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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

INFORME DE PRÁCTICAS PRE - PROFESIONALES

Validación de un método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

AUTOR: Br. GARCIA ARTEAGA, Lesly Fabiola

ASESOR: Dr. ALVA PLASENCIA, Pedro Marcelo

TRUJILLO – PERÚ 2022

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DEDICATORIA A Dios, por darme su bendición y acompañarme en cada paso de la vida, dándome las fuerzas necesarias para continuar día a día y superar las adversidades que se me presentan.

A mis padres, Lizandro y Emma, a pesar que en estos últimos años hemos pasado por muchas dificultades, permanecemos unidos afrontando los problemas que se nos presentan en la vida; ustedes son mi mayor motivación y ejemplo a seguir.

Gracias por los consejos, apoyo y confianza brindada, espero algún día poder retribuir todo lo que han hecho por mí.

A mis hermanas Liz y Merly, por acompañarme a lo largo de la vida dándome ánimos y consejos para seguir adelante y cumplir mis metas propuestas.

A mis sobrinas Kiara y Mía, a quienes veo crecer día a día, quiero que sepan que siempre podrán contar conmigo, deseo que sean muy felices y que logren todo lo que se proponen.

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AGRADECIMIENTO

A mi asesor, Dr. Alva Plasencia, Pedro Marcelo, por las enseñanzas y apoyo brindado durante el desarrollo de mis prácticas pre - profesionales y en la realización del presente informe. Además, por darme la oportunidad de pertenecer en el proyecto de investigación PIC 06-2014: “Tuberculosis, parasitosis, diabetes e hipertensión: calidad fisicoquímica de los medicamentos adquiridos por el estado peruano”.

A mi compañera y amiga Abigail, por los consejos y ayuda brindada durante el transcurso del año de prácticas pre – profesionales.

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PRESENTACIÓN Señores miembros del jurado:

De conformidad con las normas establecidas en el reglamento de grados y títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a su consideración y elevado criterio profesional el presente Informe de Prácticas Pre – Profesionales titulado:

“Validación de un método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg”

En consecuencia, Señores miembros del jurado, dejo a vuestra consideración la calificación del presente informe.

Trujillo, 08 de abril del 2022

………

GARCIA ARTEAGA, Lesly Fabiola

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JURADO DICTAMINADOR

____________________________________

Dra. GONZÁLES BLAS, María Virginia PRESIDENTE

____________________________________

Dr. ALVA PLASENCIA, Pedro Marcelo ASESOR

____________________________________

Mg. SALDAÑA BOBADILLA, Vanessa MIEMBRO

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RESUMEN

El presente informe tuvo como finalidad validar el método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg. Se utilizó 100 tabletas de isoniazida 100 mg y se realizaron las lecturas en el espectrofotómetro UV/Visible - PERKIN ELMER, LAMBDA 25 a una longitud de onda de 263 nm para los tres medios de

disolución (pH 1,2; 4,5 y 6,8). La validación del método analítico se realizó tomando en consideración lo descrito en la Farmacopea de Estados Unidos 42, la Conferencia Internacional de Armonización y la Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria.

Los parámetros de validación evaluados fueron: linealidad del sistema y del método, exactitud, precisión (repetibilidad y precisión intermedia), selectividad, robustez, interferencia de filtro y estabilidad. Los resultados demostraron que el método analítico es lineal con un r² > 0,99; es exacto con un promedio recuperado dentro del rango establecido (95 – 105 %); es preciso y robusto con un coeficiente de variación porcentual < 2 % y es selectivo con un porcentaje de interferencia < 2 %. Además, se observó que no hubo interferencia de filtro con un coeficiente de variación porcentual < 2 % y que la muestra analizada es estable hasta las 12 horas. Se concluye que el método analítico cumple con las especificaciones establecidas en las guías oficiales; por lo tanto, se da por validado el método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg.

Palabras clave: validación, espectrofotometría UV/Vis, isoniazida.

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ABSTRACT

The purpose of this report was to validate the UV/Vis spectrophotometric method for in vitro bioequivalence studies of isoniazid 100 mg tablets. 100 tablets of 100 mg isoniazid were used and the readings were made in the UV/Visible spectrophotometer - PERKIN ELMER, LAMBDA 25 at a wavelength of 263 nm for the three dissolution media (pH 1.2; 4.5 and 6.8). The validation of the analytical method was carried out taking into consideration what is described in the United States Pharmacopeia 42, the International Conference on Harmonization and the Spanish Association of Industry Pharmacists. The validation parameters evaluated were: system and method linearity, accuracy, precision (repeatability and intermediate precision), selectivity, robustness, filter interference and stability. The results showed that the analytical method is linear with r² > 0.99; is accurate with an average retrieved within the stated range (95 – 105%); it is accurate and robust with a percentage variation coefficient < 2% and it is selective with an interference percentage < 2%. In addition, it was observed that there was no filter interference with a percentage variation coefficient < 2% and that the analyzed sample is stable up to 12 hours. It is concluded that the analytical method complies with the specifications established in the official guides;

therefore, the UV/Vis spectrophotometric method for in vitro bioequivalence studies of isoniazid 100 mg tablets is considered validated.

Keywords: validation, UV/Vis spectrophotometry, isoniazid.

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ÍNDICE

PRESENTACIÓN ... iii

JURADO DICTAMINADOR ... iv

RESUMEN ... v

ABSTRACT ... vi

I. INTRODUCCIÓN ... 1

II. PROBLEMA ... 5

III. OBJETIVOS ... 5

IV. MATERIAL Y MÉTODO ... 6

V. RESULTADOS ... 16

VI. DISCUSIÓN ... 24

VII. CONCLUSIONES ... 28

VIII. RECOMENDACIONES ... 29

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 30

ANEXOS... 36

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I. INTRODUCCIÓN

Un aspecto de vital importancia para el éxito terapéutico es el uso adecuado y continuo de medicamentos de calidad. La calidad de un medicamento se evalúa mediante tres criterios: eficacia del principio activo, determinada por una correcta acción farmacológica; la seguridad del medicamento, mediante una adecuada dosificación y disminución en la probabilidad de reacciones adversas; y la estabilidad del medicamento, dada por la conservación de sus propiedades durante su vida útil.

