c.a. ljijbima d. MEXICO , Desarrollo de un proceso

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d.

MEXICO

Desarrollo de un proceso de

fermentación en la producción de vacuna pertussis

L.RECAMIER •

A. MEDINA" H. RODRÍGUEZ •••

Rccamler, L; Medina, A.; Rodriguez. n.: Desarrollo de un proceso de fenneDtadón en la producción de vacuna pertussls. Sal. Púb. Méx., xxm, .563- 57 3, 1981.

Re!IiUmeo:se describe el desarrollo en matraz y fer-mentadores de 14 litros. de la producción de vacuna

pertussis en el Instituto Nacional de Higiene. Varios

INTRODUCCION /'

E

l objetivo de este estudio fue encontrar las condiciones para producir vacuna pertussis por cultivo sumergido empleando los recursos de equipo, reactivos y personal del Instituto Nacional de Higiene.

Para abordar este cambio se utilizaron las valiosas experiencias de Hornibrook.' Cohen-Wheeler," Rowatt,' Stainer W y Van Hemert "

sobre la producción de vacuna pertussis. • Jefe del área microbiológica de la sección de fer-mentaciones del Instituto Nacional de Higiene.

•• Jefe de la sección de fermentaciones del Instituto Nacional de Higiene.

••• Ex-Jefe del laboratorio de producción de vacuna

pertussis del Instituto Nacional de Higiene.

NOVIEMBRE-DICIEMBRE 1981

ajustes y modificaciones a métodos. equipo y medio de cultivo originales fueron necesarios para producir esta vacuna.

Las razones para cambiar a producción de vacuna pertussis por fermentación fueron las de aumentar la producción y mejorar su cali-dad al fabricarlas con mayores posibilicali-dades de controlar las condiciones de su proceso.

1

~ MATERIAL Y METODOS

Los cultivos usados fueron cinco cepas de

BordeteJ/a pertussis; tres cepas fueron de

Mi-chigan con los números 18,904, 18,334 y 10,536 que se usaban en cultivo estacionario en el Instituto Nacional de Higiene y otras dos cepas de origen holandés, la 509 y la l 34 adaptadas especialmente a cultivo su-mergido.

El medio de cultivo base fue el de Stainer con la siguiente fórmula por litro de medio:

563

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Ingrediente Vol. en mi gil A Acidos casamínicos (solución al 5% ) 300 15 B Acido nicotínico (solución al 0.01 % ) lO 0.001 C MgCI,·6H,0 (solución al 1% ) 2.5 0.025 O K,HPO. (solución al 10%) 2.5 0.25 E NaCl 5.0 F csci, (solución al 0.01%) 2 0.002 G KCI (solución al 2% ) 10 0.20 H Glutation (solución al 1% ) 100 0.001 I Almidón (solución al 0.1 % ) 20 1.0 J FeSO.·7H,0 (solución al 0.14%) 10 0.014 K CuSO,·5H,0 (solución al 0.05%) I 0.0005 L Agua destilada 1,000 1,000 Ingrediente

Recamier, L; Medina, A. y Rodrigue.. H.

La solución al 5% de casarninoácidos se prepara en agua y se le agrega 0.3 gil de carbón activado para absorber sustancias tó-xicas que afecten el crecimiento de la

Borde-leila. se agita la suspensión fuertemente y se

filtra por filtro de asbesto K-5. Al filtrado se agregan los demás ingredientes del medio de cultivo y después de homogenizar se ajusta el pH a 6.9 con NaOH ION y se esteriliza a

121 "C por 20 minutos.

Este medio de cultivo base se ajustó en matraces siguiendo un diseño experimental en el que algunos ingredientes: A (ácidos ca-samínicos), B (ácido nicotínico) H (gluta-tion) e I (almidón) se hicieron variar en la forma siguiente:

Ingrediente Nivel basal

A 200 280 120

B 10 15 5

H 100 150 50

I 20 25 15

Las cifras son volúmenes en mi de las so-luciones de la fórmula antes mencionada por litro de medio de cultivo.

Para tener control sobre el número de me-dio de cultivo probado en cada mg se hizo el siguiente diseño experimental:

Base A 120 280 200 5/~15 5/~15 B 10

/

-.

/

-,

/

-,

/

-,

H 50 150 50 150 50 150 . 50 ₁₅₀ 100

1\

1\ 1\

1\

1\ 1\

1\

I\.

