Transformación clonal de progenitores hematopoyéticos de ratón deficientes en el gen del grupo Polycomb Ring1B

A mi familia

Agradecimientos

En primer lugar, quiero agradecer a mi directora de tesis, Dra. Carmela Calés Bourdet, por haber confiado en mí al dirigirme esta tesis, por su permanente ayuda y exigencia, por su enorme paciencia, y por saber organizar la secuencia de mi formación académica. Gracias también por escuchar, comprender y aconsejar en las diferentes situaciones personales que pudieron habérseme presentado en estos cuatro años.

Gracias a la Universidad Industrial de Santander-Colombia, Institución a la que pertenezco y que apoyó esta investigación con la financiación de mi estancia hasta el momento en que yo lo decidí. Gracias a mis compañeros de la Escuela de Microbiología y Bioanálisis, especialmente a la profesora Clara Inés Sánchez.

Muchas gracias al Dr. Miguel Ángel Vidal por apoyarnos a Carmela y a mí, tanto académica como económicamente, desde el principio hasta el final en este proyecto. Igualmente, quiero agradecer al Dr. Ignacio Palmero, por la confianza brindada, al hacerme parte de su grupo y espero en ningún momento haber abusado de ella.

Quiero agradecer al Dr. Hector Mayani Viveros, Jefe del laboratorio de Células Troncales y Progenitoras Hematopoyéticas y de la Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS, México, así como a TODO su grupo de trabajo. Gracias por tantas enseñanzas recibidas durante esos cortos seis meses en tan maravilloso país. Gracias especialmente a la Dra. Patricia Flores, por sus clases en diseño de figuras y por atender cada uno de mis llamados académicos, no solo durante mi estancia, sino también por correo electrónico desde que la conocí. Gracias a la Dra. Eugenia Flores, por los clubs de revistas, por compartir conmigo el gusto por los ratones y aconsejarme en la interpretación de mis datos. Gracias a los compañeros del laboratorio, Roberto, Angélica e Ileana, por recordarme lo agradable que es tener a un grupo de trabajo unido y con objetivos comunes.

Especialmente gracias a Ileana por acompañarme y compartir lo cursos extracurriculares de epidemiologia y citometría que decidimos hacer. Gracias a Luis y Nachito, técnicos del laboratorio, y a las Dras. Rosana Pelayo y María

Antonieta Chávez por sus valiosas clases. Finalmente, recordar que esta estancia no habría sido posible sin la financiación otorgada por el Banco Santander, a través de la Catedra Isaac Costero de la Universidad Autónoma de Madrid.

Muchas gracias a todos los compañeros del Instituto de Investigaciones Alberto Sols. Creo que en su momento tuve que pasar solicitando algún favor o préstamo por cada uno de los laboratorios. Sin embargo, gracias especialmente a mis vecinos del 1.4.1, Isa, Irene, Javier, Ikaru, Alberto, Irma y Martha, que compartieron gran parte de mi estancia, también al 1.3.1, María y especialmente José, por escucharme cuando lo necesité con la mayor seriedad y discreción.

Además, gracias por compartir conmigo esas comiditas colombianas que tanto extraño. Gracias a los compañeros del 0.2, Pilar, Víctor y Anna, también a Ana Villarejo y Yuri Chiodo, por las asesorías prestadas. A Rafita, Silvia, Irene García, Laura Ruiz, los niños del 1.3.2 y las niñas del laboratorio de la Dra. Ángela Valverde, por su sincera amistad. También quiero agradecer a los Doctores Teresa Iglesias, Benilde Jiménez, Aurora Sánchez, Víctor Ruiz y Jorge Martín.

Mi trabajo en el IIB y la Facultad de Medicina no habría sido posible sin la colaboración de TODOS los servicios de apoyo. No obstante, mi más sincero agradecimiento en especial a Irene Cuevas, técnico del animalario, Laura Molero, técnico del Servicio de Citometría UAM y a Diego Navarro, técnico del Servicio de Microscopia, por nunca mirar el reloj cuando estaban conmigo, mil y mil gracias. A Seguridad, especialmente a Diego y a Carlos. Quiero dar también las gracias a Gloria Orozco “Champi”, por todo su apoyo desde mi llegada a este país, hasta el día de hoy.

Por último, dedico esta tesis a mi familia, a mi esposo LUIS ÁLVAREZ CÓNSUL, por ser mi amigo, confidente, hombro y el mejor compañero de tesis. Gracias a mi hijo, CARLOS ÁLVAREZ MONTENEGRO, por ser tan bueno y perfecto. A mi mamita ANA INÉS MEDINA, por estar siempre conmigo, por sacrificar su salario y vida durante tres meses para enseñarme como criar a mi hijo y permitirme escribir la tesis. Por último, quiero dar las gracias a mis hermanitas PATICO y NEGRITA.

Sin embargo, a ellas, además de las gracias, quiero pedirles excusas, por no estar cerca en los momentos más difíciles de sus vidas y no haber podido ejercer más mi papel como hermana mayor durante estos cuatro años.

Resumen

regulador homeostático, mediante el control negativo de la proliferación de células progenitoras y positivo de la expansión de precursores maduros. Así, el fenotipo de los ratones Ring1BKO condicionales desarrollan una médula ósea hipocelular con un compartimiento hiperproliferativo de células inmaduras y potencial de diferenciación intacto. Dicho fenotipo está asociado a la represión diferencial de dos reguladores antagónicos del ciclo celular, Ciclina D2/Ccnd2 y p16Ink4a/Cdkn2a. Por otra parte, la inactivación simultánea de Ink4a en estos ratones no afecta a la actividad hiperproliferativa de los progenitores y provoca un acortamiento en el tiempo de aparición de neoplasias hematopoyéticas inducidas por la inactivación de Ink4a.

En esta tesis mostramos que los progenitores multipotentes (MPPs) tardíos (LKS/CD150-), son una población diana de RING1B, ya que es el compartimento que presenta el fenotipo hiperproliferativo más acusado en ratones Ring1BKO.

Estos datos sugieren, por tanto, que RING1B tiene un papel posterior al mantenimiento de las HSC.

Además, nuestros resultados sugieren que RING1B inhibe la auto-renovación de los MPPs, convirtiendo a este compartimento, en su ausencia, en una fuente de células potencialmente transformables, no solo por oncogenes débiles como HoxA9, sino también por otros como la oncoproteína de fusión MLL-AF9, en condiciones en las que las células control no se transforman. Asimismo, la transformación de los MPPs tardíos nos ha permitido establecer líneas celulares inmortalizadas con fenotipo indiscutiblemente mieloide el cual puede deberse al silenciamiento de Ring1B o a la naturaleza del progenitor transformado. Por último, nuestros resultados sugieren que éstos progenitores Ring1BKO transformados, pueden conducir a una alteración del estroma medular que resulta en una displasia medular severa en el contexto de un trasplante hematopoyético.

En conjunto, nuestros resultados nos llevan a proponer a Ring1B como posible gen supresor de transformación de progenitores hematopoyéticos: su ausencia favorecería la aparición de un síndrome mielodisplásico letal compatible con afectación del nicho hematopoyético.