De esta manera, la utilización de medicamentos de calidad garantiza la efectividad del tratamiento, mayor seguridad y por lo tanto la recuperación del paciente^1,2,3.

Por esta razón, el manual de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) garantiza que los productos farmacéuticos son manufacturados y evaluados conforme a los estándares de calidad para su uso y comercialización en el país, con la finalidad de asegurar que el producto farmacéutico sea eficaz, seguro y de calidad. Una de las leyes en las cuales se fundamenta el manual de BPM es la ley N° 29459, Ley de los Productos Farmacéuticos, Dispositivos Médicos y Productos Sanitarios, donde señala que, para efectos de la inscripción y reinscripción en el Registro Sanitario de medicamentos, se requieren los estudios de intercambiabilidad, normado por el D.S.

N° 024-2018-SA^4,5,6.

La intercambiabilidad entre un medicamento genérico e innovador, se basa en el criterio de bioequivalencia. Los estudios de bioequivalencia in vitro se desarrollan mediante ensayos comparativos de perfiles de disolución, determinando la cantidad del principio activo disuelto en función del tiempo bajo condiciones experimentales controladas y validadas. En los últimos años, los perfiles de disolución en medios con pH fisiológicos han alcanzado gran relevancia debido a que están directamente

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relacionadas con la biodisponibilidad del fármaco.Estos ensayos de disolución, se realizan con el objetivo de valorar el rendimiento del medicamento a través de la medición de la velocidad y el grado en que se libera el fármaco de la formulación en un medio definido. La Organización Mundial de la Salud (OMS) establece que los ensayos de disolución in vitro pueden sustituir las pruebas de bioequivalencia in vivo para los ingredientes farmacéuticos activos de sólidos orales de liberación inmediata que, según el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (SCB), se encuentren en la clase I (alta solubilidad y alta permeabilidad) y clase III (alta solubilidad y baja permeabilidad). Del mismo modo, estos ensayos proveen información útil referente a la biodisponibilidad de un medicamento, además de la uniformidad de un lote a otro; por tal razón, es considerada una de las principales pruebas de control de calidad en la industria farmacéutica^7,8,9.

Debido a la importancia de los estudios de disolución, en la actualidad, los métodos analíticos empleados en los laboratorios son sometidos previamente a pruebas de validación¹⁰. La validación de un método analítico es el proceso en el cual se determina, a través de análisis realizados en laboratorio, que las características de desempeño del método sean las indicadas según los parámetros de referencia establecidos en la metodología¹¹. Este proceso es primordial para asegurar que un método analítico sea preciso, reproducible en el rango especificado y apto para el propósito indicado¹². Los parámetros analíticos mediante el cual se expresan las características de desempeño analítico son: linealidad, exactitud, precisión, selectividad y robustez¹³.

Además, el uso de filtros en los ensayos de disolución evita que las partículas no disueltas del medicamento ingresen a la muestra de análisis y ocasionen

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interferencias significativas en los resultados. De igual manera, se debe asegurar la estabilidad de la solución muestra hasta el momento de su análisis para evitar posibles interferencias en las lecturas. Por lo tanto, es necesario la evaluación de la interferencia de filtro y estabilidad de la solución muestra en estos ensayos¹⁴.

Por otro lado, la tuberculosis es una enfermedad infecciosa bacteriana, curable y prevenible, causada por el bacilo Mycobacterium tuberculosis. Con frecuencia la infección ocurre debido a la inhalación de aerosoles que contienen el patógeno, expulsadas por el paciente con tuberculosis activa al toser, hablar o estornudar. Esta enfermedad afecta comúnmente a los pulmones (tuberculosis pulmonar) sin embargo puede afectar otros sitios (tuberculosis extrapulmonar)^15,16.

El tratamiento de primera línea para la tuberculosis activa es de larga duración (mínimo 6 meses) y consiste en la administración de isoniazida, rifampicina, pirazinamida y etambutol durante los 2 primeros meses, seguidos de isoniazida y rifampicina durante los siguientes 4 a 7 meses. Debido a que la isoniazida satisface una de las necesidades sanitarias más importantes de la población, este medicamento se encuentra en el Petitorio Nacional Único de Medicamentos Esenciales del Perú^17,18,19.

Además, la isoniazida presenta una buena absorción por vía oral a través de la mucosa gastrointestinal, su biodisponibilidad es de 100 % aproximadamente para la dosis de 300 mg y alcanza su pico sérico en 1 - 2 h. Se distribuye en todos los líquidos y células corporales incluyendo el líquido cefalorraquídeo, pasa a la leche materna en un 20 % y posee un volumen de distribución de 35,2 L. Es metabolizada casi en su totalidad por el hígado y se elimina aproximadamente un 80 % por excreción urinaria y menos del 10 % por medio de las heces^20,21,22.

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Asimismo, la isoniazida es un polvo cristalino blanco, estable a temperatura ambiente, que no ha demostrado polimorfismo. Posee un punto de fusión de 171,4

°C, un pKa de 1,8 a 20 °C y LogP de -0,64. A 37 °C, este medicamento presenta una solubilidad de 196 mg/mL en agua, 211 mg/mL a pH 1,2 y 188 mg/mL a pH 6,8^23,24,25.

Las características fisicoquímicas de la isoniazida mencionadas, permiten clasificarla como un medicamento de clase III según el SCB de la OMS, debido a que posee una alta solubilidad y baja permeabilidad de la membrana; pero diferentes estudios hacen referencia que este medicamento se encuentra en clase I/III, dado que sus datos reflejan una alta solubilidad, pero una permeabilidad no claramente definida^26,27.

