Distribuição e quantificação de hidrocarbonetos em sedimentos do estuário do rio Sergipe

Texto completo

(1)Universidade Federal de Sergipe Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Núcleo de Pós-Graduação em Química. DISTRIBUIÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE HIDROCARBONETOS EM SEDIMENTOS DO ESTUÁRIO DO RIO SERGIPE. Aluno: Manoel Bomfim Lima Orientador: Prof. Dr. Marcelo da Rosa Alexandre. São Cristóvão - SE 2012.

(2) DISTRIBUIÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE HIDROCARBONETOS EM SEDIMENTOS DO ESTUÁRIO DO RIO SERGIPE. MANOEL BOMFIM LIMA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Sergipe, como parcial. requisito. para. a. obtenção do título de Mestre em Química.. Orientador: Prof. Dr. Marcelo da Rosa Alexandre. São Cristóvão - SE 2012.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. Lima, Manoel Bomfim Distribuição e quantificação de hidrocarbonetos em sedimentos do estuário do Rio Sergipe / Manoel Bomfim Lima ; orientador Marcelo da Rosa Alexandre. – São Cristóvão, 2012. 76 f. ; il.. L732d. Dissertação (Mestrado em Química)–Universidade Federal de Sergipe, 2012. O 1. Biomarcadores geoquímicos. 2. Sedimentos. 3. Estuário – Rio Sergipe. I. Alexandre, Marcelo da Rosa, orient. II. Título. CDU: 547.2:627.223.7.

(4)

(5) Dedico esta obra a minha querida esposa ELIZÂNGELA ARAÚJO SANTOS LIMA pelo incentivo e parceria na realização deste trabalho, aos meus dois filhos amados EMMANUELL SANTOS LIMA e EMMANUELLE SANTOS LIMA, e aos meus pais ANA MARIA LIMA e MANOEL LIMA DOS SANTOS (in memoriam) por sempre terem me incentivado a galgar esses passos..

(6) AGRADECIMENTOS. Toda conquista que almejamos é construída por meio de desafios que devemos vencer. Durante esse processo de caminhada, existem momentos que nos levam a tomadas de decisão, renúncias, sacrifícios momentos impares em nossa vida. Mas tudo isso só é possível devido a permissão do D-us Altíssimo - D-us de Avraham, de Yitz‟chak e de Ya‟akov. Conforme texto do Tanakh, especificamente no livro de Yesha‟yahu: “ Seca-se a erva, e caem as flores, mas a palavra de nosso D-us subsiste eternamente ( Is 40:8). De forma que, o meu primeiro agradecimento é para ELE, por permitir e me possibilitar condições humanas de resistir aos grandes desafios que até o momento foi possível vencer. O segundo momento de agradecimento é para o Prof. Dr. Marcelo da Rosa Alexandre. Caríssimo professor, não tenho palavras para descrever os meus sinceros agradecimentos por ter caminhado com você durante. este período de formação. acadêmica. Foram valiosíssimas as suas contribuições neste processo de aprendizagem. Pude perceber ao longo desta caminhada que são várias as suas qualidades como professor, orientador e ser humano, dentre elas descrevo algumas: compromisso, responsabilidade, humildade, simplicidade, paciência, etc. Entretanto, quero lhe dizer que foi uma benção celestial tê-lo como orientador. Por fim, meu muito OBRIGADO, e que o Criador Eterno te dê em dobro o bem que fazes aos seus semelhantes. Gostaria nesse momento de lembrar do prof. Dr. Sandro Navickiene, uma pessoa muito especial, a quem admiro muito, como professor e sobre tudo como ser humano, devido a sua simplicidade, seriedade e compromisso com esse processo de formação educacional. Professor muito obrigado por sua colaboração nesta etapa da minha caminhada. Não posso deixar de lembrar como muita admiração do Prof. Dr. Haroldo Silveira Dórea, excelente profissional a quem tenho grande respeito e admiração. Professor, de coração agradeço por sua participação nesse processo de ensino-.

(7) aprendizagem, foi muito promissora a sua colaboração desde a graduação até esse momento, o mestrado. Meu muito obrigado. Também quero deixar registrado o meu agradecimento aos professores das disciplinas cursadas no mestrado ( Prof. Dr. Marcelo da Rosa Alexandre, Prof. Dr. Perícles Barreto, Profa. Dra. Elizangela Passos, Profa. Dra. Luciane Romão, Prof. Dr. Ricardo, Prof. Dr. Sandro, Prof. Dr. Haroldo Silveira Dórea ). Aos professores da Banca na Qualificação ( Prof. Dr. Haroldo e Profa. Dra. Lisiane) suas observações foram valiosíssimas para a conclusão deste trabalho. Ao Mestre Elissandro S. Emídio pela grande colaboração, sempre disposto a ajudar. Caro colega meu muito obrigado, muita paz e sucesso onde quer que você vá. Aos professores da Banca na Defesa da Dissertação ( Profa. Dra. Elisângela de Andrade Passos (DQI-UFS) , Profa. Dra. Maria Nogueira Marques (ITP-UNIT) e o Prof. Dr. Alberto Wisniewski Júnior (DQI-UFS) pelas preciosíssimas orientações que de certa forma contribuíram muito para a melhoria deste trabalho, meus sinceros agradecimentos. Enfim, a todos os colegas do LCP, em especial : Antônio Sérgio Oliveira dos Santos que no primeiro momento me ajudou muito, bem como nas horas que ligo sempre me atende e Danielle Góis pela parceria nesse projeto. OBRIGADO A TODOS!.

(8) “Toda boa dádiva e todo dom perfeito vêm do alto, descendo do Pai das luzes, em quem não há mudança, nem sombra de variação”. (Ya’akov 1:17).

(9) SUMÁRIO. LISTA DE SIGLAS. i. LISTA DE FIGURAS. ii. LISTA DE TABELAS. iii. RESUMO. iv. ABSTRACT. v. 1. INTRODUÇÃO. 1. 2. OBJETIVOS. 3. 2.1 Objetivos Gerais. 3. 2.2 Objetivos Específicos. 3. 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 4. 3.1 Biomarcadores Geoquímicos. 4. 3.1.1 Hidrocarbonetos. 5. 3.1.1.1 Hidrocarbonetos Alifáticos. 6. 3.1.1.2 Hidrocarbonetos Isoprenóides. 7. 4. PROCEDIMENETO EXPERIMENTAL. 9. 4.1 Área de estudo. 9. 4.1.1 A Bacia Hidrográfica do Rio Sergipe. 9. 4.2 Amostragem 5 . METODOS E MATERIAIS. 10 11. 5.1 Material. 11. 5.1.1 Reagentes, solventes e outros materiais. 11. 5.1.2 Equipamentos. 11. 5.1.3 Limpeza dos materiais. 11. 5.2 Métodos. 12. 5.2.1 Extração. 12. 5.2.2 Tratamento com cobre metálico. 13. 5.2.2.1 Ativação do cobre metálico. 13. 5.2.2.2 Extração de Enxofre. 13. 5.2.3 Limpeza e Fracionamento da amostra (Clean up ). 14. 5.2.4 Coluna de Fracionamento Otimizada. 15. 5.2.4.1 Componentes químicos da coluna. 15. 5.2.4.2 Preparação da coluna. 17.

(10) 5.2.4.3 Teste de eficiência da coluna. 17. 5.2.5 Fracionamento. 18. 5.2.6 Análise cromatográfica. 19. 5.3 Parâmetros Analíticos de Validação. 20. 5.3.1 Linearidade. 21. 5.3.1.1 Curva Analítica. 21. 5.3.2 Sensibilidade. 22. 5.3.2.1 Limite de Detecção e Limite de Quantificação. 22. 5.3.3. 23. Recuperação para Hidrocarbonetos Alifáticos em sedimento. 5.3.4 Precisão. 24. 5.4 Análise Granulométrica. 25. 5 . RESULTADOS E DISCUSSÃO. 27. 6.1 Otimização da coluna de fracionamento. 27. 6.2 Linearidade. 29. 6.2.1 Curva Analítica. 29. 6.3 Recuperação. 31. 6.4 Caracterização do sedimento. 33. 6.4.1Granulometria. 33. 6.4.2Carbono Orgânico Total e Matéria Orgânica Total. 35. 6.5 Distribuição e quantificação de hidrocarbonetos. 36. 7. CONCLUSÕES. 45. 8. BIBLIOGRAFIA. 51. APÊNDICES. 61. Apêndice I - Fotos dos pontos de amostragem. 62. Apêndice II - Área dos Hidrocarbonetos após clean up com Sílica. 63. Apêndice III Área dos Hidrocarbonetos após clean up com Sílica+Alumina+Sulfato de Sódio Anidro 64. Apêndice IV Curva de Calibração para os Hidrocarbonetos Alifáticos. 65. Apêndice V Recuperação dos Hidrocarbonetos nível baixo ( 0,5 µg/mL). 68. Apêndice VI Recuperação dos Hidrocarbonetos nível alto ( 4,0 µg/mL). 69. Apêndice VII Tempo de retenção dos hidrocarbonetos estudados. 70. Apêndice VIII Cromatogramas dos Hidrocarbonetos Alifáticos em sedimento do rio Sergipe no inverno. 71.

