ELISA y Western
Blot
Prof. Edwin Escobar
Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina
Escuela de Medicina “José María Vargas” Cátedra de Inmunología
Práctica 1
Aplicaciones Diagnósticas de las Interacciones
Ag/Ac
ELISA
Ensayo de Inmunadsorción Ligado a Enzima
E
nzyme-
L
inked
I
mmuno
S
orbent
A
ssay
•
Mide la cantidad de complejo Ag/Ac formado
• Utiliza reactivo detector conjugado a una enzima
•
Reacción colorimétrica en presencia de sustrato
cromógeno
•
Intensidad de color proporcional a cantidad de complejo
Ag/Ac
ELISA Indirecto
•
Detección de
anticuerpos específicos
en el suero del paciente
•
Aplicaciones:
•Diagnóstico de Infección o exposición a microorganismos
•Detección de Autoanticuerpos •Respuesta a Inmunizaciones/Vacunas Fase de Captura Ag de VIH-1 Proteínas Recombinantes
Diagnóstico de Infección por VIH-1
Fase de Detección Anti-IgG Conjugados a Enzima Lavado Revelado Reacción de Color Sustrato Cromógeno Lavado Marcador Identificado IgG anti-VIH-1 Anticuerpos en Suero del Paciente
Agregar
ELISA Tipo Sándwich
•
Detección de
antígenos específicos
en el suero del paciente
•
Aplicaciones:
•Detección de Ag microbianos
•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.
Fase de Captura
Ac Anti-HBsAg
Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de Hepatitis B
Fase de Detección Anti-HBsAg Conjugados a Enzima Lavado Revelado Reacción de Color Sustrato Cromógeno Lavado Marcador Identificado HBsAg Antígeno en Suero del Paciente
Agregar
Anti-h-CG
ELISA Competitivo
•
El antígenos específico en el suero del paciente compite con el
antígeno unido a la fase sólida para unirse al anticuerpo.
La intensidad de color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra•
Aplicaciones:
•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.
Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG)
Fase de Captura h-CG Proteínas Recombinantes IgG Fase de Detección Anti-IgG Conjugados a Enzima Lavado Revelado Reacción de Color Sustrato Cromógeno Lavado Marcador Identificado h-CG Hormona en Suero del Paciente
Agregar
Técnica de
ELISA
Ventajas
Alta sensibilidad y alta
especificidad
Cuantitativa
Relativamente económica
Se pueden procesar hasta
96 muestras por placa
Gran estabilidad.
Positividad Vs. Infección
activa
: depende del tipo de
anticuerpo evaluado. A
menos que se evalúe
presencia de antígenos en la
muestra problema
Dificultad de detección de
Acs en pacientes con alguna
inmunodeficiencia, en
período de ventana o
infectados por cepas
desconocidas.
Limitaciones
ELISA
Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Infección
por VIH-1
p24
de VIH-1ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1Días
de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de
1ra. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Sensibilidad Limitada
Proteínas Celulares Contaminantes
Reactividad Cruzada
Fase de Captura Ag de VIH-1 Lisado Viral (Cultivo Celular) Marcador Identificado IgG anti-VIH-1 Anticuerpos en Sangre del PacienteFase de Detección Anti-IgG Conjugados a Enzima Revelado Reacción de Color Sustrato Apropiado
ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección
por VIH-1
p24
de VIH-1ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1Días
de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de
2da. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf Fase de Captura Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes Marcador Identificado IgG anti-VIH-1/VIH-2 Anticuerpos en Sangre del Paciente
Fase de Detección Anti-IgG Proteína A Conjugados a Enzima Revelado Reacción de Color Sustrato Apropiado
VIH-1, VIH-2
Mejora Sensibilidad
No Proteínas Celulares Contaminantes
Mejora Especificidad
ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección
por VIH-1
p24
de VIH-1ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1Días
de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de
3ra. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf Fase de Captura Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes Marcador Identificado IgM e IgG anti-VIH-1/VIH-2 Anticuerpos en Sangre del Paciente
Fase de Detección Ag Virales Conjugados a Enzima Revelado Reacción de Color Sustrato Apropiado
VIH-1, VIH-2
Detecta IgM e IgG
ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección
por VIH-1
p24
de VIH-1ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1Días
de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de
4ta. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf Revelado Reacción de Color Sustrato Apropiado Fase de Captura Anti-p24 Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes Marcador Identificado Ag p24 IgM e IgG anti-VIH-1/VIH-2 Ac y Ag en Sangre del Paciente
VIH-1, VIH-2
Detecta Antígeno Viral (p24)
Detecta IgM e IgG
Detección más Temprana
Fase de Detección Anti-p24 Ag Virales Conjugados a Enzima EARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección
por VIH-1
p24
de VIH-1ARN
de VIH-1Anticuerpos
anti-VIH-1Días
de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de Seroconversión
Período de
Eclipse
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf Neonatos
WESTERN BLOT
Western Blot
Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos celulares o de tejidos.
Etapas:
1. Preparación de la muestra
2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de poliacrilamida)
3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa ) 4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.
Western blot
Aplicaciones:
Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular
Permite identificar antígenos inmuno-dominantes para vacunas. Estudiar perfil de citocinas.
Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra. Factores de crecimiento
Niveles de fosforilación, modificaciones post-traduccionales, etc.
Diagnóstico:
Prueba confirmatoria de VIH
Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada “enfermedad de las vacas locas”
