TESI DOCTORAL
Programa de Doctorat: Bioquímica i Biologia Molecular. Bienni: 1996-1998
ESTUDI DELS MECANISMES IMPLICATS EN LA
REGULACIÓ HORMONAL I CÈL.LULA ESPECÍFICA DEL GEN DE LA KIDNEY ANDROGEN-REGULATED PROTEIN (KAP), EN EL RONYÓ DE
RATOLÍ.
Memòria presentada per Montse Soler i Codina per optar al grau de Doctora en Bioquímica i Biologia Molecular
Tesi doctoral realitzada al Centre d’Investigacions en Bioquímica i Biologia Molecular dels Hospitals Vall d’Hebron, sota la direcció de la Dra. Anna Meseguer Navarro
Tesi adscrita al departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Ciències, Universitat Autònoma de Barcelona
Tutor: Dr. Simó Schwartz Riera
La interessada: La directora de Tesi:
Montse Soler i Codina Dra. Anna Meseguer Navarro Universitat Autònoma de Barcelona
ÍNDEX
INTRODUCCIÓ
I. Control transcripcional de l’expressió gènica en eucariotes. Aspectes generals
II. Les hormones en el control de l’expressió gènica
II.a. Hormones esteroïdals, tiroïdals, vitamina D i àcid retinoic
II.a.1. Receptors
A) Estructura
B) Mecanismes d’acció hormonal a) Unió a DNA
b) Proteïnes reguladores c) Fosforilació
d) Efectes no genòmics de les hormones esteroïdals i tiroïdals
II.b. La cromatina en la regulació hormonal
2 10 10 13 14 16 16 17 22 25 27 1
II.c. Regulació androgènica i tiroïdal
II.c.1. CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs)
II.d. GH i IGF-I
II.d.1. Mecanismes d’acció de GH i d'IGF-I
III. El ronyó de ratolí
III.a. El ronyó com a model de l’acció androgènica
III.b. Descripció anatòmica
III.c. Túbul contornejat proximal
IV. El model cel.lular: Línies cel.lulars de túbul proximal renal murí
V. La Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) com a model d’estudi del control multihormonal de l’expressió gènica en el ronyó
V.a. Control multihormonal de l’expressió del mRNA de KAP 30 35 38 40 42 42 42 45 48 50 51
V.b. Seqüència genòmica de KAP
V.c. Seqüència nucleotídica del cDNA de KAP
V.d. Anàlisi computacional i funcional de la proteïna KAP
OBJECTIUS
MATERIAL I MÈTODES
I. Animals i tractaments I.a. Castració
I.b. Tractament amb KClO4 1%
I.c. Tractament amb 3,5,3’-triiodotironina (T3) I.d. Tractament amb hormona de creixement (GH) I.e. Sacrifici dels animals
I.f. Disseny experimental
I.f.a. Anàlisi de la necessitat de T3 postnatal I.f.a.1. Per administració exògena de T3 I.f.a.2. Per substitució del KClO4 1% per aigua
II. Hibridació in situ
56 59 60 62 65 66 66 66 67 67 67 68 68 68 69 70
II.a. Preparació de seccions de teixit i tractament dels portaobjectes
II.b. Preparació de material lliure de ribonucleases II.c. Síntesi de sondes de RNA
II.c.1. Preparació del motlle de la transcripció
in vitro
II.c.2. Reacció de transcripció in vitro II.c.3. Protocol d’Hibridació in situ II.c.4. Autorradiografia
III. Cultiu cel.lular
III.a. Línies cel.lulars III.b. Medis de cultiu
III.c. Deplecció d’hormones esteroïdals i tiroïdals del sèrum boví fetal
III.d. Hormones III.e. Tripsinització
III.f. Contatge de cèl.lules III.g. Congelació
III.h. Descongelació
III.i. Clonació per dilució al límit
IV. Soques bacterianes
V. Vectors 70 71 72 72 73 76 77 79 79 79 80 81 82 83 83 84 85 86 86
VI. Clonatge de DNA
VI.a. Preparació del vector i de l’insert VI.b. Clonatge de productes de PCR VI.c. Reacció de lligació
VI.d. Electro-transformació amb elevada eficiència d’E. coli
VI.d.1. Preparació de bacteries competents VI.d.2. Electroporació
VII. Puricació i extracció d’àcids nucleics
VII.a. Extracció de RNA total de teixit i de cèl.lules VII.b. Purificació de DNA plasmídic a petita escala
(Miniprep)
VII.c. Purificació de DNA plasmídic a gran escala (Maxiprep)
VII.d. Digestió del DNA
