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Enfermedades infecciosas. Enfermedades producidas por un patógeno Virus, bacterias, parásitos, hongos

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Enfermedades infecciosas

Enfermedades producidas por un patógeno

Virus, bacterias, parásitos, hongos

Las enfermedades infecciosas causan alrededor del 60% de muertes en la niñez en los países no industrializados

En los países en desarrollo y desarrollados, la emergencia de nuevas, raras o olvidadas enfermedades infecciosas (SARS, HIV, tuberculosis, sífilis) contribuye a que continuamente se vigile, controle, investigue y desarrollen nuevas metodologías de diagnóstico.

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Qué interesa determinar?

Métodos fenotípicos

Métodos genotípicos

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3

Cultivo “in vitro”: métodos bioquímicos, tinciones.

Desventajas: Limitado a la detección de determinados organismos. A veces se requiere medios especiales, largos períodos de tiempo. Propagación en cultivo de células in vitro (bacterias intracelulares obligados como por ej.: Clamidia y Micoplasmas.

Métodos de cultivo: solo para microorganismos viables

Virus: Microscopía electrónica (106virus/ml, concentración por ultracentrif.)

Propagación en cultivo, CPE. Muy sensible, hay variedad pero no para todos los virus. Para algunos falta de especificidad. Experiencia del técnico.Virus peligrosos

Líneas celulares transgénicas.

Métodos serológicos: Detección de Ag: ELISA, IFA, DFA, RIA, Citometría de flujo,

inmuno-microscopía electrónica (virus) Muchas veces la cantidad de Ag en la muestra es muy poca y la detección se debe hacer sobre cultivos o después de una propagación en cultivo de células in vitro.

Para virus: IF o Ac unido a peroxidasa, ensayos de neutralización (pre-CPE).

Co-cultivo de células y uso de mezcla de Acs con especificidad para distintos virus.

Métodos fenotípicos

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5

POCT (point-of-care test): inmuno-cromatografía de flujo lateral

Determinación de Ags.

Método rápido. Llevado a cabo en el lugar donde se encuentra el paciente. No muy sensible: situación de shock séptico, parasitemia, viremia.

Con el fin de tomar rapidamente decisiones en cuanto a posibles terapias.

+

-Línea de control Línea del test Lecho con Acs conjugados

Lugar de siembra de muestra

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7

Métodos genotípicos

Concentración de molécula blanco por captura: Micropartículas magnéticas covalentemente unidas a oligo dT, Oligonucleótido quimérico: Secuencia complementaria al blanco en el 5´ y una cola de dA en el 3´.

Amplificación

Muchas veces la cantidad de ADN en la muestra es muy poca y la detección se debe hacer sobre cultivos o después de una propagación en cultivo de células in vitro para el caso de virus o bacterias intracelulares obligadas .

Captura por Acs de partículas virales y luego extracción del ADN o ARN

Hibridación

Hibridización

Utilización de sondas moleculares No es habitual hacerlo sobre la muestra tal cual.

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Amplificación

(detección sobre muestra)

Distintos métodos: NAT: PCR, RT-PCR (caso de virus a RNA), TMA, LCR, etc.

Detección de los productos de PCR

:

Corrida en geles de agarosa, poliacrilamida. Electroforesis capilar, HPLC.

Detección con: BrEt, Sybr-green, utilizando en la reacción primers o deoxinucleótidos marcados.

Especialmente útil para bacterias difíciles de cultivar

in vitro (bacterias fastidiosas, muestras peligrosas), para virus donde el cultivo in vitro es dificultoso, no se cuenta con el antisuero específico.

También para cuando se hace la identificación después del tratamiento con un antibiótico

Ventajas:

Mayor rapidez, especificidad y sensibilidad

No necesita viabilidad

Desventajas:

Contaminación, unión inespecífica de oligo, inhibición por distintos componentes de la muestra, no distingue entre viables y no viables (la presencia indica enfermedad?), inestabilidad del RNA, pérdida de uniformidad en resultados

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9

Confirmación de especificidad

:

Nested PCR (PCR anidada)

Secuenciación

Corte con enzimas de restricción Hibridación con sonda marcada

Hibridación específica a sonda en soporte (Line probe assay (LiPA),microarray)

Combinación con otros métodos: PCR-ELISA:: dNTP marcados con digooxigenina, oligonucleótido unido a biotina, unión a multiwell que tiene unido streptavidina: oligonucleótido de captura, reacción con antiDigo-enzima.

