FOR EXPORT ONLY, Not for sale in the USA.
(US Patent No. US D560,281S; US D561,344S; US 744,9775 B2)
A Rapid Immunoassay for the Detection of IgM Antibodies to
EBV Viral Capsid Antigen (VCA) in Human Serum
751730
In vitro diagnostic medical device
INTENDED USE
TRU EBV-M is a rapid immunochromatographic assay for the qualitative detection of IgM antibodies specific to EBV viral capsid antigen (VCA) in human serum. When performed in conjunction with assays for other EBV markers, this assay can be used to aid in the diagnosis of active or recent infection in patients with signs and symptoms of EBV infection such as infectious mononucleosis. Note: This assay is not intended for use with blood donors, transplant patients or cancer patients.
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
Epstein Barr Virus (EBV) is a widely disseminated lymphotropic and epitheliotropic gammaherpesvirus. It is implicated in a number of benign and malignant disorders, including acute and chronic infectious mononucleosis (IM), Hodgkin’s disease, nasopharyngeal carcinoma, Burkitt’s lymphoma and B- and T-cell non-Hodgkin’s lymphoma.1
Infection with EBV in young children is generally less severe than when it occurs in adults and infected children are often asymptomatic. However, when EBV infection occurs during adolescence or early adulthood, IM usually results.2, 3
During early infection, circulating IgM antibodies to EBV viral capsid antigen (VCA) are found. IgG antibodies to VCA may develop simultaneously or shortly thereafter, while IgG antibodies to the nuclear antigen of Epstein Barr virus (EBNA) do not appear until weeks or months after the acute phase of infection has passed.1
Reactivation of the EBV virus is generally associated with elevations in IgG anti-VCA titers. A past EBV infection is identified by the absence of IgM anti-VCA and the presence of both IgG anti-VCA and IgG anti-EBNA. Because IgM and IgG forms of antibodies to VCA and EBNA appear at different stages of infection, serodiagnostic assays for the specific types of antibodies can be used to aid in the diagnosis of acute and convalescent stages of disease.
TRU EBV-M, when used in conjunction with other EBV assays, such as Meridian’s TRU EBV-G (for the detection of IgG antibodies to EBV VCA and EBNA) can aid in distinguishing patients with active EBV infections and infectious mononucleosis from those with past infections.
BIOLOGICAL PRINCIPLES
TRU EBV-M is a single use immunoassay that consists of a Conjugate Tube, a Test Strip, Sample Diluent and Buffer. The Conjugate Tube contains a lyophilized bead of colloidal gold-linked anti-human IgM antibody. The Test Strip carries a nitrocellulose membrane with dried recombinant EBV VCA (p18) antigen at the Test Line. The Test Strip holder caps the Conjugate Tube during testing and subsequent disposal to reduce exposure to potential pathogens.
The patient sample is diluted with a Sample Diluent that contains an absorbent to remove IgG. The absorbent prevents rheumatoid factor complexes from forming and prevents interfering competition from IgG during the test procedure. The diluted patient sample is incubated with recombinant VCA (p18) antigen immobilized on the Test Strip (Test Line). Any antigen-specific IgM antibody in the sample will bind to the immobilized antigen. The conjugate bead is then rehydrated in the Conjugate Tube with Buffer and the Test Strip is added. When the rehydrated gold conjugate moves up the Test Strip to the Test Line it will react with IgM antibody immobilized on the solid phase yielding a pink-red line. If no antibody is present, no complexes are formed and no pink-red line appears at the Test Line. An internal Control Line helps determine whether adequate flow has occurred through the Test Strip during a test run. A visible pink-red line at the Control Line of the Test Strip should be present each time a specimen or Control is tested. If no pink-red Control Line is seen, the test is considered invalid. REAGENTS/MATERIALS PROVIDED
The maximum number of tests obtained from this test kit is listed on the outer box.
1. Test Strip: A test strip attached to a plastic holder enclosed in a foil pouch with desiccant. Recombinant EBV VCA (p18) antigen is immobilized on the test strip at the Test Line. The holder is used to stopper the Conjugate Tube. The paddle portion of the holder indicates where Test and Control Lines should appear. Store the pouch at 2-8 C when not in use. Do not use the device if the desiccant indicator (line in center of desiccant) changes from blue to pink.
2. Conjugate Tube: A capped plastic tube containing a conjugate bead. The tube is enclosed in a foil pouch. The conjugate consists of monoclonal anti-human IgM antibody coupled to colloidal gold. Store the foil pouch at 2-8 C when not in use. Do not store in the freezer. Do not remove the cap before use. 3. Sample Diluent: A buffered solution provided in a dropper vial. Sodium azide (0.094%) added as a
preservative and goat anti-human IgG as an absorbent. Use as supplied. Store at 2-8 C when not in use. 4. Buffer: A buffered protein solution provided in a dropper vial. Sodium azide (0.094%) added as a
preservative. Use as supplied. Store at 2-8 C when not in use.
5. Positive Control: Serum or defibrinated/decalcified plasma containing IgM antibodies specific to EBV VCA in a buffered solution provided in a dropper vial. Sodium azide (0.094%) added as a preservative. Use as supplied. Store at 2-8 C when not in use.
6. Negative Control: Serum or defibrinated/decalcified plasma without IgM antibodies specific to EBV VCA in a buffered solution provided in a dropper vial. Sodium azide (0.094%) added as a preservative. Use as supplied. Store at 2-8 C when not in use.
7. Plastic Transfer Pipettes with 25 µL, 50 µL, 100 µL, and 150 µL markings.
8. TRU EBV-M Conjugate Tube Labels (to differentiate TRU EBV-M Conjugate Tubes from Conjugate Tubes of other TRU assays).
MATERIALS NOT PROVIDED 1. Interval timer
2. Small test tubes (eg, 10 x 75 mm or 12 x 75 mm) for dilution 3. Vortex mixer (optional)
PRECAUTIONS
1. All reagents are for in vitro diagnostic use only. 2. Directions should be read and followed carefully.
3. Do not use the Sample Diluent or the Buffer if either is discolored or turbid. Discoloration or turbidity may be a sign of microbial contamination.
4. Test Strips and Conjugate Tubes are packaged in foil pouches that exclude moisture during storage. Inspect each foil pouch before use. Do not use Test Strips or Conjugate Tubes in pouches that have holes or where the pouch has not been completely sealed. Do not use the Test Strip if the desiccant indicator has changed from blue to pink. The change in the desiccant color is an indicator the Test Strip has been exposed to moisture. The desiccant packaged with the Conjugate Tube does not have a moisture indicator. However, on exposure to moisture, the Conjugate Bead becomes difficult to rehydrate. When properly stored, the conjugate bead should dissolve immediately when Buffer is added. False negative reactions may result if Test Strips or Conjugate Tubes are exposed to moisture.
5. Handle specimens, controls and the materials that contact them as potential biohazards. The source materials used to prepare the control reagents were tested at the donor level and found to be nonreactive for the antigens or nuclear materials associated with, or antibodies to, the following viruses, as defined by required FDA-licensed tests: Human immunodeficiency viruses Types 1 and 2, Hepatitis B virus and Hepatitis C virus. However, since no test method can offer complete assurance that infectious agents are absent, these materials should be handled at the Biosafety Level 2 as recommended in the CDC/NIH “Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories”.
6. Frozen/thawed specimens should be mixed thoroughly before testing to ensure a representative sample prior to testing.
7. Specimens with obvious microbial contamination or severe hemolysis should not be tested as they may yield unreliable results.
8. Severe lipemic specimens, contaminated specimens or specimens with excess debris may restrict movement of the Conjugate up the Test Strip producing an invalid result. Noncontaminated specimens causing flow problems may be centrifuged and retested.
9. Failure to bring samples and reagents to room temperature (20-25 C) before testing may decrease assay sensitivity.
10. All reagents should be gently mixed before use.
11. Reagent droppers and transfer pipettes should be held vertically when dispensing to ensure consistent drop size and delivery.
