“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y
LA SEGURIDAD ALIMENTARIA”
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENIERIA
PESQUERA
TEMA : CULTIVO DE UNA MICROALGA, MEDIANTE LA TECNICA DE LA MASIFICACIÓN
CURSO : CULTIVO DE FITOPLANCTON, ZOOPLANCTON Y MACROALGAS
PROFESOR : ING. EDGAR REGULO VEGA ALCAZAR M. Sc.
INTEGRANTES:
ALDANA AMAYA, GIAN MARCOS
ALVARADO NUÑEZ ARNOLD
CORDOVA CRUZ, HERNAN
SILVA TALLEDO, JOSE HERNAN
SUAREZ RAMIREZ SEGUNDO CHRISTIAN
ÍNDICE
I.
INTRODUCCIÓN………
………
4
III. MATERIALES
Y
EQUIPOS……… 5
IV.
FUNDAMENTO
TEÓRICO………
7
4.1. CARACTERISTICAS DE LA MICROALGA EN CULTIVO
(nannochloropsis)
……… 7
4.2. ACONDICIONAMIENTOS FISICOS………..
8
4.3. ACONDICIONAMIENTOS QUIMICOS
……….. 10
4.4. TÉCNICAS DE CONTAJE CELULAR…...
13
V.
PROCEDIMIENTO
Y
RESULTADOS……… 14
5.1. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE TODOS LOS EQUIPOS
Y
MATERIALES………
………….. 14
5.2.
PRIMERA
MASIFICACIÓN……….…
17
5.3. RESULTADOS DE LA CUANTIFICACION………..
24
5.4.-
SEGUNDA
MASIFICACIÓN:
………... 31
5.5. RESULTADOS DE LA CUANTIFICACION………..
37
CRECIMIENTO
DEL
CULTIVO……….
43
VII.-DISCUSIONES………
45
VIII.- CONCLUSIONES………
46
IX.- BIBLIOGRAFIA………
47
I.-INTRODUCCIÓNEl cultivo de microalgas se realiza mediante la “técnica de la masificación”, que necesariamente debe ser desarrollada en la práctica, para reafirmar los conocimientos teóricos y finalmente capacitar al estudiante de Acuicultura para obtener microalgas como cultivo de apoyo para alimentar a los diferentes cultivos principales.
Las microalgas en los sistemas acuáticos cumplen un papel importante debido a que son el primer eslabón en la cadena trófica ya que ellas son foto autótrofas, es decir, generan su propio alimento utilizando la luz, el CO2 y una serie de nutrientes que les brinda el medio donde se
desarrollan.
Su cultivo es muy importante en una acuicultura comercial ya que representan un adecuado alimento para los cultivos principales, por lo que deben manejarse las condiciones adecuadas semi-controladas o controladas totalmente, para lograr en ellas una biomasa considerable como alimento.
requerimientos físicos (Agitación, luz, Temperatura) y químicos (Manejo de la contaminación, nutrientes o sales minerales, gases, Ph, salinidad) los cuales si se manejan eficientemente van a generar una exitosa y considerable biomasa.
Además de todo lo anteriormente mencionado se deben realizar controles de desarrollo del cultivo (generales y sistemáticas) para determinar crecimiento, incremento de biomasa o posibles competidores o predadores.
Por lo que en el presente informe detallamos el procedimiento para un cultivo adecuado de microalgas (nannochloropsis), teniendo en cuenta las características físicas y químicas, así como los controles mencionados.
II.- OBJETIVOS
Utilizar el medio de cultivo de GUILLARD modificado.
Establecer y acondicionar un sistema de cultivo para microalgas.
Desarrollar la técnica de la masificación, hasta llegar a un volumen de 3 litros.
Cuantificar el cultivo mediante la técnica de conteo directo, utilizando la cámara de “Neubaver”
III.- MATERIALES Y EQUIPOS
3.1.- Materiales para la masificación:
Dos botellas de 1.5 litros. Dos botellas de 3.0 litros.
2 mts de manguera transparente ( ).
2 llaves para acuario ( ).
2 pali globos. ( ).
2 pliegos de papel de molde. Un rollo de papel higiénico. Un paño para limpieza (toalla). Un paquete de algodón.
Una cinta de embalaje. Un marcador indeleble.
3.2.- Materiales y reactivos para la desinfección y conteo de microalgas:
Hipoclorito de sodio. Tiosulfato de sodio. Agua destilada Formol al 5%.
3.3.- Materiales y equipos de laboratorio utilizados: Microscopio. Cámara de neubaver. Pipetas volumétricas. Vasos de precipitados (500 y 250 ml). Probeta (500 ml).
Laminillas cubre y porta objetos. Placas Petri. Pizeta MICROSCOPIO BOTELLAS PIZETA LLAVES T TOALLA PLUMON INDELEBLE PAPEL HIGIENICO PAPEL MOLDE CINTA ALGODON
IV.- FUNDAMENTO TEORICO
4.1 CARACTERISTICAS DE LA MICROALGA EN CULTIVO.
Nannochloropsis sp.
Nannochloropsis es una pequeña alga verde usada ampliamente en la industria de la acuicultura para cultivar zooplancton, tal como la alimentación de rotíferos y para hacer la técnica de las aguas verdes. También es usada para alimentar corales y otros consumidores filtradores.