En el contexto de la calidad de medicamentos, se debe indicar que la Ley de Control y Prevención de la Tuberculosis en el Perú (Ley N° 30287), declara que el tratamiento de esta enfermedad es una política de Estado; por tal razón, el Ministerio de Salud ha implementado diversos programas gratuitos para la prevención y control de la tuberculosis, dada la prohibición de la venta libre de medicamentos antituberculosos en nuestro país. Considerando que los medicamentos usados en estos programas son genéricos, es necesario demostrar que las tabletas de isoniazida 100 mg son equivalentes con el medicamento de referencia por medio de ensayos de disolución in vitro, garantizando la calidad del medicamento, evitando el fracaso terapéutico y/o

el desarrollo de resistencia bacteriana a isoniazida^3,28,29.

Es por ello que el presente informe busca realizar la validación de un método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg, según lo establecido por la OMS³⁰.

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II. PROBLEMA

¿Cumple el método espectrofotométrico UV/Vis con los parámetros de validación para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg?

III. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

• Validar el método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg.

3.2. Objetivos Específicos

• Determinar los parámetros de validación: linealidad, exactitud, precisión, selectividad, interferencia de filtro, robustez y estabilidad del método espectrofotométrico UV/Vis para perfiles de disolución de tabletas de isoniazida 100 mg, a pH 1,2.

• Evaluar si los parámetros de validación del método espectrofotométrico UV/Vis, para pH 1,2; 4,5 y 6,8; cumplen con las especificaciones establecidas en las guías oficiales.

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IV. MATERIAL Y MÉTODO 4.1. Material

4.1.1. Muestras

• 100 tabletas de isoniazida 100 mg (medicamento multifuente).

• Estándar secundario de isoniazida – SIGMA ALDRICH.

4.1.2. Material de vidrio

• Vasos de 50, 100, 250 y 500 mL.

• Matraces aforados de 10, 25, 100, 250 y 1000 mL.

• Matraz Erlenmeyer de 125, 250 y 500 mL.

• Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10 mL.

• Probetas de 1000 mL.

4.1.3. Equipos e instrumentos

• Balanza analítica - AND, AH-250AZ.

• Espectrofotómetro UV/Visible - PERKIN ELMER, LAMBDA 25.

• Espectrofotómetro UV/Visible – ORION, AQUAMATE 8000.

• Ultrasonido - BRANSON, 3510.

• Agitador Magnético - IKA, CMAG - HS10.

• Destilador de agua - BOECO, WS 8000.

• Potenciómetro - HANNA, HI 8424.

• Campana extractora - ESCO, FRONTIER.DUO.

• Micropipetas de 20 - 200 µL, 100 - 1000 μL y 500 - 5000 μL - BRAND.

• Papel filtro N° 41 – WHATMAN.

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4.1.4. Reactivos

• Ácido clorhídrico 37 % grado ACS (del inglés, American Chemical Society) – J.T. BAKER.

• Ácido acético glacial 99,7 % grado ACS – J.T. BAKER.

• Acetato de sodio trihidratado 99,65 % grado ACS – J.T. BAKER.

• Fosfato potásico monobásico 99,63 % grado ACS – J.T. BAKER.

• Hidróxido de sodio grado ACS – MERCK.

• Cloruro de Potasio grado ACS – J.T. BAKER.

4.2. Método

4.2.1. Selección del método

La validación del método analítico se realizó tomando en consideración lo descrito en la Farmacopea de Estados Unidos 42 (USP 42)^13,31,32, la Conferencia Internacional de Armonización (de las siglas en inglés, ICH)³³ y la Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI)³⁴.

4.2.2. Obtención de la muestra

Se adquirieron 100 tabletas de isoniazida de 100 mg (medicamento multifuente), pertenecientes a un mismo lote de fabricación y que no hayan cumplido su fecha de expiración, donadas por el Gobierno Regional de La Libertad.

4.2.3. Preparación de los medios de disolución

4.2.3.1. Solución amortiguadora de ácido clorhídrico pH 1,2

Se colocó 250 mL de la solución de cloruro de potasio 0,2 M en un matraz volumétrico de 1000 mL; luego se agregó 425 mL de la solución de ácido clorhídrico 0,2 M; después se añadió agua destilada a volumen y se procedió a mezclar la solución utilizando un agitador magnético a 37 °C.

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4.2.3.2. Solución amortiguadora de acetato pH 4,5

Se colocó 2,99 g de acetato de sodio trihidratado en un matraz volumétrico de 1000 mL; luego se agregó 14 mL de la solución de ácido acético 2 N; después se añadió agua destilada a volumen y se procedió a mezclar la solución utilizando un agitador magnético a 37 °C.

4.2.3.3. Solución amortiguadora de fosfato pH 6,8

Se colocó 250 mL de la solución de fosfato monobásico de potasio 0,2 M en un matraz volumétrico de 1000 mL; luego se agregó 112 mL de la solución de hidróxido de sodio 0,2 M; después se añadió agua destilada a volumen y se procedió a mezclar la solución utilizando un agitador magnético a 37 °C.

El ajuste del pH de las soluciones amortiguadoras se realizó utilizando un potenciómetro.

4.2.4. Preparación de la solución stock de estándar secundario de isoniazida Se colocó aproximadamente 50 mg de estándar secundario de isoniazida en un matraz volumétrico de 50 mL, luego se procedió a disolver con agua destilada, utilizando un sonicador y se aforó al volumen correspondiente.

4.2.5. Preparación de la solución stock de tabletas de isoniazida

Se colocó una cantidad de polvo de tableta equivalente a 50 mg de isoniazida en un matraz volumétrico de 50 mL, luego se procedió a disolver con agua destilada, utilizando un sonicador y se aforó al volumen correspondiente.

