Análisis de interacciones reguladoras en transducción de señales de nitrógeno mediante el sistema del doble

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Análisis de interacciones reguladoras en transducción de señales de nitrógeno mediante el sistema del doble

híbrido de levaduras

Trabajo realizado en la División de Genética del Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de Alicante, para optar al grado de Doctor en Biología por la Licenciada Paloma Salinas Berna

Alicante, 2003

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ASUNCIÓN CONTRERAS DE VERA, Profesora Titular de Genética de la Universidad de Alicante

HAGO CONSTAR:

Que el presente trabajo h a sido realizado bajo mi dirección y recoge fielmente la labor desarrollada por la Licenciada Paloma Salinas Berna para optar al Grado de Doctor en Biología.

Alicante, Noviembre de 2003

Agradecí mientos

A Asunción Contreras, por confiar en mí capacidad para llevar a cabo este trabajo. Por su dedicación y entusiasmo por este proyecto desde el primer al último momento.

A Rafael Maldonado, José Martín Nieto e Ignacio Luque, por permitirme aprender de su amplia experiencia. Por s u ayuda durante los años de laboratorio y por soportar pacientemente mis largas discusiones y "comeduras de coco".

A Isabel Martínez y María Luisa Cayuela, por s u constante apoyo dentro del laboratorio y por todos los momentos compartidos fuera de el. Gracias a vosotras, las horas de laboratorio se hicieron más amenas. Me habéis ayudado a aprender muchas cosas, tanto a nivel profesional y científico como a nivel personal.

A Inma Fuentes por s u inestimable ayuda técnica y por su entusiasmo constante por el trabajo (¡incluso el rutinario y aburrido!). Sin las largas charlas que hemos compartido y las sesiones de "despeje" (a costa de nuestros pobres bolsillos) los últimos años no habrían estado tan llenos de buenos recuerdos. ¡No cambies nunca!

A mís compañeros y vecinos del laboratorio de al lado. Por compartir penas, quejas, malos ratos, experimentos fallidos, algún que otro reactivo y, sobretodo, buenos cafés y buena música. A Fernando y Arantxa, porque sois únicos. ¡Sé que vais a llegar lejos!!!

A Elena, por compartir los últimos cinco años de trabajo, charlas, y buenos recuerdos. Empezamos siendo sólo dos en el laboratorio y ¡mira cuanta gente hay ahora! Por haber estado siempre ahí para escuchar mis largos rollos delante de u n café. Se que conseguirás todo lo que te propongas.

Al Dr. Martin Drummond y a su grupo en el J o h n Innes Centre (Norwich), por acogerme durante u n a brevísima estancia en su laboratorio. Por su paciencia,

entusiasmo y apoyo en el trabajo que realicé allí. Fue u n a experiencia enriquecedora a nivel científico y personal.

A mis amigos de siempre. J u n t o a vosotros empecé mi andadura universitaria.

Porque se que a pesar de que nuestros caminos hayan tomado rumbos diferentes siempre estáis al otro lado del teléfono o del correo electrónico, sea la hora que sea y pase lo que pase. Entonces ya erais, y seguís siéndolo, como el viento que ayuda a sostener mis alas.

A mi familia, por su apoyo incondicional y su cariño.

A mis hermanos, porque se que siempre están ahí, (aunque a veces no lo parezca o yo no sepa verlo). Espero que sigáis poco a poco encontrando vuestro sitio en este mundo (¡creo que empezáis a ir por buen camino!).

A mis padres, porque me h a n enseñado casi todo lo que se. Por haberme inculcado el afán por conseguir todo con mi propio esfuerzo. Y por haberme dado, con su educación y ejemplo, los dos mejores regalos que puede tener u n a persona: u n a s sólidas raíces sobre las que basarme y u n a s fuertes alas para poder volar.

A José. Llegaste en el momento más complicado, cuando todo era u n remolino en mi cabeza que no sabía deshacer. Me diste la paz y la serenidad necesarias para saber encajar todas las piezas en s u sitio y llevar este barco a buen puerto. No se que me depara el camino que ahora se abre ante mi. Pero se que, me lleve a donde me lleve, quiero andarlo contigo.

-Hijo mío -dijo el padre-. Para volar, hay que crear el espacio de aire libre necesario para que las alas se desplieguen. Es como tirarse en paracaídas: necesitas cierta altura antes de saltar.

Para volar hay que empezar asumiendo riesgos. Si no quieres, lo mejor quizás sea resignarse y seguir caminando para siempre.

Jorge Bucay

Déjame que te cuente...

índice

Introducción

1. Transducción de señales y sistemas de dos componentes.

1.1. Los sistemas de dos componentes en la era genómica 1.2. Regulación.

1.3. Organización y mecanismo.

1.4. Relación estructura-función en histidina quinasas.

1.5. Relación estructura-función en reguladores de respuesta.

2. Regulación de la asimilación del nitrógeno.

2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.

2.2. Relación estructura-función en el sistema de dos componentes NtrB/NtrC.

2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en Klebiella pneumoniae y Azotobacter vinelandit

3. El sistema del doble híbrido de levaduras y transducción de señales en bacterias.

3.1. El problema biológico: Interacciones entre proteínas.

3.2. El sistema del doble híbrido de levaduras. Variantes y secuelas

3.3. Contribución de las herramientas doble-híbrido al estudio de la transducción de señales en bacterias

3.4. Ensayos doble híbrido: Consideraciones generales.

Objetivos

Materiales y Métodos 1. Estirpes y plásmidos.

2. Medios y condiciones de cultivo.

2.1.Cultivo de bacterias.

2.2. Cultivo de levaduras.

3. Procedimientos de obtención, manipulación, clonación y selección de moléculas de DNA recornbinante.

3.1. Aislamiento de DNA de microorganismos.

3.1.1. Obtención de DNA genómico de Azotobacter vinelandü.

índice

3.1.2. Obtención de minipreparaciones de DNA de S. cerevisiae.

3.2. Fragmentación de DNA genómico medíante sonicación.

3.3. Tratamiento enzimático de DNA.

3.3.1. Tratamiento con enzimas de corte y modificación del DNA.

3.3.2. Reparación de extremos de DNA.

3.3.3. Comprobación por PCR de fragmentos clonados.

3.4. Construcción de fusiones a dominios de GAL4 de AnfA y VnfA de A.

vinelandii.

3.5. Construcción de u n plásmido para la sobreexpresión de AspA91-312

4. Obtención y conservación de genotecas doble híbrido en S. cerevisiae PJ696.

Resultados y Discusión

1. Interacciones moleculares mediadas por NtrB, NtrC y sus dominios.

1.1. Diseño de proteínas de fusión y análisis doble híbrido.

1.2. Interacciones NtrC-NtrC.

1.3. Interacciones NtrB-NtrB.

1.4. Interacciones NtrB-NtrC.

1.5. Interacciones NtrB-GlnB.

Anexo I Anexo II

2. Interacciones entre los activadores parálogos NífA, AnfA y VnfA de A.

vinelandii.