Nannochloropsis es un género de alga que comprende aproximadamente 6 especies. Las especies mayormente se han conocido en el medio marino, pero también se producen en agua dulce y salobre. Todas la especies son pequeñas esferas, no móviles que no expresan ninguna característica morfológica distintiva, y no puede ser indicada mediante luz o microscopia electrónica.
Las algas del genero Nannochloropsis ellos tienen un diámetro de alrededor de 2 a 3 micrómetros.
CLASIFICACIÓN CIENTIFICA
Dominio
Eucariontes
Reino
Chromalveolata
Filo
Heterokontophyta
Clase
Eustigmatophyceae
Familia
Eustigmataceae
Genero
Nannochloropsis
4.2.-
ACONDICIONAMIENTOS FISICOS:
Nuestro cultivo masificado deberá contar con 3 factores físicos fundamentales que son: agitación, luz blanca y temperatura del medio ambiente.
Estos acondicionamientos tienen influencia de forma directa sobre los cultivos debido a que si faltarán algunos de estos factores nuestro cultivo se verá seriamente afectado y posteriormente fracasará.
LA AGITACIÓN.- Este acondicionamiento evita la sedimentación de las
microalgas y es necesario agitar constantemente; esto es posible hacerlo por medios mecánicos es decir utilizando un aireador, logrando así que en el cultivo haya una mejor distribución de los nutrientes disueltos en el agua, además permite un abastecimiento continuo de anhídrido carbónico (CO2 ) el cual es un componente del
aire, como efecto del bombeo y además la agitación permite que todas las microalgas aprovechen la mayor captación de la luz para la fotosíntesis. Por esta razón es considerada como el primero factor físico y más importante.
LA LUZ.- Es un factor físico de gran influencia, la cual puede ser tomada de dos fuente, una natural que es la luz solar, esta es utilizada si los cultivos son exteriores y extensivos, y la otra fuente es artificial que por lo general es utilizada para cultivos intensivos e interiores es decir los que se controlan dentro de un laboratorio.
Esta luz artificial debe de ser LUZ BLANCA O FRIA, no la luz amarilla o la que produce calor.
En cambio la luz blanca es producida por la reacción de la energía eléctrica con el gas neón, contenida en los fluorescentes; mientras que la luz amarilla es producida por incandescencia ósea por calor en el vació, lo que genera mucha energía calorífica, que calienta los cultivos de microalgas y los mata.
Las condiciones que debe reunir La luz artificial es que tener la calidad espectral adecuada, que están comprendidas entre los 380 y 720 nano micras (nm), nunca por debajo de los 380 ni mayor a los 720 nano micras, debido a que cuando se encuentran fuera de estos rangos son muy perjudiciales para nuestros cultivos debido a que producen inhibición de la fotosíntesis.
La otra condición es que debe tener una adecuada intensidad, que está en relación a la distancia que existe entre la fuente de luz y el cultivo de microalgas, esta debe estar entre
0,20 a 1.0 m dependiendo del volumen del cultivo. La intensidad de la luz se mide por LUX, y el rango adecuado de LUX para los cultivos está entre 2000 a 5000 lux, dependiendo siempre del volumen y la densidad del cultivo.
LA TEMPERATURA.- Es un factor de igual importancia que los anteriores
mencionados debido a que la fisiología de las microalgas depende de la temperatura del medio en la que se desarrollan en este caso el agua de mar.
La temperatura del medio de cultivo determina la principal actividad fisiológica, que es la fotosíntesis y su intensidad. Razón por la que la producción de biomasa de las microalgas, depende de la temperatura del agua o medio.
4.3.- ACONDICIONAMIENTOS QUÍMICOS:
Nuestro cultivo de Nannochloropsis sp también deberá contar con los 5 factores químicos más importantes los cuales son: manejo de la contaminación, nutrientes, pH, gases y salinidad. Los cuales tienen influencia sobre los cultivos debido a que si algunos de estos factores no estuviera en los márgenes correctos nuestro cultivo estará retardado en crecimiento o aumento de densidad y se vería seriamente afectado y posteriormente fracasará.
MANEJO DE LA CONTAMINACIÓN: Este factor es el primero y
principal requerimiento o acondicionamiento químico, debido a que determina la producción de biomasa (microalgas) en el tiempo y en las condiciones proyectadas. Manejar la contaminación va a significar principalmente evitar que el ecosistema o medio de cultivo no sea invadido por otros organismos competidores u organismos predadores es decir evitar que en nuestro cultivo existan “organismos no invitados”. Entre los competidores están otras microalgas y/o bacterias que se alimentan de los nutrientes desplazando a la microalga cultivada; de los predadores serán
todos aquellos organismos que se alimentan de las microalgas Las dos principales técnicas para manejar la contaminación son:
La Esterilización.- Consiste en la eliminación de TODOS los
microorganismos como bacterias y otras microalgas y sus formas resistentes, para evitar que compitan con la microalga en cultivo y así obtener un ecosistema estéril, donde sólo viva la microalga en cultivo. Se logra luego de haber utilizado el calor directo o húmedo y procedimientos químicos en combinación con procesos químicos, cuando se filtra el agua hasta llegar a las 2 micras, y luego aplicar radiación ultravioleta.