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11 Se utilizan secuencias consenso sobre genes universales:

rRNA 16S (18S en el caso de hongos y parásitos), 23S rpoB, proteínas de heat shock, recA (primers degenerados)

PCR de amplio rango

Secuencias conservadas comunes a vs especies o géneros y luego un segundo método de identificación especie específico.

Secuencias para genes específicos de cada especie y luego otro método de confirmación

ESPECIE BACTERIANA

Ejemplo de distintas estrategias a aplicar en el caso de querer identificar la o las especies bacterianas presentes en una muestra

Por ejemplo: Separación de los productos y secuenciación. Secuencias conservadas comunes a una especie (que la diferencien de otra) y luego otro método de confirmación

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Varias especies bacterianas del tracto urinario

Identificación simultánea de 20 Patógenos distintos

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13 Si bien la amplificación del ADN/ARN

es el método más sensible: El costo, las

mayores posibilidades de contaminación, el equipamiento necesario, la no

standarización (dificil comparación), la menor practicidad para adoptarlo como ensayo rutinario en laboratorio diagnóstico (cualitativo y cuantitativo).

La inestabilidad del ARN.

Hacen que se sigan utilizando en los

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Diferenciación de variantes

Métodos de DNA fingerprinting

Importante en estudios epidemiológicos. Comparación de distintos aislamientos

Electroforesis en gel en campo pulsado (PFGE) Ribotyping

RFLP: polimorfismo de longitud de fragmento de restricción.

PCR-RFLP

RAPD: polimorfismo por amplificación con primers al azar.

REP-PCR: PCR basado en elementos repetitivos.

PCR-RFLP

Ribotyping

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15

Tipibilidad

(16)

Detección de la presencia de un determinado marcador asociado con la enfermedad (marcador

característico de determinada cepa bacteriana o tipo o subtipo viral).

Se debe realizar un análisis en una gran cantidad de individuos para determinar si el grado de asociación de la enfermedad con la presencia de determinada variante tiene significación estadística:

HPV

Helicobacter pylori

Genotipificación de HCV

Asociación clara: toxina colérica

A veces el desarrollo de la enfermedad solo se asocia a la presencia de una determinada variante del patógeno (determinada cepa o determinado tipo o subtipo de virus).

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17

NAT con

primers específicos

para detectar un determinado marcador asociado con la

enfermedad.

Se debe realizar un análisis en una gran cantidad de individuos para determinar si el grado de asociación de la enfermedad con la presencia de determinada variante tiene significación estadística:

HPV (Hibridación DNA-RNA con Acs anti híbridos; Heminested PCR; SSCP)

Helicobacter pylori(3 PCR paralelas: primers sobre rRNA 16S, primers sobre región conservada de cagA, primers sobre región variable de cagA)

genotipificación de HCV (2 PCR consecutivas (nested PCR)) Se debe contar con un test altamente específico, sensible y seguro.

Asociación clara: toxina colérica (heminested PCR)

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El HPV (virus del papiloma genital humano) es transmitido sexualmente. Se determinó que es un factor que contribuye a la constitución de varios canceres ano-genitales. El grupo HPV contiene 100 tipos distintos. Varios de estos infectan la mucosa genital y anal. Haciendo un estudio y tipificación de los HPVs en tejidos normales y cancerosos se determinó que los tipos 6 y 11 se asocian comúnmente a lesiones ano-genitales benignas mientras que los tipos 16 y 18, se hallan en la mayoría de los carcinomas. Hay otros tipos que son de mediana asociación.

El HPV no se propaga in vitro y no hay Acs anti HPV que identifiquen los distintos tipos entonces para su detección se utilizan métodos genotípicos.

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19

Hibridación Captura Amplificación de

la señal

Test de HPV (Digene)

Se basa en la técnica de ¨captura híbrida¨ que combina la detección de ác. nucleicos por hibridación de con una sonda de RNA y la amplificación de la señal mediante la Utilización de anticuerpos, enzima y sustrato quimioluminiscente.

T.P

Nested PCR SSCP

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NAT con

primers específicos

para detectar un determinado marcador asociado con la

enfermedad.