HAZARD and PRECAUTIONARY STATEMENTS There are no known hazards associated with this product. SHELF LIFE AND STORAGE
The kit expiration date is indicated on the kit label. Store the kit at 2-8 C. PROCEDURAL NOTES
The TRU EBV-M transfer pipette is diagrammed below.
The TRU EBV-M Test Strip and Conjugate Tube are diagrammed below.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Blood samples are to be collected using aseptic venipuncture technique. No anticoagulants or preservatives should be added. Separated serum should be tested as soon as possible, but may be held up to 72 hours at 2-8 C prior to testing. If testing cannot be performed within this time frame, specimens should be frozen immediately at -20 C or lower for up to 30 days until tested. Self-defrosting freezers are not recommended as storage units. Samples should not be frozen and thawed more than three times. Prior to testing, bring sera to room temperature slowly and mix gently, avoiding foam formation. Serum samples must not be heat-inactivated prior to use. TEST PROCEDURE
1. Bring all test components, reagents and samples to room temperature (20-25 C) before testing. 2. Using the reagent dropper, add 350 µL of Sample Diluent to a clean test tube labeled with the patient’s
name or identification number.
3. Using a transfer pipette supplied with the kit, draw up patient sample to the 25 µL mark (first mark from the end of the pipette) and transfer the sample to the test tube containing the Sample Diluent. Vortex or swirl the contents of the tube for 10 seconds to mix. Return the transfer pipette to the tube.
4. Remove a Test Strip from its foil pouch and discard the pouch. Label the top of the Test Strip holder with the patient’s name or identification number. Place the Test Strip holder face up on a clean surface. 5. Using the same transfer pipette, draw up diluted sample to the 25 µL mark (first mark from the end of the
pipette tip) and dispense the diluted sample exactly to the application area marked with an “S” on the Test Strip. Dispensing diluted sample in a different position may cause erroneous results.
6. Incubate the Test Strip for 2 minutes at 20-25 C.
7. While the Test Strip is incubating, remove the Conjugate Tube from its foil pouch and discard the pouch. Apply a TRU EBV-M label to the tube. Remove the cap from the Conjugate Tube and discard the cap. Within 1 minute, add 200 µL of the Buffer to the Conjugate Tube using the reagent dropper. Vortex or swirl the contents of the tube for 10 seconds to mix.
8. Insert the narrow end of the Test Strip holder into the Conjugate Tube and firmly press down on the holder to close the tube.
9. Incubate for 15 minutes at 20-25 C.
10. Read the results on the Test Strip within 1 minute. NOTE: Remove the Test Strip from the Conjugate Tube if Test or Control lines are difficult to read. Recap the Conjugate Tube with the Test Strip holder and discard when testing is completed.
EXTERNAL CONTROL TESTS
1. Bring all test components, reagents and samples to room temperature (20-25 C) before testing. 2. Remove two Test Strips from their foil pouches and discard the pouches. Label the top of one Test Strip
holder for the Positive Control. Label the top of the second Test Strip holder for the Negative Control. Place the Test Strip holders face up on a clean surface.
3. Using the dropper bottle provided, add one drop of the Positive Control exactly to the application area marked with an “S” on the appropriately labeled Test Strip. Similarly, using the dropper bottle provided, add one drop of the Negative Control exactly to the application area marked with an “S” on the appropriately labeled Test Strip. Dispensing the controls in a different position may cause invalid results. 4. Incubate the Test Strips for two minutes at 20-25 C.
5. While the Test Strips are incubating, remove two Conjugate Tubes from their foil pouches and discard the pouches. Remove the caps from the Conjugate Tubes and discard the caps. Within one minute, add 200 µL of the Buffer to each Conjugate Tube using the reagent dropper. Vortex or swirl the contents of the tubes for 10 seconds to mix.
6. Insert the narrow end of each Test Strip holder into a Conjugate Tube and firmly press down on the holders to close the tubes.
7. Incubate for 15 minutes at 20-25 C.
8. Read the results on each Test Strip within one minute. NOTE: Remove the Test Strip from the Conjugate Tube if Test or Control Lines are difficult to read. Recap the Conjugate Tube with the Test Strip holder and discard when testing is completed.
INTERPRETATION OF RESULTS
Negative Test: A PINK-RED band at the Control Line position. No other bands are present.
Positive Test: PINK-RED bands at the Control and EBV Test Line positions. The appearance of an EBV Test Line, even if very weak, indicates the presence of IgM antibody to EBV VCA. The color of the Test Line can be lighter than that of the Control Line.
Invalid Test Results:
1. No band at the designated position for the Control Line. The test is invalid since the absence of a control band indicates the test procedure was performed improperly or that deterioration of reagents has occurred. 2. A PINK-RED band appearing at the Test Line position of the device after 16 minutes of incubation, or a
band of any color other than PINK-RED. Falsely positive results may occur if tests are incubated too long. Bands with colors other than PINK-RED may indicate reagent deterioration.
If any result is difficult to interpret, the test should be repeated with the same sample to eliminate the potential for error. Obtain a new sample and retest when the original sample repeatedly produces unreadable results.
REPORTING OF RESULTS
Negative Test Result = no Test Line color with a PINK-RED Control Line (indicates the absence of IgM antibody to EBV VCA)
Positive Test Result = appearance of PINK-RED lines at Test Line and Control Line (indicates the presence of IgM antibody to EBV VCA)
QUALITY CONTROL
This test should be performed per applicable local, state, or federal regulations or accrediting agencies. At the time of use, each kit component should be visually examined for obvious signs of microbial contamination, freezing or leakage. Do not use contaminated or suspect reagents.
Internal Controls: Internal controls are contained within the Test Strip and therefore are evaluated with each test.
1. A PINK-RED band appearing at the Control Line serves as an internal procedural control and indicates the test has been performed correctly, that proper flow occurred, and that the test reagents were active at the time of use.
2. A colorless background surrounding the Control or Test Lines also serves as a procedural control. Control or Test Lines that are obscured by a heavy background color may invalidate the test and may be an indication of reagent deterioration, use of inappropriate samples or improper test performance. External Control reagents should be tested according to the requirements of the laboratory or those applicable local, state or federal regulations or accrediting agencies:
See section EXTERNAL CONTROL TESTS for instructions on performing these control tests. The results expected with the controls are described in INTERPRETATION OF RESULTS.
External positive and negative controls should be tested upon opening each kit. However, the number of additional tests performed with the external controls will be determined by the requirements of local, state or federal regulations or accrediting agencies. The external controls are used to monitor reagent reactivity and test performance. Failure of the controls to produce the expected results can mean that one of the reagents or components is no longer reactive at the time of use, the test was not performed correctly, or that reagents were not added.
The kit should not be used if control tests do not produce the correct results. Repeat the control tests as the first step in determining the root cause of the failure. If control failures are repeated please contact Meridian’s Technical Services Department at 1-800-343-3858 (US) or your local distributor. Specimen matrix interference has not been observed in this assay.
EXPECTED VALUES
EBV is widely distributed throughout all populations and ethnic groups; 50-80% of children older than five years of age have been infected and as many as 95% of adults. Prevalence rates may vary slightly from geographic region to region. Specific EBV serological assays, when used to evaluate symptomatic patients, can aid in determining whether a person has a recent infection, was infected in the past, or has a reactivated infection. IgM to EBV VCA appears early in infection and disappears within 4-6 weeks. IgG to EBV VCA appears in the acute phase, peaks 2-4 weeks after onset, declines slightly, then persists throughout life. IgG to EBV EBNA slowly appears weeks or months after disease onset and persists for life. Table 2 below summarizes serological findings for the infection states.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
1. The test is qualitative and no quantitative interpretation should be made with respect to the intensity of the positive line when reporting the result.
2. Test results are to be used in conjunction with information available from the patient clinical evaluation and other diagnostic procedures. For definitive serodiagnosis, concurrent testing for antibody response to other EBV antigens is highly recommended.
3. The test should be performed on serum. The performance of this test with whole blood or plasma has not been established.