3. Identificación de proteínas implicadas en transducción de señales de nitrógeno.

3.1. Fragmentación del genoma de A. vinelandii por sonicación.

3.2. Construcción genotecas >Sau3AI de E. coli.

3.3. Escrutinios de genotecas Sau3AI de E. coli con NtrB como cebo.

3.3.1. Interacciones NtrB-GlnK.

3.3.2. Interacciones NtrB-AspA.

3.4. Escrutinios de genotecas Sau3AI E. coli con GlnB como cebo.

3.5. Construcción de genotecas Tsp5091 de E. coli

3.6. Construcción de genotecas Sau3AI y Tsp509I de K. pneumoniae.

3.7. Escrutinios doble híbrido por conjugación.

índice

Anexo III

Conclusiones

Bibliografía

Introducción

introducción

1, Transducción de señales y sistemas de dos componentes.

1.1. Los sistemas de dos componentes en la era genómica.

Con la aparición de los programas de análisis de secuencias, se puso de manifiesto u n a sorprendente relación entre proteínas bacterianas aparentemente no relacionadas (Drummond et al, 19S6; Kofoid & Parkinson,

1988; Nixon et al, 1986). Estas proteínas estaban implicadas en el control de procesos como el metabolismo del nitrógeno en enterobacterias, la quimiotaxis en E. coli y la esporulación en B, subtilis. Se clasificaron en dos grandes familias: sensores y reguladores, entre las que la transmisión de la señal se realiza a través de u n mecanismo conservado de transferencia de grupos fosfato. A diferencia de los entonces mucho mejor conocidos sistemas eucarióticos, la fosforilación implicaba residuos His y Asp, en lugar de Ser/Thr o Tyr. El término "sistema de dos componentes" se acuñó entonces para referirse a este nuevo tipo de sistemas de regulación, en los que cada pareja de sensor y regulador {más tarde denominado regulador de respuesta) constituye la unidad básica del sistema de regulación (Gross et al, 1989; Stock et al,

1989; Stock et al., 1990). La secuenciación de genomas completos y s u posterior análisis h a n aportado u n a gran cantidad de información en cuanto a diversidad y distribución biológica de estos sistemas de transducción de señales, que, aunque presentes en los tres dominios, son mucho más abundantes en Eubacteria que en Arehaea y Eukarya.

En bacterias, donde más importancia relativa adquieren estos sistemas, su número puede variar considerablemente y refleja en buena medida la necesidad de responder a ambientes cambiantes, y por tanto su capacidad de adaptación. Así, en Escherichia coli se h a n identificado 62 proteínas pertenecientes a estos sistemas (Mizuno, 1997), 27 en Streptococcus (Throup et al, 2000) 70 en B. subtilis (Fabret et al, 1999), 80 en Synechocystis (Mizuno et al, 1996} y ninguna en organismos como Micoplasma genitalium o Methanoccoccus jannaschii (Mizuno, 1998). Recientemente, se ha creado u n a base de datos, que incluye todas las proteínas pertenecientes a sistemas de dos componentes identificadas en los distintos organismos (Maltsev et al, 2002). Los procesos celulares que regulan estos sistemas incluyen adaptación metabólica a cambios en las fuentes de carbono (Island et al, 1992), nitrógeno

Introducción

{Keener & Kustu, 1988), aceptares de electrones (Lin & Iuchi, 1991) o fosfato {Wanner & Wilmes-Riesenberg, 1992); respuestas a cambios en la osmolaridad {Mizuno, 1991), temperatura o pH; quimiotaxis (Stock et al, 2002);

diferenciación (Shapiro & Losick, 1997; Ward & Zusman, 1997) y esporulación (Hoch, 1993; Perego, 1998). También actúan regulando procesos de especial interés sanitario o medioambiental como los relacionados con patogénesis (Groisman & Heffron, 1995), resistencia a antibióticos (Matsushita & J a n d a , 2002) o establecimiento de simbiosis {Gottfert et al, 1990).

En eucariotas, donde la presencia de estos sistemas de dos componentes se restringe a levaduras, hongos, protozoos y plantas, los sistemas de dos componentes identificados están implicados en osmorregulación, estrés y procesos de desarrollo mediados por hormonas (Thomason & Kay, 2000).

Merece la pena destacar la ausencia de este tipo de sistemas en animales, no habiéndose encontrado los correspondientes genes en ninguno de los genomas completos analizados hasta la fecha (1998; Adams et al, 2000; Lander et al, 2001).

1.2. Regulación.

Con frecuencia el componente regulador de u n sistema de dos componentes está sometido a autorregulación, actuando la forma fosforilada del regulador como activador o represor de su propio operón (Birkey et al., 1994; Soncini et al, 1995; Ueno-Nishio et al, 1984; Wanner & Chang, 1987).

Por otra parte, dependiendo del tipo de ruta o proceso que controlan, algunos sistemas de dos componentes producen u n a respuesta del tipo todo o nada, como el sistema Spo que controla la esporulación en B. subtilis (Hoch, 1995), mientras que otros median respuestas más graduales (Pratt & Silhavy, 1995).

En cualquier caso, las respuestas producidas son dependientes del nivel de acumulación del componente regulador fosforilado, que a s u vez puede depender de diversas señales y componentes, que permiten optimizar la respuesta en función de las necesidades de cada sistema concreto. Esta multiplicidad de mecanismos de regulación permite la integración de distintas señales metabóücas, proporcionando u n a importante flexibilidad.

Introducción

1.3. Organización y mecanismo.

El único mecanismo demostrado de comunicación entre proteínas de los sistemas de dos componentes (Bourret eí al., 1991) implica reacciones de fosforilación y desfosforilación entre módulos altamente conservados. En el sistema prototipo, cada componente esta formado por dos módulos funcionales, aunque estos módulos pueden hallarse en solitario, es decir constituir el único dominio de la proteína, o en combinación con otros módulos de transferencia de fosfatos, dando lugar a las denominadas histidina quinasas híbridas (Grebe & Stock, 1999; Wolanin eí al, 2002). Esto último ocurre en la mayoría de los sistemas eucarióticos analizados.

Independientemente de su asociación con otros, los módulos conservados se denominan transmisor y receptor, y se localizan, respectivamente, en la región C-terminal de las histidina quinasas y N-termínal de los reguladores de respuesta "clásicos". Dentro de cada componente, estos dominios conservados se asocian a otros dominios no relacionados que funcionan como elementos de entrada (dominio sensor o input} o de salida (dominio efector, regulador u outpuf¡, respectivamente. El dominio input del componente sensor, generalmente asociado a membrana, actúa detectando la señal específica del sistema y regulando la actividad del módulo transmisor conservado, que a su vez controla la fosforilación del dominio receptor del regulador de respuesta.