I 20 25 20 25 20 25 20 25 20 25 20 25 20 25 20 25 20

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tt+t+t++

Medio núm. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1I 12 13 14 15 16

De ..arrollo de un proce ..o de fermentación para vacuna pertussi ..

Los resultados se sometieron al tratamiento estadístico de Box Wilson' para encontrar entre los 16 medios de cultivo probados. el mejor.

La semilla se inoculó. Tanto para matraces como para fermentadores se hizo del siguien-te modo: los cultivos liofilizados se reconsti-tuyeron con solución de casa mino ácidos al 5 % y se sembraron por la técnica de estría cruzada en Bordet Gengou (BG). Después de 48 horas de incubación a 35 .C se aislaron colonias de morfología típica de Borde/ella

pertussis en fase 1 por la técnica de Lincoln."

Estas colonias se sernbraron en tubos de BG incubándose 48 horas a 35

e.

y finalmente en matraces Erlcnrncyer de 500 mi que

con-tenían 100 mi de medio de Stainer.

scrnbrán-dose un matraz con la suspensión obtenida de un tubo de BG. Estos matraces se incubaron a 200 r.p.m. por 24 horas a 35 -C en un agi-tador rotatorio New Brunswick modelo G-25. Esta semilla sirvió para los estudios en ma-traz. Para los estudios en .ermcnrador. el medio de Stainer se sustituyó por el HBP-I

(Higiene Bordetella pertussis 1) que se en-centró en los experimentos en matraz: además

't' agrcgú un pase en garrafón de cuatro litro .. que contcnia 1.500 mi de medio de cultivo HBP-I ) que se incubó por 18 horas a 200 r.p.m. y a 35 C en un agitador Ncw Bruns-wick (¡-53.

En el matraz Erlcnmeycr se hicicron los ..iguicnrcs estudios:

ti) Selección de cepas de trabajo. Se

inocu-laron con 10';, de inóculo matraces de 500 mI con 100 mi de Stainer. Los inóculos fue-ron la, cepas de Borde/ella pertussis 18,904,

18.33-1. 10.536. 134 Y 509. Se incubaron en un agitador rotatorio G-25 con las siguientes condiciones: 300 r.p.m.z Jf 'C/72 horas y se

determinó el crecimiento en cada caso.

b ) Velocidad óptima de agitación. varian-do ésta a 100. 150, 200, 250 y 300 r.p.m. con las siguientes condiciones: agitador G-25. lor; de inóculo volumen/volumen. 35

0e.

72 horas. 100 mI de medio de Stainer en matra-ces Erlcnrneyer de 500 mI.

e) Concentración óptima de inóculo. con

variación de l a 10% con incrementos de 1%.

"OVIEM BRE-DICIEMBRE 1981

Condiciones: medio de Stainer, G-25, 35 'C, 72 horas. 100 mi de medio, matraces de 500 mi. 200 r.p.m,

d) Optimización de medio de cultivo. Por

la técnica que ya se explicó en la preparación de medio de cultivo.

e) Curva de crecimiento. Las condiciones

fueron: medio HBP-I, So/e de inóculo v l v , 200

r.p.m., G-25. 35 'C, cultivo seguido por 50 horas.

En fermentadores New Brunswick CSF-314 de 14 litros con 10 litros de volumen de tra-bajo, se hicieron los siguientes experimentos:

a) Estudio de volumen óptimo de inóculo.

Los val úmenes de inóculo probados fueron: 5, 10, 15 Y 20% v/v. Las condiciones de la prueba: 700 r.p.m./35 'C /48 horas/0.2 volú-menes de aire por volumen de medio por mi-mito. medio HBP-l.

¡,) Aereación óptima. La aereación se hizo

sobre la superficie de un vórtice de agitación: este vórtice se logró eliminando rompeolas y dejando una sola propela al fondo del agita-dor. Los volúmenes de aire probados fueron 0.1. 0.2. 0.3. 0.4 Y 0.5 v v medial minuto. Las condiciones del experimento: 700 r.p.m./35' / 48 horas HBP-I 4'1; de inóculo v rv,

e) Curva de crecimiento. Las condiciones

del experimento fueron: 700 r.p.m./35 'C /50 horas 0.2 v. aire, v. medio" minuto:' /4% in-óculo (vv) HBP-l.

En matraces los resultados se obtuvieron

como promedio de tres experimentos por dato, en fermentadores como resultado de cinco fer-mentadores por experimento.