4. Samples obtained too early during infection may not contain detectable levels of IgM antibody. If an Epstein-Barr viral infection is suspected, a second sample should be obtained in 7-14 days and tested.
5. There is a possibility of assay crossreactivity with specimens containing anti-E. coli antibody.
6. The performance characteristics have not been established for patients with nasopharyngeal carcinoma, Burkitt’s lymphoma, other EBV associated lymphadenopathies, and other EBV-associated diseases other than EBV-related mononucleosis.
7. Results from immunosuppressed patients should be interpreted with caution.
8. Failure to add sufficient patient specimen to the Sample Diluent may result in a falsely negative test result. Addition of too much sample may result in invalid test results due to the inhibition of proper sample flow. 9. Over incubation of tests may lead to false positive test results. Incubating tests at reduced temperatures or
times may lead to falsely negative results. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
One hundred seventy-three prospective and 135 retrospective sera from patients were analyzed for the presence of IgM antibodies to VCA using TRU EBV-M and two commercially available EIA reference tests. There was a difference in the sample populations (39 samples) detected by the two reference IgM assays. For this reason, a sample was classified as IgM positive or IgM negative when both of the reference methods were in agreement. The disease stage of the samples was determined by additional testing using commercially available EIA tests for IgG antibodies to EBV viral capsid antigen (VCA) and nuclear antigen (EBNA). Testing was performed at Meridian Bioscience, Inc. and at one independent laboratory.
Table 1 compares the performance of TRU EBV-M to the two commercially available reference kits for the detection of IgM antibodies to VCA. Classification of the samples by the stage of EBV infection is shown in Table 2. Of the 308 serum samples tested (combined prospective and retrospective), four samples could not be classified as to the stage of EBV infection due to indeterminate results generated from the commercially available kits.
Table 1 – Comparison of TRU EBV-M to reference assays for the detection of IgM anti-VCA Reference EIA
EBV IgM Assays
TRU EBV-M
Positive Negative Total
IgM Positive 76 7 83 IgM Negative 8 217 225 Total 84 224 308 95% CI Positive Agreement 76/83 91.6% 83.4 - 96.5% Negative Agreement 217/225 96.4% 93.1 - 98.5% Overall Agreement 293/308 95.1% 92.1 - 97.2%
Table 2 - TRU EBV-M Performance Characteristics by Disease State EBV Serological Status Anti-VCA IgM Anti-VCA IgG
IgG Anti-EBNA TRU EBV-M Positive Negative % Agreement 95% CI Seronegative
Negative Negative Negative 1 112 99.1% 95.2-100% Acute
Positive Positive Negative
71 6 92.2% 83.8-97.1%
Positive Negative Negative Acute Late Infection4
VCA IgG Only Negative Positive Negative 0 3 100.0% 29.2-100% Past Infection
Negative Positive Positive 6 100 94.3% 88.1-97.9% Indeterminate
EBNA-1 IgG Only Negative Negative Positive 1 2 66.7% 9.4-99.2% Convalescent/Reactivation Positive Positive Positive 2 0 100.0% 15.8-100%
Un-interpretable Positive Negative Positive 0 0 N/A N/A Excluded
Uncharacterizable by
reference methods Pos/Neg/Ind Pos/Neg/Ind Pos/Neg 11 28 N/A N/A VCA IgG Indeterminate Pos/Neg Indeterminate Pos/Neg 3 1 75.0% (3/4) N/A
Additional information regarding the tests performed with TRU EBV-M can be obtained from Technical Support Services at Meridian Bioscience Europe.
REPRODUCIBILITY
Assay precision, intra-assay variability and inter-assay variability were assessed with a reference panel prepared from pools of negative samples spiked with positive samples. The reproducibility panel consisted of moderate positive (n = 3), low negative (n = 2), low positive (n = 3) and high negative specimens (n = 3). The latter were prepared near the assay limit of sensitivity. Each reference specimen was coded to prevent its identification during testing. Each was evaluated twice per day for three consecutive days. All samples produced the correct results 100% of the time.
ASSAY SPECIFICITY
Sera containing detectable lgM antibody levels to Herpes Simplex Virus (n = 8), Cytomegalovirus (n = 9) or Varicella Zoster Virus (n = 6) by commercially available assays were tested in the TRU EBV-M assay. Sera containing anti-nuclear antibody (n = 8), EBV VCA IgG antibody and rheumatoid factor (n = 18) were also tested. All specimens were classified as negative in the TRU EBV-M assay, indicating no cross-reactivity.
TESTS FOR INTERFERING SUBSTANCES
The following substances were found to have no effect on results when present in serum samples at the concentrations indicated: hemoglobin (20 g/dL), bilirubin (40 mg/dL), and triglycerides (3000 mg/dL).
ITALIANO
(US Patent No. US D560,281S; US D561,344S; US 744,9775 B2)
Test immunologico rapido per il rilevamento degli anticorpi di classe IgM specifici
verso l’antigene capsidico (VCA) del virus di Epstein-Barr (EBV), nel siero umano
751730
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
FINALITÀ D’USO
TRU EBV-M è un test immunocromatografico rapido per il rilevamento qualitativo degli anticorpi di classe IgM specifici verso l’antigene capsidico (VCA) del virus di Epstein-Barr (EBV), nel siero umano. Se eseguito in concomitanza con le analisi per altri marker di EBV, questo test può essere usato per coadiuvare la diagnosi di infezioni attive o recenti in pazienti con segni e sintomi di infezione da EBV, quali la mononucleosi infettiva. Nota: l’uso di questo test non è previsto su donatori di sangue, su pazienti che abbiano subito un trapianto o pazienti affetti da carcinoma.
SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Il virus di Epstein-Barr (EBV) è un virus linfotrofico ed epiteliotrofico ampiamente diffuso, facente parte della famiglia dei gamma herpes virus. Esso è implicato in un vasto numero di disordini sia benigni che maligni, fra cui la mononucleosi infettiva acuta e cronica (MI), il morbo di Hodgkin, il carcinoma rinofaringeo, il linfoma di Burkitt e il linfoma non-Hodgkin delle cellule B e T.1
Nei bambini, in genere, l’infezione da EBV è meno grave rispetto all’infezione rilevata negli adulti ed è spesso asintomatica. Tuttavia, l’infezione da EBV negli anni adolescenziali o nei primi anni dell’età adulta generalmente sfocia in MI.2, 3
Durante il primo periodo di infezione, vengono rilevati gli anticorpi di classe IgM specifici verso l’antigene capsidico (VCA) del virus di Epstein-Barr (EBV). Gli anticorpi di classe IgG specifici verso VCA possono svilupparsi simultaneamente o subito dopo, mentre gli anticorpi di classe IgG specifici verso l’antigene nucleare del virus di Epstein-Barr (EBNA) compaiono alcune settimane o alcuni mesi dopo la fine della fase acuta dell’infezione.1 La riattivazione del virus EBV in genere è associata a valori elevati nei titoli di anticorpi anti-VCA IgG. Una infezione passata da EBV è evidenziata dall’assenza di anticorpi IgM anti-VCA e dalla presenza di entrambi gli anticorpi IgG anti-VCA e IgG anti-EBNA. Poiché le varietà di anticorpi IgM e IgG specifici verso VCA ed EBNA compaiono in diverse fasi dell’infezione, i test sierodiagnostici per gli specifici tipi di anticorpi possono essere usati per coadiuvare la diagnosi della fase acuta e della fase di convalescenza della malattia.
TRU EBV-M, se usato in concomitanza con altri test EBV quali TRU EBV-G di Meridian (per il rilevamento degli anticorpi IgG specifici verso l’antigene capsidico VCA ed l’antigene nucleare EBNA), può aiutare a distinguere i pazienti con infezioni attive da EBV e da mononucleosi infettiva dai pazienti con infezioni passate.