Abstract

regeneration and maintenance of adult tissues, such as the hematopoietic system, where it is believed to act as an homeostatic regulator through negative or positive control of progenitor cells proliferation or mature precursors expansion, respectively. Thus, Ring1B conditional KO mice develop a hypocellular bone marrow with a hyperproliferative compartment of immature cells and intact differentiating potential. The phenotype is associated to the repression of antagonic cell cycle regulators Cyclin D2/Ccnd2 and p16Ink4a/Cdkn2a. In addition, simultaneous inactivation of Ink4a and Ring1B in these mice does not prevent the hyperproliferative activity of progenitors and provokes a shorter delay in the appearance of Ink4a knock-out induced hematopoietic neoplasias.

In this thesis, we show that late multipotent progenitors (MPP) LKS/CD150- are a Ring1b target population, as it is the compartment with the most hyperproliferative phenotype in Ring1bKO mice. Therefore these data suggest that Ring1B functions downstream HSC.

Moreover, our results suggest that RING1B inhibits MPP self-renewal, converting this bone marrow compartment in a cell source potentially transformable by HoxA9 and also by oncoprotein Mll-AF9 in conditions in which control cells are not transformed. Furthermore, late MPP transformation has led us to the generation of immortalized cell lines with a strong myeloid marker expression, probably due to Ring1b silencing or to the nature of the transformed progenitor. Finally, our results suggest that these transformed Ring1BKO progenitors can result in marrow stroma alteration leading to a severe bone marrow dysplasia in the context of an hematopoietic transplant.

Altogether, we propose that Ring1B may be acting as a transformation

suppressor of hematopoietic progenitors: its inactivation would favor the

appearance of a lethal myelodysplastic syndrome, compatible with an

alteration of the hematopoietic niche.

Índice

1. PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS 9

2. SÍNDROMES MIELODISPLASICOS (SMD) 11

2.1. CLASIFICACIÓN DE LOS SMD 12

2.2. BASES MOLECULARES DE LOS SMD 13

2.2.1. Alteraciones cromosómicas: reordenamientos y deleciones 14

2.2.2. Alteraciones génicas 15

2.3. MODELOS ANIMALES DE SMD 17

3. PROTEÍNAS POLYCOMB (PcG) 17

3.1. COMPLEJOS DE REPRESIÓN DE POLYCOMB (PRC) 18 3.2. UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS PcG A LOS GENES DIANA 20 3.3. MECANISMOS DE SILENCIAMIENTO DE PRC1 21

3.4. RING1A/RING1B 22

3.4.1. Complejos que contienen RING1A y RING1B 23

3.4.2. Funciones de RING1A y RING1B 23

3.5. FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS PcG EN LAS CÉLULAS MADRE 24 3.6. PROTEÍNAS PcG Y NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS 26 3.7. PROTEÍNAS RING EN LAS NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS 28

OBJETIVOS 29

MATERIALES Y MÉTODOS 33

1. LÍNEAS DE RATONES EMPLEADAS EN ESTE ESTUDIO 35

2. INACTIVACIÓN CONDICIONAL DE Ring1B 35

3. SEPARACIÓN DE POBLACIONES 36

4. MARCAJE DE SUPERFICIE 37

5. CULTIVOS CELULARES 38

6. ENSAYOS CLONOGÉNICO DE PROGENITORES Y LÍNEAS TRANSFORMADAS

39

6.1. COLONIAS SIN ESTIMULO DE DIFERENCIACIÓN 39 6.2. COLONIAS CON ESTIMULO DE DIFERENCIACIÓN MIELOIDE 41

7. PLASMIDOS UTILIZADOS 41

8. INFECCIONA RETROVIRAL 42

8.1. INFECCIÓN RETROVIRAL DE CÉLULAS EN CULTIVO 42 8.2 . INFECCIÓN RETROVIRAL EN ENSAYOS CLONOGÉNICOS. 43

9. CURVAS DE CRECIMIENTO 43

10. EXTRACTOS TOTALES DE PROTEÍNA 44

11. WESTERN BLOT 44

12. ENSAYOS DE MIGRACIÓN IN VITRO 45

13. TRASPLANTE DE MÉDULA ÓSEA 45

14. HISTOLOGÍA DE MÉDULA ÓSEA 46

15. COLONIAS ESPLÉNICAS 47

16. ENSAYOS DE CO-CULTIVO 47

17. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 48

RESULTADOS 49

1. CARACTERIZACIÓN DEL COMPARTIMENTO DE CÉLULAS PROGENITORAS EN AUSENCIA DE Ring1B

51

1.1. CAPACIDAD CLONOGÉNICA Y DE AUTORRENOVACIÓN DE CÉLULAS C-KIT+ DEFICIENTES DE Ring1B EN ENSAYOS DE COLONIA DE CÉLULA ÚNICA

51

1.1.1. Cuantificación del compartimento de células cKit+ 51 1.1.2. Actividad clonogénica del compartimento de células cKit+ 55 1.2. ORIGEN DE LAS COLONIAS INMADURAS (CI) 64 1.2.1. Caracterización de los diferentes tipos de CI en ratones silvestres 64 1.2.2. Caracterización de los diferentes tipos de CI en ausencia de

RING1B

67

2. SUSCEPTIBILIDAD DE TRANSFORMACIÓN DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS EN AUSENCIA DE RING1B

68

2.2 IDENTIFICACIÓN DE PROGENITORES MULTIPOTENTES (MPP) Ring1BKO COMO CÉLULAS TRANSFORMABLES

73

2.3. TRANSFORMACIÓN DE MPPs DEFICIENTES EN RING1A 80 3. CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS TRANSFORMADAS

Ring1BKO/HoxA9+

84

3.1. SELECCIÓN DE CLONES TRANSFORMADOS 84

3.2. CARACTERIZACIÓN DE LAS LÍNEAS ESTABLECIDAS 85

4. TRANSFORMACIÓN DE LOS PROGENITORES Ring1BKO/HoxA9+ IN VIVO

96

4.1. TRASPLANTES SERIADOS DE MPPs Ring1BKO 96 4.2. INTERACCIÓN EX VIVO DE CÉLULAS TRANSFORMADAS

Ring1BKO/HoxA9+ CON EL ESTROMA HEMATOPOYÉTICO

102

DISCUSIÓN 105

CONCLUSIONES 119

BIBLIOGRAFÍA 123

Abreviaturas

4OHT 4-hidroxitamoxifeno

AEBP2 Adipocyte Enhancer-Binding Protein 2 AML1 Acute Myeloid Leukemia 1 Protein AR Anemia Refractaria

AREB Anemia Refractaria con Exceso de Blastos

AREBT Anemia Refractaria con Exceso de Blastos en Trasformación ARS Anemia Refractaria con Sideroblastos

ARSA Anemia Refractaria con Sideroblastos en Anillo ASXL1 Additional Sex Combs Like 1

BCOR BCL-6 interacting corepressor

Bmi1 B lymphoma Mo-MLV insertion region 1

CBX Chromoboxhomolog

CD Colonia Diferenciada

CDK4/6 Quinasa dependiente de ciclinas (Cyclin Dependent Kinase)

CDKi Inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (Cyclin Dependent Kinase Inhibitor)

CEBPA CAAT/enhancer-binding protein alpha CFC Células Formadoras de Colonias CI Colonias Inmaduras

CLP Progenitores linfoides comunes (Commom Lymphoid Progenitor) CMP Progenitores mieloides comunes (Common Myeloid Progenitor) CRDM Citopenia Refractaria con Displasia Multilinaje

CRDU Citopenia Refractaria con Displasia Unilinaje CTNNA1 Catenin (cadherin-associated protein), alpha 1 d.p.c. día post coitum

