) _ _ _ _ FILTRATION ON PLATE 1 FILTRATE STORAGE CHROMATOGRAPHY _ _ _ _ CONCENTRATION (Ultra-Filtration) Dairy product AUTOLYSE/ KILLING (If necessary) STAGE 3 STAGE 4 Liquid way MIXING

STANDARDISATION PACKAGING OF SOLID ENZYME SPRAY DRYING (Granulation) FINAL PRODUCT STORAGE PACKAGING OF LIQUID ENZYME Solid way STAGE 5

PERÍMETRO DE CERTIFICACIÓN DE SEGURIDAD ALIMENTARIA

FILTRATION ON PLATE 2 FORMULATION

Microfiltration

El Proceso de Producción DSM:

Fermentación Sumergida Líquida

(16)

Enzimas Industriales: mercados de

aplicación?

• Farmacéutica y salud

• Diagnostic and analyses

• Detergentes

• Fuel etanol de 1

ª

y 2ª generación

• Bioplásticos

• Textil

• Conversión de almidón

• Alimentación animal

• Mejora digestiva

(17)

“Food Enzymes” : mercados de aplicación?

• Food

Panadería (amilasas, galactolipasas , xilanasas,

proteasas)

Lácteos (lactasa, chymosine , proteasas, lipasas)

Carne (transglutaminasa)

Desgomado de aceite en refinado (fosfolipasa)

Cervecería: glucanasas, xilanasas, amilasas

Procesado de fruta: pectinasas, xilanasas, amilasas, AG

Vino

Alcohol: amilasas , AG

Mayonesa (fosfolipasa)

(18)

Pan Cerveza Lácteos

Procesado de Frutas

Alcohol

Vino

Ejemplos de DSM « Food Enzymes »

PRODUCIDAS EN SECLIN

Mayonesa

Tartas& snacks

(19)

Las Enzimas y el etiquetado de los

Alimentos: cuales son las reglas?

• Las enzimas son “coadyuvantes” de elaboración

y no “Aditivos”

Ausente en el producto final

Presente pero no “funcionalmente activo”

(20)

Las Enzimas y el etiquetado de los

Alimentos: las excepciones

• Invertasa

• Lisozima

Son considerados “Aditivos”, por lo

que está sometidos a etiquetado

(21)

Regulación de las enzimas de vino

“OIV International Enological Codex

and Code”

(22)

18 | 04 | 2012

La aplicación de las enzimas en enología está

definida por el “OIV International Enological

codex and Code”

Hasta 2013 Desde 2013

Pectinasas para la clarificación de mostos de uva

Pectinasas, celulasas, glucanasas, xilanasas para varias aplicaciones: maceración, rendimiento, clarificación , …

Beta-glucanasas para filtración de vinos

Beta-glucanasas para filtración y crianza sobre lías

Glicosidasas para la hidrólisis de precursores aromáticos de la uva Ureasa para la prevención del

carbamato de etilo en vinos

Ureasa para la prevención del carbamato de etilo

Lisozima para la prevención de

contaminación microbiana durante la fermentación

Lisozima para la prevención de contaminación microbiana

(23)

18 | 04 | 2012

Enzimas enológicas

Enzimas Producción micro-organismo Producción técnica Formulaciones Polisacarido-hidrolasas : pectinasas, celulasas, glucanasas, xilanasas … A. niger, A. aculeatus, T. longibrachiatum… . Fermentaciones sumergida o de superficie Líquida glicerol/ KCl Microgranuladas maltodextrina Glicosidasas A. niger Glucanasas T. harzianum, T sp. Ureasa L. fermentum

Lisozima Clara de huevo Purificada por Cromatografía

Microgranulada pura

(24)
(25)

Enzimas, un poco de bioquímica

(26)

La energía de activación de una

reacción

Energia de activación Progreso de la reacción Ene rgía No-enzimática Enzimática

(27)

Temperatura Óptima

Temperatura Activ id ad

estabilidad

actividad

La actividad

enzimática es el

resultado de

• Incremento de actividad a mayor Tª

Por encima de cierta

Tª las enzimas se

(28)

La actividad relativa en relación con la temperatura:

criterios esenciales para la elección de las enzimas!