(11) Apêndice IX Cromatogramas dos Hidrocarbonetos Alifáticos em sedimento do rio Sergipe no inverno. 74.

(12) LISTA DE SIGLAS ABNT – Associação Brasileira de Normas e Técnicas Ace – Acenafteno Acf – Acenaftileno An - Antraceno ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária C/N- Carbono/Nitrogênio DCM: Diclorometano Fen – Fenantreno Flt – Fluoranteno Flu – Fluoreno F1- fração da extração contendo os hidrocarbonetos alifáticos F2 - fração da extração contendo os HPAs GC-FID - cromatografia gasosa com detector por ionização de chama (Gas Chromatography-Flame Ionization Detector) GC-MS - cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas ( Gas Chromatography-Mass Spectrometry ) HA – Hidrocarbonetos Alifáticos HPAs – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos HAR - Hidrocarbonetos Alifáticos Resolvidos HMW – Alta Massa Molar (High Molecular Weight ) HPAs – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada ( International Union of Pure and Applied Chemistry ) IPC - Índice Preferencial de Carbono LCP - Laboratório de Análise de Compbustíveis e Poluentes LD - Limite de Detecção ( Limit of Detection ) LMW – Baixa Massa Molar ( Low Molecular Weight ) LMW/HMW - Baixa Massa Molar / Alta Massa Molar ( Low Molecular Weight/High.

(13) Molecular Weight) LQ - Limite de Quantificação ( Limit of Quantification ) MOT - Matéria Orgânica Total m/z - Razão massa/carga Naf – Naftaleno n-C16-d - Hexadecano deuterado ND - não detectável Ph - Fitano Pr - Pristano Pr/Ph - razão pristano/fitano PI - Padrão Interno Pir – Pireno R – Coeficiente de Correlação R2 - Coeficiente de determinação RSD - Desvio Padrão Relativo ( Relative Standard Deviation ) RTA - razão terrestre aquática S/R - Razão sinal/ruído TAH - Hidrocarbonetos Alifáticos Totais TOC - Carbono Orgânico Total USEPA - Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos ( United States Environmental Protection Agency ) UCM - Mistura Complexa não-Resolvida (Unrevolved Complex Mixture ).

(14) LISTA DE FIGURAS Figura 1: Bacias hidrográficas do rio Sergipe. 2. Figura 2: Fórmula estrutural de Hidrocarbonetos. 5. Figura 3: Fórmula estrutural dos isoprenóides Pristano e Fitano. 6. Figura 4: Fórmula estrutural de um Hidrocarbonetos Alifático. 6. Figura 5: Esquema de degradação do Fitol. 8. Figura 6: Fórmula estrutural da Clorofila A. 8. Figura 7: Bacia Hidrográfica do rio Sergipe. 10. Figura 8: Amostrador do tipo draga usado na coleta. 11. Figura 9: Distribuição espacial dos pontos de amostragem. 12. Figura 10: Liofilizador usado para desidratar as amostras de sedimentos coletadas no estuário do rio Sergipe.. 13. Figura 11: Banho ultrassônico usado na extração dos Hidrocarbonetos Alifáticos. 15. Figura 12: Rotaevaporador usado para pré-concentrar os extratos. 16. Figura 13: Estrutura da sílica gel mostrando um possível poro da partícula de sílica (a), um grupo siloxano (b), um grupo silanol isolado (c), silanóis vicinais (d) e silanóis geminais (e).. 19. Figura 14: Fluxograma esquemático para separação das frações alifáticas e aromáticas na coluna de sílica 21 Figura 15: Coluna otimizada para separação da fração alifática dos extratos das amostras nesse estudo 22 Figura 16: Cromatógrafo Gasoso a clopado a um espectômetro de massas. 23. Figura 17: Relação sinal-ruído. 26. Figura 18:Grau de separação dos Hidrocarbonetos usando a coluna de sílica. 31. Figura 19: Percentagem de recuperação para os HPAs de menor massa molar. 31. Figura 20: Grau de separação dos Hidrocarbonetos usando a coluna de sílica-alumina 32 Figura 21: Procedimento par construção da curva analítica. 33. Figura 22: Comparando a recuperação dos analitos nos dois níveis de fortificação. 36. Figura 23: Comparando a composição granulométrica nos pontos de amostragem. 39. Figura 24: Perfil dos n-alcanos nos pontos de amostragem P4 e P5. 40.

(15) Figura 25: Comparando os n-alcanos no ponto P1 (a); ponto P2 (b); ponto P3 (c); ponto P4 (d); ponto P5 (e);ponto P6 (f); ponto P7 (g);ponto P8 (h); ponto P9 (i). 46. Figura 26: Cromatograma do ponto 7 indicando a presença da UCM. 47.

(16) LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Pontos de amostragem da coleta de sedimento no estuário do rio Sergipe. 10. Tabela 2: Colunas de fracionamento para Hidrocarbonetos. 18. Tabela 3: Parâmetros analíticos de validação. 24. Tabela 4: Coeficiente de correlação linear e Correlação. 25. Tabela 5: Recuperação dos analitos em função da concentração. 27. Tabela 6: Escala Granulométrica de Wentworth. 29. Tabela 7: Dados para a construção da curva analítica. 33. Tabela 8: Parâmetros da curva analítica. 34. Tabela 9: Massa de sedimento, concentração do MIX de HA e concentração do PI. 35. Tabela 10: Limites de Detecção e Quantificação para os n-alcanos estudados. 37. Tabela 11 : Carbono orgânico total, matéria orgânica total e granulometria dos sedimentos do estuário do Rio Sergipe no inverno e verão. 38. Tabela 12: Concentrações de hidrocarbonetos alifáticos calculadas em sedimentos do Rio Sergipe. 41. Tabela 13: Índices de distribuição calculados em sedimentos do Rio Sergipe. 42.

(17) RESUMO. A bacia Hidrográfica do Rio Sergipe está situada na região central do estado de Sergipe, no sentido oeste-leste, abrangendo 26 municípios, com uma área correspondente a 3.673 km² e ocupação populacional de 1.213.607 habitantes, segundo o censo 2010 do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). Nesta região são desenvolvidas diversas atividades, entre elas podemos destacar a atividade de pesca, a atividade petrolífera e de abastecimento humano. O presente trabalho visa compreender a distribuição dos hidrocarbonetos alifáticos no estuário do rio Sergipe. A partir do estudo desses hidrocarbonetos ou biomarcadores geoquímicos, é possível saber como acontece a deposição sedimentar dos alcanos saturados e isoprenóides, bem como o impacto ambiental associado a esse aporte. Para a realização desse estudo dezoito amostras de sedimentos superficiais foram coletadas ao longo do estuário. Para a compreensão da distribuição desses hidrocarbonetos na região foram considerados vários índices geoquímicos, entre eles: o Índice Preferencial de Carbono (IPC), a Razão Terrestre Aquática (RTA), e Razão Pristano/Fitano. Os resultados da análise dos sedimentos amostrados indicaram a influência antrópica, o que pode ser observado a partir das concentrações elevadas dos n-alcanos pares na série homóloga. Também foi observado em sete dos nove pontos estudados a presença de uma mistura complexa não-resolvida (UCM), evidência muito importante de contaminação petrogênica. Nos pontos estudados, no inverno, os n-alcanos apresentaram valores de concentração entre 9,86 e 30,78 µg.g-1 enquanto que no verão os valores apresentaram variação entre 2,8 e 26,1 µg.g-1. A quantidade de mistura complexa não resolvida (UCM) na primeira campanha (inverno) variou entre 31,1 e 500,1 µg.g-1, enquanto que no verão essa variação foi de 1,2 a 135,8 µg.g-1. Já os hidrocarbonetos alifáticos totais apresentaram no inverno valores entre 12,5 e 553,2 µg.g-1 e no verão variou de 9,7 a 236,7 µg.g-1. Os índices de distribuição e os parâmetros de composição sugerem uma origem predominantemente antropogênicas em sete dos nove pontos de amostragem. Para dois pontos (P6 e P9) os índices apontam para uma origem predominantemente biogênica. Nos pontos de amostragem (P4 e P5) no inverno, o IPC foi de 1,1 e 1,2 respectivamente, e indicativos de que a origem dos hidrocarbonetos naquela região é antrópica, sendo corroborado com os valores de IPC calculados na segunda campanha (verão), variando de 0,9 a 3,3. Os resultados encontrado neste estudo mostram que há uma relação fortíssima com o perfil de cada ponto de amostragem. São várias as características que descrevem cada ponto de amostragem, entre elas, à presença de portos usados para travessia entre as cidades de Barra dos Coqueiros e Aracaju, atividades de pequenos navios cargeiros e barcos de pesca, presença marcante na região, e que geram resíduos de hidrocarbonetos.. Palavras-Chave: Biomarcadores Geoquímicos , Sedimento, Estuário, Rio Sergipe..