Esta fosforilación repercute drásticamente en la conformación de la proteína, alterando la actividad del correspondiente módulo efector.

El módulo transmisor del componente sensor posee actividad auto- quinasa, lo que le permite catalizar la incorporación de grupos fosfato desde el ATP a residuos conservados de histidina presentes en este mismo módulo. Por este motivo, los componentes sensores de los sistemas de dos componentes reciben también el nombre de histidina quinasas. El residuo de fosfohistidina es el sustrato para la transferencia del fosfato al dominio receptor del regulador en u n a reacción que parece catalizada por el propio dominio receptor, al igual que la desfosforilación (Hess eí al, 1988; Lukat eí al,, 1992).

En otros casos, la histidina quinasa promueve la rápida desfosforilación del dominio receptor en respuesta a señales ambientales (Aiba eí al, 1989; Keener 8s Kustu, 1988; Lois eí al., 1993). Esta actividad recibe el nombre de actividad fosfatasa regulada, aunque no está claro si implica u n a actividad catalítica propia del módulo transmisor o u n a activación alostérica de la actividad autofosfatasa del dominio receptor (Parkinson, 1993). Análisis genéticos y

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Introducción

bioquímicos en diversos sistemas indican que esta actividad juega u n papel central en la regulación de la actividad del componente regulador (Stock et al., 2000). En otros sistemas, la desfosforilación del componente receptor está mediada por proteínas no relacionadas con las histidina quinasas (Blat &

Eisenbach, 1994; Blat & Eisenbach, 1996; Ohlsen et al, 1994; Perego et al, 1994).

Así, pues, las actividades quinasa y fosfatasa de los sensores y reguladores de respuesta constituyen la base bioquímica de la transducción de la señal en los sistemas de dos componentes. A pesar de la gran cantidad de análisis que se h a n llevado a cabo en algunas de estas proteínas, los mecanismos moleculares operativos en la comunicación entre los distintos módulos, y entre éstos y las señales de entrada y salida del sistema continúan siendo en muchos casos desconocidos.

1.4. Relación estructura-función en histidina quinasas.

El módulo transmisor, de unos 250 aminoácidos, presenta u n a serie de motivos altamente conservados en la superfamilia de las histidina quinasas. El sitio de fosforilación, incluido en la región H, se localiza en posición N-terminal respecto del resto de las secuencias conservadas que constituyen las regiones N, G l , F y G2, denominadas asi por el residuo conservado que define al corespondíente bloque de secuencias (Alex & Simón, 1994; Parkinson &

Kofoíd, 1992). En todos los casos estudiados, la autofosforilación tiene lugar mediante u n mecanismo de transfosforilación entre las unidades que constituyen el dímero (Ninfa et al, 1993; Pan et al, 1993; Surette et al, 1996;

Swanson et al., 1993; Wolfe & Stewart, 1993). Los alineamientos de u n a gran cantidad secuencias han permitido la clasificación de las histidina quinasas en 11 subfamilias diferentes (Grebe & Stock, 1999).

Las estructuras tridimensionales de las histidina quinasas EnvZ y CheA, indican la presencia de dos dominios diferenciados en el módulo transmisor (Bilwes et al, 1999; Park et al, 1998). En EnvZ, el dominio fosfotranferasa, central o de dimerización comprende las regiones H y N y forma u n a estructura de cuatro hélices {four-helix bundle), a la que cada monómero contribuye con dos hélices (Tomomori et al, 1999). Por el contrario en CheA, u n a histidina quinasa atípica, la misma estructura de 4 hélices es monomérica, y cada dímero CheA contiene dos de estas estructuras con s u s correspondientes histidinas fosforilables (Zhou et al, 1995).

Introducción

El segundo dominio del módulo transmisor es el dominio quinasa o catalítico, localizado en posición C-terminal. Las estructuras determinadas para este dominio en EnvZ y CheA muestran u n a elevada homología con la familia GHKL de ATPasas, a la que pertenecen las proteínas DNA girasa B, Hsp90 y MutL (Bilwes et al, 1999; Tanaka et al, 1998). Esta similitud había sido previamente observada a nivel de secuencia, fundamentalmente en los motivos N, G l , F y G2, que conforman el sitio de unión a ATP (Mushegían et al, 1997).

La organización de ambos dominios, fosfotranferasa y catalítico, dentro de la proteína y del dímero implican movimientos de estos dominios uno sobre el otro para llevar a cabo la autofosforilación. Algunas evidencias sugieren que las regiones entre dominios pueden ser importantes para permitir esta flexibilidad de movimientos.

Las histidína quinasas pueden llevar asociados diferentes tipos de dominios sensores, que pueden ser extracelulares o citoplasmáticos, diseñados para interacciones específicas con s u s ligandos o estímulos (Dutta

et al, 1999; Galperin et al, 2001; Stock et al, 2000). Esta enorme variedad se refleja en u n a muy baja similitud de secuencia y tamaño existente entre los sensores pertenecientes a distintas histidína quinasas. Los sensores extracelulares se encuentran conectados al citoplasma y al módulo transmisor a través de u n a o más regiones transmembrana. Entre los dominios sensores citoplasmáticos, se h a n identificado en muchos casos la presencia de dominios tipo PAS o GAF. Estos dominios actúan como módulos de detección de diferentes tipos de señales {luz, potencial redox, etc..) y su función suele estar asociada a la unión de u n cofactor o a interacciones proteína-proteína (Taylor

&Zrrulin, 1999).

La mayoría de las histidína quinasas contienen u n a región de unos 50 amino ácidos con dos segmentos en hélice separados por u n a corta región m á s compacta, denominada "linker" (o HAMP), que precede a la región H y que parece jugar u n papel importante en la transducción de señales (Appleman et al, 2003; Aravind & Ponting, 1999; Hsing et al, 1998). Diversos análisis mutacionales sugieren su implicación en u n correcto alineamiento de los monómeros (Appleman & Stewart, 2003; Hsíng et al, 1998; Raivio & Silhavy,

1997). En base a la naturaleza dinámica de estas estructuras, se ha propuesto u n posible papel en la detección de cambios conformacionales producidos en el dominio sensor y su transmisión al módulo transmisor (Park & Inouye,

Introducción

1997). La localización de la histidina fosforilable cerca del extremo de u n a estructura de este tipo sugiere que u n cambio en la conformación de dicha estructura podría controlar la accesibilidad de esta histidina al dominio quinasa, permitiendo la fosforilación (Hsing eí al, 1998).