DNMT ADN metiltransferasa (DNA (cytosine-5-)-methyltransferase) E(z) Enhancer of Zeste

EED Embryonic Ectoderm Development EGR1 Early growth response 1

ELN Ret Europea de Leucemia (European LeukemiaNet) EPO Eritropoyetina

ESC Extra Sex Combs

ESC Célula madre embriónica Escl Extra comb sex like

ETO Eight-Twenty One oncoprotein EVI-1 Ecotropic Viral Integration site 1 EZH2 Enhancer of Zeste Homolog 2 GATA1 GATA binding protein 1

G-CFU Unidad Formadora de Colonia Granulocitica

GMP Progenitor granulocito/monocito (Granulocyte-Monocyte Progenitors)

Gy grey

H2K119ub Ubiquitina en la lisina 119 de la histona 2 H3K23me Metilacion de la lisina 23 en la histona 3 H3K27me2 Doble metilacion de la lisina 27 en la histona 3 H3K27me3 Triple metilacion de la lisina 27 en la histona 3 HDAC Histona deaceitilasa

HoxA9 Homeobox A9

HoxD1 homeobox D1

HPC Progenitores Comunes Hematopoyéticos (Human Progenitors Common) HSC Célula madre hematopoyética (Hematopoietic Stem Cell)

IDH isocitrato deshidrogenasa (Isocitrate Dehydrogenase)

IRES Sitio interno de entrada al ribosoma (Internal Ribosome Entry Site) KDM2B lysine (K)-specific demethylase 2B

L3MBTL2 L(3)Mbt-Like 2

LCM Leucemia de Células del Manto LCO Célula Originadora de Leucemia LLA Leucemia Linfoide Aguda LMA Leucemia Mieloide Aguda LMC Leucemia Mieloide Crónica LMMC Leucemia Mielomonicitica crónica

LMPP Progenitor multipotente con preferencia linfoide (lymphoid-Primed multipotential progenitors)

LPA Leucemia promielocitica aguda

LSC Células madre leucémicas (Leukemia Stem Cells)

LT-HSC Célula madre hematopoyética de largo plazo (Long Term Hematopoietic Stem Cells)

MDS1 Myelodysplasia syndrome 1

MEP Progenitor megacariocito -eritroide (Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors) MGG May Grünwald-Giemsa

MkP Progenitor megacariocito comprometido (MkP - megakaryocyte progenitor) MLL Mixed-Lineage Leukemia

MO Médula Ósea

MPP Progenitores multipotentes (Multipotent Progenitors)

NCCN Red Nacional de Centros Oncológicos Integrales (National Comprehensive Cancer Network)

NK Células asesinas naturales (Natural Killer)

NPM Nucleophosmin

NSC Células madre neurales (Neural Stem Cell) NUP98 nucleoporin 98kDa

OMS Organización Mundial de la Salud PAX3 Paired box 3

PBS Phosphate Buffered Saline PcG Grupo polycomb (Polycomb Group) PE ficoeritrina (Phycoeritrine)

PercpCy5.5 Complejo clorofila-peridina Ph-d Polyhomeotic distal PHF1 PHD Finger Protein 1

PHO Pleiohomeotic

Ph-p Polyhomeotic proximal Poly(I:C) Poli-inosina-policitidin

PRC Complejo de represión de polycomb (Polycomb Repressor Complex) Pre MEgE Progenitor pre-megacariocito-eritrocito

PreGM, Progenitor pre-granulocito-monocito PSC posterior Sex Combs

RbAp46/48 Retinoblastoma protein associated protein 46 y Retinoblastoma protein associated protein 48

Ring1A Really interesting new gene 1A.

Ring1B Really interesting new gene 1B.

RIPA Radio immunoprecipitation assay.

RUNX1 Runt-related transcription factor 1 RYBP RING1A and YY1 binding protein

SCF Factor de crecimiento de células madre (Stem Cell Factor)

SCM Sex combo midleg

SDM-U Síndrome Mielodisplasico sin clasificar

SIRT1 Sirtuin (Silent Mating Type Information Regulation 2) SMD Síndrome Mielodisplasico

SMD/NMP Síndromes mielodisplasicos/Neoplasias Mieloproliferativas SPARC Secreted Protein, Acidic, Cysteine-Rich

ST-HSC Células madre hematopoyética de corto plazo (Short Term Hematopoietic Stem Cells)

SUZ Suppressor of Zeste

TE Tampón Tris-EDTA.

TET2 Tet Methylcytosine dioxygenase 2 TFIID Factor de Transcripción II

TrxG Trithorax Group

Introducción

1. PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS¹

La hematopoyesis se describe como un proceso jerárquico donde las células madre hematopoyéticas (HSC) dan origen a progenitores con potencial de auto- renovación restringido. Estos a su vez, dan lugar a una serie de precursores reconocibles por su morfología y que progresivamente adquieren las características fenotípicas y funcionales de células maduras de los diferentes linajes. Gracias a la utilización de marcadores de superficie, en combinación con análisis funcionales, se han podido identificar, y se siguen identificando, diversas poblaciones, en mayor o menor medida, homogéneas, lo que ha permitido el diseño de diversos modelos de diferenciación hematopoyética.

El modelo más reconocido (Figura 1a) y ampliamente aceptado por la comunidad científica en la actualidad es el planteado por el grupo del Dr. Weissman², en el cual, las células más inmaduras LT-HSCs (Long Term Hematopoietic Stem Cells), multipotentes y con la propiedad de auto-renovarse, a pesar de tener una baja tasa proliferativa, dan lugar, probablemente gracias a divisiones asimétricas, a las ST-HSCs (Short Term Hematopoietic Stem Cells), que mantienen la capacidad de autorenovación solo por 6 a 8 semanas in vivo y que generan progenitores multipotentes (MPP: Multipotent Progenitors), capaces de auto-renovarse durante menos de dos semanas³. Este grupo de células, definidas en ratón como LKS (cKit⁺/Sca⁺/Lin^-)⁴, retiene la capacidad para comprometerse al linaje mieloide o linfoide, diferenciando a un progenitor mieloide común (CMP) o a un progenitor linfoide común (CLP)³. Tanto los CMPs como los CLPs, son progenitores clonales sin capacidad de auto-renovación detectable y diferenciación limitada. Los CMPs dan lugar al progenitor eritro-megacariocítico (MEP: Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors) y al granulo-monocítico (GMP: Granulocyte-Monocyte Progenitors), mientras que los CLPs dan origen a los progenitores de células B, células T, Natural Killer (NK) y células dendríticas². Además, en 2002⁵, en el propio laboratorio de Weissman, también fue caracterizado en ratón un progenitor megacariocito comprometido (MkP), probablemente derivados de MEP. Estos progenitores comprometidos (cKit^low/Sca^low/-), finalmente dan origen a células con linaje restringido y sin capacidad de auto-renovación, capaces de producir las nuevas células sanguíneas por tres a cuatro semanas.

Figura 1. Modelos para la diferenciación hematopoyética en ratón. A la izquierda, propuesta de Akashi & Weismman² a partir de las HSC. En en centro, modelo alternativo de Adolfsson, donde se incluye como nuevo progenitor al LMPP y se amplía la batería de marcadores para la identificación de las ST-HSC⁶, y finalmente, a la derecha, la propuesta de Pronk, quien usando nuevos marcadores de superficie, resalta la existencia de otros progenitores mielo-eritroides con diferentes potenciales de linaje, dejando ver la complejidad del sistema.