La evaluación de resultados se realizó ba-sándose en determinaciones de opacidad. Es-tas se hicieron por comparación con un están-dar internacional en un fotocolorímetro Klett Sumrncrson con filtro verde (,\ de 540 nm). El patrón de opacidad equivale a 10 unida-des de opacidad por mililitro o 1 X 10'" bac-terias (Borde/ella pertussis) por mI.

RESl'LTADOS

Las cepas de Borde/ella pertussis de Holan-da 509 y 134 dieron un crecimiento de 30% superior a la mejor cepa de Michigan, la

565

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Recamier, L.; Medina. A. y Rodríguez. H.

Figura I

'CRECIMIENTO COMPARATIVO DE LAS CEPAS DE MICHlGAN Y HOLANDA DE

BORDETELLA PERTUSSIS A NIVEL DE MATRAZ DE 500 ML 20 f- 18 16 E

'"

14

2

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12 el Ü

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o- 10 O

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el 8

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el 6 Z :o 4 2 -O

I

18.904 IU34 10.536 134 509

I

CEPAS

10,536; por tanto se optó por continuar los estudios con estas dos cepas (fig. 1).

En matraces. el volumen óptimo de medio de cultivo fue de 100 ml, la mejor veloci-dad de agitación fue de 200 r.p.m. y la con-centración óptima de inóculo de 5% v/v. Es-tos resultados fueron paralelos tanto para la cepa 509 como para la 134. Los resultados con la cepa 509 siempre fueron ligeramente mejores que los de la cepa 134 (gráficas 1, 2 Y 3).

Las condiciones obtenidas habían

permití-do un rendimiento promedio de 17 unidades de opacidad (u.o.). Por la optimización del medio de cultivo se llegó a 31 u.o. Este re-sultado se logró con el medio número 10 que pasó a llamarse H BP-I (cuadro 1).

La cinética de crecimiento en matraz mues-tra una máxima opacidad entre las 30 y las 38 horas a un pH entre 8.3 y 8.7 (gráfica 4).

En fermentadores de 14 litros el mejor volumen de inóculo fue de 5 % v/v dando 36 u.o. El volumen óptimo de aereación fue de 0.2 vol, de aire/vol, de medio/minuto

(grá-Desarrollo de un proceso de fermentación para vacuna pertussis Cuadro 1

RESULTADOS OBTENIDOS EN LOS 16 MEDIOS DE CULTIVO DlSEI'IADOS POR EL METalla DE BOX Y WILSON

MEDIOS DE CULTIVO UNIDADES DE OPACIDAD POR mI

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I1 12 13 14 15 16 26.6 25.2 21.6 25.6 23.0 26.6 26.6 28.2 28.6 31.0 28.6 29.6 28.6 29.3 25.2 26.0 20 18

El

16

'"

O 14 e, el < el 12 Ü < o.. O ₁₀ ul el

t:l

8 el < el 6

Z

::> 4 2 O Gráfica 1

EFECTO DEL VOLUMEN DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO

DE 80RDETELLA PERTUSSIS. CEPA ~09 Co) Y CEPA 134 (o)

EN MATRACES DE ~OO MI.

-o

100 _ISO 200 . 250 mi NOVIEMBRE-DICIEMBRE 1981 ₅₆₇

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-Recamier. L.: Medina. A. y Rodríguez. H. Gráfica 2

ESTUDIO DE LA VELOCIDAD OPTlMA DE AGITACION A NIVEL DE MATRAZ

DE 500 ML DE BORDE.TE.LLA PE.RTUSS/S. CEPA 509 (.) Y CEPA I)~ (o)

10 18 16 E

'"

•

O 14 o-O ,,Q , « / -, O 12 / , <, ü_« / ....

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O « O ₆ z :;¡ 4

.,

2 " O 100 L50 :!OO 2.50 )00 r.p.m.

-,

fica 5). La curva de crecimiento dio un máxi-mo desarrollo a las 44 horas a un pH de 8.4 (gráfica 6).

COMENTARIOS

Las cepas holandesas lo mismo que las de Michigan proveen en conjunto los aglutinóge-nos 1,2 Y 3 que. según Presten,':" son nece-sarios para provocar inmunidad sólida contra cepas seleccionadas en Borde/ella perutssis, de tal forma que el cambiar la producción con cepas de Michigan a las holandeses no

repre-senta un detrimento si Preston tuvicra razón.