1.5. Relación estructura-función en reguladores de respuesta.

El dominio que caracteriza a u n regulador de respuesta es el dominio receptor, que suele tener unos 125 residuos y presenta homología con las GTPasas eucarióticas (Artymiuk eí al, 1990; Chen eí al, 1990; Stock eí al,

1991). La mayoría de los reguladores de respuesta contienen dos dominios: el dominio receptor conservado en s u extremo N-terminal, y u n dominio efector en su extremo C-terminal. Estos últimos están generalmente implicados en regulación transcripcional, aunque también se conocen algunos ejemplos de dominios efectores con actividad enzímática, como es el caso de CheB (Simms

eí al, 1985).

Los reguladores de respuesta que actúan como reguladores transcripcionales pueden clasificarse en tres subfamilias en función de la homología que presentan en su dominio efector C-terminal. Estas subfamilias reciben el nombre del regulador representativo de la subfamilia: OmpR, NarL y NtrC (Gross eí al, 1989). Aunque todos ellos contienen motivos de unión a DNA del tipo hélice-vuelta-hélice, la estructura del dominio que lo contiene es diferente. Las interacciones que cada regulador de respuesta presenta con la maquinaria de transcripción y el mecanismo de activación de la transcripción varían entre componentes de u n a misma subfamilia.

La primera estructura tridimensional obtenida para u n dominio receptor fue la de la proteína CheY, implicada en el control de la quimiotaxis en E. coli, y que no contiene dominios efectores asociados (Stock eí al, 1990; Volz, 1993). Todos los dominios receptores cuya estructura ha sido resuelta desde entonces, y que incluyen a NtrC (Volkman eí al, 1995), PhoB (Sola eí al,

1999) ó CheB (Djordjevic eí al, 1998), tienen u n a estructura similar a la determinada para CheY.

Los dominios receptores catalizan la transferencia del grupo fosfato desde la correspondiente histidina quinasa a s u propio residuo de Asp. Esta autofosforilación del dominio receptor también puede llevarse a cabo

introducción

utilizando como sustrato pequeñas moléculas donadoras como el acetilfosfato (Lukat et al, 1992) o, a menos in vitro, a los residuos de fosfohistidina de histidina quinasas pertenecientes a otros sistemas. Las tasas de fosforilación en ambos casos son mucho menores que las obtenidas utilizando como sustrato su correspondiente histidina quinasa (Fisher et al, 1996; McCleary,

1996).

En la mayoría de los casos, los dominios receptores catalizan su propia desfosforilación con eficiencias que difieren considerablemente de un regulador a otro, con oscilaciones en el tiempo de vida medio de la forma fosforilada de entre segundos y horas. Estas diferencias reflejarían las necesidades propias de cada sistema.

Los estudios genéticos, bioquímicos y biofisicos llevados a cabo con diferentes reguladores ha permitido elaborar hipótesis para explicar la transducción de las señales intramoleculares. Los reguladores de respuesta se encontrarían en equilibrio entre dos estados conformacionales alternativos:

inactivo y activo. La fosforilación del dominio receptor provocaría u n cambio conformacional que desplaza este equilibrio hacia la forma activa (Birck et al., 1999; Halkides et al, 2000; Kern et al, 1999; Lewis et al, 1999; Nohaile et al, 1997; Zhu et al, 1997). Las regiones alteradas tras la fosforilación coinciden con las superficies previamente identificadas por s u implicación en interacciones proteína-proteína y difieren de u n regulador a otro. Las consecuencias de estas interacciones intramoleculares también pueden ser muy diferentes. En algunos casos se modifican regiones implicadas en la interacción con sus correspondientes histidina quinasas u otras proteínas auxiliares que controlan la actividad de los reguladores de respuesta. En otros casos, la fosforilación promueve la dimerización u oligomerización de la proteína, requerida para alguna de s u s actividades, la liberación de interacciones inhibitorias o la regulación de la actividad enzimática.

2. Regulación de la asimilación de nitrógeno.

2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.

En enterobacterias, la actividad de la glutamina sintetasa {GS) y de otros enzimas importantes en la asimilación de nitrógeno está regulada de acuerdo con la disponibilidad de fuentes de nitrógeno, entre las cuales el amonio es la que permite la mayor velocidad de crecimiento. La GS y en general las

introducción

proteínas implicadas en el transporte y catabolismo de fuentes alternativas de nitrógeno se sintetizan a bajos niveles cuando dicho nutriente es abundante, y a altos niveles en ausencia o escasez de amonio (Kustu et al, 1979; Merrick &

Edwards, 1995; Neidhardt & Magasanik, 1957; Pahel, Rothstein & Magasanik, 1982; Prival & Magasanik, 1971).

Los genes implicados en la asimilación de fuentes alternativas de nitrógeno se agrupan en varios operones ntr (de nitrogen regulation), que en conjunto se conocen como el reguión Ntr. Este reguión incluye sistemas de movilización y transporte de aminoácidos como glutamina (glnHPQ), arginina (argT) o histidina (hisJQMP), genes implicados en la asimilación de nitrato y nitrito (nasFEDCBA) y, en K. pneumoniae, los genes reguladores de la fijación de nitrógeno atmosférico (nifLA) (Ninfa et al, 2000; Reitzer, 2003). La expresión de estos operones está regulada por el sistema de dos componentes NtrB/NtrC. La histidina quinasa NtrB (también llamada NRII) está codificada por el gen ntrB (glnL) y el regulador de respuesta NtrC (NRI) por el gen ntrC (glnQ.

En condiciones limitantes de amonio, NtrB fosforíla al regulador transcripcional NtrC, mientras que en condiciones de exceso de nitrógeno promueve su desfosforilación. La proteína activa (NtrC-P) regula positivamente al conjunto de promotores ntr, que tienen en común la presencia de secuencias UAS (de Upstream Activator sequence), también llamadas intensificadoras o enhancers, localizadas a cierta distancia del inicio de la transcripción. Estos promotores dependen para su actividad de NtrC-P, que reconoce u n a secuencia consenso centrada a 100-150 pb aguas arriba del inicio de la transcripción, y de la RNA polimerasa cargada con el factor sigma alternativo a54 (Ea54) (Hirschman et al, 1985; Ninfa, Reitzer & Magasanik, 1987; Reitzer & Magasanik, 1986; Reitzer, Movsas & Magasanik, 1989). Los promotores dependientes de Ea54 presentan secuencias consenso centradas a -12 y -24 con respecto al inicio de la transcripción en +1, mientras que la inmensa mayoría de los promotores de enterobacterias están definidos por secuencias consenso a -10 y - 3 5 (Merrick, 1993).

Los genes ntrB y ntrC comparten operón con glnA, el gen estructural de la glutamina sintetasa, y enzima clave en la asimilación de nitrógeno. Estos tres genes se transcriben en el orden glnA, ntrB, ntrC (Esphi et al, 1982) a partir de tres promotores distintos: glnApl, glnAp2 y ntrB (Pahel et al, 1982).

