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Enfermedades infecciosas
Enfermedades producidas por un patógeno
Virus, bacterias, parásitos, hongos
Las enfermedades infecciosas causan alrededor del 60% de muertes en la niñez en los países no industrializados
En los países en desarrollo y desarrollados, la emergencia de nuevas, raras o olvidadas enfermedades infecciosas (SARS, HIV, tuberculosis, sífilis) contribuye a que continuamente se vigile, controle, investigue y desarrollen nuevas metodologías de diagnóstico.
Qué interesa determinar?
Métodos fenotípicos
Métodos genotípicos
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Cultivo “in vitro”: métodos bioquímicos, tinciones.
Desventajas: Limitado a la detección de determinados organismos. A veces se requiere medios especiales, largos períodos de tiempo. Propagación en cultivo de células in vitro (bacterias intracelulares obligados como por ej.: Clamidia y Micoplasmas.
Métodos de cultivo: solo para microorganismos viables
Virus: Microscopía electrónica (106virus/ml, concentración por ultracentrif.)
Propagación en cultivo, CPE. Muy sensible, hay variedad pero no para todos los virus. Para algunos falta de especificidad. Experiencia del técnico.Virus peligrosos
Líneas celulares transgénicas.
Métodos serológicos: Detección de Ag: ELISA, IFA, DFA, RIA, Citometría de flujo,
inmuno-microscopía electrónica (virus) Muchas veces la cantidad de Ag en la muestra es muy poca y la detección se debe hacer sobre cultivos o después de una propagación en cultivo de células in vitro.
Para virus: IF o Ac unido a peroxidasa, ensayos de neutralización (pre-CPE).
Co-cultivo de células y uso de mezcla de Acs con especificidad para distintos virus.
Métodos fenotípicos
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POCT (point-of-care test): inmuno-cromatografía de flujo lateral
Determinación de Ags.
Método rápido. Llevado a cabo en el lugar donde se encuentra el paciente. No muy sensible: situación de shock séptico, parasitemia, viremia.
Con el fin de tomar rapidamente decisiones en cuanto a posibles terapias.
+
-Línea de control Línea del test Lecho con Acs conjugados
Lugar de siembra de muestra
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Métodos genotípicos
Concentración de molécula blanco por captura: Micropartículas magnéticas covalentemente unidas a oligo dT, Oligonucleótido quimérico: Secuencia complementaria al blanco en el 5´ y una cola de dA en el 3´.
Amplificación
Muchas veces la cantidad de ADN en la muestra es muy poca y la detección se debe hacer sobre cultivos o después de una propagación en cultivo de células in vitro para el caso de virus o bacterias intracelulares obligadas .
Captura por Acs de partículas virales y luego extracción del ADN o ARN
Hibridación
Hibridización
Utilización de sondas moleculares No es habitual hacerlo sobre la muestra tal cual.
Amplificación
(detección sobre muestra)Distintos métodos: NAT: PCR, RT-PCR (caso de virus a RNA), TMA, LCR, etc.
Detección de los productos de PCR
:Corrida en geles de agarosa, poliacrilamida. Electroforesis capilar, HPLC.
Detección con: BrEt, Sybr-green, utilizando en la reacción primers o deoxinucleótidos marcados.
Especialmente útil para bacterias difíciles de cultivar
in vitro (bacterias fastidiosas, muestras peligrosas), para virus donde el cultivo in vitro es dificultoso, no se cuenta con el antisuero específico.
También para cuando se hace la identificación después del tratamiento con un antibiótico
Ventajas:
Mayor rapidez, especificidad y sensibilidadNo necesita viabilidad
Desventajas:
Contaminación, unión inespecífica de oligo, inhibición por distintos componentes de la muestra, no distingue entre viables y no viables (la presencia indica enfermedad?), inestabilidad del RNA, pérdida de uniformidad en resultados9
Confirmación de especificidad
:
Nested PCR (PCR anidada)Secuenciación
Corte con enzimas de restricción Hibridación con sonda marcada
Hibridación específica a sonda en soporte (Line probe assay (LiPA),microarray)
Combinación con otros métodos: PCR-ELISA:: dNTP marcados con digooxigenina, oligonucleótido unido a biotina, unión a multiwell que tiene unido streptavidina: oligonucleótido de captura, reacción con antiDigo-enzima.