La desinfección.- Es la eliminación de la mayoría de los
microorganismos como bacterias otras microalgas y sus formas resistentes, para evitar que compitan con la microalga en cultivo y así obtener un ecosistema monoespecífico , donde prevalezca la microalga en cultivo por su densidad sobre los demás acompañantes, así la microalga tendrá un ecosistema acuático más indicado para su crecimiento. Se logra aplicando lavados con detergentes, alcohol, lejía, formol, yodo.
NUTRIENTES O SALES MINERALES: Es un factor importante
pues los nutrientes son el conjunto de sustancias que son agregadas al medio de cultivo en este caso agua de mar esterilizada o desinfectada, que deberá necesariamente contener toda la composición de sales minerales que requiera cada especie de microalga, en general se requiere:
-Nitrato de sodio 75 mg/L -Fosfato de sodio 5 mg/L
-Trazas de minerales - Vitaminas
GASES: tercer factor a tener en cuenta en los cultivos de
microalgas, los principales son el Anhídrido carbónico (CO2) y el
oxígeno disuelto en el agua (O2), el CO2 es el gas insumo y
deficitario en el cultivo de microalgas, debido a que participa en la fotosíntesis.
El CO2, ingresa mediante la agitación con el aire filtrado al cultivo de
microalgas, logrando densidades elevadas ejemplo 4.5 x 106, para
mayores densidades es necesita añadir al cultivo CO2 en su forma
purificada en un 1% del volumen del aire que ingresa con la agitación, caso contrario el cultivo no se desarrolla y por falta de CO2 el pH se
eleva hasta 9, creando un medio ambiente no adecuado para las microalgas.
PH DEL AGUA.- Es el cuarto factor químico a tener en cuenta
debido a que este representa la cantidad de hidrogeniones activos que están presentes en el agua y determinan si el cultivo de microalgas se va a desarrollar adecuadamente, para lo cual debe estar en el rango de 6,5 a 9,5, siendo el óptimo entre 7 y 8, valores fuera de este rango (6,5 a 9,5) causan problemas de erosión y deterioro en la pared celular de las microalgas.
El pH del agua está relacionado directamente con la cantidad de CO2 disuelto en el agua.
Por esta razón el pH promedio recomendado para el medio de cultivo de microalgas en agua dulce será de 7,5 y en agua de mar 8,4 los que con la edad de las células y el desarrollo del cultivo se incrementará hasta 9,0 , pH que detendrá el desarrollo del cultivo,
dado que se ha consumido todo el CO2 administrado por la agitación al cultivo, debiendo
obligatoriamente agregar el 1% de CO2 al sistema de agitación, para proveer CO2 para que
el desarrollo del cultivo reinicie su incremento, y se baje el pH a 7,5 o 8,4 según el tipo de agua.
SALINIDAD DEL AGUA.- Es el quinto factor químico a tener en
cuenta debido a que este comprende todas las sales disueltas en el agua, que las microalgas necesitan para su desarrollo normal, como por ejemplo el cloruro de sodio, el nitrato de sodio y el fosfato de sodio.
Las microalgas cultivadas pueden ser de origen marino o de agua dulce, en ambos casos será necesario verificar con un salinómetro óptico que la salinidad del medio de cultivo sea igual o muy similar al nuevo medio de cultivo a utilizar, durante el proceso de la masificación.
4.4.- TECNICAS DE CONTAJE CELULAR:
A continuación se hace una descripción breve de los métodos que se utilizan para determinar el número de células presentes en una muestra.
UTILIZANDO UN MICROSCOPIO Y UNA CÁMARA DE NEUBAVER.
Primero tomamos una muestra la cual tiene que ser homogénea y representativa, esto ser realiza no destapando la botella si no apretando la botella y por la misma manguera de aireación verter en un vasito la
muestra, luego mediante una pipeta se toma una submuestra de 2 ml del cultivo y se les aplica 2 ml de formol al 5%, luego homogenizamos, después con otra pipeta se extrae la muestra homogénea y se desliza en la cámara. Luego se cubre con la lámina cubreobjetos, se procede a contar el número de células presentes en cada cámara mediante el microscopio.
Una vez que se tiene el promedio de células de las cámaras, el cálculo total de células por mililitro se lleva a cabo de la siguiente manera:
a.- Primero calcule el factor de dilución
m = Muestra problema (ml)
f = solución de formol al 5% (ml)
b.- Se tiene que multiplicar por 10 000, debido a que el volumen de una cuadricula es de 0.1 micro litro y para llevarlo a mililitro se tiene q multiplicar por 10 000
c.- Se requiere el número promedio de células de la muestra problema. N.P. = Número promedio de células por ml
Con todos los incisos anteriores se realiza el cálculo de número de células de la muestra problema por ml y la fórmula queda así:
No. de Células/ ml = (F.D.) (10 000) (N.P.
V.- PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS
5.1. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE TODOS LOS EQUIPOS Y MATERIALES
Para manejar el problema de la limpieza y desinfección, hemos tenido que lavar los materiales que vamos a utilizar en la masificación y también el lugar de trabajo del grupo (mesa). Aquí se realizó lo siguiente:
El Primero lavado se hizo con detergente.