Las dos primeros están situados aguas arriba del gen glnA y el tercero se

Introducción

encuentra entre los genes glnA y ntrB. En condiciones de exceso de amonio, tiene lugar u n a expresión basal del operón a partir de los promotores glnApl y ntrB. Estos son promotores típicos, dependientes del factor de iniciación transcripcional 070 (Reítzer & Magasanik, 1985) y están negativamente regulados por NtrC (Ueno-Nishio et al, 1984). En condiciones de carencia de amonio, la transcripción se realiza a partir del promotor glnAp2, dependiente de cr54 y NtrC, lo que permitte la amplificación de la señal correspondiente (Hunt & Magasanik, 1985; Reitzer & Magasanik, 1985).

A diferencia de otros sistemas de dos componentes, la histidina quinasa NtrB no detecta directamente la señal, sino que le es comunicada por las proteínas triméricas PII, codificadas por los genes parálogos glnBy glnK. Tanto GlnB como GlnK son modificados por la enzima UTasa/UR, producto del gen glnD, en función de la concentración intracelular de glutamina. En condiciones de escasez de nitrógeno (baja concentración de glutamina), la UTasa uridilila a GlnB y GlnK, mientras que en condiciones de exceso de nitrógeno cataliza la reacción contraria (Arcondeguy et al, 2001). Las formas no uridililadas de las proteínas PII inhiben ligeramente la actividad autoquinasa e inducen la actividad fosfatasa de NtrB (Atkinson & Ninfa, 1999;

Jiang & Ninfa, 1999; Jiang et al, 2000). Este efecto resulta en la rápida desfosforilación de NtrC-P {Kamberov et al, 1995). En ausencia de proteínas PII, o en presencia de s u s formas modificadas (GlnB-UMP y/o GlnK-UMP), prevalece la actividad quinasa de NtrB (Jiang eí al, 2000). A pesar de s u s funciones comunes, el papel fisiológico de las proteínas GlnB y glnK difiere debido a sus diferentes patrones de expresión (Atkinson et al, 2002). Por otra parte, las proteínas PII forman heterotrímeros estables, aunque con propiedades distintas de los homotrímeros, que h a n sido puestas de manifiesto tanto in vitro como in vivo {Forchhammer et al, 1999; van Heeswijk

et al, 2000 y datos sin publicar). La formación de heterotrímeros añade por tanto nuevas sutilezas a la regulación dependiente de nitrógeno (van Heeswijk et al, 2000).

Además de en el control transcripcional del reguión Ntr, las proteínas PII juegan u n papel clave en el control de la actividad glutamina sintetasa (GS).

Esta regulación la ejercen a través de la ATasa o adeniltransferasa/adenilremovasa, codificada por glnE. Las actividades de la ATasa son reguladas en función del grado de uridililación de las proteínas PII

Introducción

(Jaggi et al, 1997). La adenilación de la GS resulta en una rápida inactivación del enzima (Rhee et al, 1985; Rhee et al, 1989).

Las interacciones clave en las que participan los componentes reguladores de la asimilación de nitrógeno en enterobacterias se resumen esquemáticamente en la Figura 2

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Figura 2. Regulación de la asimilación de nitrógeno en K.

pneumoniae. Los detalles se describen en el texto.

2.2. Relación estructura función en el sistema de dos componentes NtrB/NtrC.

NtrB es u n a proteína de 369 aminoácidos, cuya organización modular se representa esquemáticamente en la Figura 3. La región N-terminal de NtrB, bastante diferente a las de la mayoría de las histidina quinasas, es esencial en la regulación de las actividades quinasa y fosfatasa de NtrB. En esta región, y en particular en el linker que precede al sitio de fosforilación, se localizan la mayoría de las mutaciones reguladoras (Ninfa et al, 1995; Pioszak & Ninfa, 2003a). En el extremo N-terminal se localiza u n a región con homología a los recientemente identificados dominios PAS, implicados en la unión de ligandos reguladores y en interacciones proteína-proteína.

El módulo transmisor conservado presenta u n a organización típica, estando compuesto por dos dominios estructurales y funcionales. El dominio central o fosfotransferasa contiene el sitio de autofosforilación His-139 y el dominio C-terminal, quinasa o catalítico contiene el resto de los motivos de secuencia conservados (Kramer 85 Weiss, 1999; Jiang et al, 2000; Kramer &

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Vv'eiss. i999). La autofosforilación de NtrB implica transfosforilación entre s u b u n i d a d e s (Ninfa et ai. 1993). En condiciones de deficiencia de nitrógeno.

NtrB promueve la transferencia del grupo fosfato desde su residuo de h i s t i c m a al residuo Asp54 del domino receptor de NtrC. m i e n t r a s que en suficiencia de nitrógeno p r o m u e v e la desfosforilación de NtrC a través de su actividad fosfatasa. E n s a y o s con derivados t r u n c a d o s indican que e s t a actividad reside en el dominio central y sugieren que es n e c e s a r i a u n a d e t e r m i n a d a conformación ce dicho dominio p a r a inducirla. La actividad fosfatasa cíe NtrB.

que r x es u n a reversión de la reacción de transferencia, de fosfato es el blanco principal cic las p r o t e í n a s PII (Jiang et ai. 2 0 0 0 : Pioszak & Ninfa. 2003a:

Pioszak & Ninfa. 2003b).

El reguiador de r e s p u e s t a NtrC pertenece a la subfamilia de activadores trar.scripcicnales d e p e n d i e n t e s de a5 : (Kustu et ai. 1989:. Se t r a t a ele u n a proteir.a cimérica en la que se distinguen tres dominios e s t r u c t u r a l e s v funcionales Figura. 3: ; D r u m m o n d et ai. 1986). El dominio N-termmal de 123 aminoácidos es el módulo receptor conservado, fosforilado por NtrB en Asp-5-1- El dominio centra.! interacciona con el complejo transcripeior.al E ~: _•

contiene u n motivo de unión a ATP (Morctt & Segovia. 1993: O s u n a . Soberon

& Morett. 1997.. El dominio C-tcrminal contiene u n motive H-'i'-i: -cíe E'exv T:.¿n:-Iielix o hélice-giro-hélice necesario p a r a la unión a ENA Ccntrerax &

Drummonci. 19SS• y es también necesario p a r a la dimenzación de NtrC Portcr et ai. 1993: S h i a u . Chcn & Reitzer. 1993).

La fosforilación de NtrC a u m e n t a la coopcratividac en su tmiór. al enhancer en el DNA ;Chen & Reitzer. 1995: Portcr et ai. 1993' Wciss ?:, ai.