Bacterial Alpha – amilasas

Bacillus licheniformis

Bacillus amyloliquefaciens

(29)

pH óptimo

pH

Activ

id

ad

Las enzimas tiene un

cierto rango de pH en

la que son activas

Fuera de este rango

existe un fuerte

decreciemento de la

actividad de manera

habitual

(30)

Enzimas: son fácilmente

desnaturalizables?

• pH shocks

• Calor, con excepciones

(31)

Mecanismo de desnaturalización de enzimas?

• Actividad de agua

• Las enzimas

termoestables son

mas hidrofóbicas

• Opciones para la

ingeniería de

proteínas

(32)
(33)
(34)

18 | 04 | 2012

Las enzimas son una herramienta fundamental

para cualquier elaboración de vino!

3 familias de Enzimas función de sus objetivos:

1. Mejora de Proceso

2. Mejora de la calidad del vino

3. Resolución de problemas

(35)

18 | 04 | 2012

Mejora del Proceso

Mejora de la calidad

Resolución de problemas

Debates en marcha

(36)

18 | 04 | 2012

Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo

Mejora del Prensado & rendimiento mosto

Actividades Pectinasas activas en cadenas laterales de

homogalacturónico y arabinan

Ahorro de costes, mas rendimiento de mosto

Clarificación del mosto por flotación

Pectinasa activa en homogalacturónico

Ahorro de tiempo y trabajo

Clarificación del mosto por desfangado estático

Pectinasa activa en homogalacturónico

Ahorro de energía & agua

Clarificación de mostos y vinos por filtración

Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas

Sostenibilidad: menos viñedo para el mismo volumen de producción

Termovinificación Pectinasa termoestables Más calidad de mosto: flor Menos oxidación por

menor tiempo de

producción antes de la FA

(37)

Fermentación

Mosto prensa

Mosto yema

Dep. desfangado

Aplicación de pectinasas

Para prensado& mejora del rendimiento

Despalillado

crianza / almacenamiento

Prensa

Rapidase® Extra Press

Estrujado

1-3 ml / 100kg

Rapidase® Clear

1 ml / hl

enfriamiento

 incrementa el mosto yema: 4 – 15% facilita& reduce el tiempo de filtración  especialmente útil en prensados de uvas difíciles

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18 | 04 | 2012

Mejora de los rendimientos de prensado

Rapidase® Extra Press

Rendimiento total : 790

Litros/Ton

Chardonnay, Cooperativa Languedoc France

Enzima : 2 g/100kg

2 h at 20 °C

Rendimiento total : 825

Litros/Ton

20% 7% 15% 5 % 80%

(39)

18 | 04 | 2012

Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo

Mejora del Prensado & rendimiento mosto

Actividades Pectinasas

activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan

Ahorro de costes, mas rendimiento de mosto

Clarificación del mosto por flotación

Pectinasa activa en homogalacturónico

Ahorro de tiempo y trabajo

Clarificación del mosto por desfangado estático

Pectinasa activa en homogalacturónico

Ahorro de energía & agua

Clarificación de mostos y vinos por filtración

Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas

Sostenibilidad: menos energía utilizada

Termovinificación Pectinasa termoestables Más calidad de mosto: flor Menos oxidación por menor tiempo de producción antes de la FA