PRINCIPI BIOLOGICI
TRU EBV-M è un test immunologico monouso che comprende una Provetta con Coniugato, una Striscia Test, un Diluente del Campione e una Soluzione Tampone. La provetta con coniugato contiene un granulo liofilizzato di anticorpi anti-IgM umane coniugati ad oro colloidale. La Striscia Test contiene una membrana di nitrocellulosa con antigene ricombinante essiccato EBV VCA (p18) in corrispondenza della linea di analisi. Il portastriscia serve a sigillare la provetta con coniugato durante le analisi e il successivo smaltimento, al fine di limitare l’esposizione ad eventuali agenti patogeni.
Il campione del paziente è diluito con un diluente contenente un composto assorbente per rimuovere gli anticorpi IgG. Il composto assorbente previene la formazione dei complessi del fattore reumatoide e previene l’interferenza competitiva da parte degli anticorpi IgG nel corso della procedura di analisi. Il campione diluito viene incubato con antigene ricombinante VCA (p18) immobilizzato sulla striscia test (linea di analisi). Tutti gli anticorpi IgM specifici diretti contro l’antigene contenuti nel campione si legheranno all’antigene immobilizzato. Il granulo di coniugato viene quindi reidratato con il tampone nella provetta con coniugato prima di aggiungere la striscia test. Quando l’anticorpo coniugato a oro colloidale reidratato migra nella linea di analisi attraverso la striscia, reagisce con l’anticorpo IgM immobilizzato nella fase solida producendo una linea rosa-rossa. Se l’anticorpo non è presente, non si forma alcun complesso e la linea rosa-rossa non appare nella posizione di analisi. Una linea di controllo all’interno della striscia aiuta a stabilire se nel corso delle analisi il flusso è stato adeguato. La linea rosa-rossa che appare nella posizione di controllo della striscia è presente ogni volta che si eseguono le analisi di un campione o di un controllo. Qualora tale linea sia assente, l’analisi non sarà considerata valida.
REAGENTI/MATERIALI FORNITI
Il numero massimo di analisi eseguibili con questo kit è indicato sulla confezione esterna.
1. Striscia Test: striscia fissata a un portastriscia di plastica, racchiusa in una busta di alluminio con essiccante. L’antigene ricombinante EBV VCA (p18) è immobilizzato sulla striscia test nella posizione di analisi. Il portastriscia serve a sigillare la provetta con il coniugato. La parte piatta del portastriscia indica il punto in cui devono apparire le linee di analisi e quelle di controllo. Quando non viene usata, conservare la busta a una temperatura compresa fra 2 e 8 C. Non usare il dispositivo se l’indicatore dell’essiccante (la linea al centro dell’essiccante) cambia colore da blu a rosa.
2. Provetta con coniugato: provetta di plastica con cappuccio, contenente un granulo di coniugato. La provetta è contenuta all’interno di una busta di alluminio. Il coniugato è composto da un anticorpo monoclonale anti-IgM umani coniugato ad oro colloidale. Quando non viene usata, conservare la busta di alluminio a una temperatura compresa fra 2 e 8 C. Non congelare. Non rimuovere il cappuccio prima dell’uso.
3. Diluente del campione: soluzione tamponata fornita in un flacone contagocce, con sodio azide (0,094%) aggiunto come conservante e siero di capra anti-IgG umane come adsorbente. Usare il prodotto come fornito. Quando non viene usato, conservare il prodotto a una temperatura compresa fra 2 e 8 C. 4. Tampone: soluzione proteica tamponata fornita in un flacone contagocce, con sodio azide (0,094%)
aggiunto come conservante. Usare il prodotto come fornito. Quando non viene usato, conservare il prodotto a una temperatura compresa fra 2 e 8 C.
5. Controllo positivo: siero o plasma defibrinato/decalcificato contenente anticorpi IgM specifici verso l’antigene capsidico dell’EBV in una soluzione tamponata fornita in un flacone contagocce. Sodio azide (0,094%) aggiunto come conservante. Usare il prodotto come fornito. Quando non viene usato, conservare il prodotto a una temperatura compresa fra 2 e 8 C.
6. Controllo negativo: siero o plasma defibrinato/decalcificato senza anticorpi IgM specifici verso l’antigene capsidico dell’EBV in una soluzione tamponata fornita in un flacone contagocce. Sodio azide (0,094%) aggiunto come conservante. Usare il prodotto come fornito. Quando non viene usato, conservare il prodotto a una temperatura compresa fra 2 e 8 C.
7. Pipette di trasferimento di plastica da 25 µL, 50 µL, 100 µL e 150 µL.
8. Etichette per la provetta con coniugato TRU EBV-M (per distinguere le provette con coniugato TRU EBV-M dalle provette con coniugato di altri test TRU).
MATERIALI NON FORNITI 1. Timer
2. Provette piccole (10 x 75 mm o 12 x 75 mm) per la diluizione 3. Agitatore vortex (facoltativo)
PRECAUZIONI
1. Tutti i reagenti sono esclusivamente per uso diagnostico in vitro. 2. Leggere e seguire attentamente le istruzioni.
3. Non usare il diluente del campione o il tampone se appaiono scoloriti o torbidi, in quanto ciò potrebbe indicare la presenza di una contaminazione microbica.
4. Le strisce test e le provette con coniugato sono confezionate in buste di alluminio per evitare l’esposizione all’umidità durante la conservazione. Controllare attentamente ciascuna busta prima dell’uso. Non usare le strisce test o le provette con coniugato se le buste di alluminio presentano fori o non sono state completamente sigillate. Non usare la striscia test se l’indicatore dell’essiccante ha cambiato colore, da blu a rosa. Tale cambiamento di colore indica che la striscia test è stata esposta all’umidità. L’essiccante confezionato nella provetta con coniugato non ha un indicatore di esposizione all’umidità. Tuttavia, se esposto all’umidità, il granulo di coniugato diventa difficile da reidratare. Se conservato adeguatamente, il granulo di coniugato si dissolve immediatamente dopo l’aggiunta del tampone. L’esposizione all’umidità delle strisce per le analisi o delle provette con coniugato può dar luogo a reazioni falso-negative. 5. Maneggiare campioni, controlli e materiali che possono entrare a contatto con essi come sostanze
biologicamente pericolose. I sieri usati per preparare i reagenti di controllo sono stati analizzati a livello del donatore e sono risultati non reattivi per gli antigeni o il materiale nucleare o gli anticorpi in base ai metodi di analisi richiesti dalla FDA per i seguenti virus: HIV-1, HIV-2, Epatite B ed Epatite C. Tuttavia, poiché nessun metodo di analisi può offrire garanzia assoluta dell’assenza di agenti infettivi, questi materiali devono essere maneggiati al Livello di biosicurezza 2, come consigliato nella normativa CDC/NIH “Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories”.
6. I campioni congelati/scongelati vanno miscelati a fondo prima dell’analisi, al fine di ottenere un campione adeguato e rappresentativo.
7. I campioni con contaminazione microbica o fortemente emolizzati non devono essere analizzati, in quanto potrebbero generare risultati inattendibili.
8. Campioni fortemente lipemici, campioni contaminati o campioni con troppi detriti potrebbero limitare la migrazione del coniugato nella striscia test, generando risultati non validi. I campioni non contaminati che causino problemi di migrazione possono essere centrifugati e rianalizzati.
9. Se non si portano campioni e reagenti a temperatura ambiente (20-25 C) prima di dare inizio alle analisi, la sensibilità del test potrebbe diminuire.
10. Mischiare delicatamente tutti i reagenti prima dell’uso.
11. I flaconi contagocce dei reagenti e le pipette di trasferimento vanno mantenuti in posizione verticale durante l’erogazione, al fine di assicurarne portata e dosaggio costanti.
DICHIARAZIONI DI PERICOLO E PRUDENZA
Per le nostre attuali conoscenze, non ci sono rischi associati a questo prodotto. STABILITÁ E CONSERVAZIONE
La data di scadenza è riportata sull’etichetta del. Conservare il kit a 2-8 C. NOTE PROCEDURALI
Il diagramma seguente mostra la pipetta di trasferimento TRU EBV-M.