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4.2.6. Validación del método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida

Se evaluó los siguientes parámetros de validación en tres diferentes medios de disolución (pH 1,2; 4,5 y 6,8).

4.2.6.1. Linealidad

Se trabajaron seis niveles de concentración, los cuales abarcaron desde una concentración inferior a la más baja concentración esperada hasta una concentración mayor de la concentración más alta esperada.

Se realizó el análisis por triplicado para cada nivel de concentración.

• Procedimiento analítico

➢ Linealidad del sistema

A partir de la solución stock de estándar secundario de isoniazida, se realizó diluciones para alcanzar el 20, 40, 60, 80, 100 y 120 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 0,2222; 0,4444; 0,6667;

0,8889; 1,1111 y 1,3333 mL de la solución stock y se diluyó en fiolas de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo concentraciones de 0,0222; 0,0444; 0,0667; 0,0889; 0,1111 y 0,1333 mg/mL respectivamente. Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a una longitud de onda de 263 nm, según lo establecido en la USP 42.

➢ Linealidad del método

A partir de la solución stock de tabletas de isoniazida, se realizó diluciones para alcanzar el 20, 40, 60, 80, 100 y 120 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 0,2222; 0,4444; 0,6667;

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0,8889; 1,1111 y 1,3333 mL de la solución stock y se diluyó en fiolas de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo concentraciones de 0,0222; 0,0444; 0,0667; 0,0889; 0,1111 y 0,1333 mg/mL respectivamente. Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a una longitud de onda de 263 nm, según lo establecido en la USP 42.

• Análisis de datos

Se evaluó estadísticamente considerando los parámetros: coeficiente de correlación (r > 0,999), coeficiente de determinación (r² > 0,99), coeficiente de variación porcentual del factor respuesta (CV < 2 %), prueba de linealidad de la pendiente (texp > ttabla), prueba de proporcionalidad del intercepto (texp < ttabla) y test de Cochran (Gexp <

Gtabla).

4.2.6.2. Exactitud

Se trabajó tres niveles de concentración (inferior, medio y superior).

Se realizó el análisis por triplicado para cada nivel de concentración.

A partir de la solución stock de tabletas de isoniazida, se realizó diluciones para alcanzar el 60, 80 y 120 % de la concentración prueba para lo cual se midió 0,6667; 0,8889 y 1,3333 mL de la solución stock y se diluyó en fiolas de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo concentraciones de 0,0667; 0,0889 y 0,1333 mg/mL respectivamente.

Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de

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medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a una longitud de onda de 263 nm, según lo establecido en la USP 42.

Se evaluó estadísticamente considerando los parámetros: promedio de los porcentajes de recuperación (95 % – 105 %), coeficiente de variación porcentual (CV < 2 %) y error relativo (Er % < 5 %).

4.2.6.3. Precisión

➢ Repetibilidad

El procedimiento analítico se realizó en un mismo laboratorio, durante un período corto de tiempo, por el mismo analista y con el mismo equipo.

A partir de la solución stock de tabletas de isoniazida, se prepararon seis soluciones al 100 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 1,1111 mL de la solución stock y se diluyó en una fiola de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo una concentración de 0,1111 mg/mL. Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a una longitud de onda de 263 nm, según lo establecido en la USP 42.

Se evaluó estadísticamente a través del cálculo del coeficiente de variación porcentual (CV < 2 %).

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➢ Precisión intermedia

Se determinó la variación en un mismo laboratorio, pero con dos diferentes analistas, en dos diferentes días y con dos equipos diferentes.

Se realizó el análisis por triplicado.

A partir de la solución stock de tabletas de isoniazida, se realizó diluciones para alcanzar el 100 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 1,1111 mL de la solución stock y se diluyó en una fiola de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo una concentración de 0,1111 mg/mL. Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a una longitud de onda de 263 nm, según lo establecido en la USP 42.

4.2.6.4. Selectividad

Se analizó la posible interferencia de los componentes de la formulación de las tabletas, utilizando concentraciones conocidas de estándar secundario de isoniazida añadidas a las muestras de polvo de tabletas. Se realizó el análisis por triplicado.

❖ Preparación de la solución muestra

Se colocó una cantidad de polvo de tableta equivalente a 45 mg de isoniazida y 5 mg de estándar secundario de isoniazida en un matraz

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volumétrico de 50 mL, luego se procedió a disolver con agua destilada, utilizando un sonicador y se aforó al volumen correspondiente.

❖ Preparación de las soluciones de lectura

A partir de la solución muestra, se realizó diluciones para alcanzar el 100 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 1,1111 mL de la solución muestra y se diluyó en una fiola de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo una concentración de 0,1111 mg/mL. Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a una longitud de onda de 263 nm según lo establecido en la USP 42.

Se evaluó estadísticamente a través del cálculo del porcentaje de interferencia (< 2 %).

4.2.6.5. Interferencia de filtro

Se evaluó el grado de retención del filtro. Se realizó el análisis por triplicado.

A partir de la solución stock de tabletas de isoniazida, se extrajo dos volúmenes de 10 mL, el primer volumen extraído fue usado como solución patrón y el segundo volumen se filtró utilizando el papel filtro Whatman N° 41. Posteriormente se realizaron diluciones para obtener el 100 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 1,1111 mL de la solución stock y se diluyó en una fiola de 10 mL con el medio de

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disolución, obteniendo una concentración de 0,1111 mg/mL. Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a una longitud de onda de 263 nm, según lo establecido en la USP 42.

4.2.6.6. Robustez

Se analizó las soluciones bajo distintas condiciones de trabajo. Se realizó el análisis por triplicado.

A partir de la solución stock de tabletas de isoniazida, se realizó diluciones para alcanzar el 100 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 1,1111 mL de la solución stock y se diluyó en una fiola de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo una concentración de 0,1111 mg/mL. Luego, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a diferentes longitudes de onda (± 2 nm).