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18 | 04 | 2012

Induce la reducción accelerada de la viscosidad del mosto

Facilita la agregación de las borras

Accelera la decantación de los sólidos

Permite conseguir borras más compactas

Modo de acción bioquímico

:

hidrolisis completa de la cadena principal (homogalacturonano) de

las pectinas solubles

hidrolisis parcial de las cadenas laterales (ramnogalacturonano) de

las pectinas solubles

Facilita interacciones electro-estáticas entre las particulas de borras

Disminuye la viscosidad del mosto debido a la pectina soluble

Dosis : ~ 1 a 2 g/ Hl

Temperatura > 12 °C

Contacto entre 1 y 12 horas

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18 | 04 | 2012

Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo

Mejora del Prensado & rendimiento mosto

Actividades Pectinasas

activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan

Ahorro de costes, mas rendimiento de mosto

Clarificación del mosto por flotación

Pectinasa activa en homogalacturónico

Ahorro de tiempo y trabajo

Clarificación del mosto por desfangado estático

Pectinasa activa en homogalacturónico

Ahorro de energía & agua Clarificación de mostos y

vinos por filtración

Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas

Sostenibilidad: menos energía utilizada

Termovinificación Pectinasa termoestables Mejor calidad de mosto: menor turbidez para mejor calidad del vino

Menos oxidación por menor tiempo de producción antes de la FA

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18 | 04 | 2012

Proceso mejorado Perfil de la actividad Beneficios para el enólogo

Mejora del Prensado & rendimiento mosto Actividades Pectinasas activas en cadenas laterales de homogalacturónico y arabinan

Clarificación del mosto por flotación

Pectinasa activa en homogalacturónico

Time and labour savings Clarificación del mosto por

desfangado estático

Pectinasa activa en homogalacturónico

Energy savings Clarificación de mostos y

vinos por filtración

Pectinasa activa en homogalacturónico Glucanasas

Sustainability : less energy used

Termovinificación Pectinasa termoestables Proceso no realizable sin enzimas

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18 | 04 | 2012

Mejora del Proceso

Mejora de la calidad

Resolución de problemas

Debates en marcha

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18 | 04 | 2012

Mejoras de la calidad

Perfiles de actividad Aplicadas a la etapa del proceso

Beneficios para los enólogos

Liberación de precursores

aromáticos de la piel de la uva

Pectinasas , Rgasas, Maceración de

pieles de uvas tintas y blancas

Incremento de

aromas de uva como tioles y terpenos, …. Taninos y otros polifenoles Pectinasas , Rgasas, Xilanasas, celulasas Maceracion de uvas tintas

Incremento del color y polifenoles

esenciales para la calidad del vino Aromas glicosidados de la uva no volátiles convertidos en aromas volátiles Glucosidasa, arabinosidasa, rhamnosidasa, apiosidasa

Aplicada al vino Incremento de terpenos y norisoprenoides Liberación de compuestos específicos de la levadura Beta-(1,6)-glucanasas

Crianza sobre lías, batonnage

Boca, aroma, mejora de la estabilidad

(45)

18 | 04 | 2012

Acelera y aumenta la extracción de los precursores

aromáticos presentes en el hollejo de la uva durante la

maceración pelicular

El mosto escurrido (generalmente) no necesita nueva

adición de enzima pectolíticas

Modo de acción bioquímico

:

Degradación parcial de las paredes celulares del hollejo para liberar

los precursores aromáticos de la uva

hidrolisis avanzada de la pectina y de la protopectina , incluyendo

las cadenas laterales de arabinanos

hidrolisis parcial de las hemicelulasas

Dosis : entre 2 – 3 g/ 100kg

Temperatura> 10 °C

Contacto entre 2 y 18 h

(46)

Aplicación de Rapidase Expression Aroma + Rapidase Clear

en Sauvignon blanc de vendimia mecánica

Rapidase Expression Aroma

Maceración en prensa

~ 2 horas a 15 °C

Rapidase® Clear

1,5 g / 100kg 1 ml / hl de mosto al escurrir + 1 ml / hl después de 6 horas Escurrido (55 % rendimiento) tanque de desfangado estático + PVPP 10 g/hl Prensa Vendimia ~ 6 horas

desde vendimia Intercambiador hasta ~15 °C

16 horas después de escurrir la prensa : Mosto limpio : 15 NTU,

Pectina negativa 10,2 °Baumé

Intercambiador hasta 10 °C

(47)

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración

pelicular y su impacto en

el aroma de los vinos

blancos

2008

IFV , Francia

(48)