Dentro de las poblaciones recientemente descritas, se ha demostrado la existencia de una población de LKS con altos niveles de expresión de Flt3, la cual impide la diferenciación a MEPs (Figura 1b), aunque mantiene el potencial mieloide y favorece el linaje linfoide (LMPP, lymphoid-primed multipotential progenitors)⁶. Sin embargo, observaciones más recientes, han indicado que los LMPP (Lin^- /Sca1⁺/cKit⁺/Flt3⁺⁺), mantienen el potencial MEP in vivo. Por otra parte, Pronk y cols⁷ usando los marcadores CD150, endoglina y CD41, aislaron diferentes poblaciones de progenitores con diferentes potenciales de granulocitos/macrófagos, eritroide y megacariocítica. Las poblaciones fueron nombradas Pre MEgE, Pre CFU-E, MkP, PreGM, y GMP. Adicionalmente, los progenitores PreMEgE dan lugar a PreCFU-E, que a su vez, producen células CFU-E (Figura 1c).Esta diversidad de poblaciones y de marcadores apunta a que no es posible asignar un número finito y bien definido de progenitores muy tempranos, probablemente porque existen entidades diversas que pueden hallarse en la transición de un estadio a otro de las células.

2. SÍNDROMES MIELODISPLÁSICOS (SMD)

Los SMD representan un grupo heterogéneo de desórdenes de tipo clonal con hematopoyesis inefectiva, que se caracterizan por citopenias y displasias en uno o más linajes mieloides⁸. Fueron descritos por primera vez en 1900 por Leube, quien describió el SMD como una anemia macrocítica de probable etiología infecciosa que progresaba a leucemia y que llamo “leukanamie”. Muchas décadas después, se observó que algunos de los pacientes con “leukanamie”, desarrollaban leucemias mieloides agudas (LMA) y por tanto, se acoto el término de “pre- leucemia”⁹. Sin embargo, ese grupo de pacientes, corresponde a menos del 30%, abandonándose en parte el término de pre-leucemia y remplazándose desde 1970 por Síndrome Mielodisplásico^9,10; no obstante, en la actualidad continúan usándose como sinónimos, en parte, por criterios diagnósticos como el porcentaje de blastos en médula ósea (MO) y sangre periférica, que favorece el solapamiento entre ambos conceptos.

Los SMD ocurren en 5 de cada 100.000 personas/año. Sin embargo, entre mayores de 70 años, la incidencia aumenta hasta 45 casos/100.000 personas/año.

Por ello, la morbilidad se ve afectada también por desórdenes no hematológicos y el tratamiento se complica generalmente por la no tolerancia a tratamientos intensivos¹¹. En niños, los SMD correspondan del 1% al 5% de las neoplasias hematopoyéticas¹², aunque se piensa que esta frecuencia puede estar subestimada, ya que las manifestaciones, por lo general, no son tan graves como en los adultos y porque las mielodisplasias y las enfermedades mieloproliferativas se superponen considerablemente¹³,¹⁰.

En general, podemos decir que los SMD se caracterizan por médulas hipocelulares con alteraciones megaloblásticas, megacariocitos atípicos, hiperplasia eritroide, defectos en la maduración de la serie mieloide e incremento en los blastos o sideroblastos en anillo. En sangre periférica, monocitosis, la anomalía de Pelger-Huet (granulocitos con núcleos hiposegmentados) y células mieloides y eritroides inmaduras⁹. Sin embargo, como indica su propio nombre, es un síndrome y por tanto, su presentación es muy variada y agrupa un conjunto de patologías, clasificadas de acuerdo con las características fenotípicas¹¹.

2.1. CLASIFICACIÓN DE LOS SMD

El primer esquema de clasificación, fue el realizado por el grupo FAB, que en principio identificaron dos grandes grupos de síndromes mielodisplásicos, pero en 1982 expandieron su clasificación a 5 subcategorías (Tabla 1a). Aunque un tanto arbitraria en sus definiciones, fundamentalmente establecidas de acuerdo al porcentaje de blastos en MO y sangre periférica, la clasificación FAB ha proporcionado por más de dos décadas, un lenguaje común para los médicos, lo que ha permitido hacer una estimación de la supervivencia y el riesgo de progresión a LMA⁹. Si bien se ha demostrado que el número de blastos es un dato que gradualmente va cambiando y en conjunto, se comporta como una variable continua en los SMD y por tanto, no debería ser el principal criterio para distinguir entre SMD y LMA¹⁴, en el 2008, la OMS propuso una nueva clasificación para los SMD (Tabla 1b), centrada nuevamente en la morfología y no en las anomalías moleculares (excepto la deleción 5q-) o hallazgos inmunofenotípicos¹¹. No obstante, tanto el NCCN (National Comprehensive Cancer Network) como la ELN (European LeukemiaNet), han incluido criterios biológicos dentro de sus recomendaciones diagnósticas^11,15, buscando determinar más claramente la etiología de la enfermedad, así como la administración de tratamientos acordes con las características biológicas de la enfermedad.

La clasificación propuesta por la OMS introdujo nuevas entidades y permitió la redefinición de otras, al incorporar un mayor número de criterios diagnósticos. Los nuevos subgrupos reconocidos fueron: la Citopenia Refractaria con displasia unilinaje, la Citopenia Refractaria con displasia multilinaje con o sin sideroblastos, el Sindrome 5q- y los SMD sin clasificar. Otro grupo a resaltar dentro de la clasificación hecha por la OMS, es el SMD/NMP (Síndromes mielodisplasicos / Neoplasias Mieloproliferativas), el cual incluye desordenes en los que se solapan características displásicas y proliferativas. Por otra parte, la actual clasificación de la OMS define también a la LMA con cambios relacionados con mielodisplasia, una entidad que engloba a pacientes con LMA post-SMD, LMA con displasia multilinaje y LMA con anomalías citogenéticas asociadas a SMD. Esta discriminación ha permitido determinar que las LMA secundarias a un SMD, son más resistentes a la quimioterapia y progresan más rápidamente, lo cual facilita a redes de trabajo como la europea, proponer protocolos diferentes tratamiento, que al parecer son más efectivos^11,15.

CLASIFICACIÓN FAB (1982)

Subclase de SMD Sigla % de blastos en sangre periférica

% de blastos en médula ósea

Anemia refractaria simple AR <1 <5

Anemia refractaria con sideroblastos. ARS <1 <5

Anemia refractaria con exceso de blastos AREB <5 5-20

Anemia refractaria con exceso de blastos en trasformación

AREBT >5 21-30

Leucemia mielomonictica crónica LMMC <5 5-20

CLASIFICACIÓN FAB (1982)

Subclase de SMD Sigla Sangre periférica Medula ósea

Citopenia Refractaria

con displasia unilinaje. CRDU Citopenia unilinaje o bilinaje

Displasia en >10% de una de las líneas celulares, <5% de blastos.

Anemia refractaria con

sideroblastos en anillo ARSA Anemia sin blastos

>15% de precursores eritroides con sideroblastos en anillo, displasia eritroide únicamente, <5% de blastos.

Citopenia refractaria con displasia multilinaje

CRDM Citopenia(s),

<1x10⁹/L monocitos

Displasia en >10% de celulas en >2 linajes; +15% de sideroblastos en anillo.<5% de blastos.

