R e v. Soc. Esp. Dolor 7: 520-525, 2000
Modulación opioide de la actividad antinociceptiva
de L-arginina en ratones
L. Chanqueo*, L. Yates*, H.F. Miranda* y G. Pinar d i *
Chanqueo L, Yates L, Miranda HF and Pinardi G. Opioid modulation of the antinociceptive activity of L-arginine in mice. Rev Soc Esp Dolor 2000; 7: 520-525.
S U M M A RY
O b j e c t i v e s :
Nitric oxide (NO) is an intercellular neuro m o d u l a t o r synthetized by NO synthetase (NOS). L-arginine (L-ARG) is converted to ornithine and NO by NOS and is involved in the L-ARG-NO pathway of nociceptive transmission and/or modulation in the CNS and in the periphery. In the p resent work, the antinociceptive activity of L-ARG was d e t e rmined and the effects of non selective and selective opioid antagonists was evaluated.
Material and methods:
The dose-response curve for the antinociceptive eff e c t of intraperitoneal (i.p.) L-ARG was determined in CF-1 mice, using the acetic acid writhing test. The dose-re s p o n-se curves were repeated after pre t reatment with the follo-wing opioid receptor antagonists: naloxone and naltre x o n e (non selective), naltrindole (δ antagonist) y norbinaltorphi-mine (κantagonist). The antinociceptive activity of a single dose of L-ARG administered intrathecally (i.t.) and intrace-re b ro-ventricularly (i.c.v.) was determined by the same al-gesiometric test.
R e s u l t s :
L-ARG i.p. exhibited a dose-dependent antinociceptive activity, with an ED5 0of 4,65 mg•k g
- 1. NOS inhibition
signi-ficatively reduced the antinociceptive effect of L-ARG. The administration by the i.t. and i.c.v. routes of a dose appro-ximately 45 times lower (0,16 and 0,15 mg.kg- 1) pro d u c e d
a comparable antinociceptive effect. The pre t re a t m e n t with all opioid receptor antagonists significantly displaced the dose-response curve for the antinociceptive activity of L-ARG to the right, indicating a pharmacologic antago-n i s m .
C o n c l u s i o n s :
Systemically administered L-ARG, through NO form a-tion and activaa-tion of cyclic GMP induce antinocicepa-tion p robably by a direct effect on peripheral nociceptors, addi-tionally activating spinal and supraspinal antinociceptive mechanisms. The relation between systemic, intrathecal and intracere b roventricular equipotent doses suggests that a major part of the acción is exerted in the CNS. The synt-hesis and release of NO facilitates in some way the activa-tion of opioid receptors at spinal and supraspinal levels and confirms the modulating action of NO in nociception. © 2000 Sociedad Española del Dolor. Published by Arán Ediciones, S.A.
Key wor d s : Antinociception. L-arginine. Nitric oxide. Opioid antagonists. Writhing test.
R E S U M E N
O b j e t i v o s :
El óxido nítrico (NO) es un neuromodulador interc e l u l a r sintetizado por la NO sintetasa (NOS). L-arginina (L-ARG) es convertida a ornitina y NO por la NOS y está envuelta en la vía L-ARG-NO de la transmisión y/o modulación no-ciceptiva, tanto en el SNC como en la periferia. En el pre-sente trabajo se determinó la actividad antinociceptiva de L-ARG y se evaluó la neuromodulación producida por an-tagonistas opioides selectivos y no selectivos.
Material y métodos:
En ratones de la cepa CF-1 se determinó la curva dosis-respuesta de la actividad antinociceptiva de L-ARG adminis-trada por vía intraperitoneal (i.p.), usando el test algesiomé-trico de las contracciones abdominales inducidas por ácido acético. Las curvas dosis-respuesta se re p i t i e ron después del p retratamiento con los siguientes antagonistas de re c e p t o re s *Programa de Farmacología Molecular y Clínica.