Se debe realizar un análisis en una gran cantidad de individuos para determinar si el grado de asociación de la enfermedad con la presencia de determinada variante tiene significación estadística:

HPV (Hibridación DNA-RNA con Acs anti híbridos; Heminested PCR; SSCP)

Helicobacter pylori(3 PCR paralelas: primers sobre rRNA 16S, primers sobre región conservada de cagA, primers sobre región variable de cagA)

genotipificación de HCV (2 PCR consecutivas (nested PCR)) Se debe contar con un test altamente sensible y seguro.

Asociación clara: toxina colérica (heminested PCR)

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Resistencia a drogas anti microbianas y antivirales

Métodos fenotípicos: testeo de susceptibilidad mediante difusión en disco.

Métodos genotípicos:

Los mecanismos de reistencia a drogas pueden involucrar:

Reflujo de la droga, enzimas modificadoras de la droga, mutación en blanco.

Ej. Detección de gen de resistencia: Staphylococcus aureus- resistencia a oxacillina mediada por el gen mecA Detección de mutación: resistencia a macrólidos en Helicobacter pylori.

Virus: Emergencia de virus resistentes a drogas durante la terapia (mutaciones en los genes que codifican para proteínas virales que son blanco de las drogas).

Los métodos más usados son PCR y secuenciación o distintas variantes de PCR ó PCR-RFLP ó

hibridación reversa con sondas de oligonucleótidos específicos (específicos para cada mutación conocida) inmovilizados a líneas paralelas.

Se amplifica la muestra a analizar con oligonucleótidos cebadores biotinilados.

Hibridación reversa ( line probe) INNO-LIPA

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Diagnóstico por presencia de anticuerpos.

Ensayos serológicos: ELISA, RIA, IFA, Citometría de flujo, etc.

Interesa determinar:

* Detectar posible infección por patógeno e identificar de que patógeno se trata.

Casos en que no se puede detectar el patógeno (muy poco antígeno, inaccesible, inestabilidad del RNA, estar una etapa en que ya declinó el patógeno, pacientes tratados).

* Porcentaje de individuos infectados en una población

* Determinación del estado de inmunización del individuo--- Diferenciación entre estado inmune debido a vacunación y aquel debido a infección

* Especificidad, clase, subclase y avidez de Acs. Estudio de la variación durante la progresión de la enfermedad. Detección de asociación con una determinada sintomatología o con una determinada progresión de la enfermedad.

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23

No es lo apropiado en neonatos

individuos inmunosuprimidos

En período temprano post-infección

Test de distinta generación

Mejoramiento de la detección de anticuerpos (sensibilidad, especificidad, acortamiento de la ventana de diagnóstico, el lapso de tiempo entre inicio de la infección y detección de que el individuo fue infectado)

mediante:

La incorporación de varios antígenos al ensayo Combinación de métodos de detección de Acs y Ags

Si es posible es conveniente realizar conjuntamente algún tipo de ensayo que detecte el Ag.

Ensayos en el lugar en que se encuentra el paciente, simple, poco equipamiento, sin necesidad de personal capacitado, bajo costo.

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0

10

20

30

40

50

60

70

80

16

22

11

HIV RNA (plasma)

HIV antibody

HIV p24 Ag

Days

Theoritical Identify

Day 0

HIV RNA

Day 11

HIV p24 Ag

Day 16

HIV Antibody

Day 22

5 Days

6 Days

11 Days

HIV Marker During Early Infection

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25

Third

Third

-

-

generation

generation

ELISA

ELISA

for

for

Ab detection

Ab detection

P

P

rHIV Ags /

peptides

Enzyme conjugated

rHIV Ags / peptides

IgG

IgG

Anti

Anti

-

-HIV

HIV

P

P

IgM

IgM

Anti

Anti

-

-HIV

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Fourth generation

Fourth generation

ELISA

ELISA

for detecting Abs and HIV Ag simultaneously

(VIDAS HIV DUO)

B

B

Anti-P24

rHIV Ags /

peptides

Biotine-conjugated

Anti-P24

P24 Ag

P24 Ag

Enzyme conjugated

rHIV Ags / peptides

Anti-HIV

P

P

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27

Disease Serological marker Interpretation

Hepatitis B HBsAg “Surface” antigen Early acute infection. Needs confirmation for specificity. Persistence beyond six months denotes chronicity *HBeAg “Envelope” antigen Indicates HBV replication and high infectivity

*Anti HBs “Surface antibody Past infection with immunity to HBV, or passive immunity from immunoglobulin or vaccine

*Anti HBe “Envelope antibody” Liver cell regeneration and a good prognosis. Presence in a carrier state indicates low titres of HBV