Anemia refractaria con

exceso de blastos-1 AREB-1

Citopenia (s),

<2% - 4% blastos

<1x10⁹/L monocitos

Displasia unilinaje o multilinaje, cuerpos de Auer, + 5%-9% de blastos.

Anemia refractaria con

exceso de blastos-2 AREB-2

Citopenia (s), 5% - 19% blastos

<1x10⁹/L monocitos

Displasia unilinaje o multilinaje, sin cuerpos de Auer, 10%-19% de blastos.

SMD sin clasificar SMD-U Citopenia(s)

Displasia o no unilinaje , pero con citopenias características de SMD,

<5% de blastos.

SMD asociados con 5q-

Anemia con

plaquetas normales o aumentadas.

Displasia eritroide unilinaje, presencia de la deleción 5q-, <5% de blastos.

Tabla 1. Clasificación de los Síndromes mielodisplásicos, En la parte superior (a), propuesta realizada por el Grupo Franco-Americano-Británico en 1982 y en la parte inferior (b), el esquema planteado por la Organización Mundial de la salud (OMS) en 2008¹¹¹⁶.

2.2. BASES MOLECULARES DE LOS SMD

La definición de las bases moleculares del SMD, en parte depende de si consideramos a los SMD como una pre-leucemia o como una patología con

entidad propia. Como pre-leucemia, los SMD se pueden considerar desórdenes con alteraciones en la diferenciación hematopoyética que favorecen la aparición de una segunda mutación, la cual conferirá ventajas proliferativas y de autorrenovación a las células inmaduras, y permitirá la transformación de la enfermedad en LMA⁹. Pero si se contempla como una entidad independiente, parece necesario identificar cambios moleculares que estén representados únicamente en SMD y no en leucemias.

El SMD “pre-leucemia” tendría su origen, al igual que en la LMA, en una célula originadora de leucemia (LCO) que acumularía gradualmente múltiples cambios genéticos y epigenéticos, hasta generar una población de células madre pre- leucémicas (pre-LSC) presentes en los SMD, que darían lugar, a su vez, a las células madre leucémicas (LSC), causantes de la LMA. La pre-LSC se definiría por tanto como una célula capaz de generar la leucemia si (y solo sí) sufre otra lesión oncogénica, mientras que la LSC ya tiene el potencial para iniciar la enfermedad a corto plazo¹⁷. Muchas alteraciones cromosómicas y moleculares han sido descritas como marcadores de la células pre-LSC, empleando modelos animales y/o muestras de pacientes, mediante la purificación de subpoblaciones y xenotrasplantes.

2.2.1. Alteraciones cromosómicas: reordenamientos y deleciones

Uno de los principales hallazgos en pacientes con SMD fue la presencia de anomalías cromosómicas que se asociaban especialmente a situaciones específicas como la exposición a radiación o agentes alquilantes. Entre ellas, reordenamientos, anormalidades en 17p, pérdida del cromosoma Y, las deleciones 5q-, 7q- o 20q-, aneuploidias en los cromosomas 7 y 8, todas concomitantes con HSCs y su progenie normales⁹. A continuación, describiremos algunas de las más frecuentes:

La t(3;21) asociada con SMD y crisis blástica de LMC, reorganiza el gen AML1 con los genes MDS1 y EVI-1 (AML1-MDS1/EVI-1). Tanto AML1 como los genes MDS1 y EVI-1, parecen jugar un papel crítico en la desregulación de hematopoyesis. El gen AML1 está involucrado en numerosas translocaciones, más comúnmente la t(8;21 AML1-ETO), que se encuentra en LMA-M2. AML1 también puede encontrarse mutado tanto en SMD (un solo alelo) como en LMA (mutación bialélica), por tanto en SMD, hay expresión de la proteína pero insuficiente ¹⁸.

En el Sindrome 5q-, los pacientes se caracterizan por anemia macrocitica, recuento anormal o elevado de plaquetas, megacariocitos unilobulares y un bajo riesgo de LMA. Este síndrome se ha visto relacionado con pacientes expuestos a toxinas medioambientales o a tratamientos quimioterapéuticos. Hasta el momento, solo se sabe que son 45 genes los eliminados, y se proponen como candidatos SPARC, EGR1, CTNNA1, NPM1.1 y RPS14, este último relacionado con el gen RPS29, el cual está implicado en la etiología de la anemia congénita de Diamond- Blackfan¹¹. Igualmente, en la deleción 20q-, aunque es de buen pronóstico, hasta ahora no se conocen exactamente los genes involucrados. Sin embargo, al parecer en la región delecionada, se codifica entre otros el gen polycomb MBTL1.

En Drosophila, se ha demostrado que mutaciones bialélicas en este gen favorecen la aparición de tumores, sugiriéndolo como gen supresor de tumor. MBTL1 es expresado en progenitores hematopoyéticos CD34+ en humanos y actúa como un represor de la trascripción.

2.2.2. Alteraciones génicas

Dentro de las alteraciones génicas, podría hablarse fundamentalmente de dos grupos, las asociadas a factores de transcripción, y las asociadas a desórdenes epigenéticos.

Factores de transcripción. De los factores de transcripción asociados a SMD, podríamos mencionar las mutaciones en CEBPA (CAAT/enhancer-binding protein alpha), demostradas en pacientes con LMA (entre el 8 y 19%), SMD (4,2%) y ocasionalmente, en donantes sanos de MO. Se considera que mutaciones en este gen pueden ser consideradas pre-LSC, porque en la mayoría de pacientes en que reaparece la mutación después de alcanzar la remisión completa, sufren recaídas^19,20. En ratones condicionales, se ha demostrado que en ausencia de la isoforma p42, hay un aumento significativamente de los CMPs y de su potencial de autorrenovación. Éstos ratones finalmente, desarrollan LMA¹⁹. Por otra parte, en ratones Knockdown para Gata1, se reproduce una enfermedad similar a un SMD después de un largo periodo de latencia, por acumulación de progenitores que expresan niveles bajos de GATA1. Aquí, es llamativo observar, como se requiere la expresión de un mínimo (5%) de GATA1 para que se produzca la trasformación, pues los ratones Gata1KO, tienen una expectativa de vida normal, destacando la importancia de niveles residuales de reguladores claves, en lugar de una deficiencia completa para mantener las funciones básicas de la célula y la

vida útil de la misma, durante un periodo de tiempo suficiente para adquirir otros golpes que produzcan su transformación completa²¹. Otras factores de transcripción asociados a SMD son: RUNX1, PU.1, p53 y MLL, así como mutaciones en Ras (entre el 5% a 20% de SMD)⁹.

Reguladores de metilación y cambios epigenéticos. Estudios genómicos recientes han identificado nuevas mutaciones somáticas recurrentes en pacientes con SMD y otras neoplasias mieloides. En algunos casos, estas mutaciones se producen en genes con funciones conocidas en la regulación de la cromatina y/o metilación en progenitores hematopoyéticos y, en otros casos, las mutaciones están en genes que alteran los patrones epigenéticos, entre ellos: Tet methylcytosine dioxigenasa 2 (TET2), isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), IDH2, el gen polycomb (ASXL1), potenciador del homólogo zeste 2 (EZH2) y la ADN metiltransferasa 3A (DNMT3A)²².

Mutaciones en DNMT3A por ejemplo, han sido descritas en el 8% de los pacientes con SMD y 22% de los pacientes con LMA de novo. En ratones, la ausencia de DNMT3A, impide la diferenciación de las HSC, expandiendo este compartimento en MO. Al parecer DNMT3A inactiva genes de multipotencialidad y a su vez, favorece la expresión de otros relacionados con la auto-renovación de las HSC.