El Segundo lavado se hizo con hipoclorito de sodio. El tercer lavado se hizo con tiosulfato.
El cuarto lavado se hizo con agua destilada.
El procedimiento fue el siguiente:
EL PRIMER LAVADO:
Lo hicimos utilizando detergente con la finalidad de eliminar las partículas más grandes y persistentes como la suciedad y algunas impurezas de mayor tamaño, pues inicialmente lavamos cuidadosamente el área de la mesa de trabajo, utilizando abundante agua y una cierta cantidad detergente, restregando con el paño de limpieza para poder sacar la mayor suciedad posible; luego el área lavada con agua, detergente y enjuagada con agua potable la secamos totalmente con el papel higiénico.
Así mismo, se procedió el lavado con detergente y agua a los materiales tanto de vidrio como los materiales de plástico que se utilizaran durante el proceso de masificación.
EL SEGUNDO LAVADO:
Luego se procedió a realizar el segundo lavado utilizando hipoclorito de sodio (lejía), con el fin de eliminar todo tipo de microorganismos presentes e impurezas de menor tamaño adheridas al material, pero solo se realizó en materiales que luego utilizaríamos en la masificación; ya que el cloro tiene una valencia muy activa y por lo tanto corrosiva. Que al estar en contacto con cualquier organismo vivo este lo corroerá (es decir les destruirá su pared celular lo que les impedirá seguir reproduciéndose y en consecuencia morirán) Determinamos la cantidad de esta solución para luego diluirla y realizar el desinfectado utilizando la siguiente cantidad 5.88ml a una concentración de 500 ppm para 500 ml de agua de mar.
TERCER LAVADO:
Luego pasamos al tercer lavado que lo hicimos con Tiosulfato el cual se agregó 0.5 ml por cada 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitado, este lavado se hace con el fin de neutralizar y eliminar los residuos de HCl que han quedado presentes tanto en los materiales como en la zona de trabajo, es importante neutralizar con tiosulfato debido a que si no lo hacemos los residuos de cloro al momento de verterle nuestro inoculo corroerá la pared celular de nuestras micro algas causándoles la muerte.
CUARTO LAVADO:
Por último realizamos el cuarto lavado con agua destilada para retirar los residuos de Tiosulfato concluyendo finalmente que los materiales están desinfectados completamente. Para evitar que nuestros materiales se vuelvan a contaminar cubrimos con papel molde todos los materiales desinfectados: botellas rotuladas, el pali globo, la manguera, las conexiones de plástico (Uniones, llaves T). Una ver cubierto todos los materiales los recubrimos con un pliego de papel para obtener un solo paquete u bolsa, lo cerramos con cinta y volvemos a rotular (marcar con los datos del grupo) está vez el paquete.
Al final todo el paquete de materiales desinfectados se les entregará al docente para guardarlos, además se le hará la devolución de todos los materiales utilizados en esta práctica completamente limpios.
5.2.- PRIMERA ETAPA DE MASIFICACIÓN:
5.2.1.- PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO A MASIFICAR.
5.2.1.1.- TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR:
Se inicia con el proceso de recolección en el (mar), para luego ser llevada al CEAPA entregada a los encargados de esa zona y luego ellos hagan lo siguiente:
a.- FILTRACIÓN:
Los encargados del CEAPA tuvieron que aplicar el filtrado a nuestra agua con el fin de esta no presente sólidos, tal que todos los elementos sólidos no deseados se vayan quedando en el papel filtro y así lograr el adecuado manejo de la contaminación. Una vez filtrada un alumno del grupo tiene que ir a recoger la botella previa desinfección.
b.- TRATAMIENTO TERMICO:
Una vez filtrada el agua de mar llevamos a calor húmedo la cual se eleva a una determinada temperatura hasta que sea calentada, obteniendo la eliminación de: esporas, bacterias y todo tipo de microorganismos que pongan en riesgo nuestro cultivo.
Nota: El tiempo de aplicación del calor húmedo debe ser breve ya que si
esta hierve se formaran precipitados de color blanquecino (básicamente son sales), lo cual perjudicaría el desarrollo óptimo de nuestro cultivo.
5.2.1.2.- PREPARACIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DEL MEDIO DE CULTIVO
El proceso de filtración y esterilización lo llevamos a cabo dos días un día antes de la masificación respectivamente. Nutrientes (nitrato de sodio, fosfato de sodio trazas de minerales y vitaminas) cada una con su respectivo volumen que a continuación detallamos:
NITRATO DE SODIO:
Se trata de una sustancia incolora, ligeramente higroscópica y altamente oxidante; debido a su contenido de nitrógeno se utiliza como fertilizante.
1 mg 1000 ml
X mg 1000 ml
Para los nitratos de sodio en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse 1 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (nitrato de sodio) está en forma de solución entonces decimos que: 1 mg = 1ml, para que pueda ser tomado como medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 1 ml de fosfato de sodio para empezar a enriquecer nuestra agua de mar.
FOSFATO DE SODIO:
Se emplean como aditivos alimentarios principalmente estabilizantes, en algunas ocasiones empleado como regulador de la acidez, y también como agente en algunos minerales.