Il diagramma seguente mostra la striscia test e la provetta con coniugato TRU EBV-M.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
I campioni ematici devono essere raccolti usando la tecnica di prelievo venoso. Non aggiungere anticoagulanti o conservanti. I campioni di siero separato devono essere analizzati non appena possibile, ma possono essere conservati fino a 72 ore a una temperatura compresa tra 2 e 8 C. Qualora non sia possibile eseguire le analisi entro questo intervallo di tempo, congelare immediatamente i campioni a una temperatura pari a -20 C o inferiore, fino a un massimo di 30 giorni prima delle analisi. I congelatori dotati di scongelamento automatico non sono consigliati per la conservazione. I campioni non devono essere sottoposti a cicli di congelamento e scongelamento più di tre volte. Prima dell’analisi, portare lentamente il siero a temperatura ambiente e mischiare delicatamente, per evitare la formazione di schiuma. I campioni di siero non devono essere inattivati a caldo prima dell’uso.
PROCEDURA DEL TEST
1. Prima di dare inizio alle analisi, portare componenti, reagenti e campioni a temperatura ambiente (20-25 C).
2. Usando il contagocce del flacone, aggiungere 350 µL di diluente del campione ad una provetta pulita etichettata con il nome o il codice di identificazione del paziente.
3. Usando una pipetta di trasferimento fornita con il kit, aspirare il campione del paziente fino alla tacca 25 µL (prima tacca dall’estremità della pipetta) e trasferire il campione nella provetta contenente il diluente del campione. Mischiare il contenuto della provetta agitandolo con il vortex o agitandolo a mano per 10 secondi. Reinserire la pipetta di trasferimento nella provetta.
4. Estrarre una striscia test dalla busta di alluminio e gettare la busta. Etichettare la parte superiore del portastriscia con il nome o il codice di identificazione del paziente. Poggiare il portastriscia su una superficie pulita, con la parte superiore rivolta verso l’alto.
5. Usando la stessa pipetta di trasferimento, aspirare il campione diluito fino alla tacca 25 µL (prima tacca dalla punta della pipetta) e dispensare il campione diluito esattamente nell’area indicata con la lettera S sulla Striscia Test. La deposizione del siero diluito in posizioni differenti può dare origine a risultati erronei.
6. Incubare la striscia test per due minuti a 20-25 C.
7. Mentre la striscia test è in incubazione, estrarre la provetta con coniugato dalla busta di alluminio e gettare la busta. Applicare un’etichetta TRU EBV-M sulla provetta. Rimuovere il cappuccio dalla provetta con coniugato e gettare il cappuccio. Entro 1 minuto, aggiungere 200 µL di tampone nella provetta con coniugato usando il contagocce del reagente. Mischiare il contenuto della provetta agitandolo con il vortex o agitandolo a mano per 10 secondi.
8. Inserire l’estremità più stretta del portastriscia nella provetta con coniugato e premere bene il portastriscia per chiudere la provetta.
9. Lasciare incubare a 20-25 C per 15 minuti.
10. Leggere i risultati sulla striscia test entro 1 minuto dal termine dell’incubazione. NOTA: rimuovere la striscia test dalla provetta con coniugato se le linee di analisi o le linee di controllo sono difficili da leggere. Richiudere la provetta con coniugato utilizzando il portastriscia e gettare la provetta al termine delle analisi. ANALISI CON CONTROLLI ESTERNI
1. Prima di dare inizio alle analisi, portare componenti, reagenti e campioni a temperatura ambiente (20-25 C).
2. Estrarre due strisce test dalle buste di alluminio e gettare le buste. Etichettare la parte superiore di uno dei portastriscia per il controllo positivo. Etichettare la parte superiore del secondo portastriscia per il controllo negativo. Poggiare i portastriscia su una superficie pulita, con la parte superiore rivolta verso l’alto. 3. Usando il flacone contagocce fornito, aggiungere uno goccia di controllo positivo esattamente nell’area
indicata con la lettera S sulla Striscia Test adeguatamente etichettata. Allo stesso modo, usando il flacone contagocce fornito, aggiungere uno goccia di controllo negativo esattamente nell’area indicata con la lettera S sulla Striscia Test adeguatamente etichettata. La deposizione dei controlli in posizioni differenti può dare origine a risultati erronei.
4. Incubare le strisce per le analisi per due minuti a 20-25 C.
5. Mentre le strisce per le analisi sono in incubazione, estrarre due provette con coniugato dalle buste di alluminio e gettare le buste. Rimuovere i cappucci dalle provette con coniugato e gettare i cappucci. Entro uno minuto, aggiungere 200 µL di tampone in ciascuna provetta con coniugato usando il contagocce del reagente. Mischiare il contenuto delle provette agitandolo con il vortex o agitandolo a mano per 10 secondi.
6. Inserire l’estremità più stretta di ciascun portastriscia in una provetta con coniugato e premere bene i portastriscia per chiudere la provetta.
7. Lasciare incubare a 20-25 C per 15 minuti.
8. Leggere i risultati su ciascuna striscia test entro uno minuto dal termine dell’incubazione. NOTA: rimuovere la striscia test dalla provetta con coniugato se le linee di analisi o le linee di controllo sono difficili da leggere. Richiudere la provetta con coniugato utilizzando il portastriscia e gettare la provetta al termine delle analisi.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
RISULTATO RISULTATO RISULTATO POSITIVO NEGATIVO NON VALIDO
Risultato di analisi negativo: una linea ROSA-ROSSA nella posizione di controllo. Non compaiono altre linee. Risultato di analisi positivo: linee ROSA-ROSSE nelle posizioni di controllo e di analisi EBV. Una linea nella posizione di analisi EBV, anche se molto tenue, indica la presenza di anticorpi IgM specifici verso EBV VCA. Il colore della linea di analisi può essere più chiaro rispetto a quello della linea di controllo.
Risultati non validi:
1. Non appare alcuna linea nella posizione designata al controllo. L’analisi non è valida in quanto l’assenza della linea di controllo indica che la procedura di analisi non è stata eseguita correttamente o che si è verificato il deterioramento dei reagenti.
2. Una linea ROSA-ROSSA appare nella posizione di analisi quando sono trascorsi più di 16 minuti di incubazione, o compare una linea di qualsiasi altro colore che non sia ROSA-ROSSO. Se le analisi vengono incubate troppo a lungo possono verificarsi risultati falso-positivi. Linee di altri colori che non siano ROSA-ROSSO possono indicare il deterioramento del reagente.
Se i risultati sono difficili da interpretare, ripetere l’analisi con lo stesso campione per eliminare eventuali errori. Se il campione originale continua a produrre risultati illeggibili, raccogliere un nuovo campione ed eseguire una nuova analisi.
REFERTAZIONE DEI RISULTATI
Risultato negativo = nessuna linea nella posizione di analisi, con una linea di colore ROSA-ROSSO nella posizione di controllo (indica l’assenza di anticorpi IgM specifici verso EBV VCA)
Risultato positivo = linee ROSA-ROSSE nella posizione di analisi e nella posizione di controllo (indica la presenza di anticorpi IgM specifici verso EBV VCA)
CONTROLLO QUALITÀ
Il test va eseguito conformemente ai requisiti stabiliti dai competenti enti locali, regionali, nazioinali o dagli enti di accreditamento.
Ad ogni utilizzo, esaminare visivamente tutti i componenti del kit per controllare che non vi siano segni di contaminazione microbica, congelamento o perdite. Non usare reagenti contaminati o sospetti.
Controlli interni: i controlli interni sono contenuti nelle strisce test e pertanto vengono valutati nel corso di ciascuna analisi.
1. Una linea ROSA-ROSSA che appare nella posizione di controllo funge da controllo procedurale interno e indica che il test è stato eseguito correttamente, il campione è migrato correttamente e i reagenti erano attivi al momento dell’uso.