ICBM. Facultad de Medicina. Universidad de Chile
Recibido: 5 - 0 4 - 0 0 .
opioides: naloxona y naltrexona (no selectivos), naltrindole (antagonista δ) y norbinaltorfimina (antagonista κ). La activi-dad antinociceptiva de una dosis única de L-ARG administra-da tanto por vía intratecal (i.t.) como por vía intracere b ro-ventricular (i.c.v.) se determinó mediante el mismo test. R e s u l t a d o s :
L-ARG por vía i.p. exhibió una actividad antinociceptiva dosis-dependiente, con una DE5 0de 4,65 mg•k g
- 1. La
inhi-bición de NOS redujo significativamente el efecto antinoci-ceptivo de L-ARG. La administración i.t. e i.c.v. de una do-sis aproximadamente 45 veces menor (0,16 y 0,15 m g . k g- 1) produjo un efecto antinociceptivo comparable. El
p retratamiento con todos los antagonistas de re c e p t o re s opioides desplazó significativamente la curva dosire s-puesta de la actividad antinociceptiva de L-ARG hacia la d e recha, indicando un antagonismo farm a c o l ó g i c o . C o n c l u s i o n e s :
L-ARG administrada por vía sistémica, a través de la f o rmación de NO y activación de GMP cíclico, induce anti-nocicepción probablemente por efecto directo sobre noci-c e p t o res periférinoci-cos, anoci-ctivando menoci-canismos antinonoci-cinoci-cepti- antinocicepti-vos a nivel espinal y supraespinal. La relación de dosis sistémicas, intratecales e intracere b ro - v e n t r i c u l a res equipo-tentes sugiere que la mayor parte de su acción se ejerce en el SNC. La síntesis y la liberación de NO facilita en alguna f o rma la activación de re c e p t o res opioides tanto a nivel es-pinal como supraeses-pinal y confirma el efecto modulador del NO en la nocicepción. © 2000 Sociedad Española del D o l o r. Publicado por Arán Ediciones, S.A.
Palabras clave : Antinocicepción. L-arginina. Óxido nítri-co. Antagonistas opioides. Test de las contorsiones.
I N T R O D U C C I Ó N
El óxido nítrico (NO) es un neuromodulador inter-celular importante que está presente en el sistema ner-vioso central (SNC) y en otros tejidos (1). El NO, que es sintetizado por la NO sintetasa (NOS), produce sus efectos biológicos activando la guanilato ciclasa, lo cual produce un aumento significativo de los niveles intracelulares de GMP (1). Esta señal intracelular mo-dula diversas funciones, incluyendo la transmisión si-náptica, la regulación del apetito (2), la memoria, el aprendizaje (3) y la percepción del dolor (4). A d e m á s , el NO se libera también de sinaptosomas cerebrales de rata estimulados con N-metil-D-aspartato o kainato y la expresión de la NOS sinaptosomal, que convierte L - a rginina (L-ARG) en NO, sugiere que el NO puede funcionar como un neurotransmisor en el SNC (5).
Por otra parte, L-ARG es una fuente de NO, ya que es convertida a ornitina por la NOS y está en-vuelta en la vía L-ARG-NO de la transmisión y/o modulación nociceptiva, tanto en el SNC como en la periferia (6). Debido a que la L-ARG posee actividad antinociceptiva, se ha sugerido que la antinoci-cepción inducida por L-ARG puede ejercerse a tra-vés de la vía kiotorfina-met-encefalina en el SNC (7). Además, la L-ARG produce una analgesia rá-pida, duradera y concentración dependiente a nivel prerectal en la rata (8).
Se ha observado que numerosos fármacos produ-cen antinocicepción a través de la activación de la vía NO-GMP cíclico, tales como acetilcolina (9, 10), morfina (11-13), dipirona (14), ketorolaco (15), di-clofenaco (16) y antidepresivos (17). El NO parece jugar un rol importante en los procesos nociceptivos tanto a nivel central como periférico, sin embargo, su contribución no está totalmente aclarada. El propósi-to del presente trabajo fue el de determinar la activi-dad antinociceptiva de L-ARG, usando el test alge-siométrico, test de las contorsiones abdominales inducidas por ácido acético y evaluar la neuromodu-lación producida por antagonistas opioides selectivos y no selectivos.
M AT E R I A L Y M É TO D O S
Se usaron ratones CF-1 de un peso de 25-28 g aclimatados al ambiente del laboratorio durante por lo menos 2 horas antes de su uso y se observaron las consideraciones éticas tal como se ha descrito pre-viamente (18). En particular, la duración de los expe-rimentos fue lo más corta posible, el número de ani-males se redujo al mínimo y fueron sacrificados inmediatamente después del periodo de observación. Cada animal fue usado solamente una vez y recibió una sola dosis del fármaco en estudio. Todos los fár-macos fueron disueltos en solución salina normal y las dosis se calcularon en base a las sales.