Sin embargo y a pesar de tener este efecto, ratones Knockout para este gen, no desarrollan LMA, pero si favorecen la expansión de clonas mutadas²³. Recientemente, el laboratorio del Dr. Dick propuso que las mutaciones en DNMT3 podían considerarse la marca genética de la pre-LSC de LMA²⁴. En mutantes condicionales de IDH1, se demostró un aumento de progenitores hematopoyéticos tempranos, esplenomegalia y anemia con hematopoyesis extramedular, lo que sugiere un nicho de la médula ósea disfuncional. Además, estas células tenían hipermetiladas las histonas y presentaban cambios de metilación en el ADN similares a los observados en pacientes con LMA que tienen mutaciones en IDH1 o IDH2²⁵.

Igualmente, entre el 15% y 25% de los pacientes con SMD tienen mutaciones en el gen Asxl1. Se ha demostrado que la pérdida de función de ASXL1 contribuye a la transformación mieloide a través de la desregulación del silenciamiento génico mediado por Polycomb^22,26.

2.3. MODELOS ANIMALES DE SMD

Los modelos murinos son una potente herramienta para determinar el efecto de las primeras mutaciones sobre el compartimento de células inmaduras, ya que permiten desarrollar modelos de leucemogenesis mediante la expresión ectópica de oncogenes, el silenciamiento de otros o el diseño de ratones transgénicos con mutaciones o simulaciones de las mismas, equiparables a las halladas en los pacientes. Además, los modelos murinos también permiten a su vez, entender los efectos de la combinación de las mutaciones recurrentes con cambios epigenéticos y transcripcionales y, sobre todo, permiten la investigación específica de la potencial célula madre pre-leucémica y los progenitores.

El primer modelo animal para SMD fue realizado por Buonamici ²⁷, quien usó retrovirus para sobreexpresar Evi1 en HSC. Los ratones trasplantados no desarrollaron leucemia. Sin embargo, empezaron a morir a los 10 meses postrasplante con pancitopenia, diseritropoyesis e hiperplasia eritroide y megacariocitica. En sangre periférica, se observó anisocitosis y poiquilocitosis.

Ellos plantearon que la tardanza en evidenciar el fenotipo podría deberse a la necesidad de otra mutación. Otro modelo presentado por Grisendi y cols²⁸, indica que aunque la ausencia de NPM (nucleofosmina), es letal a nivel embrionario; los ratones presentan un SMD a la semana E11.5 y E12.5. Este gen es importante en la biogénesis de los ribosomas y está regulado por p53/ARF y juega un rol importante en la formación del centrosoma. Un tercer modelo, es el ratón transgénico NUP98/HoxD13 diseñado por Lin y cols²⁹. Estos ratones expresan la t(2;11) y son de apariencia saludable. Solo desarrollan SMD después de los 4 meses de edad y a partir de los 10 meses LMA. Son ratones con citopenias y displasia en MO, leucopenia y anemia macrocitica en sangre periférica.

3. PROTEÍNAS POLYCOMB (PcG)

Los genes del grupo Polycomb (PcG, Polycomb Group) fueron inicialmente identificados en Drosophila melanogaster³⁰, asociados a la regulación de los genes Hox como responsables de la determinación de la identidad antero- posterior de los organismos³¹. El nombre Polycomb, deriva del fenotipo de machos

adultos mutantes que presentaban peines sexuales (sex combs) ectópicos en los pares segundo y tercero de las patas³⁰.

Las proteínas PcG son modificadores epigenéticos implicados en la represión de una gran variedad de genes, desde la embriogénesis hasta la edad adulta, siendo esenciales para la identidad celular. Así, las PcG actúan en diferentes células y contextos genómicos, especialmente durante el desarrollo embrionario, en las células madre pluripotentes y en la reprogramación de células somáticas con cierta capacidad de pluripotencia³¹.

3.1. COMPLEJOS DE REPRESIÓN DE POLYCOMB (PRC)

Las proteínas PcG se asocian en complejos multiprotéicos cuya actividad represora de la transcripción ocurre a través de varios mecanismos moleculares aún no dilucidados totalmente y con toda probabilidad, coordinados. Desde una perspectiva bioquímica, los complejos PcG están asociados fundamentalmente a la remodelación de la cromatina.

Aunque la composición de los mismos es variable y dinámica³², en mamíferos han sido caracterizados fundamentalmente dos; el complejo de represión a polycomb 2 (PRC-2), responsable de di- y trimetilar la lisina 27 de la histona 3 (H3K27me2 y H3K27me3), una modificación reconocida como marca de represión epigenética y el complejo de represión a polycomb 1 (PRC1), el cual tiene una función enzimática y otra no enzimática. La función enzimática consiste en monoubiquitinar la histona H2A, impidiendo la elongación de la transcripción^33,31; la no enzimática, en reprimir la expresión génica por compactación de la cromatina y disminución de la capacidad de movimiento de los nucleosomas³⁴.

En mamíferos, PRC2 es variable (Tabla 2), aunque en general podemos decir que el núcleo del complejo está formado por las proteínas SUZ12, una de las isoformas de EED y la histona metiltransferasa EZH1 o EZH2 como subunidad catalítica del complejo. SUZ12 y EED por su parte, son necesarios para el ensamblaje del complejo y la apropiada actividad enzimática³¹. Para el anclaje de PRC2 a la cromatina, se han sugerido tres mecanismos mediados por: Jarid, capaz de unir secuencias ricas en GC y GA³⁵, Plc, que reconoce a la marca H3K23me, asociada a elongación trascripcional^31,36 y Tet1 que regula específicamente islas CpG. Adicionalmente, PRC2 también se asocia con

proteínas de diversas funciones bioquímicas tales como unión a retinoblastoma (RbAp46/48), reconocimiento de histonas metiladas (PHF1), unión a amplificadores (AEBP2) o actividad deacetilasa de histonas (SIRT1, HDAC1, HDAC2)³⁷.

Drosophila melanogaster Mus musculus Homo sapiens Dominio ESC, Extra sex combs y

Escl, Extra comb sex like EED EED WD40

E(z) Enhancer of Zeste EZH1 / ENX2 y EZH2 / ENX1

EZH1

EZH2 / KMT6 SANT,CXC y SET

SUZ12, Supressor of Zeste SUZ12 SUZ12 Zinc finger y VEFS

CAF1, Chromatin assembly factor 1

RBBP4 / RBAP48

RBBP7 / RBAP46 WD40

Jing AEBP2 Zinc finger

Drosophila melanogaster

Mus musculus Homo sapiens Dominio

PC polycomb CBX2, 4 y 8 / M33

CBX4 / PC2 o 3 CBX2, 4, 6, 7 y 8 Cromodominio SCE o RING1, E3

ubiquitin-protein ligase

RING1 / RING1A RNF2 / RING1B

RING1 / RNF1 / RING1A

RING2 / RNF2 / RING1B Ring finger Ph-p Polyhomeotic

proximal

Ph-d Polyhomeotic distal

RAE28 / PHC1

EDR2 y 3 / PHC2 y 3 EDR1 ,2 y 3 / PHC1, 2 y3 SAM y Zinc finger PSC, posterior Sex

Combs

SUZ2, supresor of zeste

BMI1 / PCGF4 MEL18 / PCGF2

NSPC / PCGF1 MBLR / PCGF6

BMI1 / PCGF4 MEL18 / PCGF2

NSPC / PCGF1 MBLR / PCGF6

Ring finger

PHO, Pleiohomeotic YY1 YY1 Zinc finger

PHO-like

SCM, Sex combo n

midleg SCML1 SCMH1 y SCML2 MBT, SAM y Zinc

finger

PCL PHF1 PHF1 / PCL1

Tabla 2. Principales Proteínas Polycomb de los complejos PRC1 y PRC2 en Drosophila, ratón y humano. Se indican, además, los dominios característicos de cada proteína.