VII.e. Electroforesi de DNA de gels d’agarosa VII.e.1. Electroforesi analítica
VII.e.2. Electroforesi preparativa
VII.f. Obtenció de DNA a partir de gels d’agarosa VII.g. Purificació de productes de RT-PCR o PCR
VIII. RT-PCR semiquantitativa VIII.a. Plàsmids VIII.b. Oligonucleòtids 90 90 91 92 93 94 95 96 96 98 98 98 99 99 99 99 100 100 101 102
VIII.c. Condicions d’amplificació VIII.c.1. Transcripció reversa (RT) VIII.c.2. PCR
VIII.d. RT-PCR semiquantitativa en un sol pas VIII.e. RT-PCR semiquantitativa en dos passos
IX. Seqüenciació automàtica
X. Extracció de proteïna
X.a. Separació de la fracció nuclear a partir de: X.a.1.Extracció de proteïna a partir de teixit X.a.2.Extracció de proteïna a partir de cèl.lules X.b. Mètode de Bradford
XI. Western blot
XI.a. Electroforesi i transferència de proteïnes XI.b. Immunodetecció de la proteïna
XII. Assaig de retardament en gel (EMSA)
XIII. Mutagènesi dirigida XIII.a. Protocol
XIII.b. Oligonucleòtids
XIV. Transfecció transitòria
103 103 104 104 105 107 109 109 109 111 111 112 113 114 116 117 117 120 122
XIV.a. Plàsmids
XIV.b. Protocol de transfecció transitòria XIV.c. Assaig CAT
XIV.c.1. Preparació d’extractes cel.lulars XIV.c.2. Reacció β-galactosidasa
1- Colorimetria 2- Fluorimetria XIV.c.3. Reacció CAT XIV.d. Assaig Luciferasa
XIV.d.1. Preparació d’extractes cel.lulars XIV.d.2. Reacció dual luciferasa
RESULTATS
I. Determinació del període del desenvolupament murí en el que la T3 permet la resposta cortical dependent d’andrògens del gen del KAP
I.a. Efecte de T3 i GH en la resposta cortical del gen del KAP en ratolins C57BL/6 amb hipotiroïdisme postnatal
I.b. Diferències en l’expressió cortical mitjançada per T3 en mascles i femelles C57BL/6 122 124 126 126 127 127 128 128 130 130 130 131 132 132 139
II. Estudi de la relació entre l’hormona tiroïdal, les C/EBPs i l’expressió del gen del KAP en el ronyó murí durant el desenvolupament postnatal
II.a. Expressió endògena de KAP, C/EBPα i C/EBPβ en ratolins mascles C57BL/6 control, hipotiroïdals i castrats, a nivell transcripcional i de proteïna (C/EBPα i C/EBPβ)
II.b. Efecte de la T3 sobre p42C/EBPα i p35C/EBPβ i la capacitat de transactivació del gen del KAP
III. Determinació de la capacitat de resposta a andrògens de les línies cel.lulars renals PKSV-PCT i PKSV-PR, utilitzant com a model el gen del KAP
III.a. Clonació de PKSV-PCT i PKSV-PR
III.b. Transactivació dependent d’andrògens del promotor del gen del KAP en PCT3 i PR10
III.c. Especificitat cel.lular del promotor del gen del KAP
III.d. Assaig de retardament en gel del putatiu element de resposta a andrògens (ARE)
140 141 143 145 146 147 149 151
III.e. Assaig funcional de l’element de resposta a andrògens (ARE)
IV. Correlació de la regulació multihormonal del gen del KAP observada en el ronyó de ratolí amb el comportament del promotor de KAP en les línies cel.lulars renals PKSV-PCT i PKSV-PR
IV.a. La T3 i el promotor del gen del KAP en PCT3
IV.b. Expressió endògena del gen del KAP en PCT3 i PR10
IV.c. L’IGF-I i el vanadat sòdic modifiquen la capacitat de transactivació dependent d’andrògens del promotor del gen del KAP en PCT3 i PR10
IV.d. Assaig funcional de la capacitat transactivadora de C/EBPα i C/EBPβ sobre el promotor de KAP
IV.e. Expressió endògena de C/EBPα i C/EBPβ en PCT3 i PR10
IV.f. Identificació de dos putatius elements de resposta a proteïnes de la família de C/EBPs
153 155 155 157 159 163 165 169
IV.g. Andrògens i C/EBPs en la transactivació del promotor del gen del KAP
IV.h. Expressió endògena d’AP-2 en PCT3, PR10 i ronyó murí
IV.i. Assaig funcional d’AP-2α amb el promotor de KAP
V. Model proposat DISCUSSIÓ CONCLUSIONS BIBLIOGRAFIA ABREVIATURES AGRAÏMENTS 172 175 176 178 181 209 214 247 252