1 9 9 1 ' . estimula la actividad ATPasa e i n d u c e la formación de oiigómercs sobre los sitios de unión a 1DNA (Hwang et ai. 1999: VVeiss et ai.. 1992: IVyman et ai. 1997'. Mientras que la c a p a c i d a d de represión reside en el dominio ele unión a ENE iContreras & Drummonci. 1988: Erummonci et ai. 199C:. la función activacora requiere los tres dominios de la proteína Erummonxl el ai.

1990, y es n o t a b l e m e n t e m á s compleja. Ú n i c a m e n t e la forma fosfonlaxla de NtrC es capaz de activar la transcripción (Ninfa & Magasanik. 1986:.

Introducción

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2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en Klebsiella pneumoniae y Azotobacter uinelandii.

La c a p a c i d a d de fijar nitrógeno atmosférico s u p o n e u n alio coste energético, que u n i d o a la sensibilidad de la enzima n i t r o g e n a s a al oxigene, obliga a u n estricto control de los genes c o r r e s p o n d i e n t e s (genes nifl. La regulación ele estos procesos h a sido a m p l i a m e n t e e s t u d i a d a en varíes o r g a n i s m o s modelo, entre ellos K. pneumoniae, enterobacteria que fija nitrógeno en a n a e r o b i o s i s . y A. uinelandii, u n aerobio estricto.

Tanto en K. pneumoniae como en A. uinelandii, la expresión de los genes .".;/" es d e p e n d i e n t e del regulador transcripcional NifA. codificado por nifA. que c o m p a r t e operon con el gen nifL. En condiciones de exceso de nitrógeno y p r e s e n c i a de oxígeno. NifL forma u n complejo proteico con NifA inhibiendo su actividad. La formación de este complejo NifLA e s t á m o d u l a d a por cambios redox e interacción con ligandos y o t r a s p r o t e í n a s r e g u l a d o r a s (Schmitz el al..

2002:.

Las p r o t e í n a s NifL p r e s e n t a n uno o dos dominios PAS en su región X- tcrmina'. en K. pneumoniae o .4. uinelandii. respectivamente.. irr.pLca.doiS en la detección del estado redox m e d i a n t e la u n i ó n a u n cofactor LAD HL1 ez al.

1996: Schrnnz. 1997). Los dominios C-terminal de las proteínas Nifl..

c o m p a r t e n homología con histidina q u i n a s a s , a u n q u e no están implicados en transferencia de fosfato (Blanco et al, 1993; D r u m m o n d & Wootton. 1987) El dominio C-terminal de NifL de A. uinelandii es capaz de u n i r nucleótidos (Soderback et al. 1998). m i e n t r a s que no se h a d e m o s t r a d o ic mismo en el caso de NifL ele K. pneumoniae (Klopprogge et al, 2002).

Las p r o t e í n a s NifA c o m p a r t e n homología en s u s dominios centra, y C- ternninal con reguladores t r a n s c r i p c i o n a l e s d e p e n d i e n t e s ce factor stgma 5 - ceme XtrC Lvíoreit & Buck. 1988; Morett et al. 1988: S t u d h o l m e & Dixon.

20031. En su región N-terminal p r e s e n t a n u n dominio GAF. que h a sido relacionado con la regulación de NifA en r e s p u e s t a a oxígeno.

La regulación de la activación de NifA en función de ia disponibiiciaá de nitrógeno se realiza a través de la p r o t e í n a GlnK; a u n q u e el m e c a n i s m o difiere en Celda organismo. En K. pneumoniae. een condiciones ce a u s e n c i a de nitrógeno. NtrC-? activa la expresión de GlnK. La interacción de Glr.X con el complejo XifLA promueve su disociación, permitiendo la activación de XifA 1-1 c

Introducción

et ai, 1998; J a c k et al, 1999). En el caso de A. vinelandii, donde la expresión de GlnK es constitutiva (Colnaghi et ai, 2001; Meletzus et al, 1998), la forma no modificada de GlnK promueve la formación de u n complejo ternario inhibitorio de la actividad de NifA. En condiciones de falta de nitrógeno, la modificación de GlnK promueve la liberación del complejo y la activación de NifA.

En A. vinelandii, existen tres nitrogenasas alternativas que contienen diferentes cofactores. La expresión de los genes correspondientes requiere activadores específicos. Asi, NifA activa la expresión de la nitrogenasa de hierro y molibdeno, mientras que s u s parálogos VnfA y AnfA activan la síntesis de las nitrogenasas de hierro y vanadio y hierro solo, respectivamente (Joerger et ai, 1989}. Algunos genes nif pueden ser activados transcripcionalmente por cualquiera de los tres reguladores. La presencia en dichos promotores de sitios de unión solapados para los tres reguladores puede implicar la existencia de interacciones moleculares entre ellos, que jugarían u n papel en el control de estos genes en las distintas situaciones fisiológicas (Drummond et ai, 1996).

3. El sistema del doble híbrido de levaduras y transducción de señales en bacterias.

3.1. El problema biológico: Interacciones entre proteínas.

Las interacciones pro teína-pro teína y su especificidad son fundamentales en los más variados procesos biológicos, incluyendo la formación de estructuras celulares, complejos enzimáticos y otras asociaciones más transitorias y no exentas de complejidad, como las que pueden tener lugar entre proteínas implicadas en transducción de señales. Puesto que la supervivencia de las bacterias depende en buena medida de la capacidad de detectar e integrar estímulos ambientales para producir u n a respuesta celular apropiada, el estudio de las interacciones que tienen lugar entre componentes de las rutas de transducción de señales es fundamental para entender las estrategias de adaptación de los microorganismos.

La complejidad de los procesos de transducción de señales se sustenta, en gran parte, en la multifuncionalidad de las proteínas implicadas en estos procesos. Esta multifuncionalidad puede ser u n reflejo de las actividades de los diferentes dominios de la proteína, pero también de la interacción u n

Introducción

mismo dominio con diferentes componentes celulares. Esto explicaría el efecto pleiotrópico de m u c h a s mutaciones en este tipo de genes. La existencia de redundancia de funciones, a su vez, complicaría la correspondiente adscripción fenotípica de los mutantes (Schaechter, 2001). La visión "lineal", en la que la amplificación de u n a señal a través de actividades catalíticas sucesivas conduce a u n a respuesta celular, ha dado paso a u n a visión más interactiva en la que las proteínas reguladoras de u n a ruta modulan su actividad en función de interacciones con otros reguladores y componentes celulares. Diferentes señales pueden así converger en elementos comunes o ser anuladas o amplificadas, en función de la actividad de los distintos componentes celulares, permitiendo u n a regulación coordinada y flexible en función de las condiciones ambientales. Por todo ello, más que de rutas habría que hablar de redes de transducción de señales.

3.2, El sistema del doble híbrido de levaduras. Variantes y secuelas.