(18) ABSTRACT. The Sergipe River Watershed is located in the central region of the state of Sergipe. It flows from west to east, covering 26 municipalities, with a corresponding area of 3.673 Km2 and population of 1,213,607 inhabitants in its surrounding, according to the 2010 census of the Brazilian Geography and Statistics (IBGE). In this region are developed several activities, among them we can highlight the activity of fishing, petroleum extraction and water supply for human consumption. The present work aims to understand the distribution of aliphatic hydrocarbons in the Sergipe River estuary. Studying the hydrocarbons distribution, or geochemical biomarkers, one can infer on how the sedimentary deposition of saturated alkanes and isoprenoids happens, as well as the environmental impact associated with this input. To conduct this study, eighteen samples of surface sediments were collected along the estuary. To understand the distribution of these hydrocarbons, a number of geochemical indices were used, among them there is the Carbon Preference Index (CPI), the Terrestrial Aquatic Ratio (TAR), the pristane/phytane ratio, etc. The results found indicate human influence, which can be observed from the high concentrations of even n-alkanes in the homologous series. It was also observed in seven of nine points studied the presence of unresolved complex mixture (UCM), most significant evidence of petrogenic contamination. In the samples collected during the winter time, the n-alkanes showed concentration values between 9.86 and 30.78 µg.g-1 while in the summer, theses values showed variation between 2.8 and 26.1 µg.g-1. The amount of unresolved complex mixture (UCM) in the winter sampling campaign ranged between 31.1 and 500.1 µg.g-1, whereas in summer, this variation ranged from 1.2 and 135.8 µg.g-1. The total aliphatic hydrocarbons found in the samples collected in the winter ranged from 12.5 up to 553.2 µg.g-1 and in the summer, from 9.7 to 236.7 µg.g-1. The distribution indexes and composition parameters suggest a predominantly anthropogenic origin in seven of nine sites studied. For two sampling sites (P6 and P9) the indices point out to a predominantly biogenic origin. For the sampling sites P4 and P5, in the winter, the CPI was 1,1 and 1,2 respectively, indicating that the origin of the hydrocarbons in the region is anthropogenic; being supported with CPI values in the summer, 0.9 to 3.3 respectively. The results found in this study show that there is a very strong relationship with the profile of each sampling point. There are several characteristics that describe each sampling point, such as the presence of harbors were small boats are used for transport between the city of Aracaju and Barra dos Coqueiros, as well as small ships and fishing boats activities that possible generate hydrocarbons residues which eventually will sink in the sediments.. Keywords: Geochemical Biomarkers, Sediment, Estuary, Sergipe River.

(19) 1 INTRODUÇÃO. A compreensão e avaliação das características do ambiente em que vivemos é de suma importância, dada a velocidade com a qual sociedade tem avançado. Neste aspecto, é possível perceber o impacto da produção industrial, levando-nos a reflexão sobre algumas medidas que devem ser adotadas, sobretudo no que se refere aos resíduos gerados em grande ou pequena escala de produção e seu descarte no meio ambiente (FREITAS, 2003). A preocupação em cuidar bem da natureza deveria ser diária, já que a qualidade de vida é sinônimo de cuidar bem do ambiente em que vivemos. Assim sendo, a qualidade do ar que respiramos, da água que consumimos ou até o tipo de alimento, deriva desse cuidado ambiental. O tema em discussão não deve ser discutido apenas no contexto da academia, mas em um horizonte mais amplo. Essa atividade pode ser desenvolvida através do monitoramento de compostos ou grupos de compostos, podendo estes serem orgânicos ou inorgânicos (SANTOS, 2004). A caracterização da matéria orgânica em uma região estuarina é um fator importante porque nos leva a compreender melhor a origem do material sedimentar ali depositado, visto que, estudos já realizados na costa litorânea brasileira revelam que os contaminantes são oriundos de esgostos domésticos não tratados, resíduos industriais, petróleo e derivados (WEBER, 1992). Contudo, os ecossistemas aquáticos são ambientes deposicionais que apresentam em seus sedimentos registros dos processos que ocorreram “in situ” e em sua bacia de drenagem (AMORIM et al., 2009). Territorialmente, Sergipe compreende uma unidade federativa de 22050 km2. Sua hidrografia é bastante significativa, sendo composta por diversos rios. No estado de Sergipe foram catalogadas 8 grandes bacias hidrográficas sendo 3 federais (a do rio São Francisco, a do rio Real e a do rio Vaza Barris) e cinco estaduais (a do Japaratuba, a do rio Piauí, a do rio Sergipe, o grupo de bacias costeria 1 (GC1) e o grupo de bacias costeria 2 (GC2) (Figura 1).. 1.

(20) Figura 1: Bacias hidrográficas de Sergipe (SEMARH, 2012). A região estuarina correspondente a Bacia do rio Sergipe é formada por diversos afluentes merecendo destaque o rio do Sal (ao norte), o rio Poxim (ao sul) e próprio rio Sergipe (a oeste), sendo sua foz o oceano atlântico (a leste) (ROCHA, 2006). Como os grandes cursos de água existentes no mundo, a bacia do rio Sergipe funciona como região de descarte de esgotos domésticos e efluentes industriais, sobretudo na região próxima a sua foz, compreendendo os municípios de Aracaju, Barra dos Coqueiros e Nossa Senhora do Socorro (ALVES et al., 2006). Dentre os compostos orgânicos, pode-se dar destaque a uma grande classe de compostos, os hidrocarbonetos. No presente estudo, apenas os hidrocarbonetos alifáticos serão avaliados. Estes compreendem os compostos de cadeia aberta, saturada, normal ou ramificada, dentre os quais podem ainda ser subclassificados em alcanos saturados nãoramificados (também denominados de alcanos) e os isoprenóides (pristano e fitano). Esses hidrocarbonetos são de grande importância e norteadores para a caracterização geoquímica ambiental da região onde o estudo foi desenvolvido. Neste, busca-se compreender a distribuição dos hidrocarbonetos no estuário do rio Sergipe.. 2.

(21) 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivos Gerais. O objetivo principal deste estudo é avaliar a distribuição de hidrocarbonetos presentes nos sedimentos do estuário do Rio Sergipe.. 2.2 Objetivos Específicos Determinar o teor de matéria orgânica presente nos sedimentos do Rio Sergipe; Estabelecer a granulometria e verificar o comportamento da matéria orgânica quando esta é incorporada no sedimento; Determinar os níveis de biomarcadores geoquímicos, especialmente os hidrocarbonetos alifáticos, nos sedimentos coletados no Estuário do Rios Sergipe; Obter índices e razões entre os biomarcadores estudados; Estabelecer a real contribuição da atividade petrolífera no aporte de material orgânico no ambiente estudado.. 3.

(22) 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 3.1 Biomarcadores Geoquímicos. Os biomarcadores podem ser definidos como compostos orgânicos complexos, que podem ser encontrados em betumes, petróleo e sedimentos, e que cujas estruturas moleculares apresentam uma ligação inequívoca com compostos naturais presentes em organismos vivos tais como bactérias, fitoplânctons, zooplânctons e vegetais superiores (PETERS et al., 2005; TISSOT et al., 1984). No petróleo, a principal classe de biomarcadores é a dos hidrocarbonetos. Estes compostos estão presentes, devido ao processo de maturação da matéria orgânica que deu origem ao mesmo (PEDERZOLLI, et al., 2004). Dessa forma, a matéria orgânica em sedimentos costeiros tem origem em diversas fontes, dentre as quais podem ser citadas, as terrestres, as aquáticas, as atmosféricas e as antropogênicas, neste estudo representada pelo aporte de contaminantes derivado do petróleo. (ALEIXO et al., 2007; CARREIRA et al., 2009). É importante também ressaltar que a compreensão da origem da matéria orgânica nesses ambientes pode ser norteador na interpretação acerca da sua origem e da qualidade ambiental nas amostras consideradas (STEFENS, 2006). Os hidrocarbonetos podem ser considerados uma das classes de compostos mais abundantes da matéria orgânica presente nas zonas costeiras (MAIOLI et al., 2010), apresentando uma ampla distribuição, principalmente em ambientes estuarinos formados por rios, lagos, lagoas, etc. (WAGENER et al., 2006; CARREIRA et al., 2009). Por essa razão, diversos autores têm utilizado a distribuição desses compostos como parâmetro para avaliar a qualidade ambiental de ambientes estuarinos ( MAIOLI et al., 2010; EMÍDIO et al., 2010 ) Para a interpretação dos dados obtidos, alguns parâmetros são considerados, tais como o Índice Preferencial de Carbonos (IPC) que fornece informações sobre a predominância entre os n-alcanos ali depositados, também as razões entre compostos ou grupos de compostos, tais como, a razão Pristano/Fitano que caracteriza o tipo de processo deposicional da matéria orgânica sedimentada, a Razão Terrestre Aquática (RTA) que indica qual tipo de fonte da matéria orgânica, se autóctone ou alóctone. A presença da mistura complexa não resolvida (UCM) também é um importante parâmetro na identificação da origem dos hidrocarbonetos alifáticos (CARREIRA et al., 2009). Outro parâmetro é a razão 4.