11 Se utilizan secuencias consenso sobre genes universales:
rRNA 16S (18S en el caso de hongos y parásitos), 23S rpoB, proteínas de heat shock, recA (primers degenerados)
PCR de amplio rango
Secuencias conservadas comunes a vs especies o géneros y luego un segundo método de identificación especie específico.
Secuencias para genes específicos de cada especie y luego otro método de confirmación
ESPECIE BACTERIANA
Ejemplo de distintas estrategias a aplicar en el caso de querer identificar la o las especies bacterianas presentes en una muestra
Por ejemplo: Separación de los productos y secuenciación. Secuencias conservadas comunes a una especie (que la diferencien de otra) y luego otro método de confirmación
Varias especies bacterianas del tracto urinario
Identificación simultánea de 20 Patógenos distintos
13 Si bien la amplificación del ADN/ARN
es el método más sensible: El costo, las
mayores posibilidades de contaminación, el equipamiento necesario, la no
standarización (dificil comparación), la menor practicidad para adoptarlo como ensayo rutinario en laboratorio diagnóstico (cualitativo y cuantitativo).
La inestabilidad del ARN.
Hacen que se sigan utilizando en los
Diferenciación de variantes
Métodos de DNA fingerprinting
Importante en estudios epidemiológicos. Comparación de distintos aislamientos
Electroforesis en gel en campo pulsado (PFGE) Ribotyping
RFLP: polimorfismo de longitud de fragmento de restricción.
PCR-RFLP
RAPD: polimorfismo por amplificación con primers al azar.
REP-PCR: PCR basado en elementos repetitivos.
PCR-RFLP
Ribotyping
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Tipibilidad
Detección de la presencia de un determinado marcador asociado con la enfermedad (marcador
característico de determinada cepa bacteriana o tipo o subtipo viral).
Se debe realizar un análisis en una gran cantidad de individuos para determinar si el grado de asociación de la enfermedad con la presencia de determinada variante tiene significación estadística:
HPV
Helicobacter pylori
Genotipificación de HCV
Asociación clara: toxina colérica
A veces el desarrollo de la enfermedad solo se asocia a la presencia de una determinada variante del patógeno (determinada cepa o determinado tipo o subtipo de virus).
17
NAT con
primers específicos
para detectar un determinado marcador asociado con la
enfermedad.
Se debe realizar un análisis en una gran cantidad de individuos para determinar si el grado de asociación de la enfermedad con la presencia de determinada variante tiene significación estadística:
HPV (Hibridación DNA-RNA con Acs anti híbridos; Heminested PCR; SSCP)
Helicobacter pylori(3 PCR paralelas: primers sobre rRNA 16S, primers sobre región conservada de cagA, primers sobre región variable de cagA)
genotipificación de HCV (2 PCR consecutivas (nested PCR)) Se debe contar con un test altamente específico, sensible y seguro.
Asociación clara: toxina colérica (heminested PCR)
El HPV (virus del papiloma genital humano) es transmitido sexualmente. Se determinó que es un factor que contribuye a la constitución de varios canceres ano-genitales. El grupo HPV contiene 100 tipos distintos. Varios de estos infectan la mucosa genital y anal. Haciendo un estudio y tipificación de los HPVs en tejidos normales y cancerosos se determinó que los tipos 6 y 11 se asocian comúnmente a lesiones ano-genitales benignas mientras que los tipos 16 y 18, se hallan en la mayoría de los carcinomas. Hay otros tipos que son de mediana asociación.
El HPV no se propaga in vitro y no hay Acs anti HPV que identifiquen los distintos tipos entonces para su detección se utilizan métodos genotípicos.
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Hibridación Captura Amplificación de
la señal
Test de HPV (Digene)
Se basa en la técnica de ¨captura híbrida¨ que combina la detección de ác. nucleicos por hibridación de con una sonda de RNA y la amplificación de la señal mediante la Utilización de anticuerpos, enzima y sustrato quimioluminiscente.
T.P
Nested PCR SSCP
NAT con
primers específicos
para detectar un determinado marcador asociado con la
enfermedad.