Anti HBc IgM Recent infection. Positive for 4-6 months post infection

*Anti HBc Total Exposure to HBV at some undefined time

Marcadores y que significan

Especificidad, clase, subclase y avidez

Clase de Ac en infección con Helicobacter. Presencia de IgM determina infección reciente y sirve para

detectar tempranamente una infección cuando aún no se manifiestan los síntomas específicos de la enfermedad

Especificidad y clase de Ac Hepatitis B

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Diferenciación entre individuos vacunados y naturalmente infectados

Especificidad de los anticuerpos: a la cepa vacunal puede faltarle algún antígeno que esté presente en cepas que normalmente infectan (Bacillus bovis y Bacillus tuberculosis), utilización en la vacunación de un antígeno recombinante que presente un marcador que no presenta en antígeno natural.

Subclase de IgG:

Virus del Sarampión. Título de IgG4> 30 infección natural, <30 vacunado

Avidez de los anticuerpos: Se incrementa a lo largo del período post infección

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29

Cuando se habla de diagnosticar una enfermedad causada

por un patógeno se cuenta con una amplia variedad de

técnicas. Optar por una u otra depende de varios factores:

Las características propias de la enfermedad

Las herramientas con las que se cuenta

Con que análisis se obtiene el menor número de falsos positivos o falsos

negativos

De la rapidez con que se debe hacer la determinación

(30)

Un ensayo diagnóstico debe ser validado.

Un ensayo diagnóstico validado provee resultados de análisis que identifican individuos como positivos o negativos para un analito (Ac, Ag, templado de ADN o ARN) y por inferencia predice el estado infeccioso del mismo con un predeterminado grado de certeza estadística

El método elegido (condiciones físicas, concentración de reactivos, dilución de suero) debe distinguir variaciones en la concentración del analito en un amplio rango, con un mínimo de background. Debe ser sensible y específico.

VALIDACION

Hay que contar con controles positivos y negativos conocidos y determinados por otro método (Gold Std o ensayo de gran certeza)

Hay que normalizar los valores obtenidos con las muestras incógnita en base a

los valores obtenidos con los controles. También se requieren para la cuantificación. Por ejemplo en un ELISA, por interpolación en una curva Std obtenida a partir de los valores resultantes de los Stds de título conocido que se ensayan en la misma placa se puede calcular el título de Acs de la

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31

Parametros a determinar que permiten conocer la validez estadística del ensayo:

Repetibilidad

Precisión del ensayo

CV= (Ds/Promedio) x100

Sensibilidad y especificidad analítica:

A-SN

: está dada por la menor cantidad detectable de Ag o Ac. Se determina por

un análisis de dilución final.

A-SP

: depende del grado en el cual el ensayo da reacción cruzada con otros

Ags o Acs

Reproducibilidad

intraplaca

interplaca

en distintos laboratorios

en distintas fechas

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Sensibilidad y especificidad diagnóstica (clínica):

D-SN: % de muestras positivas verdaderas en el ensayo que se esta validando respecto a

todas las que son positivas según el ensayo de gran certeza con el que se compara.

Positivos verdaderos

SN= --- x 100

positivos verd.+ negativos fals.

positivos totales

D-SP: % de muestras negativas verdaderas en el ensayo respecto a las que son

negativas en el otro ensayo. Aquellas que dan positivo son falsos positivos

.

Para determinar D-SN y D-SP hay que reducir los resultados de un test a la categoría de (+) y (-).

Para esto hay que fijar un punto de corte o cut-off

Frecuencia _ +

Absorbancia

Baja la sensibilidad

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33

Predictibilidad: Da una idea de cual es la seguridad de que un resultado positivo

según el ensayo validado sea realmente positivo (Idem para los

negativos). Este valor depende de la prevalencia de la enfermedad

en la población.

positivos verdaderos

Valor predictivo positivo= ________________________ x100 VPP= 309 x 100= 96% 321 positivos (verdad.+falsos) VPN= 106 x 100= 78% 136 D-SN= 309 x 100 339 D-SP= 106 x 100 118 FN=30 x 100 339 FP=12 x 100 118

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Enfermedad producida por un patógeno

Qué interesa determinar?