4.2.6.7. Estabilidad de la solución muestra

El análisis se realizó a temperatura ambiente y por triplicado.

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A partir de la solución stock de tabletas de isoniazida, se realizó diluciones para alcanzar el 100 % de la concentración prueba, para lo cual se midió 1,1111 mL de la solución stock y se diluyó en una fiola de 10 mL con el medio de disolución, obteniendo una concentración de 0,1111 mg/mL. Luego, al momento de realizar las lecturas, se extrajo 1 mL de la muestra obtenida y se disolvió en 5 mL de medio de disolución. La lectura espectrofotométrica se realizó a los tiempos cero (0 h), doce (12 h) y veinticuatro horas (24 h) a una longitud de onda de 263 nm, según lo establecido en la USP 42.

Se evaluó estadísticamente la estabilidad de la solución muestra a través del cálculo del porcentaje de concentración final (98 % - 102 %).

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V. RESULTADOS

TABLA 1. Parámetros estadísticos de la Linealidad del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida a pH 1,2

* Estadísticamente significativo.

** Tabla G de Cochran para homogeneidad de varianzas: α = 0.05; K = 6; N = 3.

Parámetros evaluados Linealidad del sistema

Linealidad del método Coeficiente de correlación (r) 0,9999 0,9999 Coeficiente de determinación (r²) 0,9998 0,9998

CV del Factor de Respuesta 1,0983 0,9754

Prueba de Linealidad de la pendiente ^*

texp 185,0984 223,2566

ttabla 2,1199 2,1199

Prueba de Proporcionalidad del

intercepto ^*

texp 1,9472 1,7199

ttabla 2,1199 2,1199

Test de Cochran^**

Gexp 0,3600 0,4729

Gtabla 0,616 0,616

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FIGURA 1. Curva de calibración de la Linealidad del sistema a pH 1,2

FIGURA 2. Curva de calibración de la Linealidad del método a pH 1,2 y = 6.3033x + 0.0057

R² = 0.9998

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 0.8000 0.9000

0.00 0.05 0.10 0.15

ABSORBANCIA

CONCENTRACIÓN mg/mL

y = 6.2333x + 0.0042 R² = 0.9998

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 0.8000 0.9000

0.00 0.05 0.10 0.15

ABSORBANCIA

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TABLA 2. Parámetros estadísticos de la Linealidad del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida a pH 4,5

texp 224,8535 216,1560

ttabla 2,1199 2,1199

intercepto ^*

texp 1,4926 1,4283

ttabla 2,1199 2,1199

Gexp 0,3998 0,4066

Gtabla 0,616 0,616

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R² = 0.9998

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 0.8000

0.00 0.05 0.10 0.15

ABSORBANCIA

y = 5.4123x + 0.0031 R² = 0.9998

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 0.8000

0.00 0.05 0.10 0.15

ABSORBANCIA

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TABLA 3. Parámetros estadísticos de la Linealidad del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida a pH 6,8

texp 217,4687 210,0051

ttabla 2,1199 2,1199

intercepto ^*

texp 0,2412 0,0532

ttabla 2,1199 2,1199

Gexp 0,3984 0,3807

Gtabla 0,616 0,616

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R² = 0.9998

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 0.8000

0.00 0.05 0.10 0.15

ABSORBANCIA

y = 5.1574x + 0.0001 R² = 0.9998

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 0.8000

0.00 0.05 0.10 0.15

ABSORBANCIA

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TABLA 4. Parámetros estadísticos de la Exactitud del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida en los tres medios de disolución

Parámetros evaluados pH 1,2 pH 4,5 pH 6,8 Promedio recuperado 98,8179 99,2327 98,7504 Coeficiente de variación < 2 % 0,8765 0,6915 0,7786

Error relativo

< 5 %

Inferior 0,1931 0,9723 0,2444

Medio 2,1843 0,0909 1,8394

Superior 1,1689 1,4205 1,6649

TABLA 5. Parámetros estadísticos de la Precisión del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida en los tres medios de disolución

Parámetros evaluados

Valor aceptable

(CV)

Valor obtenido (CV) pH 1,2 pH 4,5 pH 6,8 Repetibilidad del método < 2 % 0,0805 0,1449 0,1109 Precisión intermedia < 2 % 0,0920 0,1293 0,1138

TABLA 6. Evaluación de la Selectividad del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida en los tres medios de disolución

Valor aceptable

Valor obtenido (Porcentaje de interferencia)

pH 1,2 pH 4,5 pH 6,8

La interferencia no

debe exceder el 2 % 0,8302 0,7054 1,3156

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TABLA 7. Evaluación de la Interferencia de filtro del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida en los tres medios de disolución

TABLA 8. Parámetro estadístico de Robustez del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida en los tres medios de disolución

Valor aceptable

Valor obtenido (CV)

pH 1,2 pH 4,5 pH 6,8

CV ≤ 2 % 0,1914^* 0,2862^* 0,3146^*

* CV a tres longitudes de onda (261 nm, 263 nm y 265 nm)

TABLA 9. Evaluación de la Estabilidad del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida en los tres medios de disolución

Valor aceptable

Valor obtenido (CV)

pH 1,2 pH 4,5 pH 6,8

CV ≤ 2 % 0,3748 0,5017 0,5301

Medio de disolución Porcentaje de concentración final

pH 1,2

0 h 100

12 h 99,2542

24 h 97,8593

pH 4,5

0 h 100

12 h 98,9079

24 h 97,4684

pH 6,8

0 h 100

12 h 99,1149

24 h 97,3737

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VI. DISCUSIÓN

El artículo 6° del manual de BPM establece que todo método analítico debe ser validado. La validación asegura que los resultados obtenidos en el análisis sean cercanos a los valores reales. En el presente estudio se realizó la validación de un método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg, mediante la evaluación de los siguientes parámetros:

linealidad, exactitud, precisión, selectividad, interferencia de filtro, robustez y estabilidad^35,36.