(23) Carbono/Nitrogênio (C/N). Segundo Saito, et al.,(1989), a C/N indica se os hidrocarbonetos ali presentes são de origem terrestre ou aquática. A concentração dos compostos Resolvidos é de grande importância para a avaliar o nível dos hidrocarbonetos sobretudo em ambientes aquáticos conforme descreve Readman et al. ( 2002). Outros. parâmetros. importantes. podem. ainda. ser. correlacionados. para. complementar as informações sobre os compostos estudados, tais como, a razão Mistura Complexa não Resolvida/Hidrocarbonetos Alifáticos Resolvidos (UCM/HAR), onde valores maiores que 4 sugerem que os hidrocarbonetos provém de fontes antropogênicas, bem como a razão Mistura Complexa não Resolvida/Alcanos Resolvidos(UCM/R) (MAIOLI et al., 2010) e ainda a razão Baixa Massa Molar/Alta Massa Molar (LMW/HMW), que auxiliam na interpretação dos resultados obtidos (SAKARI et al., 2008). O uso dos n-alcanos como biomarcadores é possível porque eles apresentam diferenças em relação ao tamanho da cadeia carbônica e distribuição, permitindo assim a identificação de sua origem como sendo de fontes autóctones, alóctones ou ainda contaminação petrogênica (CARREIRA et al., 2009).. 3.1.1 Hidrocarbonetos. Os hidrocarbonetos são compostos orgânicos que possuem em sua estrutura apenas átomos de carbono e hidrogênio (SOLOMONS, 2001; KOTZ, 2005) (Figura 2).. Figura 2: Fórmulas estruturais de hidrocarbonetos. Esta classe de compostos é muito grande, podendo ser subdividida em alcanos, alcenos, alcadienos, cicloalcanos, cicloalcenos e aromáticos. Nesse trabalho dar-se-á ênfase 5.

(24) apenas aos alcanos de cadeias carbônicas normais e os isoprenóides (alcanos ramificados) pristano e fitano (Figura 3).. Figura 3: Fórmula estruturais dos isoprenóides Pristano e Fitano. 3.1.1.1-Hidrocarbonetos Alifáticos. Os alcanos normais saturados constituem um grupo de biomarcadores geoquímicos de grande importância na identificação da origem da matéria orgânica presente nos sedimentos (Figura 4).. Dodecano Figura 4: Fórmula estrutural de um hidrocarboneto Alifático. Estudos realizados revelam que quando a origem dos hidrocarbonetos é natural há uma preferência de n-alcanos ímpares sobre os pares, quando o processo de formação se dá de forma espontânea, ou seja, biogênica. Esta preferência natural ocorre se sua origem for marinha (BLUMER et al, 1971) ou terrestre,. sendo a primeira devido à diagênese de. compostos proveniente de organismos aquáticos, tais como os fitoplânctons, e a última devido a decomposição de plantas superiores (VOLKMAN et al., 1992). Por outro lado se a origem desses n-alcanos se dá de maneira não natural, ou seja, se a origem é fóssil, não há predominância de n-alcanos pares ou ímpares (MEDEIROS, 2000; MEDEIROS et al., 2005).. 6.

(25) Para avaliação dessa preferência entre n-alcanos numa série homóloga, utiliza-se o Índice Preferencial de Carbono (IPC) , uma razão de grandeza adimensional, proposta por Bay e Evans em 1961, e descrita pela equação 1:. Onde Cx refere-se ao hidrocarboneto com „x‟ átomos de carbono. Para valores de IPC entre 4 e 7 pode-se concluir que a origem desses n-alcanos é biogênica e valores próximos a 1 indicam contaminação de origem petrogênica (Oliveira et al., 2007) A Razão Terrestre Aquática (RTA) (equação 2) é um outro índice também usado para avaliar a origem da matéria orgânica, relacionando os ambiente terrestre e aquático (BOURBONNIERE et al., 1996; CARREIRA et al., 2009).. Onde Cx refere-se ao hidrocarboneto com „x‟ átomos de carbono. Este parâmetro também é muito importante na interpretação da origem dos nalcanos. Valores de RTA próximos a 1 indicam predomínio de fontes aquáticas sobre as fontes terrígenas.. Para valores maiores que 1. há predomínio das fontes terrígenas,. característica que indica a predominância de n-alcanos de maior peso molecular, especificamente os alcanos n-C27, n-C29 e n-C31, sobre os alcanos n-C15, n-C17 e n-C19. 3.1.1.2 – Hidrocarbonetos Isoprenóides. Os alcanos saturados de cadeia ramificados denominados de isoprenóides, mais especificamente, o Pristano e o Fitano, (Figura 3), são compostos originários da reação de óxido-redução do Fitol, componente da clorofila A (Figura 6). Para a formação do Pristano, a oxidação; e para o Fitano, a redução (Figura 5).. 7.

(26) Figura 5: Esquema da degradação do Fitol (Adaptada de KILLOPS e KILLOPS, 2005). O processo de degradação da clorofila A (Figura 6) sobre condições oxidativas produz o querogênio do tipo I (mistura que favorece a produção do Pristano), bastante rico em hidrocarbonetos alifáticos. Em condições redutoras a degradação do Fitol produz o Fitano (KILLOPS e KILLOPS, 2005).. Figura 6: Fórmula Estrutural da Clorofila A (Adaptada de STREIT et al., 2005). Os isoprenóides Pristano e Fitano também são compostos utilizados para compreender a origem dos hidrocarbonetos alifáticos no ambiente estudado, sobretudo no meio marinho (CRIPPS, 1989; BICEGO et al, 2006). Para valores da razão Pristano/Fitano próximos a 1 há evidências de contaminação antropogênica, mas há necessidade de considerar 8.

(27) outros parâmetros, como por exemplo, a concentração de n-alcanos totais (CRIPPS, 1989). Já valores dessa razão Pristano/Fitano maiores que 1 indicam que possivelmente o ambiente não tem contaminação por óleo (LOURENÇO, 2003).. 9.

(28) 4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL. 4.1 Área de estudo. 4.1.1 A Bacia Hidrográfica do rio Sergipe. O Rio Sergipe tem uma extensão de 210 quilômetros. Nasce no município de Nossa Senhora da Glória-SE, especificamente na Serra Negra, divisa com o Estado da Bahia, atravessando Sergipe no sentido oeste/leste até desaguar no Oceano Atlântico, entre os municípios de Aracaju e Barra dos Coqueiros (ROCHA, 2006). A sua Bacia Hidrográfica é composta por vários afluentes, dentre eles podem ser citados, em sua margem direita, os rios Sovacão, Lages, Campanha, Jacoca, Vermelho, Jacarecica e Pitanga Poxim e na margem esquerda os rios do Sal, Cágado, Ganhamoroba, Parnamirim e Pomomba; a Lagoa dos Mastros, o Açude da Macela, em Itabaiana e as Barragens Jacarecica I e II, que perfazem todo o estuário do rio (Figura 7) ( ALVES, 2006).. Figura 7: Bacia Hidrográfica de Sergipe (ALVES, 2006) 10.

(29) O crescimento urbano e o desenvolvimento industrial submetem a bacia à intensa poluição, resultante dos efluentes domésticos e industriais que sem qualquer tratamento são despejados no rio.. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), a. população de Sergipe, de acordo com o senso de 2010 é de 2.036.277 habitantes. Destes, 1.213.607 habitantes vivem em áreas de influência da bacia do rio Sergipe.. 4.2 Amostragem. A amostragem foi realizada com auxílio de coletor metálico do tipo draga de arraste (Figura 8) em nove pontos, em julho/2010 (Campanha 1 - Inverno) e março/2011(Campanha 2 - Verão), no estuário do rio Sergipe entre os municípios de Aracaju, Barra dos Coqueiros e Nossa Senhora do Socorro (Tabela 1, Figura 9 e Apêndice I). Os pontos de amostragem foram distribuídos ao longo do estuário do rio Sergipe (Ponto 4, Ponto 5, Ponto 6, Ponto 7 e Ponto 8), no rio Poxim próximo a sua foz ( Ponto 1, Ponto 2 e Ponto 3) e um outro ponto (Ponto 9) na foz do rio do Sal (Figura 9).. Figura 8: Amostrador do tipo draga usado na coleta. 11.