Todas las observaciones fueron realizadas por los autores sin conocimiento del tratamiento suministra-do. La evaluación de la actividad antinociceptiva se hizo de acuerdo a lo descrito previamente (18). Bre-vemente, la administración intraperitoneal (i.p.) se realizó inyectando la dosis total de los fármacos en
estudio en un volumen constante de 10 ml.kg- 1, 30
min antes del test algesiométrico. Para la administra-ción intratecal (i.t.) se usó la técnica de Hylden y
Wilcox (19), inyectando 0,1 mg.kg- 1de L-ARG en un
volumen constante de 5 µl, 15 min antes del test
intracerebro-ventricu-lar (i.c.v.) de 0,1 mg.kg- 1 de L-ARG se realizó
me-diante una modificación del método de Haley y Mc-Cormick (20) y las inyecciones se hicieron 2 mm cau-dal y 2 mm lateral al bregma, a una profundidad de 2
mm y en un volumen constante de 5 µl, 15 min antes
del test algesiométrico. El sitio de la inyección fue comprobado mediante administración de azul de me-tileno y examen visual post mor t e m. Para el test de las contorsiones, los ratones fueron inyectados i.p.
con 10 m g•k g
- 1
de ácido acético al 0,6% y se contó el número de contorsiones durante un periodo de 5 min, comenzando 5 min después de la administración de ácido acético. Una contorsión abdominal fue definida como una contracción de los músculos abdominales acompañada de una elongación del cuerpo y exten-sión de las extremidades posteriores. Los animales controles inyectados con solución salina fueron so-metidos al test en forma concurrente con los animales tratados con fármacos, para prevenir que todos los controles fueran realizados en un grupo único de rato-nes durante el curso de la investigación. Los posibles efectos sedantes y sobre el comportamiento fueron evaluados mediante la simpe observación visual.
Los antagonistas opioides fueron administrados i.p. a los tiempos correspondientes a su efecto máximo, de-terminados previamente: naloxona (NX), antagonista no selectivo, naltrexona (NTX), antagonista no selecti-vo de mayor potencia y duración de efecto que NX (21), naltrindol (NTI), antagonista selectivo de
recep-tores δ, 30 min antes y nor-binaltorfimina (nor- B N I ) ,
antagonista selectivo de receptores κ, 60 min antes de
la administración i.p. de L-ARG. Las curvas dosis-res-puesta de L-ARG i.p. administrada después de los an-tagonistas fueron analizadas en la forma descrita
ante-riormente y se determinaron las nuevas DE5 0. La
actividad antinociceptiva (% de antinocicepción) fue expresada como la inhibición porcentual del número de contorsiones observadas en los controles inyectados con solución salina por vía i.p. (24,3 ± 1,0; n = 30), i.t. (23,9 ± 0,5; n = 25) e i.c.v. (18,7 ± 0,8; n = 36).
Los resultados se presentan como promedios ± E.S. y fueron analizados estadísticamente mediante el test de t de Student para datos no apareados. El pa-ralelismo de las curvas fue analizado de acuerdo con Tallarida y Murray (22). La significancia fue acepta-da al nivel de 5%.
R E S U LTA D O S
Actividad antinociceptiva de L-ARG
La L-ARG exhibió una actividad antinociceptiva dosis-dependiente en el test de las contorsiones
abdo-minales del ratón, sin inducir ningún cambio visible en el comportamiento o en la actividad motora de los
animales. La DE5 0obtenida a partir de la curva
dosis-respuesta produjo una antinocicepción de 50,9 ± 4,1%
( Tabla I). La administración i.p. de 30 m g•k g
- 1
de
L-ARG después de 50 m g•k g
- 1
de NG- n i t r o - L - a rginina
me-til éster (L-NAME, inhibidor específico de la NOS), dosis que posee efecto antinociceptivo pos sí misma inferior al de L-ARG, revirtió completamente el efec-to antinociceptivo de la L-ARG (Fig. 1). La
adminis-TABLA I. ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA DE
L-AR-GININA (L-ARG) Y EFECTO DEL PRETRATAMIENTO CON LOS ANTAGONISTAS OPIOIDES NALOXONA (NX), NALTREXONA (NTX), NALTRINDOLE (NTI) Y NORBINALTORFIMINA(nor-BNI) E x p e r i m e n t o D E5 0 ( m g•k g - 1) % A n t i n o c i c e p c i ó n L-ARG i.p. 4 , 6 5 5 0 , 9 ± 3 , 1 L-ARG i.t. 0 , 1 6a 5 8 , 9 ± 4 , 1 L-ARG i.c.v 0 , 1 5a 6 3 , 3 ± 7 , 8 L - A R G + N X 2 6 , 8 3 * 5 6 , 6 ± 1 0 , 5 L - A R G + N T X 1 4 , 4 2 *b 6 7 , 3 ± 8 , 6 L - A R G + N T I 1 4 , 1 3 *b 7 1 , 0 ± 2 0 , 9 L - A R G + n o r- B N I 1 4 , 8 6 *b 7 0 , 9 ± 2 6
a = Dosis única inyectada i.t. e i.c.v. * = p < 0,05 v s L-ARG i.p. b = p < 0,05 v s L-ARG + NX 0 10 20 30 Control L-ARG L-NAME L-ARG + L-NAME
*
*
Fig. 1.— Efecto de la administración de L-arg i n i n a
(L-ARG), NG- n i t r o - L - a rginina metil éster (L-NAME)
por vía intraperitoneal (i.p.) y del pretratamiento con L-NAME sobre el número de contorsiones abdomina-les inducidas por la inyección i.p. de ácido acético en el ratón.