La inmunogenicidad de las cepas de Ho-landa está apoyada por la potencia de estas cepas demostrada por la prueba de potencia de Kendrick " y por los resultados históricos en los Países Bajos de acuerdo a los estudios de Cohen el al.'

Algunos resultados no informados en este trabajo indican que la potencia de los lotes producidos por fermentación es satisfactoria.

De acuerdo con Van Hemert," el pH óp-timo con respecto a la potencia de los lotes es de 8.2; esto está muy cercano al dato ob-tenido por nosotros en opacidad.

Desarrollo de un proceso de fermentación para vacuna pertussis

Gráfica 3

ESTUDIO DE LA CONCENTRACION OPTIMA DE INOCULO A NIVEL DE MATRAZ DE 500 ML DE BORDETELLA PERTUSSIS. CEPA 134 (.) Y CEPA 509 (o)

22 20

E

18

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O ₁₆ e, O < ₁₄ O U < e, O 12 ul O

:::i

10 O < O 8 Z ;:¡ 6 4 2 O

',O

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-,

O

•

2 3 4 6 7 9 10 CONCENTRACION DE INOCULO V/V

estudio se cumplió exitosamente. El proceso de producción de vacuna pertussis por cultivo sumergido se adaptó al equipo comercial de línea New Brunswick, de fácil adquisición en nuestro país con algunas modificaciones en los

fermentadores. El medio de cultivo se ajustó a nuestras condiciones de equipo e ingredien-tes sometiéndolo a un diseño experimental basado en la técnica industrial de proceso evo-lucionario de operaciones (EVOPl con

eco-NOVIEMBRE-DICIEMBRE 1981 569 < ~,

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Recamier, L.; Medina. A. y Rodríguez. H.

Gráfica 4

CURVA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS DE BORDETELLA PERTUSSlS 134 Y

509 A NIVEL MATRAZ DE 500 ML. (¡.)

=

CURVA DE pH. CEPA 134, (o)

=

CURVA DE pH. CEPA 509, (e) = CRECIMIENTO CEPA 509 Y CRECIMIENTO CEPA 134 (,)

28 E 18 Ó :o 16 14 12 2 10 8 6 4 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 TIEMPO Hs. 8.5 8.0 7.5

"

:r 7.0 6.5

Desarrollo de un proceso de fermentación para vacuna pertussis

Gráfica S

ESTUDIO DEL VOLUMEN OPTIMO DE AEREACION A NIVEL DE FERMENTADOR DE 14 LITROS DE BORDETELLA PERTUSSIS CEPA ~09

30

,

0.1 0.2 O.~ 20 10

--,

0.3 0.4•

VOLUMEN DE AIRE IVOLUMEN DE MEDIO I MINIMO

nomía de tiempo y experimentos.'

Esta modificación del medio de cultivo au-mentó en 82'7r la opacidad obtenida.

Aunque la medida de opacidad no es un parámetro para medir la inmunogenicidad de la vacuna. sirvió excelentemente para optimi-zar el rendimiento de la biomasa y como ya se indicó. varias pruebas de potencia han dado como resultado más de ocho unidades de

po-NOVIEMBRE-DICIEMBRE 1981

tencia por mI a 10 unidades de opacidad. de tal forma que se considera satisfactorio el producto.

Se estima que con el equipo de fermentación con que se cuenta se podrá duplicar la pro-ducción de componente pertussis para la va-cuna DPT o sea.que de un promedio de medio millón de dosis humanas de vacuna pertussis por mes se podrá pasar a un millón.

Recamier. L.: Medina. A. y Rodríguez. H. 30 28 26 24 20 18

E

16 o ;:¡ 14 12 Gráfica 6

CURVA DE CRECIMIENTO DE BORDETELLA PERTUSSIS CEPA 509 EN FERMENTADOR DE 14 L. (o) = pH. (o) = BIOMASA

2 10 8 6 4 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 TIEMPO Hs. 8.5 8 7 6.5

Desarrollo de un proceso de fermentación para vacuna pertussis

Recamler, L.; Medina, A.; Rodrf2Uez, H.: A fermentatloo proeess lo the producdoD of per-tussls vaeclne, Sal. Púb. Mb., XXIiI, 563-573, 1981.

Summary: The development of pertussis vaccine in the Instituto Nacional de Higiene at flasks and 14 liter fermentors is described. Severa! adjustments and modi-fications to metbods, equipment and culture media were needed to produce this vaccine.

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573

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