El parámetro de linealidad se evaluó por medio del análisis de linealidad del sistema y linealidad del método. Los criterios de aceptación evaluados fueron propuestos por AEFI para este tipo de estudio. En las tablas 1, 2 y 3 se pueden observar los resultados de ambas linealidades en las concentraciones de 20, 40, 60, 80, 100 y 120 % para los tres medios de disolución. En el análisis del coeficiente de correlación se observaron resultados superiores al 0,999 y para el coeficiente de determinación resultados superiores a 0,99; comprobando una relación lineal entre la concentración y la absorbancia. En el análisis del coeficiente de variación porcentual del factor respuesta se obtuvieron resultados inferiores al 2 %, encontrándose dentro del rango establecido; evidenciando la relación entre el área del pico y la concentración del analito. En el análisis del test de linealidad de la pendiente se hallaron resultados de texp mayores a ttabla, rechazándose la hipótesis nula, es decir, la pendiente es significativamente diferente de cero; demostrando una mayor sensibilidad del método debido a que la pendiente y la sensibilidad poseen una proporcionalidad directa. En el análisis del test de proporcionalidad, el cual evalúa el sesgo del método analítico, se observaron resultados de texp menores a ttabla, demostrando que el intercepto es estadísticamente igual a cero. En el análisis del test de Cochran G se

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obtuvieron resultados de Gexp inferiores a Gtabla, por lo tanto, se comprobó la homogeneidad de las varianzas de las concentraciones^34,37.

El parámetro de exactitud se desarrolló en tres niveles de concentración (60; 80 y 120

%) para los tres medios de disolución. En la tabla 4 se observan los porcentajes de promedio recuperado de 98,8179; 99,2327 y 98,7504 % para pH 1,2, pH 4,5 y pH 6,8 respectivamente; los cuales se encontraron dentro del rango establecido (95 % - 105 %). Además, presentó un coeficiente de variación porcentual de 0,8765; 0,6915 y 0,7786 % respectivamente, los cuales son inferiores al 2 %; y resultados del error relativo inferiores al 5 %. De esta manera, se evidenció un alto grado de concordancia entre el valor medido y el valor verdadero, demostrando que el método analítico empleado es exacto. En una tesis publicada en el año 2018 referente a la equivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg, muestra resultados dentro del rango

establecido en este parámetro, por lo tanto, confirma la exactitud del método^13,29,38.

En el parámetro de precisión se analizó la repetibilidad del método y la precisión intermedia para los tres medios de disolución. En la tabla 5, se observan los coeficientes de variación porcentual para la repetibilidad del método, los cuales fueron 0,0805; 0,1449 y 0,1109 % para pH 1,2, pH 4,5 y pH 6,8 respectivamente, siendo inferiores al 2 %. De esta manera, se demostró que el método analítico proporciona resultados cercanos entre sí, confirmando su repetibilidad. Además, se observan los coeficientes de variación porcentual para la precisión intermedia, los cuales fueron 0,0920; 0,1293 y 0,1138 % para cada medio respectivamente, siendo inferiores al 2 %. Según estos resultados, se observó la capacidad del método analítico de brindar valores similares entre sí cuando se realiza por diferentes analistas, en diferentes días y con equipos diferentes^34,39.

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El parámetro de selectividad se analizó para los tres medios de disolución. En la tabla 6, se observan los porcentajes de interferencia, los cuales fueron 0,8302; 0,7054 y 1,3156 % para pH 1,2, pH 4,5 y pH 6,8 respectivamente, siendo inferiores al 2 %, tomando en consideración lo descrito en AEFI. De esta forma, se demostró que el método analítico es capaz de cuantificar de manera exacta y precisa el analito en presencia de otros componentes que podrían estar presentes en la muestra. Asimismo, los parámetros de linealidad, exactitud y precisión previamente evaluados cumplen con las especificaciones establecidas, confirmando la selectividad del método^34,40,41.

El parámetro de interferencia de filtro se analizó para los tres medios de disolución.

En la tabla 7 se observan los coeficientes de variación porcentual, los cuales fueron 0,3748; 0,5017 y 0,5301 % para pH 1,2, pH 4,5 y pH 6,8 respectivamente, siendo inferiores al 2 %. Estos resultados reafirman los estudios de interferencia de filtro realizados anteriormente, demostrando que el filtro utilizado durante el procedimiento analítico no altera el porcentaje de recuperación del analito²⁹.

El parámetro de robustez se analizó para los tres medios de disolución. En la tabla 8 se observan los coeficientes de variación porcentual, los cuales fueron 0,1914; 0,2862 y 0,3146 % para pH 1,2, pH 4,5 y pH 6,8 respectivamente, medidas a diferentes longitudes de onda (±2 nm), siendo inferiores al 2 %. De esta manera, se evidenció que el método es robusto, debido a que, al variar esta condición de trabajo, los resultados obtenidos no serán afectados de forma significativa^33,34,35.

El parámetro de estabilidad se analizó para los tres medios de disolución. En la tabla 9 se observan los porcentajes de concentraciones finales, donde se observa que la muestra analizada es estable hasta las 12 horas (98 – 102 %), tomando como base el criterio de aceptación propuesto por la USP 42. Estos valores corroboran los

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resultados obtenidos en una tesis publicada en el año 2018 acerca de la equivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg; por este motivo, es recomendable realizar la lectura del analito dentro de las primeras 12 horas^13,29.

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VII. CONCLUSIONES

• El método espectrofotométrico UV/Vis demostró ser lineal con un coeficiente de correlación > 0,999; coeficiente de determinación > 0,99 y coeficiente de variación porcentual del factor respuesta < 2 % para los tres medios de disolución.

• El método espectrofotométrico UV/Vis demostró ser exacto con un promedio recuperado dentro del rango establecido (95 % - 105 %), coeficiente de variación porcentual < 2 %; y error relativo < 5 % para los tres medios de disolución.