(30) Tabela 1: Pontos de amostragem da coleta de sedimento no estuário do Rio Sergipe Pontos de coleta P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9. Localização. Latitude S. Longitude O. Parque dos Cajueiros. 10057‟33,94”. 3703‟12,68”. Shopping Rio Mar Ponte do Rio Mar Atalaia Nova Iate Clube Barra dos Coqueiros Mercado Ponte Aracaju-Barra dos Coqueiros Rio do Sal (N. Sra do Socorro). 10056‟49,98” 10056‟29,97” 10056‟24,52” 10055‟34,43” 10054‟26,81” 10054‟19,41” 10058‟31,15”. 3702‟53,11” 3702‟51,93” 3702‟08,36” 3702‟33,88” 3703‟21,46” 3702‟51,66” 3702‟54,29”. 10051‟42,59”. 3703‟10,87”. Figura 9: Distribuição espacial dos pontos de amostragem As amostras foram acondicionadas em frascos de vidros previamente lavados com água da torneira, detergente, água destilada e acetona e secos em estufa. As amostras de sedimentos foram coletadas e em seguida tratadas com clorofórmio. Os recipientes foram fechadas com papel alumínio e vedados com tampa de rosca. Os recipientes já contendo os 12.

(31) sedimentos coletados foram mantidos resfriados em gelo até a chegada no laboratório, onde foram congeladas para posterior liofilização (Figura 10). As amostras liofilizadas foram armazenadas em refrigerador até o momento da extração e análise.. Figura 10: Liofilizador usado para secar as amostras de sedimentos coletadas no estuário do rio Sergipe.. 13.

(32) 5 MATERIAL E MÉTODOS. 5.1. MATERIAL. 5.1.1 Reagentes, solventes e outros materiais. Acetona grau PA (Tedia, USA), diclorometano grau HPLC (Tedia, USA), hexano grau HPLC, frascos de 2, 4 e 20 mL, micropipetas automáticas com volumes reguláveis (Jencons Scientific, USA). Colunas de vidro, sílica-gel (70-230 mesh, silicycle), alumina neutra 50-200 µm (Sorbent Technologies, Canadá), sulfato de sódio anidro PA (Qhemis, Brasil) e padrão interno hexadecano deuterado e solução de alcanos, pristano e fintano (AccuStandard, USA).. 5.1.2 Equipamentos. Cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa modelo QP-2010 plus da Shimadzu (Kyoto, Japão) (GC-MS) equipado com amostrador automático modelo AOC-20i; injetor split/splitless e coluna capilar DB- 5MS (5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano), de sílica fundida, 30 m de comprimento, 0,25 mm d.i., 0,25 μm de espessura do filme. (J&W. Scientific, EUA); Cromatógrafo a gás modelo CG-2010 equipado com detector por ionização de chama (GC-FID) e coluna capilar RTX-5, 30 m de comprimento, 0,25 mm d.i., 0,25 μm de espessura do filme; Balança analítica de precisão, com quatro casas decimais, Sartorius modelo TE2145; Estufa de secagem e esterilização Tecnal modelo TE-393/1; Ultra-som – Unique Modelo USC1400; Centrífuga (Universal); Evaporador rotativo (Fisiton 802 D); Liofilizador (L101 – Liopop); Ultra-freezer (URUSR30 – Liopop). 5.1.3 Limpeza dos materiais. A limpeza do material seguiu protocolo adotado no Laboratório de Análise de Compostos Orgânicos e Poluentes (LCP) do Departamento de Química, conforme segue: Lavar com água comum duas vezes Lavar com uma solução de sabão neutro Lavar com água comum duas vezes 14.

(33) Lavar com água destilada duas vezes Lavar com dimetilcetona Após essa etapa da limpeza, a vidraria é seca em uma estufa a 1000C ou à temperatura ambiente, depois são envolvidos em filme de PVC e guardados (INMETRO, 2011; SANTOS, 2011). 5.2 MÉTODOS 5.2.1 Extração A extração dos analitos desejados constitui uma etapa muito importante no estudo destes no ambiente onde estão presentes. Existem diferentes técnicas de extração de compostos orgânicos em matrizes sólidas que usam solventes orgânicos, dentre elas o soxhlet, ultra-som e agitação mecânica (CALVACANTE, et al., 2008). Neste estudo optou-se pela extração por ultra-som (método 3550 da USEPA) (Figura 11). A escolha desta técnica de extração foi feita considerando os seguintes critérios: maior rapidez na extração; menor quantidade de solvente extrator e eficiência já comprovada na extração de hidrocarbonetos, analitos de interesse (FERREIRA, 2010; SANTOS, 2011; SILVA et al., 2006). Figura 11: Banho ultrassônico usado na extração dos Hidrocarbonetos Alifáticos. As amostras de sedimento (~ 4 g) foram transferidas para tubos de ensaios limpos. Após a adição de 7 mL de diclorometano, as mesmas foram agitadas e levadas para a extração em banho ultrassônico (Figura 11) por 30 minutos. Em seguida, os tubos contendo as 15.

(34) amostras foram centrifugados por 2 minutos e o sobrenadante recolhido em balão de fundo redondo de 50 mL. Esse processo foi repetido por mais duas vezes. Posteriormente os extratos foram pré-concentrados em rota-evaporador (Figura 12) até um volume aproximado de 2 mL. Os extratos já pré-concentrados foram transferidos cuidadosamente para. frascos de. capacidade volumétrica igual 5 mL, etiquetados e acondicionados em geladeira até posterior fracionamento (SANTOS, 2011).. Figura 12: Rota-evaporador utilizado para pré-concentrar os extratos. 5.2.2 Tratamento com Cobre metálico 5.2.2.1 Ativação do Cobre metálico. A presença de enxofre em amostra lipídicas é muito comum, sobretudo em pontos de amostragem onde há presença de redes de esgoto não tratada. Sendo pois de grande importância a realização do tratamento dos extratos com cobre metálico para a remoção dos compostos de enxofre presentes, os quais podem interferir na análise cromatográfica. ( SANTOS, 2007 ). Para a limpeza e ativação do cobre metálico usou-se o seguinte procedimento experimental: a) Com o auxílio de uma caneta, pequenas dimensões do fio de cobre foram enroladas em forma de mola;. 16.

(35) b) Em um béquer, os pedaços de fios de cobre foram tratados por 10 minutos com solução de HCl 10% sob agitação magnética. c) O cobre metálico foi enxaguado com água ultra-pura e a água de lavagem dispensada em recipiente adequado; d) Para garantir a completa eliminação do HCl 10% do cobre ativado, o processo de enxague (item c) foi repetido mais duas vezes, usando acetona e metanol, respectivamente. e) Após o tratamento de enxague o cobre foi submerso em Hexano e armazenado sobre refrigeração até o seu uso.. 5.2.2.2 Extração de compostos de enxofre. Após a extração das amostras foi adicionado o cobre metálico previamente ativado para remoção de compostos de enxofre. Em todos os pontos foi observada a presença de enxofre, sendo que nos pontos 5 e 7 apresentaram um elevado teor desta substância, observado pela coloração escura no cobre.. 5.2.3 Limpeza e fracionamento da amostra (Clean Up). A análise química de traços de analitos em uma amostra compreende várias etapas, que vão desde a sua amostragem até a análise cromatográfica. Dentre elas, uma das etapas mais importantes é o limpeza do extrato. Na literatura há várias propostas de procedimentos de clean up já aceitas e definidas. A escolha do tipo de clean up e fracionamento a ser utilizado depende das características dos analitos a serem fracionados. Para hidrocarbonetos, o fracionamento pode ser feito apenas com sílica ou adição de outros adsorventes na mesma coluna de vidro (Tabela 2), sendo também necessário observar a quantidade de adsorvente e solventes de eluição a serem utilizados nesta etapa (CAVALCANTE et al., 2008).. 17.

(36) Tabela 2: Colunas de fracionamento para Hidrocarbonetos (Adatptada de CALVACANTE et al., 2008) Solventes de eluição DCM ( fração alifática) Pentano DCM/pentano ( 2:3). Quantidade de solvente 40 mL 25 mL 25 mL. 8g. Hexano ( fração alifática). 30 mL. Alumina. 8g. hexano/DCM (9:1). 20 mL. Na2SO4 anidro Cobre em pó. 3 cm 5g. hexano/DCM (4:1). 40 mL. Sílica. 8g. 30 mL. LAT3. Alumina Na2SO4 anidro Cobre em pó. 4g 3 cm 0,3 g. Hexano ( fração alifática) hexano/acetato de etila (39:1) hexano/acetato de etila (8:2). CENPES4. Sílica Alumina Na2SO4 anidro Areia. 20 g 10 g 2,5 g 2,5 g. Hexano ( fração alifática) hexano/DCM (1:1). 50 mL 200 mL. Otimizada5. Sílica Alumina. 2g 1g. Hexano ( fração alifática) hexano/DCM (1:1). 5 mL 20 mL. Na2SO4 anidro. 0,5 g. Procedimento USEPA1. Adsorventes Sílica Na2SO4 anidro. Quantidade de adsorvente 10 g 2 cm. Sílica Alternativa (Met1)2. 40 mL 20 mL. FONTE: 1US-EPA (2006c), 2MET1 (SANGE et al, 2002), 3LAT (CALVACANTE et al, 2008), 4CENPES (UFRJ), 5Usada nesse estudo. Diante das possibilidades de clean up existentes, foi realizado testes em colunas de fracionamentos, contendo apenas a sílica . Com resultados não satisfatórios buscou-se outra alternativa para definir o clean up a ser utilizado neste estudo. A partir da proposta de clean up descrita em outros trabalhos (Tabela 2) foi possível projetar uma alternativa que possibilitasse uma separação efetiva da fração desejada (a fração alifática) e mais econômica.. 5.2.4 Coluna de Fracionamento Otimizada 5.2.4.1 Componentes químicos da coluna. a) Sílica-Gel 18.