Se debe realizar un análisis en una gran cantidad de individuos para determinar si el grado de asociación de la enfermedad con la presencia de determinada variante tiene significación estadística:
HPV (Hibridación DNA-RNA con Acs anti híbridos; Heminested PCR; SSCP)
Helicobacter pylori(3 PCR paralelas: primers sobre rRNA 16S, primers sobre región conservada de cagA, primers sobre región variable de cagA)
genotipificación de HCV (2 PCR consecutivas (nested PCR)) Se debe contar con un test altamente sensible y seguro.
Asociación clara: toxina colérica (heminested PCR)
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Resistencia a drogas anti microbianas y antivirales
Métodos fenotípicos: testeo de susceptibilidad mediante difusión en disco.
Métodos genotípicos:
Los mecanismos de reistencia a drogas pueden involucrar:
Reflujo de la droga, enzimas modificadoras de la droga, mutación en blanco.
Ej. Detección de gen de resistencia: Staphylococcus aureus- resistencia a oxacillina mediada por el gen mecA Detección de mutación: resistencia a macrólidos en Helicobacter pylori.
Virus: Emergencia de virus resistentes a drogas durante la terapia (mutaciones en los genes que codifican para proteínas virales que son blanco de las drogas).
Los métodos más usados son PCR y secuenciación o distintas variantes de PCR ó PCR-RFLP ó
hibridación reversa con sondas de oligonucleótidos específicos (específicos para cada mutación conocida) inmovilizados a líneas paralelas.
Se amplifica la muestra a analizar con oligonucleótidos cebadores biotinilados.
Hibridación reversa ( line probe) INNO-LIPA
Diagnóstico por presencia de anticuerpos.
Ensayos serológicos: ELISA, RIA, IFA, Citometría de flujo, etc.
Interesa determinar:
* Detectar posible infección por patógeno e identificar de que patógeno se trata.
Casos en que no se puede detectar el patógeno (muy poco antígeno, inaccesible, inestabilidad del RNA, estar una etapa en que ya declinó el patógeno, pacientes tratados).
* Porcentaje de individuos infectados en una población
* Determinación del estado de inmunización del individuo--- Diferenciación entre estado inmune debido a vacunación y aquel debido a infección
* Especificidad, clase, subclase y avidez de Acs. Estudio de la variación durante la progresión de la enfermedad. Detección de asociación con una determinada sintomatología o con una determinada progresión de la enfermedad.
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No es lo apropiado en neonatos
individuos inmunosuprimidos
En período temprano post-infección
Test de distinta generación
Mejoramiento de la detección de anticuerpos (sensibilidad, especificidad, acortamiento de la ventana de diagnóstico, el lapso de tiempo entre inicio de la infección y detección de que el individuo fue infectado)
mediante:
La incorporación de varios antígenos al ensayo Combinación de métodos de detección de Acs y Ags
Si es posible es conveniente realizar conjuntamente algún tipo de ensayo que detecte el Ag.
Ensayos en el lugar en que se encuentra el paciente, simple, poco equipamiento, sin necesidad de personal capacitado, bajo costo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
16
22
11
HIV RNA (plasma)
HIV antibody
HIV p24 Ag
Days
Theoritical Identify
Day 0
HIV RNA
Day 11
HIV p24 Ag
Day 16
HIV Antibody
Day 22
5 Days
6 Days
11 Days
HIV Marker During Early Infection
25
Third
Third
-
-
generation
generation
ELISA
ELISA
for
for
Ab detection
Ab detection
P
P
rHIV Ags /
peptides
Enzyme conjugated
rHIV Ags / peptides
IgG
IgG
Anti
Anti
-
-HIV
HIV
P
P
IgM
IgM
Anti
Anti
-
-HIV
Fourth generation
Fourth generation
ELISA
ELISA
for detecting Abs and HIV Ag simultaneously
(VIDAS HIV DUO)
B
B
Anti-P24
rHIV Ags /
peptides
Biotine-conjugated
Anti-P24
P24 Ag
P24 Ag
Enzyme conjugated
rHIV Ags / peptides
Anti-HIV
P
P
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Disease Serological marker Interpretation
Hepatitis B HBsAg “Surface” antigen Early acute infection. Needs confirmation for specificity. Persistence beyond six months denotes chronicity *HBeAg “Envelope” antigen Indicates HBV replication and high infectivity
*Anti HBs “Surface antibody Past infection with immunity to HBV, or passive immunity from immunoglobulin or vaccine
*Anti HBe “Envelope antibody” Liver cell regeneration and a good prognosis. Presence in a carrier state indicates low titres of HBV
Anti HBc IgM Recent infection. Positive for 4-6 months post infection
*Anti HBc Total Exposure to HBV at some undefined time
Marcadores y que significan
Especificidad, clase, subclase y avidez
Clase de Ac en infección con Helicobacter. Presencia de IgM determina infección reciente y sirve para
detectar tempranamente una infección cuando aún no se manifiestan los síntomas específicos de la enfermedad
Especificidad y clase de Ac Hepatitis B
Diferenciación entre individuos vacunados y naturalmente infectados
Especificidad de los anticuerpos: a la cepa vacunal puede faltarle algún antígeno que esté presente en cepas que normalmente infectan (Bacillus bovis y Bacillus tuberculosis), utilización en la vacunación de un antígeno recombinante que presente un marcador que no presenta en antígeno natural.