2. Anche uno sfondo incolore attorno alle posizioni di controllo o alle posizioni di analisi funge da controllo procedurale. Linee di controllo o linee di analisi oscurate da uno sfondo di colore scuro possono rendere il test invalido e possono indicare il deterioramento dei reagente, l’uso di campioni inadeguati o prestazioni di analisi errate.
I reagenti di controllo esterno vanno analizzati conformemente ai requisiti del laboratorio o ai requisiti stabiliti dai competenti enti locali, statali, nazionali o dagli enti di accreditamento:
Vedere la sezione ANALISI CON CONTROLLI ESTERNI per istruzioni su come eseguire tali analisi di controllo. I risultati attesi con i controlli sono descritti nel paragrafo INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI.
I controlli esterni positivo e negativo dovrebbero essere utilizzati all’apertura di ciascun kit. Tuttavia, il numero di analisi aggiuntive eseguite con i controlli esterni sarà determinato in base alle normative locali, statali o nazionali e degli enti di accreditamento. I controlli esterni servono a controllare la reattività dei reagenti e le prestazioni delle analisi. Risultati inattesi possono indicare che uno dei reagenti o dei componenti non è più reattivo al momento dell’uso, che l’analisi non è stata eseguita correttamente, oppure che i reagenti non sono stati aggiunti. Se le analisi di controllo non producono i risultati corretti, non utilizzare il kit. Il primo passo da fare per determinare la causa di eventuali guasti o errori è quello di ripetere le analisi di controllo. Se il fallimento dei test di controllo dovesse ripetersi, contattare il Servizio di Assistenza tecnica Meridian (negli USA 001-800-343-3858) o il Distributore Locale, (Italia +390331433636). In questo test non è stata osservata l’interferenza della matrice dei campioni.
VALORI ATTESI
Il virus di Epstein-Barr è largamente diffuso in tutte le popolazioni e gruppi etnici; il 50-80% dei bambini di età superiore ai cinque anni e il 95% della popolazione adulta ha contratto l’infezione. I tassi di prevalenza possono variare leggermente a seconda delle regioni geografiche. Analisi sierologiche specifiche per EBV, se usate per la valutazione di pazienti sintomatici, possono contribuire a stabilire se il paziente ha contratto l’infezione di recente, se l’ha contratta in passato o se l’infezione si è riattivata. Gli anticorpi IgM specifici verso l’antigene capsidico dell’EBV (VCA IgM) compaiono all’insorgere dell’infezione e scompaiono entro 4-6 settimane. Gli anticorpi IgG specifici verso l’antigene capsidico dell’EBV (VCA IgG) compaiono nella fase acuta, raggiungono il picco 2-4 settimane dopo l’insorgenza, diminuiscono leggermente e persistono per tutta la vita. Gli anticorpi IgG specifici verso l’antigene nuclare dell’EBV (EBNA – IgG) compaiono lentamente alcune settimane o alcuni mesi dopo l'insorgere della malattia e persistono per tutta la vita. La Tabella 2 riassume i risultati dell’analisi sierologica per i diversi stadi dell’infezione.
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
1. Il test è qualitativo, pertanto non si devono formulare interpretazioni quantitative dei valori ottenuti in base all’intensità della linea positiva.
2. I risultati del test devono essere utilizzati insieme alle informazioni ricavate dall’esame clinico del paziente e da altre procedure diagnostiche. Per una definitiva diagnosi sierologica, si consiglia di eseguire l’analisi in concomitanza alla risposta degli anticorpi ad altri antigeni dell’EBV.
3. L’analisi va eseguita sul siero. Le prestazioni di questo test eseguito con il sangue intero o con il plasma non sono state stabilite.
4. I campioni prelevati troppo presto nel corso dell’infezione potrebbero non contenere livelli rilevabili di anticorpi IgM. Se si sospetta un’infezione da virus di Epstein-Barr, è necessario prelevare un secondo campione nel giro di 7-14 giorni e analizzarlo.
5. Esiste la possibilità di reattività crociata fra test con campioni contenenti l’anticorpo anti E. coli. 6. Le caratteristiche delle prestazioni non sono state stabilite per i pazienti con carcinoma rinofaringeo,
linfoma di Burkitt, altre linfoadenopatie associate all’EBV e altri disturbi associati all’EBV, tranne che nel caso della mononucleosi associata all’EBV.
7. I risultati dei campioni provenienti da pazienti immunodepressi vanno interpretati con cautela.
8. Se al diluente per campioni non si aggiungono quantità sufficienti di campione del paziente, si possono ottenere risultati falso negativi. Se si aggiunge una quantità eccessiva di campione, si possono ottenere risultati non validi a causa dell’inibizione di un adeguato flusso di campione.
9. L’incubazione eccessiva dei test può produrre risultati falso-positivi. Le incubazioni condotte a temperature o intervalli di tempo inferiori a quelli previsti possono produrre risultati falso-negativi.
PRESTAZIONI SPECIFICHE
Centosettantatre campioni di siero prospettivo e 135 campioni di siero retrospettivo sono stati analizzati per determinare la presenza di anticorpi IgM specifici verso l’antigene capsidico usando TRU EBV-M e due test di riferimento EIA disponibili in commercio. Una differenza nelle popolazioni dei campioni (39 campioni) è stata rilevata dai due test di riferimento IgM. Per questo motivo, un campione è stato classificato come IgM positivo o IgM negativo quando entrambi i metodi di riferimento mostravano concordanza. Lo stadio della malattia nei campioni è stato determinato attraverso analisi aggiuntive usando test EIA disponibili in commercio per anticorpi IgG specifici verso l’antigene capsidico (VCA) e l’antigene nucleare (EBNA) del virus di Epstein-Barr. Le analisi sono state eseguite presso la sede di Meridian Bioscience, Inc. e in un laboratorio di analisi indipendente. La Tabella 1 mette e confronto le prestazioni di TRU EBV-M con quelle di due kit di riferimento disponibili in commercio per il rilevamento degli anticorpi IgM specifici verso l’antigene capsidico. La classificazione dei campioni in base allo stadio dell’infezione da EBV è indicata nella Tabella 2. Non è stato possibile classificare lo stadio dell’infezione da EBV in cuatro dei 308 campioni di siero analizzati (prospettivi e retrospettivi insieme), a causa dei risultati indeterminati generati dai kit di analisi disponibili in commercio.
Tabella 1 – Confronto fra TRU EBV-M e test di riferimento per il rilevamento di anticorpi IgM specifici verso l’antigene capsidico
Test EIA EBV IgM di riferimento
TRU EBV-M
Positivo Negativo Totale
IgM positivo 76 7 83 IgM negativo 8 217 225 Totale 84 224 308 IC 95% Concordanza positiva 76/83 91,6% 83,4 – 96,5% Concordanza negativa 217/225 96,4% 93,1 – 98,5% Concordanza complessiva 293/308 95,1% 92,1 – 97,2%
Tabella 2 – Caratteristiche delle prestazioni di TRU EBV-M in base allo stadio della malattia Stato sierologico EBV Anti-VCA IgM Anti-VCA IgG
IgG Anti-EBNA
TRU EBV-M
Positivo Negativo Concordanza % IC 95% Sieronegativo
Negativo Negativo Negativo 1 112 99,1% 95,2-100%
Acuto
Positivo Positivo Negativo
71 6 92,2% 83,8-97,1%
Positivo Negativo Negativo Infezione Acuta Fase
Tardiva4
Solo VCA IgG Negativo Positivo Negativo 0 3 100,0% 29,2-100% Infezione passata
Negativo Positivo Positivo 6 100 94,3% 88,1-97,9% Indeterminato
Solo EBNA-1 IgG Negativo Negativo Positivo 1 2 66,7% 9,4- 99,2% Convalescenza/Riattivazio
ne Positivo Positivo Positivo 2 0 100,0% 15,8-100%
Non interpretabile Positivo Negativo Positivo 0 0 N/A N/A Esclusi
Non caratterizzabili mediante I metodi di riferimento
Pos/Neg/Ind Pos/Neg/Ind Pos/Neg 11 28 N/A N/A
Indeterminato per VCA IgG Pos/Neg Indeterminato Pos/Neg 3 1 75.0% (3/4) N/A
Ulteriori informazioni sulle analisi eseguite con TRU EBV-M possono essere richieste al servizio di assistenza tecnica di Meridian Bioscience Europe.