(37) A sílica é uma substância química inorgânica que possui em sua estrutura grupos SiO4 distribuídos de maneira tetraédrica unidos por siloxanos no seu interior e vários grupos silanóis (Si-OH) na superfície (AIROLDI et al., 2000) (Figura 13):. Figura 13: Estrutura da sílica gel mostrando um possível poro da partícula de sílica (a), um grupo siloxano (b), um grupo silanol isolado (c), silanóis vicinais (d) e silanóis geminais (e) (COSTA, 2007; OLIVEIRA, 2008).. Além dos grupos característicos presentes na sílica na sua superfície podem existir moléculas de água ligadas por meio de ligações de hidrogênio diminuindo o poder adsorvente da sílica. Para melhorar a capacidade de adsorção, as moléculas de água podem ser removidas por aquecimento térmico numa faixa de temperatura de 373 – 423 K sem prejudicar sua estrutura e quantidade de grupos silanóis (OLIVEIRA, 2008). A grande importância da sílica-gel está na sua funcionalidade: Adsorção de metais, Catálise, Coluna cromatográfica, entre outras. Neste estudo a aplicação da sílica se dá na preparação da coluna cromatográfica, como um dos adsorventes utilizados.. b) Alumina. A alumina apresenta em sua composição óxido de alumínio (Al2O3), sendo um excelente adsorvente, com grande aplicação em catálise, remoção de enxofre e adsorvente seletivo. A alumina ativada apresenta maior área superficial e elevado número de sítios de adsorção (SILVA et al., 2006), o que justifica a sua escolha como um dos componentes químicos para a composição da coluna de fracionamento a ser usada neste trabalho. 19.

(38) c) Sulfato de Sódio Anidro Sólido cristalino branco de fórmula molecular Na2SO4 e tem grandes aplicações industriais, para processamento de polpa de madeira, produção de vidro, detergentes, corantes para tecidos. Neste estudo o sulfato de sódio foi utilizado para formar as bases inferior e superior da coluna de fracionamento (Figura 15).. 5.2.4.2 Preparação da Coluna. A preparação da coluna é uma etapa a ser consideração no fracionamento da amostra que requer bastante cuidado, sendo, pois, necessário a observação de algumas etapas na sua preparação (SANTOS, 2011) a) A sílica e a alumina utilizadas foram ativadas por 16 horas a temperatura de 120 oC e sulfato de sódio anidro foi calcinado na mufla a 400 oC por 4 horas. b) Inicialmente a coluna de vidro foi lavada com diclorometano e após seca, foi inserida na sua base a lã de vidro. c) Foi adicionado uma quantidade suficiente de sulfato de sódio calcinado (~0,5g) na coluna, para obter uma base uniforme. d) Foram adicionados 10 mL de diclorometano na coluna cromatográfica, com sua torneira fechada, para favorecer o empacotamento da alumina. e) Foi pesado 1 g de alumina em um béquer e em seguida colocada na coluna, evitando a formação de rachaduras ou bolhas durante empacotamento. f) Em um béquer contendo 25 mL de diclorometano foi adicionado 2 g de sílica gel, que após a homogeneização foi transferida para a coluna lentamente. A torneira da coluna cromatográfica foi aberta em fluxo baixo para facilitar um melhor empacotamento. g) Após a adição da sílica gel foi adicionado ainda sobre esta, aproximadamente 0,5 g de sulfato de sódio calcinado (Figura 15). h) Foi feito a troca de solvente deixando inicialmente todo diclorometano presente escoar até o nível superior de sulfato de sódio, adicionando posteriormente 10 mL de n-hexano deixando também escoar até a base superior formada com o sulfato. 5.2.4.2 – Teste de eficiência da coluna 20.

(39) Para testar a eficiência da coluna sílica-alumina, foi adicionada à mesma, quantitativamente, 500 µL de uma mistura contendo padrões de n-alcanos e HPAs conforme fluxograma de fracionamento (Figura 14).. Figura 14: Fluxograma esquemático para separação das frações alifáticas e aromáticas na coluna de sílica Alíquotas de 1 mL da fração alifática (F1 – eluídas com hexano) foram coletadas em frascos de 2 mL (indicadas como HA1, 2 , 3, 4 e 5) , totalizando 5 mL (Apêndice III). Já para a fração aromática (F2 – eluída com a mistura de diclorometano:hexano na proporção de 1:1) foram coletadas alíquotas de 2,0 mL (indicadas como HPA1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9 e 10 ), resultando em um total de 20 mL (Apêndice III). As 15 frações descritas foram pré-concentradas em fluxo de nitrogênio até 0,5 mL e injetadas no GC/MS no modo de varredura SCAN. Inicialmente foi feito uma corrida com hexano (branco do solvente), em seguida as amostras fracionadas foram analisadas. Otimizadas as condições, os extratos obtidos dos sedimentos foram submetidos ao fracionamento. 5.2.5 – Fracionamento. a) O extrato previamente concentrado até cerca de 0,5 mL foi quantitativamente transferido para a coluna cromatográfica, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur. b) A torneira da coluna foi aberta até o nível do extrato chegar a aproximadamente 1 mm do sulfato de sódio da base superior. 5 mL de n-hexano foram adicionados na coluna lentamente como solvente de eluição para a fração 1 (F1), que contém 21.

(40) majoritariamente hidrocarbonetos alfáticos, sendo essa fração recolhida em um frasco de volume de 9 mL. c) A fração alifática foi pré-concentradas até aproximadamente 1 mL em rotaevaporador, transferida para vial de 2 mL, e armazenada em geladeira sob baixa temperatura (~4 oC) até o momento da análise.. Sulfato de Sódio Anidro. Sílica Alumina. Sulfato de Sódio Anidro. Figura 15: Coluna otimizada para separação da fração alifática dos extratos das amostras nesse estudo 5.2.6 – Análise cromatográfica Alíquotas de 1 µL do extrato fracionado – Fração 1 (F1) foram submetidas a análise cromatográfica utilizando os sistemas GC/MS (Figura 15) e GC/FID. a) Condições do GC/MS Temperatura do injetor: 250 ºC; Programação no injetor: splitless por 1 minuto, split 1:10; Programação de temperatura do forno da coluna: temperatura inicial de 40 ºC (1 min), rampa de 10 ºC.min-1 até 310 ºC com isoterma de 19 min, Tempo de análise: 49 min; 22.

(41) Gás de arraste: Hélio, com uma vazão constante 1,2 mL.min-1; Temperatura da interface: 300 ºC; Modo de ionização: impacto de elétrons (70 eV) Modo de operação do espectrômetro de massas: SCAN (varredura: 40-570 m/z). Figura 16: Cromatógrafo Gasoso acoplado a Espectrômetro de massas usado nesse estudo.. b) Condições do GC/FID A temperatura do detector FID foi de 320 oC; O gás Make Up foi o Nitrogênio a 30 mL.min-1 ; O gás hidrogênio 40 mL.min-1 foi utilizado como combustível da chama do detector; O ar sintético 400 mL.min-1 foi utilizado como comburente; O gás hélio 1,2 mL.min-1 foi utilizado como gás de arraste; Programação de temperatura do forno: temperatura inicial de 40 ºC (1 min), rampa de 10 ºC.min-1 até 310 ºC com isoterma de 19 min, Tempo de análise: 49 min.. 5.3. Parâmetros Analíticos de Validação. O desempenho de uma técnica analítica depende de dois parâmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatísticas dos cálculos envolvidos no seu processamento (RIBEIRO et al., 2008). Diante dessa necessidade, órgãos de metrologia definiram parâmetros que validam e justificam trabalhos acadêmicos. No Brasil há duas grandes agências credenciadoras para verificar a competência de laboratórios de ensaios, a 23.