Todos los núcleos de PRC1 están formados por un homólogo de Psc, que puede ser Mel118/Pcgf2 o Bmi1/Pcgf4 y un homólogo de las proteínas Ring (Ring1A/Rnf1 o Ring1B/Rnf2), responsables de la actividad E3 ubiquitina ligasa, específica para la lisina 119 de H2A (H2K119ub)³³. Sin embargo, para que haya

una ubiquitinización eficiente, son necesarias otras proteínas, las cuales varían entre los diferentes complejos de PRC1³⁵ (Tabla 2). Existen dos modelos de complejo PRC1, el canónico y el no canónico. El canónico, reconoce la marca H3K27me3 por medio de las proteínas CBX, mientras que el no canónico, remplaza las proteínas CBX por RYBP y las proteínas asociadas L3MBTL2 (PRC1.6) o KDM2B (PRC1.1)³⁸. PRC1.6 contribuye al silenciamiento génico de manera independiente de Rb y reprime genes específicos necesarios para el mantenimiento de la fase G0 en los procesos de diferenciación y quiescencia³⁹, mientras que PRC1.1 se une a islas CpG sin metilar. En células madre embriónicas (ESC), también se ha propuesto la independencia de PRC1. Por tanto, los mecanismos para la represión génica mediados por PcG dependen de PRC1 y PRC2, solos o en conjunto (Figura 2).

3.2. UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS PcG A LOS GENES DIANA

En Drosophila existen regiones de unión a complejos Polycomb llamadas PRE (Polycomb Response Elements), para la unión de las proteínas PcG al DNA ⁴⁰. En mamíferos, este mecanismo parece ser mucho más complejo y diversificado, porque no existen secuencias PRE (a excepción de la región PRE-kr y el elemento D11.12 de genes Hox)³⁵. En este caso, las principales secuencias diana de PcG son las islas CpG y los RNA largos no codificantes⁴¹. Algunas de ellas presentan capacidad para reclutar a PRC2 pero no PRC1 y de igual forma, son o no dependientes de H3K27me3 para los blancos de PRC1 (Figura 2)³⁵.

Las islas CpG (Figura 2d) han sido asociadas a PcG por su fuerte correlación con H3K27me3. Tienen capacidad de reclutar componentes de PRC2, aunque no todas, solamente aquellas que no se unen a activadores transcripcionales y/o aquellas que no están metiladas. Por ello, se ha planteado la posibilidad de que la metilación del ADN regule las interacciones de la cromatina con PRC2, a través, por ejemplo, de Tet1 (con capacidad de modificar la metilación en las islas CpG)⁴². Por otra parte, ciertas CpG pueden también reclutar a PRC1 (Figura 2b) por medio de KDM2B/FBXL10, una subunidad de una variante del complejo PRC1 que se une a islas CpG sin metilar y la cual, al parecer, es requerida para blancos de Ring1B en células ES y en general para la ubiquitinizacion de H2A en mamíferos⁴³. La última vía y la de mayor diversidad, es la unión de PcG al DNA a través de múltiples factores de transcripción (Figura 2f) que se unen directamente a los promotores del gen diana y reclutan a PcG, siendo este un mecanismo muy

diferente al presentado en el modelo canónico, que contempla una amplia separación entre la región de selección y el gen diana^44,45.

Figura 2: Mecanismos de unión de los complejos PRC⁴⁵: (a) Unión del complejo PRC1 canónico, el cual requiere el reconocimiento de la marca H3K27me3 depositado por PRC2, (b) mientras que el complejo no canónico PRC1-RYBP se une a través de KDM2B a islas CpG. Los mecanismos propuestos para la unión de PRC2 son: (c) Reconocimiento de las marcas H3K36me2 y H3K36me3 por la familia de proteínas PCL, (d) Unión a islas CpG a través de JARID2 y AEBP2 y la interacción con (e) factores de transcripción o (f) ARNs no codificantes.

3.3. MECANISMOS DE SILENCIAMIENTO DE PRC1

Estudios con mutantes de RING1B en ratón han demostrado que solo un grupo de genes diana de PRC2, es dependiente de H2AK119ub para su regulación.

Además, en ellos, la ubiquitinización de la histona es prescindible para unos e imprescindible para otros. Por ejemplo, defectos en la ubiquitinización activan completamente la expresión de PAX3, mientras que varios genes Hox se mantienen parcialmente silenciados⁴⁶. Por otra parte, también se ha observado que algunos genes requieren, para su inactivación, la presencia del complejo PRC1 canónico completo, mientras que otros son independientes de RING1⁴⁷ . En resumen, estos hallazgos indican que existen otros mecanismos de silenciamiento

diferentes a H2AK119ub y probablemente no enzimáticos, como la compactación del nucleosoma y la interacción directa con la maquinaria de transcripción.

La compactación del nucleosoma es otro mecanismo de silenciamiento no enzimático en mamíferos y al parecer esta mediado por las proteínas CBX, ya que éstas son las únicas PcG para las que se ha demostrado capacidad de compactación; no obstante, estas proteínas también median el silenciamiento vía H3K27met3 y se desconocen las señales moleculares que determinan en papel de CBX⁴⁸. Finalmente, se ha demostrado un mecanismo de silenciamiento donde TFIID (Factor de Transcripción II) podría ser una marca para la identificación de genes diana de PRC1 y que la unión de este dificulta la unión del complejo mediador, impidiendo el inicio de la transcripción⁴⁹.

3.4. RING1A/RING1B

Ring1A y Ring1B (Ring1 y Rnf2), son homólogos del gen humano RING1, identificado como un tránscrito de función desconocida, que fue nombrado así, en la suposición de que se trataba de un “Really Interesting New Gene”^50,51. Las proteínas de ratón fueron identificadas con ensayos de doble híbrido por su capacidad de interaccionar con proteínas CBX^52,50 y, a diferencia del resto de proteínas PcG, fueron identificadas primero en vertebrados y luego en Drosophila, cuyo homólogo es Sce o dRING⁵³. Como se mencionó anteriormente, las proteínas RING1A y RING1B son E3 ubiquitin ligasas que constituyen la subunidad catalítica del complejo PRC1 responsable de la marca H2AK119ub, una modificación postraduccional que impide la transcripción del gen marcado.

Ring1A y Ring1B codifican para proteínas de 406 y 336 aminoácidos, respectivamente⁵², y presentan un 67% de similitud. Ambas proteínas están constituidas por tres regiones: el RING finger en el extremo N-terminal, la región de unión a la ubiquitin ligasa y la región de unión a las proteínas PCGF que actúan como cofactores positivos en la ubiquitinación de la histona H2A⁵¹. La región del RING, está formada por tres láminas β antiparalelas, dos lazos de unión a Zn+ y una hélice α seguida de otra lámina β. La conservación de los dominios de homología 2 y 3 entre RING1A y RING1B es menor que la del primer dominio, y constituyen regiones esenciales para su unión a otras subunidades PcG como CBX y RYBP^52,54 (Figura 3).