1 mg 1000 ml
X mg 1000 ml
X=1 mg=1 ml
Para los fosfatos de sodio en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse 1 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (Fosfato de sodio) está en forma de solución entonces decimos que: 1 mg = 1ml, para que pueda ser tomado como medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 1 ml de fosfato de sodio para empezar a enriquecer nuestra agua de mar.
TRAZAS DE MINERALES:
1 mg 1000 ml
X mg 1000 ml
X=1 mg= 1 ml
Para las trazas en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse en 1.1 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (trazas) está en forma de solución entonces decimos que: 1mg = 1 ml, para que pueda ser tomado como medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 1 mg de trazas para concluir el enriquecer de nuestra agua de mar.
La razón por la cual se agregan más volúmenes de fosfatos, nitratos y vitaminas es debido a que estos en el agua de mar que hemos tratado están en condiciones deficitarias; los minerales o trazas le hemos reducido su volumen a 1 ml es debido a que en el agua de mar existen más carbonatos y bicarbonatos lo cual este volumen vertido es solo para complementar algunas trazas faltantes ya que toda agua donde se va a realizar un cultivo debe contar con minerales en concentraciones relativamente bajas para que este progrese.
Todo esto que hemos realizado es con la finalidad de darle todas las facilidades a la especie a cultivar para que tenga el crecimiento o reproducción adecuada.
VITAMINAS:
La actividad de las vitaminas se pone en manifiesto químico como precursores en las formas metabólicas correspondientes por esta razón como el aporte natural es escaso de vitaminas da lugar a síntomas de deficiencia.
0.5 mg 1000 ml
X mg 1000 ml
X=0.5 mg=0.5 ml
Para las vitaminas en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse 0.55 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (Vitaminas) está en forma de solución entonces decimos que: 1 mg = 1ml, para que pueda ser tomado como medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 0.5 ml de vitaminas para empezar a enriquecer nuestra agua de mar.
5.2.2.- INCORPORACIÓN DEL INÓCULO:
Inicialmente estaba presente como cepa del cual se extraería la muestra para el cultivo (inoculo), y que posteriormente albergaría a todos los cultivos de las microalgas a cultivar. El inoculo incorporado al medio de cultivo preparado fue de 500 ml
A.- TOMA DE MUESTRA PARA SU PRIMERA CUANTIFICACIÓN.
Luego de tener nuestro sistema de cultivo en completo funcionamiento procedemos a desconectar el sistema de aireación de la línea madre,
luego extraemos una pequeña muestra la cual debe ser homogénea y representativa.
De esta muestra sacaremos una submuestra la cual tendrá un volumen de 2 ml, que lo vertimos en la placa Petri. La pipeta a utilizar para esta medida debe estar totalmente esterilizada para evitar contaminar la muestra y alterar los resultados.
De inmediato pipeteamos un volumen de 2 ml de formol al 5%, el cual le agregaremos a la placa Petri que contiene los 2 ml de la muestra, teniendo estos dos volúmenes nos servirán para el factor de dilución. El motivo por el cual agregamos formol es de inmovilizar (matar) a las microalgas para poder realizar el conteo; hecho esto homogenizaremos con el propósito de tener una muestra fiable a nuestro propósito (cuantificación).
Luego de haber realizado esto haremos uso de parte de pali globo, el cual nos servirá para llevar parte de la muestra homogenizada a la cámara de Neubaver, el pali globo y la cámara deben estar limpia y bien desinfectado, para obtener resultados fiables, Una vez realizado
esto cubrimos la muestra puesta en la cámara de Neubaver con una laminilla cubre objeto.
Para llevarla al microscopio y realizar el conteo correspondiente; para localizar las cuadriculas primero hicimos uso del lente de color rojo, el cual tiene un aumento de 4 aumentos (X 4), este sirvió para ubicar la cuadriculas en dimensiones relativamente pequeñas.
Una vez ubicada procedemos a utilizar el lente de color amarillo el cual tiene un aumento de 10 aumentos (X 10) , el cual nos sirvió para ubicar una cuadricula de las cuatro en dimensiones relativamente más grandes que a la anterior, luego hicimos uso del micrómetro para darle nitidez a la imagen a la muestra que visualizamos en el microscopio.
Hecho todo esto procedimos a realizar el conteo correspondiente de cada una de las cuadriculas
5.3.- CUANTIFICACIÓN: RESULTADOS.