(42) ANVISA e o INMETRO (RIBANI et al., 2004). Os parâmetros para validação de método podem apresentar diferenças conceituais podendo ser definidos em grupos diferentes (Tabela 3). Tabela 3: Parâmetros Analíticos de Validação (Adaptada de RIBANI et al., 2004) INMETRO Especificidade Faixa de trabalho Linearidade -----------Limite de Detecção (LD) Limite de Quantificação (LQ) Exatidão Precisão Robustez Incerteza de medição. ANVISA Seletividade Intervalo da curva de Calibração Linearidade Curva de Calibração Limite de Detecção (LD) Limite de Quantificação (LQ) Exatidão Precisão Robustez -------------. Alguns parâmetros analíticos foram considerados neste estudo como parâmetros de validação do mesmo: a linearidade do método, a sensibilidade, precisão e recuperação.. 5.3.1. Linearidade. A linearidade de um método expressa a faixa na qual o sinal, denominado de variável dependente y, é linearmente proporcional à sua concentração, denominada variável independente x (RIBEIRO et al., 2008) ou ainda corresponde à capacidade do método em produzir resultados linearmente proporcionais à concentração do analito estudado dentro de uma faixa trabalho definida.. 5.3.1.1 Curva Analítica. A curva analítica corresponde ao modelo matemático usado para estabelecer uma relação entre os sinais (áreas) e quantidades de analito a ser quantificado. A curva poder descrita pela Equação 3:. y = ax + b. (3) , onde: 24.

(43) y = sinal medido (variável conhecida) x = concentração do analito a ser determinada (variável desconhecida); a = coeficiente angular; b = coeficiente linear.. A linearidade é medida a partir do coeficiente de correlação linear (R) ao quadrado (R2), também chamada de coeficiente de determinação do modelo, e o coeficiente angular. Para se minimizar o erro na determinação de y, o coeficiente de correlação deve estar bem próximo de 1, mas segundo o Instituto Nacional de Metrologia, Normatização e Qualidade Industrial (INMETRO) um valor de R acima 0,90 já é considerado adequado para a quantificação dos analitos estudados.. Tabela 4: Coeficiente de correlação linear e tipo de correlação R. Correlação. 1. Perfeita. 0,91 - 0,99. Fortíssima. 0,61 - 0,91. Forte. 0,31 - 0,61. Média. 0,01 - 0,30. Fraca. 0. Nula. FONTE: (BRITO et al., 2003). 5.3.2. Sensibilidade. A sensibilidade de um método é determinada a partir dos limites de Detecção e Quantificação (RIBEIRO et al., 2008). Neste estudo foi realizada considerando o método da relação sinal-ruído. A relação sinal-ruído foi determinada a partir da razão entre a altura do menor pico para um determinado composto e altura do ruído do sinal próximo ao pico considerado (Figura 17).. 25.

(44) Figura 17: Relação sinal-Ruído (Adaptada de HUBER, 2010). 5.3.2.1. Limite de Detecção e Limite de Quantificação. O limite de detecção corresponde a menor concentração do analito que pode ser detectada. Já o limite de quantificação corresponde a menor concentração de um analito que pode ser determinada (RIBANI et al., 2004; RIBEIRO et al., 2008). Para determinar o limite de detecção usando método da relação sinal-ruído considerou-se como limite de detecção a razão de 3 a 5 (INMETRO, 2003) e o limite de quantificação a razão de 10 a 20 (HUBER, 2010 ).. 5.3.3. Recuperação para os hidrocarbonetos Alifáticos em sedimento. A recuperação (%R) de um analito é um dos parâmetros a ser realizado para avaliar a eficiência do método usado. A partir da recuperação, pode-se dizer o quanto o método está recuperando do analito durante o processo de extração. Ou seja, a recuperação está relacionada a exatidão, pois reflete a quantidade de determinado analito, recuperado no processo, em relação a quantidade real presente na amostra (BRITO et al., 2002) Para calcular a recuperação dos analitos foram considerados dois níveis. de. concentração 0,5 µg.mL-1 (nível baixo) e 4 µg.mL-1 (nível alto), ambos os níveis dentro da faixa de concentração na qual a curva analítica foi construída, e um branco da amosta (matriz). A recuperação para os analitos foi calculada de acordo com a equação 4:. 26.

(45) A recuperação para o branco da matriz pode ser calculada conforme a equação 5:. (5) Onde: C1 – concentração determinada na amostra adicionada; C2 – concentração determinada na amostra não adicionada C3 – concentração adicionada. Nos ensaios de recuperação pode ainda aplicar o teste “t” de Student, também denominado de teste de significância (BRITO al., 2002). O calculo de “t” pode ser realizado a partir da expressão matemática (Equação 6):. (6 ) Onde: %R = recuperação média Srec = desvio padrão da recuperação n = nº de repetições. A exatidão do método. pode ser observada conforme descrito no manual da. Association of Official Analytical Chemists (AOAC) (Tabela 5).. 27.

(46) Tabela 5: Recuperação do analito em função da concentração Concentração do analito (%) > 10 >1 > 0,1 > 0,01 > 0,001 - > 0,00001 > 0,000001 > 0,0000001. Intervalo de Recuperação Aceito (%) 98 -102 97 - 103 95 - 105 90 - 107 80 - 110 60 - 115 40 - 120. FONTE: BRITO et al., 2003. 5.3.4 Precisão A precisão representa a dispersão dos resultados obtidos em função de um valor médio (RIBANI et al., 2004; RIBEIRO et al., 2008), podendo ser calculada a partir do desvio padrão relativo (RSD), por meio das expressões 7 e 8:. (7). (8) Onde: S = desvio padrão; n = número de medidas; X = valor médio do total de medidas; Xi = valor da medida. 5.4 Análise Granulométrica. A Análise Granulométrica pode ser realizada por peneiramento, sedimentação ou pela combinação dos dois processos citados, conforme a descrição abaixo: a) O sedimento é pesado e tratado para a retirada de sais solúveis presentes na amostra; 28.

(47) b) A retirada desses sais solúveis é feita pela lavagem repetida da amostra com água destilada e papel filtro. A lavagem é feita até que o filtrado fique complemente isento de sais de cloro, que é testado mediante adição de Nitrato de Prata (AgNO3) 0,1 mol.L1. .. c) Após a retirada dos sais, a amostra é levada para a secagem, desta vez em estufa a 60 o. C.. d) Obtido o peso da amostra em uma balança analítica, procede-se a separação do material. em diferentes intervalos de tamanho de grãos, utilizando a escala. granulométrica de Wentworth (Tabela 6), da seguinte forma: d1) Método do peneiramento: Nas análises granulométricas sedimentológicas o limite 1/16 mm (0,062 mm) é normalmente escolhido como diâmetro conveniente para distinguir entre técnicas para sedimentos grosseiros e finos. Esse método é utilizado para separar a amostra neste limite de tamanho de grãos. No caso específico deste trabalho, a separação do tamanho de grão é feita apenas entre areia, e a combinação de silte e argila, não havendo distinção entre subclasses de cada fração, assim, o método do peneiramento é utilizado apenas para separar a fração areia do material. Tabela 6 – Escala granulométrica de Wentworth Diâmetro ( mm ) 1024 256 64 4 2 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048. Escala de Wentworth ( americana ) Matação Bloco Seixo Grânulo Muito grossa Grossa Média Fina Muita Fina Grosso Médio Fino Muito Fino Argila. Areia. Silte. Argila Ultra Argila. 29.

(48) 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 6.1 Otimização da coluna de fracionamento. O clean up constitui-se de duas etapas de grande importância para a análise química: o fracionamento e a limpeza da amostra. O clean up utilizando adsorção em fase sólida é o método mais utilizado na “limpeza” da amostra e separação dos seus constituintes (CAVALCANTE et al., 2008) . Para um bom resultado no fracionamento da mistura, inicialmente deve-se definir as condições necessárias para esse fracionamento, visto que durante a realização desta etapa, pode haver perda de analitos e/ou contaminação da fração obtida. A partir de soluções padrões de hidrocarbonetos, uma solução de trabalho foi preparada pela adição de 500 µL de solução padrão de n-alcanos (1 µg.mL-1) e 500 µL de solução padrão de HPAs (1 µg.mL-1), sendo diluída para 2 mL com n-hexano. Da solução resultante, foi retirada uma alíquota correspondente a 200 µL e inserida numa micro-coluna contendo 0,5 g de sílica. Foram recolhidas um total de 14 frações em dois grupos: F1 (Fração Alifática) e F2 (Fração Aromática), sendo que a primeira de cada grupo medindo 1 mL e demais frações 0,5 mL. As frações foram identificadas por HA-1, 2,3,4,5,6 e 7 (fração alifática) e HPA-1, 2,3,4,5,6 e 7 (fração aromática) e injetadas no GC/MS no modo SCAN. Após análise cromatográfica , foram identificados todos os hidrocarbonetos da fração alifática, do n-C11 ao n-C35 sendo desta forma obtidas as suas respectivas áreas (Apêndice II). Semelhantemente, na fração F2 foram identificados 16 HPAs presentes, do Naftaleno (MM=128) ao Dibenzo[a,h]antraceno (MM=278). A partir do 3o mL de eluição (fração HA-3) correspondente a fração F1 (fração alifática) já aparecem os primeiros HPAs de menor massa molar (LMW), onde oito dos 16 HPAs presentes no extrato fracionado são eluídos juntos com os alcanos normais. O percentual de HPAs é correspondente a 9,7% do total de HPAs utilizados no ensaio (Figura 18).. 30.