RIPRODUCIBILITÀ
La precisione del test, la variabilità intra e inter test sono state stabilite facendo riferimento a un pannello preparato con pool di campioni negativi addizionati con campioni positivi. La riproducibilità del pannello consisteva di campioni moderatamente positivi (n = 3), scarsamente negativi (n = 2), scarsamente positivi (n = 3) e altamente negativi (n =3). Questi ultimi sono stati preparati in prossimità del limite di sensibilità del test. Ciascun campione di riferimento è stato codificato per prevenirne l’identificazione nel corso dell’analisi. Ciascuno è stato valutato due volte al giorno per tre giorni consecutivi. Tutti i campioni hanno prodotto risultati corretti nel 100% dei casi. SPECIFICITÀ DEL TEST
I sieri contenenti livelli di anticorpi lgM verso il virus dell’Herpes Simplex (n = 8), il Cytomegalovirus (n = 9) o il virus della Varicella Zoster (n = 6) rilevabili tramite test disponibili in commercio sono stati analizzati con il test TRU EBV-M. Sono stati analizzati anche sieri contenenti l’anticorpo anti-nucleare (n = 8), l’anticorpo IgG specifico verso l’antigene capsidico dell’EBV e il fattore reumatoide (n = 18). Tutti i campioni sono stati classificati come negativi nel test TRU EBV-M, indicando la mancanza di reattività crociata.
ANALISI DI SOSTANZE INTERFERENTI
È stato osservato che, se presenti in campioni di siero alle concentrazioni indicate, le seguenti sostanze non hanno alcun effetto sui risultati: emoglobina (20 g/dL), bilirubina (40 mg/dL) e trigliceridi (3000 mg/dL). Per l’assistenza tecnica contattare Meridian Bioscience Europe, oppure il distributore del proprio Paese.
FRANÇAIS
(US Patent No. US D560,281S; US D561,344S; US 744,9775 B2)
Test immunologique rapide pour la détection des anticorps IgM dirigés contre
l’antigène de capside virale (VCA) du virus d’Epstein-Barr (EBV)
dans le sérum humain
751730
Dispositif médical de diagnostic in vitro
BUT DE LA METHODE
Le test TRU EBV-M est un dosage immunochromatographique rapide pour la détection qualitative des anticorps IgM spécifiques de l’antigène de capside virale (VCA) de l’EBV dans le sérum humain. Lorsque ce dosage est exécuté conjointement avec des dosages d'autres marqueurs de l’EBV, il peut aider au diagnostic d’une infection active ou récente chez les patients présentant des signes et symptômes d’une infection à l’EBV telle que la mononucléose infectieuse. Remarque : ce dosage n’est pas prévu pour être utilisé pour les donneurs de sang, les patients ayant subi une greffe ou les patients souffrant d’un cancer.
RESUME ET EXPLICATION DU TEST
Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un herpesviridae lymphotrope et épithéliotrope largement disséminé. Il est impliqué dans de nombreux troubles bénins et malins, y compris la mononucléose infectieuse (MI) aiguë et chronique, la maladie de Hodgkin, le carcinome du nasopharynx, le lymphome de Burkitt et le lymphome non hodgkinien à cellules B et T.1
L’infection à l'EBV chez les jeunes enfants est généralement moins sévère que chez les adultes, de plus les enfants sont souvent asymptomatiques. Cependant, si l’infection à l’EBV survient durant l’adolescence ou au début de l’âge adulte, on parle alors d’une mononucléose infectieuse la plupart du temps.2, 3
Au début de l’infection, les anticorps circulants IgM dirigés contre l’antigène de capside virale de l’EBV sont présents. Les anticorps IgG dirigés contre le VCA apparaissent simultanément ou peu après, alors que les anticorps IgG dirigés contre l’antigène nucléaire du virus d'Epstein-Barr (EBNA) n’apparaissent que des semaines voire des mois après la fin du stade aigu de l’infection.1
La réactivation de l’EBV est généralement associée à des augmentations de titres d’IgG VCA. Une infection ancienne à l’EBV est identifiée par l’absence d’IgM anti-VCA et par la présence d’IgG anti-anti-VCA et d’IgG anti-EBNA. Parce que les formes IgM et IgG des anticorps dirigés contre le VCA et l’EBNA apparaissent à différents stades de l’infection, des dosages sérodiagnostiques pour les types d’anticorps spécifiques peuvent être utilisés pour diagnostiquer les stades aigus et convalescents de la maladie.
Le test TRU EBV-M, lorsqu’il est utilisé conjointement avec d’autres dosages pour l’EBV tel que le TRU EBV-G de Meridian (pour la détection des anticorps IgG dirigés contre l’antigène de capside virale de l’EBV et l’EBNA), peut aider à distinguer les patients présentant des infections actives à l’EBV et une mononucléose infectieuse, des patients présentant une infection ancienne.
PRINCIPE DU TEST
Le test TRU EBV-M est un dosage immunologique à usage unique, il comprend un tube de conjugué, une bandelette réactive, un diluant pour échantillon et une solution tamponnée. Le tube de conjugué contient une bille, lyophilisat d’anticorps IgM antihumain conjugué à de l’or colloïdal. La bandelette réactive est faite d’une membrane en nitrocellulose sur laquelle se trouve, l’antigène recombinant (p18) de capside virale de l’EBV, immobilisé au niveau de la ligne de test. Le support de la bandelette réactive sert à fermer le tube de conjugué durant le test, et lors de la mise au rebus, réduisant ainsi une exposition aux pathogènes potentiels.
L’échantillon du patient est dilué avec un diluant pour échantillon contenant un absorbant qui élimine l'IgG. L’absorbant évite non seulement la formation des complexes du facteur rhumatoïde mais aussi la concurrence interférente de l’IgG durant la procédure du test. L’échantillon dilué du patient est incubé avec l’antigène recombinant (p18) de capside virale immobilisé sur la bandelette réactive (ligne de test). Tout anticorps IgM spécifique de l’antigène se trouvant dans l’échantillon se lie à l’antigène immobilisé. La bille de conjugué est alors réhydratée dans le tube de conjugué avec le tampon, puis la bandelette réactive est introduite dans le tube. L'or conjugué réhydraté se déplace sur la bandelette réactive pour atteindre la ligne de test où il réagit avec l’anticorps IgM immobilisé sur la phase solide pour produire une ligne rose-rouge. Lorsqu’aucun anticorps n’est présent, aucun complexe ne se forme et aucune ligne rose-rouge n’apparaît au niveau de la ligne de test. Une ligne de contrôle interne permet de déterminer si un flux adéquat a bien traversé la bandelette réactive durant le dosage. Une ligne rose-rouge visible doit être présente au niveau de la ligne de contrôle de la bandelette réactive chaque fois qu'un échantillon ou un contrôle est testé. Si aucune ligne de contrôle rose-rouge n'est visible, le test est considéré non valide.
MATERIEL FOURNI
Le nombre maximal de tests pouvant être réalisés à partir de ce coffret est indiqué sur la boite. 1. Bandelette réactive: bandelette réactive fixée sur un support en plastique et emballée dans une pochette
en aluminium avec un dessiccatif. L’antigène recombinant (p18) de capside virale de l’EBV est immobilisé sur la bandelette réactive au niveau de la ligne de test. Le support de la bandelette réactive est utilisé comme capuchon pour le tube de conjugué. Sur le cadre du support de la bandelette réactive se trouvent des repères indiquant où les lignes de test et de contrôle doivent apparaître. Conserver la pochette entre 2 et 8 C lorsqu’elle n’est pas utilisée. Ne pas utiliser le dispositif si l'indicateur du dessiccatif (ligne au centre du dessiccatif) vire du bleu au rose.