• El método espectrofotométrico UV/Vis demostró ser preciso y robusto con un coeficiente de variación porcentual < 2 % para los tres medios de disolución.

• El método espectrofotométrico UV/Vis demostró ser selectivo con un porcentaje de interferencia < 2 % para los tres medios de disolución.

• El uso del papel filtro Whatman N° 41 no alteró significativamente los resultados del método analítico para los tres medios de disolución.

• El método espectrofotométrico UV/Vis para estudios de bioequivalencia in vitro de tabletas de isoniazida 100 mg cumple con las especificaciones establecidas en las guías oficiales para los tres medios de disolución.

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VIII. RECOMENDACIONES

La solución muestra fue estable hasta las 12 horas en los tres medios de disolución, por ello se recomienda realizar la lectura espectrofotométrica del analito dentro de este periodo de tiempo.

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ANEXOS

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Anexo 1. Tratamiento estadístico para Linealidad del Sistema a pH 1,2 del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida

Porcentaje teórico

Concentración mg / mL

(x)

Absorbancia

(y) xy x² y² f (y/x)

20 0,0222 0,1435 0,0032 0,0005 0,0206 6,4640

20 0,0222 0,1441 0,0032 0,0005 0,0208 6,4910

20 0,0222 0,1438 0,0032 0,0005 0,0207 6,4775

40 0,0444 0,2855 0,0127 0,0020 0,0815 6,4302

40 0,0444 0,2863 0,0127 0,0020 0,0820 6,4482

40 0,0444 0,2850 0,0127 0,0020 0,0812 6,4189

60 0,0667 0,4322 0,0288 0,0044 0,1868 6,4798

60 0,0667 0,4336 0,0289 0,0044 0,1880 6,5007

60 0,0667 0,4329 0,0289 0,0044 0,1874 6,4903

80 0,0889 0,5612 0,0499 0,0079 0,3149 6,3127

80 0,0889 0,5616 0,0499 0,0079 0,3154 6,3172

80 0,0889 0,5623 0,0500 0,0079 0,3162 6,3251

100 0,1111 0,7034 0,0781 0,0123 0,4948 6,3312

100 0,1111 0,7047 0,0783 0,0123 0,4966 6,3429

100 0,1111 0,7039 0,0782 0,0123 0,4955 6,3357

120 0,1333 0,8470 0,1129 0,0178 0,7174 6,3541

120 0,1333 0,8474 0,1130 0,0178 0,7181 6,3571

120 0,1333 0,8482 0,1131 0,0178 0,7194 6,3631

SUMA

TOTAL 1,3998 8,9266 0,8576 0,1348 5,4573 115,2397

PROMEDIO 0,0778 0,4959 0,3032 6,4022

D.E. 0,0703

C.V. 1,0983

(46)

BIBLIOTECA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Anexo 2. Tratamiento estadístico para Linealidad del Método a pH 1,2 del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de isoniazida

(x)

Absorbancia

(y) xy x² y² f (y/x)

20 0,0222 0,1416 0,0031 0,0005 0,0201 6,3784

20 0,0222 0,1419 0,0032 0,0005 0,0201 6,3919

20 0,0222 0,1424 0,0032 0,0005 0,0203 6,4144

40 0,0444 0,2795 0,0124 0,0020 0,0781 6,2950

40 0,0444 0,2801 0,0124 0,0020 0,0785 6,3086

40 0,0444 0,2809 0,0125 0,0020 0,0789 6,3266

60 0,0667 0,4246 0,0283 0,0044 0,1803 6,3658

60 0,0667 0,4251 0,0284 0,0044 0,1807 6,3733

60 0,0667 0,4255 0,0284 0,0044 0,1811 6,3793

80 0,0889 0,5532 0,0492 0,0079 0,3060 6,2227

80 0,0889 0,5536 0,0492 0,0079 0,3065 6,2272

80 0,0889 0,5543 0,0493 0,0079 0,3072 6,2351

100 0,1111 0,6959 0,0773 0,0123 0,4843 6,2637

100 0,1111 0,6962 0,0773 0,0123 0,4847 6,2664

100 0,1111 0,6967 0,0774 0,0123 0,4854 6,2709

120 0,1333 0,8357 0,1114 0,0178 0,6984 6,2693

120 0,1333 0,8361 0,1115 0,0178 0,6991 6,2723

120 0,1333 0,8369 0,1116 0,0178 0,7004 6,2783

SUMA

TOTAL 1,3998 8,8002 0,8460 0,1348 5,3100 113,5394

PROMEDIO 0,0778 0,4889 0,2950 6,3077

D.E. 0,0615

C.V. 0,9754

(47)

BIBLIOTECA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

(x)

Absorbancia

(y) xy x² y² f (y/x)

20 0,0222 0,1231 0,0027 0,0005 0,0152 5,5450

20 0,0222 0,1227 0,0027 0,0005 0,0151 5,5270

20 0,0222 0,1235 0,0027 0,0005 0,0153 5,5631

40 0,0444 0,2457 0,0109 0,0020 0,0604 5,5338

40 0,0444 0,2451 0,0109 0,0020 0,0601 5,5203

40 0,0444 0,2464 0,0109 0,0020 0,0607 5,5495

60 0,0667 0,3663 0,0244 0,0044 0,1342 5,4918

60 0,0667 0,3659 0,0244 0,0044 0,1339 5,4858

60 0,0667 0,3689 0,0246 0,0044 0,1361 5,5307

80 0,0889 0,4939 0,0439 0,0079 0,2439 5,5557

80 0,0889 0,4929 0,0438 0,0079 0,2430 5,5444

80 0,0889 0,4948 0,0440 0,0079 0,2448 5,5658

100 0,1111 0,6111 0,0679 0,0123 0,3734 5,5005

100 0,1111 0,6099 0,0678 0,0123 0,3720 5,4896

100 0,1111 0,6124 0,0680 0,0123 0,3750 5,5122

120 0,1333 0,7293 0,0972 0,0178 0,5319 5,4711

120 0,1333 0,7274 0,0970 0,0178 0,5291 5,4569

120 0,1333 0,7302 0,0973 0,0178 0,5332 5,4779

SUMA

TOTAL 1,3998 7,7095 0,7413 0,1348 4,0771 99,3210

PROMEDIO 0,0778 0,4283 0,2265 5,5178

D.E. 0,0335

C.V. 0,6071

(48)