PRIMER CONTEO DE MICROALGAS (SIEMBRA): (lunes 11/11/13)
76 62 60 68 50 57 40 72 53 58 77 53 69 48 50 55 Promedio: X = Σ (76+62+60+68………….) = 59.36 14 Total de microalgas T = X . 2 . 10 000
T = 1.1 x 106 células/mililitro
SEGUNDA CONTEO : (miércoles 13/11/13)
13 2 124 141 123 132 110 93 105 13 0 122 120 121 87 89 94 93 13 2 11 6 14 8 11 6 96 71 73 95 10 9 10 1 16 0 12 7 97 10 5 11 4 92 Promedio: A = Σ (132+124+………+127)= 125.79 14 B = Σ (132+110+………+92)= 95.93 14
X= 125.78 + 95.93= 110.86 2 Total de microalgas T = X . 2 . 10 000 T = 110.86 x 2 x 10 000 T = 2.2 x 106 células/mililitro
TERCER CONTEO: (viernes15/11/13)
11 6 111 113 142 170 140 118 140 14 5 119 111 120 130 103 125 119 14 7 97 127 128 133 117 128 126 10 3 120 143 130 108 127 124 127 Promedio: A =Σ(116+111+……..+130)=123.43
14 B = Σ (130+140+………+108)= 125.86 14 X= 123.43 + 125.86= 124,65 Total de microalgas T = X . 2 . 10 000 T = 124,65 x 2 x 10 000 T = 2.4 x 106 células/mililitros
CUARTO CONTEO: (martes 19/11/13)
15 2 183 180 126 18 5 165 158 160 16 7 13 4 16 6 17 9 16 4 16 6 17 9 20 6 Promedio: X = Σ(152+183+……..+206) =167celulas
14
Total de microalgas
T = X . 2 . 10 000 T = 167 x 2 x 10 000
T = 3.3 x 106 células/mililitros
5.3.3. ACONDICIONAMIENTO DEL SISTEMA DE AGITACIÓN
La agitación es el acondicionamiento físico más importante que debe tener un cultivo de microalgas ya que va a evitar la sedimentación de la densidad de microalgas, generar el movimiento del medio de cultivo y así proporcionar la buena distribución de los nutrientes disueltos en el agua, también funciona como abastecedor de anhídrido carbónico (CO2) del aire por efecto del bombeo a través
del burbujeo y brinda una mejor captación de la energía de la luz. Todo esto va a ser posible que se produzca una rápida reproducción de las microalgas y por consiguiente aumento en biomasa.
El abastecimiento de aire para nuestro cultivo es proporcionado por una bomba de aire la cual toma aire del medio ambiente para luego comprimirlo y distribuirlo por toda la red. Es importante que la bomba cuente con un filtro para poder controlar la contaminación del cultivo. La distribución del aire se realiza a través de una tubería principal de PBC la cual va a tener pequeñas boquillas por donde se conecta una manguera transparente de 2 metros y , para regular la cantidad de aire que entre al cultivo es necesario colocar en la conexión una llave pequeña de plástico. En la parte final de la manguera se coloca un pali
globo ( ) el cual va a pasar por la tapa de la botella previamente perforada colocándose hasta la parte más profunda de la botella para así generar una mayor agitación del cultivo y obtener una mayor biomasa.
5.3.4. CONTROLES DE DESARROLLO DEL CULTIVO DE MICROALGAS:
A.- REGISTRO DE DESARROLLO GENERALES (Diarias):
- DETERMINACIÓN DE COLOR Y TONALIDAD:
El color que iba tomando nuestro cultivo a lo largo de los días fue uno de los indicadores que nos permitió determinar que nuestro cultivo estaba progresando, es decir que las microalgas (nannochloropsis sp) se estaban reproduciendo, consumiendo los nutrientes aportados al agua de mar y que los acondicionamientos físicos y químicos que se habían hecho estaban dentro de los rangos aceptables para el cultivo de dicha microalga.
Fue así que a diario se tomaba nota del color, este iba en aumento es decir aumentaba el tono del color, iniciándose nuestro cultivo en un verde claro de ahí en adelante se fue notando que el color iba en aumento hasta llegar a un verde oscuro.
B.- REGISTRO DE DESARROLLO SISTEMATICO (diarias)
FECHA HORA TEMPERATURA
lunes 11/11/13 08.30 am. 23 °C 11.30 24 °C martes 12/11/13 08.00 am.11.30 am. 23 °C25 °C miércoles 13/11/13 08.30 am. 12.30 pm. 23 °C25 °C jueves 14/11/13 08.30 am.12.00 m. 23 °C25 °C
viernes
15/11/13 08.30 am.12.00 m 23 °C25 °C lunes
18/11/13 08.30 am.10.55 am. 25 °C26 °C
5.4.- SEGUNDA MASIFICACIÓN:
5.3.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO A MASIFICAR
5.3.1.1. TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR:
Inicia con el uso del agua de mar anteriormente recolectada en el mar, en el CEAPA se volverá a hacer la entrega a los correspondientes encargados de esa zona y luego empiecen con el siguiente proceso:
Los encargados del CEAPA tuvieron que aplicar nuevamente el filtrado con el fin de que no haya sólidos, tal que todos los elementos sólidos no deseados se vayan quedando en el papel filtro de 50 a 1 y así poder manejar adecuadamente la contaminación dándole
calidad al agua de mar. Una vez filtrada un alumno del grupo tiene que ir a recoger la botella previa desinfección con agua de mar filtrada para luego sea calentada (técnica del calor húmedo).
b.- TRATAMIENTO TÉRMICO:
Una vez filtrada el agua de mar será llevada a calor húmedo la cual se eleva a una determinada temperatura hasta que sea calentada, obteniendo la eliminación de: esporas, bacterias y todo tipo de microorganismos que pongan en riesgo nuestro cultivo.
Hay que tener en cuenta que el tiempo de aplicación del calor húmedo debe ser breve ya que si esta hierve se formaran precipitados de color blanquecino (básicamente son sales), lo cual perjudicaría el desarrollo óptimo de nuestro cultivo.