Subclase de IgG:
Virus del Sarampión. Título de IgG4> 30 infección natural, <30 vacunado
Avidez de los anticuerpos: Se incrementa a lo largo del período post infección
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Cuando se habla de diagnosticar una enfermedad causada
por un patógeno se cuenta con una amplia variedad de
técnicas. Optar por una u otra depende de varios factores:
•
Las características propias de la enfermedad
•
Las herramientas con las que se cuenta
•
Con que análisis se obtiene el menor número de falsos positivos o falsos
negativos
•
De la rapidez con que se debe hacer la determinación
Un ensayo diagnóstico debe ser validado.
Un ensayo diagnóstico validado provee resultados de análisis que identifican individuos como positivos o negativos para un analito (Ac, Ag, templado de ADN o ARN) y por inferencia predice el estado infeccioso del mismo con un predeterminado grado de certeza estadística
El método elegido (condiciones físicas, concentración de reactivos, dilución de suero) debe distinguir variaciones en la concentración del analito en un amplio rango, con un mínimo de background. Debe ser sensible y específico.
VALIDACION
Hay que contar con controles positivos y negativos conocidos y determinados por otro método (Gold Std o ensayo de gran certeza)
Hay que normalizar los valores obtenidos con las muestras incógnita en base a
los valores obtenidos con los controles. También se requieren para la cuantificación. Por ejemplo en un ELISA, por interpolación en una curva Std obtenida a partir de los valores resultantes de los Stds de título conocido que se ensayan en la misma placa se puede calcular el título de Acs de la
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Parametros a determinar que permiten conocer la validez estadística del ensayo:
Repetibilidad
Precisión del ensayo
CV= (Ds/Promedio) x100
Sensibilidad y especificidad analítica:
A-SN
: está dada por la menor cantidad detectable de Ag o Ac. Se determina por
un análisis de dilución final.
A-SP
: depende del grado en el cual el ensayo da reacción cruzada con otros
Ags o Acs
Reproducibilidad
intraplaca
interplaca
en distintos laboratorios
en distintas fechas
Sensibilidad y especificidad diagnóstica (clínica):
D-SN: % de muestras positivas verdaderas en el ensayo que se esta validando respecto a
todas las que son positivas según el ensayo de gran certeza con el que se compara.
Positivos verdaderos
SN= --- x 100
positivos verd.+ negativos fals.
positivos totales
D-SP: % de muestras negativas verdaderas en el ensayo respecto a las que son
negativas en el otro ensayo. Aquellas que dan positivo son falsos positivos
.
Para determinar D-SN y D-SP hay que reducir los resultados de un test a la categoría de (+) y (-).
Para esto hay que fijar un punto de corte o cut-off
Frecuencia _ +
Absorbancia
Baja la sensibilidad
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Predictibilidad: Da una idea de cual es la seguridad de que un resultado positivo
según el ensayo validado sea realmente positivo (Idem para los
negativos). Este valor depende de la prevalencia de la enfermedad
en la población.
positivos verdaderos
Valor predictivo positivo= ________________________ x100 VPP= 309 x 100= 96% 321 positivos (verdad.+falsos) VPN= 106 x 100= 78% 136 D-SN= 309 x 100 339 D-SP= 106 x 100 118 FN=30 x 100 339 FP=12 x 100 118
Enfermedad producida por un patógeno
Qué interesa determinar?