tración intratecal e intracerebro-ventricular de 0,16 y
0,15 m g•k g
- 1
de L-ARG produjo una antinocicepción de 58,9 ± 4,1% y 63,3 ± 7,8%, respectivamente.
Efectos del pretratamiento con antagonistas o p i o i d e s
La Figura 2 muestra la curva dosis-respuesta de la ac-tividad antinociceptiva de L-ARG y su modificación por
el efecto de NX (1 m g•k g
- 1
) y de nor-BNI (1 m g•k g
- 1
). Se puede observar que ambas sustancias desplazan la curva dosis-respuesta hacia la derecha en forma paralela, in-dicando un antagonismo del efecto antinociceptivo de L-ARG. Un antagonismo similar se observa en la
Fi-gura 3, en la cual el pretratamiento con NTX (1 m g•k g
-1
)
y NTI (1 m g•k g
- 1
) también desplaza hacia la derecha en forma paralela la curva dosis-respuesta de L-ARG.
En la Tabla I se indican los valores de las DE5 0c o r r e
s-pondientes después del pretratamiento con antago-nistas. Se observa que el mayor efecto se obtuvo con el pretratamiento con NX y que el efecto de los otros antagonistas fue muy similar.
D I S C U S I Ó N
En diversos nervios periféricos, en el asta poste-rior de la médula y posiblemente en otras partes del SNC, el NO puede formarse presinápticamente y puede actuar como un neurotransmisor o neuromodu-lador no adrenérgico-no colinérgico. Hallazgos re-cientes han demostrado que el NO se produce enzi-máticamente en estructuras post-sinápticas en respuesta a la activación de receptores de aminoáci-dos excitatorios (23) y puede actuar como un mensa-jero retrógrado para iniciar la liberación presináptica de glutamato, uno de los transmisores excitatorios claves en el SNC usado en la transferencia de infor-mación entre neuronas. El glutamato liberado de las neuronas aferentes primarias facilita la transmisión en la primera sinapsis del asta posterior de la médu-la. Además, la formación de NO en respuesta a la ac-tivación de receptores de NMDA implica que NO es un mediador de los efectos antinociceptivos induci-dos por NMDA y los antagonistas de receptores de aminoácidos excitatorios producen un efecto antino-ciceptivo, parcialmente mediado por opioides
endó-100 75 50 25 0 0,3 1 3 10 30 100 DOSIS (mg•kg-1) L-ARG + nor-BNI 1 + NX 1
Fig. 2.—Efectos del pretratamiento con nor- b i n a l t o r f
i-mina (nor-BNI, 1 mg.kg- 1) y naloxona (NX, 1 mg.kg- 1)
sobre la curva dosis-respuesta de la actividad antinoci-ceptiva de L-arginina (L-ARG) administrada por vía in-traperitoneal en el test de las contorsiones del ratón. El desplazamiento paralelo de las curvas es estadística-mente significativo (p < 0,05). 100 75 50 25 0 0,3 1 3 10 30 100 DOSIS (mg•kg-1) L-ARG + NTX 1 + NTI 1
Fig. 3.— Efectos del pretratamiento con naltrexona
(NTX, 1 mg.kg- 1) y naltrindole (NTI, 1 mg.kg- 1) sobre la
curva dosis-respuesta de la actividad antinociceptiva of L - a rginina (L-ARG) administrada por vía intraperito-neal en el test de las contorsiones del ratón. El despla-zamiento paralelo de las curvas es estadísticamente sig-nificativo (p < 0,05).
genos (23,24). Todas estas consideraciones tienden a apoyar rol determinante del NO en la promoción del procesamiento de la información nociceptiva en la médula espinal (1,25).