5.3.1.2.- PREPARACIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DEL MEDIO DE CULTIVO:
Para poder agregar los nutrientes (nitrato de sodio, vitaminas, fosfato de sodio y trazas) cada una con su respectivo volumen como ya se ha detallado anteriormente, debemos hacer cálculos para cada uno en relación con la cantidad de agua de mar que se necesita para llegar a los tres litros obteniéndolos de la diferencia entre los tres litros que se necesitan y el inoculo. En nuestra muestra obtuvimos 1350 de inoculo y la diferencia: 1750 necesitamos de agua de mar. Cada nutriente esta
1 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como están en forma de soluciones entonces decimos que 1 mg = 1ml.
NITRATO DE SODIO:
Cálculos para determinar la cantidad de nitrato de sodio a utilizar en la segunda masificación:
1 mg 1000 ml
X mg 1750ml
X=1.75mg = 1.75 ml de Nitrato de sodio
FOSFATO DE SODIO:
Como ya se sabe estos se emplean como aditivos alimentarios principalmente estabilizantes, en algunas ocasiones empleado como regulador de la acidez, y también como agente quelante en algunos minerales.
X 1750 ml X=1.75 mg =1.75 ml de Fosfato de sodio. TRAZAS: 1 mg 1000 ml X mg 1750 ml X=1.75mg =1.75 ml de trazas.
Para las trazas en la fiola estaba especificado que dicha solución debería vestirse en 0.5 mg por cada 1000 ml de agua de mar tratada, pero como esta (trazas) está en forma de solución entonces decimos que: 1mg = 1 ml, para que pueda ser tomado como medida volumétrica en la pipeta; es por ello que nuestra muestra le hemos agregado 0.95 ml de trazas para concluir el enriquecer de nuestra agua de mar.
La razón por la cual se agregan más volúmenes de fosfatos, nitratos y vitaminas ya ha sido explicada en la primera preparación del medio de cultivo para la masificación de la microalga.
VITAMINAS:
Cálculos para determinar la cantidad de vitaminas que van a ser utilizadas para nuestro cultivo
X mg 1750 ml X=0.875mg =0.875 ml de vitaminas.
5.3.2. INCORPORACIÓN DEL INÓCULO:
En este caso debemos agregar el volumen total de nuestro cultivo realizado como inoculo que es más de 1100ml de microalga.
Una vez que se ha condicionado el sistema de cultivo para la microalga y está en completo funcionamiento procedemos a tomar una muestra para realizar la primera cuantificación, para lo cual tenemos que desconectar el sistema de aireación de la línea madre, y luego extraemos nuestra muestra (4ml).
Sacaremos una sub-muestra la cual tendrá un volumen de 2 ml, y lo verteremos en la placa Petri, cabe recordar que la pipeta a utilizar para esta medida debe estar totalmente esterilizada para evitar contaminar la muestra y alterar los resultados.
De inmediato pipetearemos un volumen de 2 ml de formol (5%), el cual le agregaremos a la placa Petri que contiene los 2 ml de nuestra muestra (determinamos el factor de disolución); hecho esto homogenizaremos con el propósito de tener una muestra fiable a nuestro propósito (cuantificación).
Luego de haber realizado esto usamos el pali globo para llevar parte de la muestra homogenizada a la cámara de Neubaver, el pali globo y la cámara deben estar limpia y bien desinfectado, para obtener resultados
fiables. Una vez realizado esto cubrimos la muestra puesta en la cámara de Neubaver con una laminilla cubre objeto.
Luego se lleva al microscopio para el conteo correspondiente; localizamos las cuadriculas con el aumento (X4). Una vez ubicadas las cuadriculas utilizamos el lente de (X10), para localizar la primera cuadricula y empezamos a realizar el conteo correspondiente.
PRIMER CONTEO: (MARTES 19/11/13) 36 50 72 55 75 79 60 70 74 84 81 85 75 68 58 62 X = Σ(36+50+…………..+62) =68.79celulas 14 Total de microalgas T = X . 2 . 10 000 T = 68.79 x 2 x 10 000 T = 1.3 x 106 células/mililitros
X = Σ(60+68+78+……….+112) =97.86células 14 Total de microalgas T = X . 2 . 10 000 T = 97.86 x 2 x 10 000 T = 1.9 x 106 células/mililitro
TERCER CONTEO: (SÁBADO 23/11/13)13 5 10 3 11 7 12 3 13 0 11 3 13 0 12 5 12 6 139 113 127 15 1 111 119 143
X = Σ(135+103+………..+143) = 125.07células 14 Total de microalgas T = X . 2 . 10 000 T = 125.07 x 2 x 10 000 T = 2.5x 106 células/mililitro
VOLUMEN FINAL: 2840 MILILITROS
5.3.4. ACONDICIONAMIENTO DEL SISTEMA DE AGITACIÓN
La agitación es el acondicionamiento físico más importante que debe tener un cultivo de microalgas ya que va a evitar la sedimentación de la densidad de microalgas, generar el movimiento del medio de cultivo y así proporcionar la buena distribución de los nutrientes disueltos en el agua, también funciona como abastecedor de anhídrido carbónico (CO2) del aire por efecto del bombeo a través
del burbujeo y brinda una mejor captación de la energía de la luz. Todo esto va a ser posible que se produzca una rápida reproducción de las microalgas y por consiguiente aumento en biomasa.