Detectar e identificar al patógeno

Diferenciación de variantes

Tipificación y detección de una determinada variante

Testeo de susceptibilidad a drogas anti microbianas

Detección en suero de anticuerpos anti patógeno

Validación de test diagnóstico

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35

Determinación de carga viral para seguir la eficiencia de una terapia

PCR cuantitativa competitiva

: Para amplificar templado y Std se usan los mismos

oligos. La secuencia del Std se diferencia del templado en la presencia o no de un sitio de

restricción, en la longitud o hasta en un solo nucleótido. Se trabaja con una concentración de

Std en un rango de concentración similar al de la muestra incógnita.

A partir de la relación de intensidades y la cantidad inicial de Std, se puede determinar la

cantidad inicial de target. También se puede hacer mezclando en cada tubo, la muestra incógnita

con una dilución seriada del Std. Cuando la cantidad de producto obtenido a partir del templado

incógnita y a partir del Std es igual, entonces es que se partió de la misma cantidad inicial de

moléculas.

PCR ó RT-PCR cuantitativa

Trabajar en rango de [ADN] de manera de terminar después de n ciclos en fase exponencial.

Cuantificación del patógeno

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PCR Mimics.

El ADN Std se obtiene haciendo dos PCR sucesivas sobre ADN heterólogo

PCR-TGGE (

electroforesis en gradiente de temperatura)

Std idéntico a target salvo por un nucleótido

(37)

37 Detección de estado de viremia

Falso negativo: PCR inhibida Nuevas variantes

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PCR en tiempo real:

Cuantificación del producto amplificado a medida que se va formando.

Se cuantifica una señal de fluorescencia.

Se aplica para cuantificaciones rápidas de ADN o ARN, detección de variantes

genéticas, mutaciones y polimorfismos.

Sonda de

Hidrólisis o 5´nucleasa

(TaqMan)

Medida de carga viral para monitorear la respuesta a la terapia con drogas (virus a ADN o ARN).

Cuantificación de ARN mensajero Mayor rapidez y especificidad

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39 Sonda ¨hairpin¨ Molecular Beacons

Sonda de

Hibridación

Transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET)

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Sonda Escorpión

SYBR Green: marcación inespecífica.

Si se utilizan estas sondas/primers (hidrólisis, hairpin, hibridación, escorpión) fluorescentes no

se requiere un análisis post amplificación

(41)

41

El Std es corrido en tubos separados al

de la muestra incógnita.

Determinación de Tm

PCR en tiempo real se aplica a detección, tipificación, determinación de resistencia y

cuantificación

Cuantificación

Sybr green

Sonda molecular beacon Sonda FRET

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(44)
(45)

45 threshold

(46)

PCR en tiempo real se aplica a detección, tipificación, cuantificación y determinación de

aparición de cepas resistentes.

Detección, diferenciación y cuantificación de distintos grupos de Leishmania

Diferenciación entre infección por Micobacterium o por Brucella con Multiplex Real time PCR (primers Específicos). Validación

Sondas de hibridación: 2 pares, uno para cada región amplificada.

Una sonda de cada par marcada con Fluoresceína. La otra con marcador Fluorescente que emite a 640 nm para Microbacterium y a 705 para Brucella.

Determinación de Tm:

1 2

3 (+)

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47

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(49)

49 infA (todos los Influenza A) SH1 (todos los H1) NH1 (específico Para 2009 H1N1)

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Genotipo de resistencia: aparición de variantes resistentes al tratamiento

La infección por el virus de la Hepatitis B (HBV) afecta cronicamente al 5% de la población mundial. Su progresión puede llevar a la formación de un hepatocarcinoma.

La lamivudina (un análogo de nucleósido) inhibe la replicación de HBV por inhibir la síntesis de ADN por terminación de cadena.

Después de un tiempo de tratamiento con lamivudina en algunos pacientes empiezan a aparecer variantes de HBV con mutaciones en el gen de la Polimerasa que las hace resistentes al efecto de la droga.

Las mutaciones ocurren en un motivo conservado.

Extracción de ADN de suero PCR para amplificar

clonado en vector PCR en tiempo real con probe fluorescente Calentamiento,

Enfríamiento y aumento lento de la temperatura Determinación de la Tm

También: Hibidización reversa PCR y secuenciación PCR competitiva y DGGE

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Enfermedad producida por un patógeno

Qué interesa determinar?

Detectar e identificar al patógeno

Diferenciación de variantes

Tipificación y detección de una determinada variante

Testeo de susceptibilidad a drogas anti microbianas o antivirales

Detección en suero de anticuerpos anti patógeno

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