Detectar e identificar al patógeno
Diferenciación de variantes
Tipificación y detección de una determinada variante
Testeo de susceptibilidad a drogas anti microbianas
Detección en suero de anticuerpos anti patógeno
Validación de test diagnóstico
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Determinación de carga viral para seguir la eficiencia de una terapia
PCR cuantitativa competitiva
: Para amplificar templado y Std se usan los mismos
oligos. La secuencia del Std se diferencia del templado en la presencia o no de un sitio de
restricción, en la longitud o hasta en un solo nucleótido. Se trabaja con una concentración de
Std en un rango de concentración similar al de la muestra incógnita.
A partir de la relación de intensidades y la cantidad inicial de Std, se puede determinar la
cantidad inicial de target. También se puede hacer mezclando en cada tubo, la muestra incógnita
con una dilución seriada del Std. Cuando la cantidad de producto obtenido a partir del templado
incógnita y a partir del Std es igual, entonces es que se partió de la misma cantidad inicial de
moléculas.
PCR ó RT-PCR cuantitativa
Trabajar en rango de [ADN] de manera de terminar después de n ciclos en fase exponencial.
Cuantificación del patógeno
PCR Mimics.
El ADN Std se obtiene haciendo dos PCR sucesivas sobre ADN heterólogoPCR-TGGE (
electroforesis en gradiente de temperatura)Std idéntico a target salvo por un nucleótido
37 Detección de estado de viremia
Falso negativo: PCR inhibida Nuevas variantes
PCR en tiempo real:
Cuantificación del producto amplificado a medida que se va formando.
Se cuantifica una señal de fluorescencia.
Se aplica para cuantificaciones rápidas de ADN o ARN, detección de variantes
genéticas, mutaciones y polimorfismos.
Sonda de
Hidrólisis o 5´nucleasa
(TaqMan)
Medida de carga viral para monitorear la respuesta a la terapia con drogas (virus a ADN o ARN).
Cuantificación de ARN mensajero Mayor rapidez y especificidad
39 Sonda ¨hairpin¨ Molecular Beacons
Sonda de
Hibridación
Transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET)Sonda Escorpión
SYBR Green: marcación inespecífica.
Si se utilizan estas sondas/primers (hidrólisis, hairpin, hibridación, escorpión) fluorescentes no
se requiere un análisis post amplificación
41
El Std es corrido en tubos separados al
de la muestra incógnita.
Determinación de Tm
PCR en tiempo real se aplica a detección, tipificación, determinación de resistencia y
cuantificación
Cuantificación
Sybr green
Sonda molecular beacon Sonda FRET
45 threshold
PCR en tiempo real se aplica a detección, tipificación, cuantificación y determinación de
aparición de cepas resistentes.
Detección, diferenciación y cuantificación de distintos grupos de Leishmania
Diferenciación entre infección por Micobacterium o por Brucella con Multiplex Real time PCR (primers Específicos). Validación
Sondas de hibridación: 2 pares, uno para cada región amplificada.
Una sonda de cada par marcada con Fluoresceína. La otra con marcador Fluorescente que emite a 640 nm para Microbacterium y a 705 para Brucella.
Determinación de Tm:
1 2
3 (+)
47
49 infA (todos los Influenza A) SH1 (todos los H1) NH1 (específico Para 2009 H1N1)
Genotipo de resistencia: aparición de variantes resistentes al tratamiento
La infección por el virus de la Hepatitis B (HBV) afecta cronicamente al 5% de la población mundial. Su progresión puede llevar a la formación de un hepatocarcinoma.
La lamivudina (un análogo de nucleósido) inhibe la replicación de HBV por inhibir la síntesis de ADN por terminación de cadena.
Después de un tiempo de tratamiento con lamivudina en algunos pacientes empiezan a aparecer variantes de HBV con mutaciones en el gen de la Polimerasa que las hace resistentes al efecto de la droga.
Las mutaciones ocurren en un motivo conservado.
Extracción de ADN de suero PCR para amplificar
clonado en vector PCR en tiempo real con probe fluorescente Calentamiento,
Enfríamiento y aumento lento de la temperatura Determinación de la Tm
También: Hibidización reversa PCR y secuenciación PCR competitiva y DGGE
51