2. Tube de conjugué: tube en plastique bouché contenant une bille de conjugué. Le tube est emballé dans une pochette en aluminium. Le conjugué est constitué d’un anticorps IgM antihumain monoclonal lié à de l’or colloïdal. Conserver la pochette en aluminium entre 2 et 8 C lorsqu’elle n’est pas utilisée. Ne pas conserver au congélateur. Ne pas enlever le capuchon avant utilisation.
3. Diluant pour échantillon: solution tampon contenue dans un flacon compte-gouttes. L’azoture de sodium (0,094 %) est ajouté comme conservateur et l'IgG antihumain caprin comme absorbant. Le réactif est prêt à l'emploi. Conserver entre 2 et 8 Centre les utilisations.
4. Solution Tamponnée: solution protéique tampon contenue dans un flacon compte-gouttes. Contient de l’azoture de sodium (0,094%) comme conservateur. Le réactif est prêt à l'emploi. Conserver entre 2 et 8 C entre les utilisations.
5. Contrôle positif: sérum ou plasma défibriné/décalcifié contenant des anticorps IgM spécifiques de VCA de l’EBV dans une solution tampon contenue dans un flacon compte-gouttes. Contient de l’azoture de sodium (0,094%) comme conservateur. Le réactif est prêt à l'emploi. Conserver entre 2 et 8 C entre les utilisations.
6. Contrôle négatif: sérum ou plasma défibriné/décalcifié sans anticorps IgM spécifiques de VCA de l’EBV dans une solution tampon contenue dans un flacon compte-gouttes. Contient de l’azoture de sodium (0,094%) comme conservateur. Le réactif est prêt à l'emploi. Conserver entre 2 et 8 C entre les utilisations.
7. Pipettes de transfert en plastique portant les repères 25 µL, 50 µL, 100 µL et 150 µL.
8. Etiquettes « TRU EBV-M » pour les tubes de conjugué destinés au test TRU EBV-M afin de faire la distinction avec les tubes de conjugué pour les autres tests TRU.
MATERIEL NON FOURNI 1. Minuteur
2. Petits tubes pour test (p. ex. 10 x 75 mm ou 12 x 75 mm) pour effectuer la dilution 3. Mélangeur vortex (optionnel)
PRECAUTIONS D’EMPLOI
1. Tous les réactifs sont pour un usage diagnostique in vitro. 2. Lire et suivre les instructions avec soin.
3. Ne pas utiliser le diluant pour échantillon ou la solution tamponnée s’il a changé de couleur ou est trouble. La décoloration ou la turbidité peut être un signe de contamination microbienne.
4. Les bandelettes réactives et les tubes de conjugué sont emballés sous pochette en aluminium qui exclut l'humidité durant le stockage. Inspecter chaque pochette avant usage. Ne pas utiliser les bandelettes réactives ou les tubes de conjugué si leur pochette est trouée ou si elle n’est pas été complètement scellée. Ne pas utiliser la bandelette réactive si l'indicateur du dessiccatif a viré du bleu au rose. Si l'indicateur a changé de couleur, la bandelette réactive a été exposée à l'humidité. Le dessiccatif emballé avec le tube de conjugué n’a pas d’indicateur d'humidité. Cependant, si la bille de conjugué a été exposée à l'humidité, elle devient difficile à réhydrater. Si elle a été conservée correctement, la bille de conjugué se dissoudra immédiatement lorsque le tampon est ajouté. Une exposition à l’humidité des bandelettes réactives ou des tubes de conjugué peut entraîner des réactions faussement négatives.
5. Manipuler les échantillons, les contrôles et tout équipement qui les touche comme s’ils présentaient un danger biologique potentiel. Les matières premières utilisées pour la préparation des réactifs de contrôles ont été testées au niveau du donneur et, selon les méthodes d’analyse requises et approuvées par la FDA, jugées non réactives pour les antigènes ou anticorps, associés ou vis-à-vis des virus suivants: le virus de l’immunodéficience humaine VIH-1 et VIH-2, l’hépatite B, l’hépatite C. Cependant, comme aucune méthode d’analyse ne peut offrir l’assurance définitive que les agents infectieux sont absents du produit, ceux-ci doivent être manipulés selon le niveau 2 de sécurité biologique comme recommandé par le Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories du CDC/NIH.
6. Les échantillons congelés, puis décongelés, doivent être très bien mélangés avant l’analyse afin d'obtenir un échantillon représentatif.
7. Les échantillons montrant une contamination microbienne évidente ou une hémolyse sévère ne seront pas analysés car ils peuvent donner des résultats non fiables.
8. Les échantillons très lipémiques, les échantillons contaminés ou les échantillons présentant un excès de débris peuvent restreindre le flux du conjugué le long de la bandelette réactive et donner un résultat non valide. Les échantillons non contaminés qui restreignent le flux peuvent être centrifugés et analysés de nouveau.
9. Si les échantillons et les réactifs n’ont pas atteint la température ambiante (20-25 C) avant l'analyse, la sensibilité du dosage peut s'en trouver diminuée.
10. Tous les réactifs doivent être mélangés doucement avant utilisation.
11. Les flacons compte-gouttes des réactifs et les pipettes de transfert doivent être tenus à la verticale lors de la distribution pour assurer que les gouttes aient une taille correcte et qu’elles soient distribuées régulièrement.
DANGER ET MISES EN GARDE
A notre connaissance, il n’y pas de risqué connu associé à ce produit. DUREE DE CONSERVATION ET STOCKAGE
La date de péremption du coffret est indiquée sur l’étiquette du coffret. Conserver le coffret entre 2 et 8 C. REMARQUES SUR LA PROCEDURE
Ci-dessous, un schéma de la pipette de transfert TRU EBV-M.
Ci-dessous, un schéma de la bandelette réactive et du tube de conjugué TRU EBV-M.
PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS
Les échantillons de sang sont prélevés en utilisant une méthode de ponction veineuse aseptique. Aucun anticoagulant ou conservateur ne peut être ajouté. Le sérum séparé doit être analysé le plus tôt possible, mais peut être conservé jusqu'à 72 heures entre 2 et 8 C avant l'analyse. Si l’analyse ne peut être effectuée dans les 72 heures, les échantillons doivent être immédiatement congelés jusqu'au moment de l'analyse à – 20 C ou moins pendant un maximum de 30 jours. Il n’est pas recommandé de conserver les échantillons dans des congélateurs autodégivrants. Les échantillons ne peuvent pas être congelés et décongelés plus de trois fois. Avant l’analyse, laisser les échantillons de sérum atteindre doucement la température ambiante, puis mélanger doucement en évitant de faire mousser. Ne pas inactiver par chauffage les échantillons de sérum avant l'analyse.
PROCEDURE DE TEST
1. Amener tous les éléments de test, les réactifs et les échantillons à température ambiante (20-25 C) avant le test.
2. À l’aide du flacon compte-gouttes, ajouter 350 µL de diluant pour échantillon dans un tube propre libellé au nom du patient ou avec un numéro d’identification.
3. À l’aide d’une pipette de transfert fournie avec le coffret, prélever 25 µL d’échantillon de patient (1er repère à partir de l’extrémité de la pipette) et transférer l’échantillon dans le tube pour test contenant le diluant pour échantillon. Pour mélanger, passer au vortex ou agiter par rotation le contenu du tube pendant 10 secondes. Remettre la pipette de transfert dans le tube.
4. Retirer une bandelette réactive de sa pochette en aluminium et jeter la pochette. Inscrire sur le haut du support de la bandelette réactive le nom du patient ou le numéro d’identification. Placer le support de la bandelette réactive à l’endroit sur une surface propre.
5. À l’aide de la même pipette de transfert, prélever 25 µL d’échantillon dilué (1er repère à partir de l’extrémité de la pipette) et déposer l’échantillon dilué sur la bandelette réactive exactement dans la zone d’application jouxtant le « S ». Déposer l’échantillon dilué à un endroit différent peut causer des résultats erronés.