Figura 3. Esquema de las proteínas RING1⁵⁵. Representación de RING1A y RING1B. En colores se muestran los dominios de homología (DH) entre las proteínas, indicando los aminoácidos que incluyen; en rojo, el Ring finger. En amarillo y verde, se indican además las zonas de unión a otros componentes de los complejos PcG.

3.4.1. Complejos que contienen RING1A y RING1B

RING1A y RING1B además de participar en PRC1, se encuentran en otros complejos sustancialmente diferentes. Un ejemplo es el complejo E2F6.com-1, formado por Ring1B, proteínas de unión a ADN, KMT1D o KMT1C y CBX5. Este complejo contribuye al silenciamiento génico de manera independiente de Retinoblastoma y reprime genes específicos necesarios para el mantenimiento de la fase G0 en los procesos de diferenciación y quiescencia³⁹. Otros complejos son los formados con el represor BCOR y la demetilasa de histonas FBXL10/KDM2B que se une a islas CpG sin metilar como previamente se ha explicado^56,57; o también por la demetilasa de histonas SCMX o proteínas de unión a histonas como WDR5⁵¹. La presencia de proteínas que unen ADN en estos complejos como E2F6/DP1 o MGA/MAX, así como la de proteínas que reconocen histonas podría ser indicativa de cómo los complejos PcG son dirigidos hacia sus genes diana.

3.4.2. Funciones de RING1A y RING1B

Como se ha mencionado, RING1A y RING1B participan en la especificación del eje antero-posterior de los individuos durante el desarrollo embrionario. Así, un mutante hipomorfo de Ring1B presenta transformaciones homeóticas posteriores, mientras que los animales carentes de Ring1A muestran también defectos en el esqueleto axial, aunque en este caso en la forma de transformaciones homeóticas anteriores^58,59. No obstante, se ha demostrado que Ring1B es esencial para el desarrollo, pues su inactivación constitutiva es letal a nivel embrionario en el estadio de gastrulación⁶⁰, mientras que la ausencia de Ring1A produce la pérdida de la cámara anterior en el ojo durante el desarrollo⁶¹. Por otra parte, RING1A y RING1B se encuentran involucradas tanto en el mantenimiento de la capacidad de

auto-renovación como en la diferenciación de ESC³¹, tejido neural ⁶² y progenitores hematopoyéticos¹. Así mismo, Ring1b, interviene en la regulación del ciclo celular, mediante la interacción con Ink4/Arf, como es explicado en el siguiente apartado.

3.5. FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS PcG EN LAS CÉLULAS MADRE

Las proteínas PcG actúan tanto en el desarrollo del embrión como en la homeostasis tisular en el adulto. Algunas de estas funciones son esenciales, como muestra la letalidad embrionaria temprana asociada a la inactivación de subunidades tanto de los complejos PRC2⁶³ como PRC1⁶⁰. Los ratones mutantes para genes PcG presentan malformaciones en el esqueleto axial asociadas a alteraciones en la expresión de genes Hox⁶⁴. Otros procesos de silenciamiento génico esenciales y dependientes de PcG son la inactivación del cromosoma X y el imprinting genómico, senescencia y reparación de ADN⁶⁵. En células madre, intervienen en procesos como la diferenciación, la auto-renovación y el control del ciclo celular, por lo que su desregulación se ha asociado a la trasformación celular.

La diversidad funcional de las proteínas PcG, tanto en células madre como en células altamente diferenciadas, se podría deber a que actúan en promotores bivalentes que pueden inducir la represión o la activación de un mismo gen, dependiendo del estado de diferenciación y las condiciones en las que se encuentre la célula⁴⁰.

PcG en la auto-renovación. Al parecer, PRC2 no se requiere para la auto- renovación de las ESC, mientras que se demostró que las dos proteínas Ring1, son esénciales para el mantenimiento de las ESC y para la represión de genes reguladores del desarrollo como Oct3/4, cuyo silenciamiento es dependiente de Rin1A/B⁶⁶. Oct3/4 y Nanog, a su vez, son responsables del silenciamiento de Cdx2 y Gata6. Por tanto, en ausencia de Ring1A y Ring1B, se impide la expresión de Gata6, manteniendo la célula en un estado indiferenciado y con propiedades de auto-renovación⁶⁶.

Por otra parte, la sobreexpresión de CBX7 pero no de CBX2, CBX4 o CBX8, induce auto-renovación de las células hematopoyéticas multipotentes, mas no en progenitores más diferenciados y su sobreexpresión induce leucemias⁶⁷. Bmi1, es también importante en la auto-renovación de las células madre neurales postnatales (NSC), al suprimir la expresión de inhibidores de ciclo celular como Ink4/Arf, p16 y p19. De igual forma la sobreexpresión de Bmi1, en NSC produce

un incremento en su proliferación y auto-renovación sin conducir a neoplasia⁶⁸. En ratones Bmi1-/-, el número de HSC en hígado fetal es normal. Sin embargo, después del nacimiento, esta población se reduce significativamente, así como su capacidad para auto-renovarse, lo cual fue demostrado en las dos poblaciones al ser trasplantadas, porque la hematopoyesis solo se recupera transitoriamente porque no se detectó auto-renovación de las HSC⁶⁹.

PcG en la diferenciación. En células ES, Ezh2, es necesaria para la diferenciación de linajes derivados del mesodermo, mientras que Suz12, lo es para los derivados del endodermo³¹. Igualmente, ratones Knockdown para PCL2 tienen altos niveles de expresión de Oct3/4 y Nanog, incrementando los marcadores de multipotencialidad⁶⁸. La pérdida de Ring1B, produce un aberrante potencial de diferenciación por la desrepresión de genes de linaje tanto en células ES como en células NS^70,62. Por otra parte, las células ES KO para Ring1B o Eed, forman pequeños teratomas con fracciones preferencialmente de endodermo o ectodermo respectivamente, mientras que los doble KO no, indicando que la depleción de ambos complejos impide la diferenciación de estas células⁷¹.

El complejo PRC1 canónico tiene un papel fundamental tanto en auto-renovación como en diferenciación y, al parecer su función, depende de la proteína Cbx presente en el complejo. Así, Cbx2 y Cbx4 por ejemplo, remplazan en las células ES diferenciadas a Cbx7 y en su ausencia, las células ES son capaces de formar teratomas con incremento de la fracción ectodermal⁷². En el sistema hematopoyético, la homeostasis parece estar también regulada por las proteínas Cbx que presentan actividades diferentes, en función del estadio de diferenciación.

Por ejemplo, la sobreexpresión de Cbx2, Cbx4 y Cbx8 inducen diferenciación y agotamiento de las HSC⁶⁷.

También parecen influir diferentes componentes en la regulación de los diferentes linajes. Así, mutantes homocigotos de mel-18 ven afectada exclusivamente la linfopoyesis, a pesar de que este gen se encuentra expresado tanto en linaje linfoide como eritroide y mieloide. La inmunodeficiencia combinada que se genera se debe a un defecto en respuesta de las células a IL-7 durante el ciclo celular, provocando un bloqueo en la diferenciación, acumulándose linfocitos inmaduros.

Este fenotipo es compartido por la MO de ratones Bmi1-/- (Akasaka T, et al., 1997). La ausencia de Ring1B, por el contrario, restringe la proliferación de los