BIBLIOTECA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

(x)

Absorbancia

(y) xy x² y² f (y/x)

20 0,0222 0,1219 0,0027 0,0005 0,0149 5,4910

20 0,0222 0,1214 0,0027 0,0005 0,0147 5,4685

20 0,0222 0,1223 0,0027 0,0005 0,0150 5,5090

40 0,0444 0,2428 0,0108 0,0020 0,0590 5,4685

40 0,0444 0,2418 0,0107 0,0020 0,0585 5,4459

40 0,0444 0,2432 0,0108 0,0020 0,0591 5,4775

60 0,0667 0,3641 0,0243 0,0044 0,1326 5,4588

60 0,0667 0,3633 0,0242 0,0044 0,1320 5,4468

60 0,0667 0,3646 0,0243 0,0044 0,1329 5,4663

80 0,0889 0,4895 0,0435 0,0079 0,2396 5,5062

80 0,0889 0,4888 0,0435 0,0079 0,2389 5,4983

80 0,0889 0,4901 0,0436 0,0079 0,2402 5,5129

100 0,1111 0,6047 0,0672 0,0123 0,3657 5,4428

100 0,1111 0,6031 0,0670 0,0123 0,3637 5,4284

100 0,1111 0,6054 0,0673 0,0123 0,3665 5,4491

120 0,1333 0,7222 0,0963 0,0178 0,5216 5,4179

120 0,1333 0,7203 0,0960 0,0178 0,5188 5,4036

120 0,1333 0,7224 0,0963 0,0178 0,5219 5,4194

SUMA

TOTAL 1,3998 7,6319 0,7338 0,1348 3,9955 98,3109

PROMEDIO 0,0778 0,4240 0,2220 5,4617

D.E. 0,0331

C.V. 0,6055

(49)

BIBLIOTECA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

(x)

Absorbancia

(y) xy x² y² f (y/x)

20 0,0222 0,1158 0,0026 0,0005 0,0134 5,2162

20 0,0222 0,1163 0,0026 0,0005 0,0135 5,2387

20 0,0222 0,1167 0,0026 0,0005 0,0136 5,2568

40 0,0444 0,2306 0,0102 0,0020 0,0532 5,1937

40 0,0444 0,2314 0,0103 0,0020 0,0535 5,2117

40 0,0444 0,2326 0,0103 0,0020 0,0541 5,2387

60 0,0667 0,3518 0,0235 0,0044 0,1238 5,2744

60 0,0667 0,3524 0,0235 0,0044 0,1242 5,2834

60 0,0667 0,3529 0,0235 0,0044 0,1245 5,2909

80 0,0889 0,4608 0,0410 0,0079 0,2123 5,1834

80 0,0889 0,4615 0,0410 0,0079 0,2130 5,1912

80 0,0889 0,4632 0,0412 0,0079 0,2146 5,2103

100 0,1111 0,5833 0,0648 0,0123 0,3402 5,2502

100 0,1111 0,5851 0,0650 0,0123 0,3423 5,2664

100 0,1111 0,5849 0,0650 0,0123 0,3421 5,2646

120 0,1333 0,6952 0,0927 0,0178 0,4833 5,2153

120 0,1333 0,6959 0,0928 0,0178 0,4843 5,2206

120 0,1333 0,6965 0,0928 0,0178 0,4851 5,2251

SUMA

TOTAL 1,3998 7,3269 0,7053 0,1348 3,6911 94,2316

PROMEDIO 0,0778 0,4071 0,2051 5,2351

D.E. 0,0326

C.V. 0,6232

(50)

BIBLIOTECA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

(x)

Absorbancia

(y) xy x² y² f (y/x)

20 0,0222 0,1145 0,0025 0,0005 0,0131 5,1577

20 0,0222 0,1153 0,0026 0,0005 0,0133 5,1937

20 0,0222 0,1148 0,0025 0,0005 0,0132 5,1712

40 0,0444 0,2262 0,0100 0,0020 0,0512 5,0946

40 0,0444 0,2269 0,0101 0,0020 0,0515 5,1104

40 0,0444 0,2254 0,0100 0,0020 0,0508 5,0766

60 0,0667 0,3476 0,0232 0,0044 0,1208 5,2114

60 0,0667 0,3487 0,0233 0,0044 0,1216 5,2279

60 0,0667 0,3481 0,0232 0,0044 0,1212 5,2189

80 0,0889 0,4559 0,0405 0,0079 0,2078 5,1282

80 0,0889 0,4574 0,0407 0,0079 0,2092 5,1451

80 0,0889 0,4565 0,0406 0,0079 0,2084 5,1350

100 0,1111 0,5745 0,0638 0,0123 0,3301 5,1710

100 0,1111 0,5763 0,0640 0,0123 0,3321 5,1872

100 0,1111 0,5756 0,0639 0,0123 0,3313 5,1809

120 0,1333 0,6849 0,0913 0,0178 0,4691 5,1380

120 0,1333 0,6867 0,0915 0,0178 0,4716 5,1515

120 0,1333 0,6860 0,0914 0,0178 0,4706 5,1463

SUMA

TOTAL 1,3998 7,2213 0,6953 0,1348 3,5868 92,8456

PROMEDIO 0,0778 0,4012 0,1993 5,1581

D.E. 0,0417

C.V. 0,8078