Los resultados del presente estudio indican que -L-ARG posee actividad antinociceptiva al ser admi-nistrada sistémicamente en un modelo de dolor vis-ceral en el ratón y que este efecto es antagonizado por la inhibición de la NOS. Es interesante notar que la administración de L-ARG directamente en el SNC, tanto a nivel espinal (i.t.) como supraespinal ( i . c . v.), en una dosis aproximadamente 45 veces me-nor que la DE 50 obtenida para la vía i.p., produjo un efecto antinociceptivo equivalente, lo cual sugie-re que la mayor parte de su acción se ejerce en el SNC. El efecto antinociceptivo de L-ARG adminis-trada por vía i.c.v. ha sido atribuido a un aumento en la formación de kiotorfina, un dipéptido antinoci-ceptivo endógeno sintetizado por la enzima kiotorfi-na sintetasa a partir de L-tirosikiotorfi-na y L-arginikiotorfi-na, el cual al incrementar la liberación de encefalina en el cerebro (26,27), ejercería su efecto antinociceptivo a través de receptores opioides y activación consi-guiente de la vía inhibitoria noradrenérgica descen-dente. La L-ARG posee alta afinidad para esta enzi-ma (28) y este hecho explicaría que por vía i.c.v. se obtiene un efecto antinociceptivo similar con dosis 45 veces menores que por vía i.p. Además, estos re-sultados son parcialmente concordantes con los ob-tenidos por Xu y Tseng (29), quienes demostraron que L-ARG administrada solamente por vía i.c.v. es capaz de potenciar los efectos de beta-endorfina en el test de la cola en ratones; la diferencia entre am-bos hallazgos podría deberse a diferentes protocolos experimentales (test de la cola v s test de las contor-siones). Debido a que se ha demostrado que la acti-vidad de kiotorfina sintetasa se encuentra también en la médula espinal (26) y que un efecto antinoci-ceptivo equivalente de L-ARG por vía i.t. se obtiene con la misma dosis que por vía i.c.v., no se puede descartar que la vía L-ARG-kiotorfina esté involu-crada también a nivel espinal. La antinocicepción ejercida por kiotorfina es antagonizada por naloxona y por naltrindole (7,26), demostrando la
interven-ción de receptores opioides del subtipo δ en este
proceso. En el presente trabajo, los antagonistas de
receptores opioides de los subtipos µ, δ y κ r e d u c e n
significativamente el efecto antinociceptivo de L-ARG, desplazando las curvas dosis-respuesta en for-ma paralela hacia la derecha, observándose un
incre-mento significativamente mayor de la DE5 0 d e
L-ARG por efecto del pretratamiento con NX que con los otros antagonistas opioides. Este resultado
puede ser explicado porque NX antagoniza no selec-tivamente todos los subtipos de receptors opioides, mientras que NTX, NTI y nor-BNI son antagonistas más selectivos (21). Estos resultados apoyan el me-canismo propuesto por Kawabata y cols. (7,26) para explicar el efecto antinociceptivo de L-ARG admi-nistrada por vía sistémica, la cual, a través de la for-mación de NO y activación de GMP cíclico, induci-ría antinocicepción probablemente por efecto directo sobre nociceptores periféricos, promoviendo además la síntesis de kiotorfina en el SNC y activan-do mecanismos antinociceptivos dependientes de la activación de receptores opioides a nivel espinal y supraespinal (Fig. 4). La síntesis y la liberación de NO facilita en alguna forma la activación de recep-tores opioides tanto a nivel espinal como supraespi-nal y confirma el efecto modulador del NO en la no-c i no-c e p no-c i ó n .
A G R A D E C I M I E N TO S
Los autores desean agradecer a J. López y A. Co-rrea su experta ayuda técnica. Parcialmente financia-do por Fondecyt, Proyecto Nº 1.990.842.
NO NOS KTP KTPS GMPc Met-encefalina Receptores opioides Nociceptores ? Receptores NMDA
Vía inhibitoria noradrenérgica
ANTINOCICEPCIÓN PERIFÉRICA
ANTINOCICEPCIÓN SNC L-ARG
Fig. 4.—Mecanismos posibles para la modulación
noci-ceptiva de L-arginina (L-ARG) en el SNC y en la peri-feria. KTP = kiotorfina. NOS = óxido nítrico sintetasa. KTPS = kiotorfina sintetasa.
B I B L I O G R A F Í A
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G. Pinardi
Facultad de Medicina. Universidad de Chile Casilla 70.000, Santiago 7, Chile