En la década de los ochenta se describió la organización modular de los reguladores transcripcionales eucarióticos, constituidos por dominios de activación (AD, de Activation Domain) y dominios de unión a DNA (BD, de Binding Domain)(Keegan, GUI & Ptashne, 1986; Ma & Ptashne, 1987a; Ma &

Ptashne, 1987b). Esta separación de funciones fue elegantemente demostrada en experimentos de intercambio entre el dominio de activación de la proteína GAL4 de S. cerevisiae y el represor de LexA de E. coli, compuesto por u n solo dominio de unión a DNA (Brent & Ptashne, 1985) y posteriormente confirmada con ejemplos en los que los módulos AD y BD son proporcionados por proteínas diferentes (Ptashne, 1988; Triezenberg, Kingsbury & McKnight,

1988a; Triezenberg, LaMarco & McKnight, 1988b). Estos experimentos fueron la base para el desarrollo de u n a nueva metodología en el estudio de las interacciones proteína-proteína in vivo: el sistema del doble híbrido de levaduras (Fields & Song, 1989). En este sistema, los módulos AD y BD son acercados mediante la interacción entre las proteínas a las que h a n sido fusionados (Figura 4). Esta interacción da lugar a la activación de genes testigos, en los que promotores dependientes del dominio BD utilizado han sido fusionados a genes cuya actividad es fácilmente detectable. Según el tipo de genes testigo presentes en las cepas de levaduras empleadas (típicamente

Introducción

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Figura 4. Detección de interacciones moleculares mediante el sistema del doble hibrido. a) La activación del promotor gall por la proteína modular Gal4 requiere la unión a DNA del dominio BD y la interacción con la RNA Polimerasa II medíate el dominio AD. b) La fusión del dominio BD a la proteína de interés X no activa la transcripción, c) La fusión entre el dominio AD y la proteína Y tampoco activa la transcripción, d) La expresión simultanea de ambas proteínas de fusión reconstituye la actividad transcripcional si las proteínas X e Y interaccionan entre sí.

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u n m a r c a d o r nutricional como HIS3 o el gen lacZ de E. coh). la interacción p u e d e visualizarse d i r e c t a m e n t e en medios específicos o c u a m i ñ e a r s e m e d i a n t e determinación de actividades enzimáticas.

Ademas del ya clásico s i s t e m a del doble híbrido b a s a d o en GAL4, se h a n desarrollado otros, como los b a s a d o s en LexA y la protcina VP16 del virus del h e r p e s ¡Vojtek et al.. 1997) o en LexA y B42 de E. coli (Goicmis & Bren;.. 1997i.

En los a ñ o s siguientes a la descripción de la técnica, la simplicidad del ensayo hizo crecer" rápidamente s u s aplicaciones. Las v a r i a n t e s de u n o o tres híbridos permiten, respectivamente, el estudio de interacciones DXA-pro:eína Li &

Fieles. 1993. Wang & Stillman, 1993) o RNA-proteína (Putz. Skehe". & Kuhl.

1996 . Las v a n a n t e s '"reversas" permiten la identificación y el estudio de m u t a c i o n e s y moléculas que d e s t r u y e n interacciones p r o t e í n a - p r o t e í n a o DXA- proteítia L c a n n a & í l a n n i n k . 1996; Vidal et al. 1996¡. Una de las aplicaciones m á s potentes es. sin d u d a , la identificación de p r o t e í n a s c a p a c e s de interaccionar con otra de interés, m e d i a n t e el escrutinio de genotecas cíe expresión.

Más recientemente, se h a n desarrollado u n a serie ce s i s t e m a s doble híbrido b a c t e r i a n o s . Algunos de estos s i s t e m a s e s t á n b a s a d o s , de m a n e r a homologa a ios s i s t e m a s de l e v a d u r a s , en la obtención de reguladores t r a n s c n p c i o n a l e s híbridos, t a n t o r e p r e s o r e s (Hu et al. 1990: Kornacker el a'..

1998: Oer:el-Buchheit et al.. 1993) como activadores Dove et al. 1997:

Jappelli & Brer.r.er. 1998: Kolmar et al. 1995). El s i s t e m a m á s conocido, sin embargo, se b a s a en la reconstitución, en u n a estirpe cya deficiente en adenilatc ciclasa, de E. coh de la actividad de la enzima aderulato ciclasa ce Borceteila p e r t u s s i s (Karimova et al. 1998). A p e s a r de que estos s i s t e m a s h a n sido aplicados con éxito en diversos estudios, su u s o no h a sido todavía generalizado y no se h a n publicado, h a s t a donde s a b e m o s , r e s u l t a d o s p r o c e d e n t e s de escrutinios de genotecas. con lo q u e . para. a l g u n a s aplicaciones, los sisteman b a c t e r i a n o s son todavía estrategias "de nesgo" Hu et al. 2000: Ladant & Karimova. 2000).

3.3. Contribución de las herramientas doble-híbrido al estudio de la transdueción de señales en bacterias.

La concentración de r e c u r s o s en la investigación de s i s t e m a s de t r a n s d u e c i ó n de s e ñ a l e s relacionada con procesos de desarrollo y cáncer, h a

Introducción

influido en el éxito espectacular de las estrategias doble híbrido. Esta circunstancia, ha hecho que sepamos hoy en día más sobre las interacciones proteína-proteína en las complejas rutas de transducción de señales eucaríóticas que en las mediadas por sistemas de dos componentes en bacterias.

En investigación científica es común la utilización de sistemas simples para el estudio de sistemas más complejos. Así, durante décadas, u n a buena parte de los conocimientos sobre el funcionamiento de los seres vivos a nivel molecular h a n sido obtenidos en E. coli. Esta bacteria y en menor medida la levadura Saccharomyces cerevisiae, son utilizadas de forma rutinaria, en laboratorios de todo el mundo, como herramientas en el análisis y manipulación de genes y genomas de organismos pluricelulares. En el marco de la Genética clásica ambos microorganismos han compartido protagonismo con otros sistemas modelo como Drosophüa melanogaster, sometidos a análisis genéticos cada vez más sofisticados. Quizás esta lógica, que implica en muchos casos trabajar con organismos simples para intentar extrapolar a otros más complejos, explique el retraso en la aplicación del sistema del doble híbrido al estudio de interacciones proteicas en procariotas. Es hecho es que, tras u n a cierta resistencia a la utilización de herramientas genéticas eucaríóticas para estudiar procesos biológicos bacterianos, este tipo de aproximación se ha consolidado en la literatura científica {Bartel et al., 1996;

Lei et al., 1999; Rain et al., 2001). Es este contexto, la menor complejidad de los genomas bacterianos y su distancia evolutiva a levaduras implican, al menos en teoría, que el ruido de fondo debido a interacciones con componentes endógenos sea menor que con proteínas eucariotas. Basándose en esta premisa, algunos autores sugieren que el uso del sistema de levaduras sería preferible en el estudio de proteínas procariotas, mientras que el sistema bacteriano sería el ambiente apropiado para el estudio de proteína de origen eucariótico (Hu et al., 2000).