El abastecimiento de aire para nuestro cultivo es proporcionado por una bomba de aire la cual toma aire del medio ambiente para luego comprimirlo y distribuirlo por toda la red. Es importante que la bomba cuente con un filtro para poder controlar la contaminación del cultivo. La distribución del aire se realiza a través de una tubería principal de PBC la cual va a tener pequeñas boquillas por donde se conecta una manguera transparente de 2 metros y , para regular la cantidad de aire que entre al cultivo es necesario colocar en la conexión una llave pequeña de plástico. En la parte final de la manguera se coloca un pali globo ( ) el cual va a pasar por la tapa de la botella previamente perforada colocándose hasta la parte más profunda de la botella para así generar una mayor agitación del cultivo y obtener una mayor biomasa.
5.3.5. CONTROLES DE DESARROLLO DEL CULTIVO DE MICROALGAS:
A.- REGISTRO DE DESARROLLO GENERALES (Diarias):
- DETERMINACIÓN DE COLOR Y TONALIDAD:
El color que iba tomando nuestro cultivo a lo largo de los días fue uno de los indicadores que nos permitió determinar que nuestro cultivo estaba progresando, es decir que las microalgas (nannochloropsis sp) se estaban reproduciendo, consumiendo los nutrientes aportados al agua
de mar y que los acondicionamientos físicos y químicos que se habían hecho estaban dentro de los rangos aceptables para el cultivo de dicha microalga.
Fue así que a diario se tomaba nota del color, este iba en aumento es decir aumentaba el tono del color, iniciándose nuestro cultivo en un verde claro de ahí en adelante se fue notando que el color iba en aumento hasta llegar a un verde caña oscuro.
B.- REGISTRO DE DESARROLLO SISTEMATICO (diarias) FECHA HORA TEMPERATURA
lunes
18/11/13 08.30 am. 25 °C
10.55 am. 26 °C
19/11/13 11.35 am. 24 °C miércoles 20/11/13 08.30 am. 10.30 pm. 23 °C24 °C jueves 21/11/13 08.30 am.11.35 am. 25 °C25 °C viernes 22/11/13 08.25 am.11.30 m 25 °C25 °C sábado 23/11/13 08.50 am.10.55 am. 24 °C25 °C
VI.-
REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA CURVA DE
CRECIMIENTO DEL CULTIVO.
Al final de todo el proceso de cultivo se obtuvo una gráfica que es una curva que muestra el resultado de 2 masificaciones del cultivo de la Nannochloropsis sp.
MASIFICACIÓN TIPO FECHA CELULAS / mL A 1500 ml 1° cuantificación (Siembra) 11/11/13 1.1 x 106 A 1500 ml 2ª cuantificación 13/11/13 2.2 x 106 A 1500 m 3ª cuantificación 15/11/13 2.4 x 106 A 1500 ml 4ª cuantificación 19/11/13 3.3 x 106 A 3000 ml 1° cuantificación (Siembra) 19/11/13 1.3 x 106 A 3000 ml 2ª cuantificación 21/11/13 1.9 x 106 A 3000 ml 3ª cuantificación 23/11/13 2.5x 106 CURVA DE CRECIMIENTO
VII.- DISCUSIONES
Se comprobó que la agitación es un factor determinante en el cultivo de microalgas porque nos va a permitir que todas las especies se encuentren en constante movimiento, es decir para que no s sedimenten.
Las determinaciones generales y sistemáticas es una actividad que se debe realizar diariamente, para tener una mejor referencia es
necesario realizar estas determinaciones dos veces x día. Esto nos permitirá verificar si hay aumento o disminución de la población.
La luz es un factor muy importante para que las microalgas puedan realizar la fotosíntesis, por lo tanto debe mantener una cierta distancia que le permita a la microalga desarrollarse. Debe de ser de color blanca o fría.
Todos los materiales deben ser lavados, desinfectados para que así nuestro cultivo se desarrolle de la mejor manera.
Se debe de entregar con anticipación el agua de mar no contaminada a los encargados del CEAPA, para que ellos sean los responsables de esterilizarla y así nosotros poder cultivar sin ningún problema cualquier tipo de microalga.
VIII.- CONCLUSIONES
Se concluyó que la técnica de la masificación de microalgas es de gran importancia, que tiene por objetivo principal obtener la densidad y volumen determinado de la microalga (Nannocholoropsis sp.)en un determinado tiempo, y que va a servir de alimento para los cultivos de apoyo y cultivos principales.
Se establecieron condiciones adecuadas para el cultivo de microalgas.
Se aprendió a manejar la cámara de NeuBauer que sirve para realizar el conteo de microalgas como una determinación sistemática.
IX.- BIBLIOGRAFIA:
http://en.wikipedia.org/wiki/Nannochloropsis
http://www.acuinuga.com/00_plugins/docs.php?id=572.
http://gaceta.cicese.mx/print.php?topico=secciones&ejemplar=152&sid=&id=2273