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto

en el aroma de los vinos blancos

IFV Gaillac (France)-2008

Rapidase® Expression Aroma en Sauvignon blanc

- extracción of precursores tiólicos

- Uso combinado con levaduras de liberación/conversión

- Impacto global en el perfil aromático del vino

Sauvignon blanc, AOC Gaillac, 8 tn/ha

(49)

18 | 04 | 2012 Enzima Control No enzima Rapidase Expression Aroma Rapidase Extra Color Levadura Fermivin TS28 Fermicru 4F9 2 Repeticiones

x

x

6 h maceración at 18°C, enzimas añadidas a 2 g/100kg

~ 65 kg uvas por ensayo

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto en

el aroma de los vinos blancos

(50)

18 | 04 | 2012

Los tioles

=> 12 micro-vinificationsen cuves de 30 Litres

C

H

3

OH

SH

3-MercaptoHexan-1-ol (3MH) 60 ng/L

C

H

3

OAc

SH

3-MercaptoHexyl acetato 4 ng/L 4-mercapto-4-metillpentan-2-one 0.8 ng/L

(51)

18 | 04 | 2012

=> 12 micro-vinificationsen cuves de 30 Litres

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 3MH (ng/l) Ac3MH (ng/l) Control R Expression aroma R Extra Color

Media de 4 vinos ,

2 cepas de levaduras

No habia 4MMP en la uva

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto en

el aroma de los vinos blancos

(52)

18 | 04 | 2012

Mejoras de la calidad Perfiles de actividad Aplicadas a la etapa del proceso

Beneficios para los enólogos

Liberación de precursores

aromáticos de la piel de la uva

Pectinasas , Rgasas, Maceración de pieles de uvas tintas y

blancas

Incremento de

aromas de uva como tioles y terpenos, …. Taninos y otros polifenoles Pectinasas , Rgasas, Xilanasas, celulasas Maceracion de uvas tintas

Incremento del color y polifenoles

esenciales para la calidad del vino

Aromas glicosidados de la uva no volátiles convertidos en aromas volátiles Glucosidasa, arabinosidasa, rhamnosidasa, apiosidasa

Aplicada al vino Incremento de terpenos y norisoprenoides Liberación de compuestos específicos de la levadura

Beta-(1,6)-glucanasas Crianza sobre lías, batonnage

Boca, aroma, mejora de la estabilidad

(53)

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración

pelicular y su impacto en

la calidad de los vinos

tintos

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18 | 04 | 2012

Rapidase

®

Extra Color

Acelera e incrementa la extracción de polifenoles

durante la maceración de uvas tintas

Modo de acción bioquímico

:

Degradación de las células del hollejo y pulpa para la

liberación rápida de color y precursores aromáticos

Hidrólisis de la pectina y protopectina, incluido cadena de

rhamnogalacturano

Hidrólisis de las hemicelulasas

Recomendaciones de uso

Adición a vendimia estrujada al llenar el dep. de fermentación

Dosis : 1 - 3 g / 100kg

Temperatura > 16 °C

(55)

18 | 04 | 2012

Rapidase

®

Extra Fruit

Favorece la extracción rápida de los precurosres

aromáticos de los hollejos durante la maceración de uvas

tintas

Contribuye a la extracción de polifenoles

Modo de acción bioquímico

:

Degradación de las células del hollejo y pulpa para la

liberación rápida de color y precursores aromáticos

Hidrólisis de la pectina y protopectina

Hidrólisis parcial de las hemicelulasas

Recomendaciones de uso

Adición a vendimia estrujada al llenar el dep. de fermentación

Dosis : 1 - 3 g / 100kg

Temperatura > 16 °C

(56)

Rapidase® Extra Color

3 g / 100kg

Prensa fin de FA

Hacia la FML

Recomendaciones de uso de Rapidase Extra Color en

maceración tradicional de tintos

Despalillar limitar trituración Maceración con Rapidase Extra Color aumenta extracción de color, estructura y perfil aromático de los vinos Medir contenido en sólidos

añadir Rapidase Extra Color a 3 g / 100kg

al llenar el Depósito

(57)