(49) Percentagem de recuperação. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0. Clean up Sílica. HA. HPA. 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Volume (mL). Figura 18: Grau de Separação dos Hidrocarbonetos usando coluna de sílica. Foram eluídos os seguintes HPAs: Naftaleno (Naf ), Acenaftileno ( Ace), Acenafteno (Acf), Fluoreno (Flu), Fenantreno ( Fen ), Antaceno (Ant ), Fluoranteno (Flt ) e o Pireno (Pir). Calculando a percentagem de recuperação desses HPAs já no 3o mL de eluição, percebe-se que ela é bastante representativa quando utilizado somente a sílica como. Percentagem de Recuperação. adsorvente (Figura 19). HPAs de menor massa molar. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Naf. Ace. Acf. Flu Fen HPAs. Ant. Flt. Pir. Figura 19: Percentagem de recuperação para os HPAs de menor massa molar. A partir da análise das frações, foi possível perceber que no fracionamento com a coluna de sílica, no intervalo de 2,0 mL a 4,0 mL, há uma mistura dos hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, mostrando que a separação não foi eficiente (Figura 18). Diante dos resultados obtidos, optou-se por utilizar uma coluna contendo sílica e alumina, conforme descrito no item 5.2.4. 31.

(50) A partir das frações obtidas através do fracionamento com a nova coluna de sílicaalumina observa-se uma boa eficiência de separação das frações alifáticas e aromáticas (Figura 20) ( Apêndice III).. 100. Clean up Sílica-Alumina. Porcentagem de recuperação. 90. HA. HPAs. 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1. 2. 3. 4. 5. 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Volume ( mL ). Figura 20: Grau de Separação usando coluna sílica-alumina. A partir desses resultados, ficou estabelecido que a coluna do clean up de sílicaalumina seria utilizada para realizar a etapa de fracionamento das amostras.. 6.2 Linearidade 6.2.1Curva Analítica. A curva analítica foi preparada a partir de uma solução padrão do MIX de n-alcanos (Hidrocarbonetos Alifáticos) considerando sete pontos (Tabela 7).. 32.

(51) Tabela 7: Dados para a construção da curva analítica Ponto da curva. Conc. Final (µg.mL-1). Conc. MIX (µg.mL-1). Vol. MIX (µL). Conc. PI (µg.mL-1). Vol. Final (µL). 1. 0,1. 5,0. 20,0. 5,0. 1000,0. 2. 0,5. 5,0. 100,0. 5,0. 1000,0. 3. 1,0. 50,0. 20,0. 5,0. 1000,0. 4. 2,5. 50,0. 50,0. 5,0. 1000,0. 5. 5,0. 50,0. 100,0. 5,0. 1000,0. 6. 7,5. 50,0. 120,0. 5,0. 1000,0. 200,0 5,0 PI= padrão interno. 1000,0. 7 10,0 50,0 Conc. = concentração Vol.= volume. Na preparação das soluções referentes aos sete pontos (Tabela 7) partiu-se de duas soluções do MIX de HA (Hidrocarbonetos Alifáticos) com concentrações iguais a 5,0 µg.mL-1 e 50,0 µg.mL-1, denominadas de soluções trabalho e representadas simbolicamente por ST1 e ST2 respectivamente. A solução do Padrão Interno (PI) teve concentração igual a 5,0 g.mL-1. Para a construção da curva foram considerados 7 pontos representados P1, P2, P3, P4, P5, P6 e P7 com concentração definida conforme descrição (Ver tabela 7) (Figura 21).. Figura 21: Procedimento para a construção da curva analítica (Adaptada de SANTOS, 2011).. 33.

(52) Após a injeção no GC-MS das soluções dos sete pontos da curva, foi possível calcular o coeficiente de correlação linear (R), bem como, o fator de correlação ao quadrado (R2). Os valores de coeficientes de correlação para os hidrocarbonetos apresentaram fortíssima correlação, com valores com R entre 0,91 e 0,99 (Tabelas 5 e 8). As curvas analíticas para os hidrocarbonetos indicados na tabela 8 estão no anexo XI.. Tabela 8: Parâmetros da Curva Analítica Hidrocarboneto n-C10 n-C11 n-C12 n-C13 n-C14 n-C15 n-C16 n-C17 n-C18 n-C19 n-C20 n-C21 n-C22 n-C23 n-C24 n-C25 n-C26 n-C27 n-C28 n-C29 n-C30 n-C31 n-C32 n-C33 n-C34 n-C35 n-C36 n-C37 n-C38 n-C39 n-C40 Pristano Fitano. a 1,059458 1,097735 1,139509 1,186580 1,221615 1,261979 1,299182 0,008900 1,375950 1,389728 1,408206 1,430047 1,451693 1,462365 1,483822 1,476033 1,527026 1,513662 1,521786 1,511065 1,528302 1,483323 1,500186 1,511298 1,488496 1,406110 1,361199 1,369029 1,335585 1,234758 1,170737 0,001200 1,411761. b 0,0015922 0,0054195 0,0053155 0,0102077 0,0175495 0,0197128 0,0140540 0,0001000 0,0278625 0,0306183 0,0386253 0,0469173 0,0455124 0,0487267 0,0490378 0,0508177 0,0536717 0,0514187 0,0583461 0,0570973 0,0541955 0,0610645 0,0659723 0,0667449 0,0816519 0,0823265 0,0908687 0,0859669 0,0984945 0,1164313 0,1141210 -0,000030 0,0147529. R 0,9999035 0,9998922 0,9999597 0,9998648 0,9998588 0,9998884 0,9998866 0,9979979 0,9987720 0,9998020 0,9997791 0,9996906 0,9997476 0,9995674 0,9996955 0,9995813 0,9994773 0,9994705 0,9995158 0,9994293 0,9994941 0,9994514 0,9992227 0,9992080 0,9987497 0,9982708 0,9980761 0,9984100 0,9980679 0,9967793 0,9967793 0,9927235 0,9999320. R2 0,9998069 0,9997844 0,9999195 0,9997297 0,9997176 0,9997768 0,9997733 0,9960000 0,9997544 0,9996040 0,9995582 0,9993814 0,9994953 0,9991349 0,9993911 0,9991627 0,9989548 0,9989413 0,9990318 0,9988590 0,9989884 0,9989030 0,9984459 0,9984166 0,9975010 0,9965447 0,9961560 0,9968224 0,9961396 0,9935689 0,9935689 0,9855000 0,9998641. a =Coeficiente angular b=Coefiente linear R=Fator de correlação R 2=Fator de determinação. 34.

(53) 6.4 Recuperação. Para verificar o quanto método usado neste trabalho é capaz de recuperar os analitos estudados, o teste foi realizado em triplica com dois níveis de fortificação (0,5 µg.mL-1 e 4,0 µg.mL-1). O ponto considerado para a realização do teste de recuperação foi o ponto 6, visto que ele contém todos os hidrocarbonetos estudados. Foi feito um branco da amostra e cada nível de fortificação foi definido como um grupo com três extrações, denominadas de sedimento fortificado e extrato fortificado (Tabela 9).. Tabela 9: Massa de sedimento, Concentração da MIX de HA e Concentração do PI Dia para análise. Massa (g). MIX de HA (µg.mL-1). [PI] ( µg.mL-1). Branco do sedimento. 1. 4. ---. 2,5. sedimento fortificado. 1. 4. 0,5. 2,5. sedimento fortificado. 1. 4. 0,5. 2,5. sedimento fortificado. 1. 4. 4,0. 2,5. sedimento fortificado. 2. 4. 4,0. 2,5. sedimento fortificado. 2. 4. 4,0. 2,5. sedimento fortificado. 2. 4. 0,5. 2,5. Extrato fortificado. 1. 4. 0,5. 2,5. Extrato fortificado. 1. 4. 4,0. 2,5. Extrato fortificado. 1. 4. 4,0. 2,5. Extrato fortificado. 2. 4. 4,0. 2,5. Extrato fortificado. 2. 4. 0,5. 2,5. Extrato fortificado. 2. 4. 0,5. 2,5. Amostra. HA= Hidrocarbonetos Alifáticos PI = Padrão Interno. Após injeção no GC-MS observou que a recuperação média dos Hidrocarbonetos Alifáticos no nível mais baixo (0,5 µg.mL-1) variou de 78,3 (n-C40) a 119,5% (n-C21) com RSD entre 0,3 a 23,3% (Apêndice V), já no nível mais alto (4,0 µg.mL-1) os valores de recuperação variaram de 70,8 (n-C10) a 119,2% (n-C21) com RSD entre 0,8 a 16,5% (Apêndice VI). O teste de recuperação realizado está de acordo com o protocolo de validação dentro da intervalo de 70 a 120% (RIBANI et al., 2004). Para a obtenção dos valores de recuperação para os n-alcanos estudados foi feito o uso da equação 5. 35.