Carrera de Especialización en Bioquímica Clínica Endocrinología IV: Módulo Testículo y Semen

El laboratorio de semen

en la reproducción asistida

Bioq. Patricia Chenlo

Laboratorio de Fertilidad Masculina. UBA Octubre de 2015

Carrera de Especialización

en Bioquímica Clínica

Ovocito en metafase II

(maduro)

Espermatozoide maduro

eyaculado

+

CAPACITACIÓN



remoción



alteración



adquisición de componentes de la membrana

plasmática

Cambios metabólicos y estructurales que ocurren durante

su transporte y permanencia en el tracto femenino.

CAPACITACIÓN

– HIPERACTIVACION

Desarrollar un patrón distintivo de movilidad

– REACCIÓN ACROSOMAL

Para la penetración de las envolturas del

ovocito.

2

mecanismos de guía:

Termotaxis y quimiotaxis

Movimiento espermático

+

Arrastre pasivo

Penetración de la corona radiada

capa muy celular

matriz intercelular formada por proteínas

Unión a la zona pelucida y penetración

zona pelucida

matriz glicoproteica acelular

ZP1 (200.000 daltons)

ZP2 (120.000 daltons)

Reacción acrosomal

• aumento de Ca,

• aumento de pH,

• proteínas fosforiladas por vía del DAG y del AMPc,

desencadenan los procesos moleculares fusogénicos que dan lugar a las primeras manifestaciones de la RA:

múltiples fusiones entre la membrana acrosómica externa y la membrana plasmática del espermatozoide

Reacción acrosomal

Unión a la zona pelucida y penetración

denudación

penetración de la m. pelucida Reación Acrosomal

Luego de un breve periodo en el espacio perivitelino hace contacto con el ovocito en dos fases:

1- se fija 2- se fusionan las membranas



Bloqueo de la polispermia

COMIENZO DE LA PRIMERA DIVISIÓN DE LA CÉLULA HUEVO Desarrollo embrionario

BLASTOCISTO

4 días

Tratamiento de Reproducción Asistida

TRA

Baja complejidad _{Alta complejidad}

Inseminación Artificial

Intrauterina

IIU

Intra

Cervical

ICSI

FIV

Fertilización In Vitro

Tratamiento de Reproducción Asistida TRA Baja complejidad Inseminación Artificial Intrauterina

IIU

ICSI

FIV

Fertilización In Vitro

Técnicas de Selección Espermática

Swim up

o

sobrenado

Swim down

o

Gradientes de densidad

Equipamiento

Centrifugas

Platinas termostatizadas

Estufa de cultivo a 37°C con atmosfera de co2 al 5%

Indispensable si se utilizan medios de cultivo con Hepes

Tubos de centrifuga estériles

Pipetas Pasteur estériles

Jeringas

Filtros Millipore de 0,2 um

Crioviales estereriles de 2 mL

Campana con flujo laminar

Reactivos:

Medios de cultivos: HAM F10; HTF (human fluid tubal)

Técnica de Swim up

Medio de Cultivo

Fuente de Energía: Piruvato, lactato, glucosa

Fuentes de Iones: Bicarbonato, Calcio

ATB: Penicilina, Streptomicina

Buffer Hepes (reemplaza el HCO₃-CO₂ para regular el pH y permite trabajar sin necesidad de disponer de estufa gaseada)

Rojo fenol

Fuente Proteica: suplementos séricos sintéticos, suero inactivado de la paciente, albúmina sérica humana

Swim up

o

Espem móviles Espem. inmóviles Plasma seminal

Swim down

o

Gradientes de densidad

Partículas de silica recubiertas de silano PureSperm

Evaluación del semen antes de comenzar

la selección y posterior a la selección

Semen

MP totales del semen

Volumen (mL) x cc (Esp/mL) x %MP

Producto de Selección

MP totales seleccionados

Volumen ajustado (mL) x cc post selec.(Esp/mL) x %MP p.selec

Valor pronóstico

MP totales seleccionados

Volumen ajustado (mL) x cc post selec.(Esp/mL) x %MP p.selec

Mayor a 5 x 106 _{espermatozoides MP recuperados IIU}

1,5 x 106 _{espermatozoides MP recuperados FIV}

Menos de 1,5 x 106 _{espermatozoides MP recuperados ICSI}

IIU

- Indicaciones

Factor cervical (Incompatibilidad moco cervical-semen. Mala calidad o cantidad de moco cervical)

Factor coital

Factor masculino leve a moderado

Endometriosis leve

Disfunción ovulatoria

Factor peritoneal unilateral

ESCA

Paternidad diferida (con semen homologo criopreservado): enfermedades que requieren de quimioterapia, enfermedades cronicas, etc.

Parejas HIV: serodiscordantes o ambos infectados (para evitar sobreinfecciones)

IIU

- Condiciones

Al menos una trompa permeable.

Recuperación espermática > 5x106_/ml

Ausencia de factor inmunológico en el semen

Probabilidad de Embarazo 10 a 20 % por intento

No mas de 3 a 6 intentos, si fracasa

Material biológico posible de emplear en TRA

 Semen

 Orina

 Biopsias o punciones de epidídimo (MESA- PESA)

Tratamiento de Reproducción Asistida TRA

FIV

ICSI

FIV

FIV

- Indicaciones

Factor tubárico no quirúrgico

Factor Masculino (concentración/ml de espermatozoides post swim up > 2.5 millones)

Fracaso de tratamientos de baja complejidad previos.

 Disminución de reserva ovárica.

 Edad mayor a 38 años

ICSI

ICSI

- Indicaciones

Factor Masculino Severo (concentración/ml de

espermatozoides post swim up < 2.5 mill; Kruger < 4-6).

Falla de fertilización previa.

Criptozoospermia

Azoospermia.

Por estrategias moleculares

Selección espermática mediada por ácido hialurónico - PICSI

Separación por Annexin V -MACS (magnetic-actived cell sorting)

Nuevas Estrategias de Selección espermática

Por propiedades físicas

Selección ultraestructural IMSI

MOLECULA DE ANNEXINA V

Anexina V:

Marcador de la exposición de fosfatidil

Anexina + = PS expuesta

Apoptosis = PS expuesta

Anexina + = Apoptosis

Magneto de alto poder

+

Dra Vanesa Rawe

Eluído final que se recoje en tubo cónico y se usa para ICSI

Selección Morfológica de alta magnificación

Motile sperm organelle morphology examination (MSOME)

•Microscopio invertido.

•Óptica de contraste inter-diferencial (DIC). •Lentes.

•Digitalización. •Zoom.

Desarrollo in vitro de los embriones

El consenso científico general establece que el

procedimiento de selección espermática empleado

debe dar seguridad con respecto a:



la viabilidad de la gameta



los efectos a largo plazo sobre el embarazo logrado