TEMPRANILLO DE RIBERA DEL DUERO D.O

MACERACIÓN ENDEP DE 50 L 50kg uvas despalilladas & estrujadas

SO2 T 50mg/l

3 condiciones x 3 tiempos de Maceración x 2 replicados = 18 ENSAYOS

CONTROL, sin enzima. Maceración t : 4 , 8 and 12 días

RAPIDASE EXTRA COLOR a 3g/100kg. Maceración : 4 , 8 and 12 días RAPIDASE EXTRA FRUIT at 3g/100 kg Maceración : 4, 8 and 12 días

(58)

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto

en el contenido en polifenoles

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Anthocyanins (g/l) Tannins (g/l) Control R Extra Color R Extra Fruit

Tempranillo, 12 días de maceración

FA completa

(59)

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto

en el Índice de Polifenoles

0 10 20 30 40 50 60

Drain wine Press wine

Control

R Extra Color R Extra Fruit

Tempranillo, 12 días de maceración

FA completa

(60)

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto

en el color del vino

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Color Intensity A 420nm A 520nm Control R Extra Color R Extra Fruit

Tempranillo, 12 días de maceración

FA completa

(61)

18 | 04 | 2012

y el impacto de la

maceración con

enzimas en el pH y

acidez del vino?

(62)

18 | 04 | 2012

Enzimas de Maceración pelicular y su impacto

en el pH y acidez del vino después de 12 días

de maceración

Tempranillo, 12 días de maceración

FA completa

Antes de la FML

0 1 2 3 4 5 6 pH TA (g/l) K+ (g/l) Control R Extra Color R Extra Fruit

(63)

18 | 04 | 2012

Mejoras de la calidad

Perfiles de actividad Aplicadas a la etapa del proceso

Beneficios para los enólogos

Liberación de precursores

aromáticos de la piel de la uva

Pectinasas , Rgasas, Maceración de

pieles de uvas tintas y blancas

Incremento de

aromas de uva como tioles y terpenos, …. Taninos y otros polifenoles Pectinasas , Rgasas, Xilanasas, celulasas Maceracion de uvas tintas

Incremento del color y polifenoles

esenciales para la calidad del vino

Aromas glicosidados de la uva no volátiles convertidos en aromas volátiles Glucosidasa, arabinosidasa, rhamnosidasa, apiosidasa

Aplicada al vino Incremento de terpenos y norisoprenoides Liberación de compuestos específicos de la levadura Beta-(1,6)-glucanasas

Crianza sobre lías, batonnage

Boca, aroma, mejora de la estabilidad

(64)

Precursores aromáticos Glicosidados:

hidrólisis enzimática secuencial

(65)

Fermentación Dep. Clarificación

Prensa

2-3 ml / Hl

libera los aromas volátiles (terpenos,

norisoprenoides) desde sus precursores no volátiles por estar con enlaces glicosilicos

Aplicaci

ó

n de Glicosidasas

Rapidase Revelation Aroma

Glu, Ara, Rha, Apio-sidases

storage

(66)

85

Liberación de geraniol desde sus precursores

en vinos de Moscateles

0 50 100 150 200 250 300 350 400 Control DP . AR 2000 à 10g/hl Control DP . AR 2000 à 10g/hl DP . AR 2000 à 5 g/hl DP Control DP . AR 2000 à 5 g/hl SM . Témoin SM . AR 2000 à 5 g/hl Diferentes concentraciones

Rapidase

Revelation

aroma

Diferentes concentraciones

Rapidase

Revelation

aroma

(67)

18 | 04 | 2012

Conclusión

las enzimas juegan un

papel fundamental en el

proceso de elaboración

del vino

una mejor compresión de

los mecanismos

moleculares de acción,

permiten el diseño de

mejores enzimas, y más

(68)

18 | 04 | 2012

MUCHAS

GRACIAS

Figure

Actualización...

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