La secuencia genómica de B. coli revela que u n a importante fracción de sus hipotéticos productos génicos son todavía de función desconocida. Los sistemas doble híbrido permiten obtener información sobre estas proteínas, a partir de la identificación y análisis de las interacciones en las que participan.

Proporcionan por tanto, herramientas fundamentales en "genómica funcional", que complementan las aproximaciones genéticas y bioquímicas clásicas. En el contexto concreto de la transducción de señales de nitrógeno en

Introducción.

enterobacferias, intensamente estudiada, el sistema del doble híbrido de levaduras, al estar basado en u n a premisa distinta (la detección de interacciones proteína-proteína), nos permite abordar aspectos como la identificación nuevos elementos, de función conocida o no, en las redes de transducción de señales, así como obtener información relevante sobre los dominios y motivos proteicos implicados en las interacciones detectadas.

3.4. Ensayos doble híbrido: Consideraciones generales.

Actualmente existe u n a gran variedad de vectores y estirpes que permiten "personalizar" el sistema del doble híbrido para adecuarlo a objetivos experimentales concretos (Bartel & Fields, 1997; Zhu & Hannon, 2000), aunque el sistema más utilizado sigue siendo el basado en el regulador GAL4.

A los componentes básicos de todos los vectores pueden añadirse elementos adicionales, que facilitan la detección y posteriores estudios de las proteínas de fusión. Estas secuencias, sin embargo, pueden aumentar la probabilidad de recombinaciones entre los plásmidos en el interior de la levadura, lo que puede dificultar la detección de algunos clones interesantes (falsos negativos), o generar fusiones capaces de activación independiente del cebo (falsos positivos) (Fromont-Racine et al, 1997).

Los distintos tipos de vector permiten diferencias en el nivel de expresión de las proteínas de fusión, en las dianas de restricción del MCS (sitio de clonación múltiple) y en el marcador de selección para levaduras. Así por ejemplo, u n elevado nivel de expresión de las proteínas de fusión puede favorecer la detección de interacciones débiles, pero aumenta la probabilidad de que la proteína de fusión expresada resulte tóxica para la célula. Este fenómeno, particularmente si afecta a la fusión a utilizar como cebo en los correspondientes escrutinios, repercute negativamente en el número de clones detectado. La utilización los vectores AD y BD con el mismo MCS facilita la construcción de los dos tipos de fusiones necesarias para la realización de ensayos recíprocos, en los que se intercambian los módulos de GAL4 fusionados a u n a pareja concreta de proteínas. La disponibilidad de variantes que difieran en la pauta de lectura del MCS, a su vez, resulta particularmente importante en la construcción de genotecas por fragmentación enzimática. Por último, los marcadores de selección de levaduras presentes de los vectores suelen ser de tipo nutricional, y la única característica a tener en cuenta es

Introducción

que sean compatibles con la estirpe de levadura seleccionada para realizar los ensayos.

Los genes testigo más utilizados en análisis doble híbrido son aquellos que permiten u n a selección nutricional (ADB2 ó HIS3), debido a su facilidad de ensayo. El marcador lacZ es también ampliamente utilizado, tanto en ensayos líquidos (actividad (5-galactosidasa), que producen resultados cuantitativos, como en placa (X-gal). Las características del promotor {tipo y repeticiones de las secuencias UAS) al que se encuentra fusionado el gen testigo permiten detectar y / o discriminar interacciones más o menos débiles.

La presencia en u n a misma estirpe de varios marcadores de selección bajo el control de diferentes promotores facilita la discriminación de señales no derivadas de la interacción entre las fusiones ensayadas {falsos positivos).

Aunque las causas de la aparición de este tipo de clones son diveras y no siempre pueden establecerse (Bai & Elledge, 1997), suelen asociarse a mutaciones genómicas o a la capacidad de algunas fusiones GAL4AD de unirse de manera específica a promotores concretos.

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Objetivos

Objetivos

El objetivo fundamental de este proyecto de investigación es contribuir a la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en transducción de señales de nitrógeno en bacterias mediante la utilización del sistema del doble híbrido de levaduras. El reto estaba en demostrar que u n a herramienta genética eucariótica podía utilizarse para aportar información en sistemas de transducción de señales procarióticos y, en particular, en el paradigmático sistema de dos componentes NtrBC.

Los objetivos concretos de este trabajo son los siguientes:

1. Investigar la utilidad del sistema del doble híbrido de levaduras en el estudio de interacciones moleculares mediadas por proteínas pertenecientes a los sistemas de dos componentes.

2. Explorar el potencial del sistema del doble híbrido para abordar el problema de la especificidad y posible comunicación cruzada entre histidina quinasas y reguladores de respuesta.

3. Analizar interacciones intra e intermoleculares en el sistema de dos componentes NtrB/NtrC.

4. Analizar interacciones entre NtrB y las proteínas que actúan aguas arriba en la ruta de transducción de señales de nitrógeno (proteínas PH).

5. Construir y analizar genotecas doble híbrido encaminadas a la identificación de nuevos componentes de las rutas de transducción de señales de nitrógeno.

6. Contribuir a la construcción de u n "ínteractoma del nitrógeno" en enterobacterias.

7. Caracterizar las posibles nuevas interacciones identificadas.

Una gran parte de ios resultados obtenidos en esta Tesis Doctora.! han sido publicados en los tres artículos que se incluyen como anexos. Con el fin de evitar duplicaciones innecesarias, en la Tesis se hace referencia a las figuras y tablas de las publicaciones f a la vez que se presenta u n resumen de los resultados y discusión correspondientes. Por el contrario, se detalla en mayor profundidad lo relativo a los resultados que, por diversas razones, no han sido publicados.

Anexo I: Two-hybrid analysis of domain interactions involving NtrB and NtrC two-component regulators. Martínez-Argudo, L, Martin-Nieto, J., Salinas, P., Maldonado, R., Drummond, M. y Contreras, A. Molecular Microbiology 40(1):169-178. 2001.

Anexo II: Domain interactions on the ntr signal transduction pathway:

two-hybrid analysis of mutant and truncated derivatives of histidine kinase NtrB. Martínez-Argudo, I., Salinas, P., Maldonado, R., y Contreras, A. Journal of Bacteriology 184(1): 200-206. 2002.

Anexo III: Identification and analysis of Bscheríchia coli proteins that interact with the histidine kinase NtrB in a yeast two-hybrid system. Salinas, P. y Contreras, A. Molecular Genetics and Genomics 269:574-581. 2003.

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Materiales y Métodos