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Cinética de crecimiento del cultivo iniciador (Lactobacillus bulgaricus y Streptococccus thermophilus) durante la fermentación y almacenamiento de yogur con quinua (harina y entera)

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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA

CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

CINÉTICA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO INICIADOR

(

Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus)

DURANTE LA FERMENTACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE

YOGUR CON QUINUA (harina y entera)

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

PAOLA LIZETH PAÉZ VELASCO

DIRECTORA: ING. NUBIA GRIJALVA

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(3)

DECLARACIÓN

Yo PAOLA LIZETH PÁEZ VELASCO, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.

La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.

_________________________ Paola Lizeth Páez Velasco

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CERTIFICACIÓN

Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Cinética de Crecimiento del Cultivo Iniciador (Lactobacillus bulgaricus y

Streptococcus thermophilus) Durante la Fermentación y Almacenamiento de Yogur con Quinua (harina y entera)”, que, para

aspirar al título de Ingeniera de Alimentos fue desarrollado por Paola Lizeth Páez Velasco, bajo mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.

___________________________ Ing. Nubia Grijalva

DIRECTORA DEL TRABAJO

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DEDICATORIA

Al escuchar la palabra “dedicatoria”, mi mente recuerda a la infinidad de personas y sueños que me han motivado y permitido culminar esta pequeña parte del camino; sin embargo, nada ni nadie me ha demostrado tanto amor, paciencia y perseverancia como Dios. La única forma en la que puedo expresar todo lo que Dios ha hecho por mí es a través de, Juan 3:16 “Porque de tal manera amo Dios al mundo, que entrego a su Hijo unigénito para que todo aquel que en él crea no se pierda más tenga vida eterna”, es por esto que dedico mi vida y esta parte de ella a Dios y a todas las personas que amo.

A mis padres que tras años de esfuerzo, sacrificio, paciencia, corrección, bromas y demás, supieron brindarme el conocimiento y la sabiduría necesaria para continuar mi vida profesional; además de obsequiarme los mejores años de mi vida tras alcanzar un pequeña parte de mis sueños, reflejados en este documento.

Mis hermanos, especialmente mi hermana, que a pesar de los disgustos, enojos y las discusiones, me permitieron mirar un rayo de luz a través de sus rizas, bromas, abrazos, juegos y amor. A quienes les doy las gracias por aquellos momentos en los que el tiempo no significo nada más que un momento más para pasar cerca de ellos.

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar agradezco a Dios por darme a los padres que tengo, puesto que ellos me permitieron estudiar en la Universidad Tecnológica Equinoccial, en la misma que pude encontrar a los profesores y a las personas que me impartieron sus conocimientos y su sabiduría durante estos 5 años y que hoy se reflejan en este documento.

Gracias a la Ing. Nubia Grijalva por ser mi directora de tesis y mi amiga, que tras un año y medio de su compañía pude aprender de sus conocimientos y disfrutar de grandes momentos que edificaron mi vida emocional y profesional; sé que hoy puedo aplicar todo lo que ella me enseño. Al Ing. Manuel Coronel, gracias por permitirme formar parte de su proyecto y a la Ing. Teresa Guerrero gracias por su ayuda y consejería.

Gracias a las amigas y a los amigos que encontré en el camino como Roxana Ati, mi mejor amiga y hermana, te conocí en la escuela y aún formas parte de mi vida; Pablo Andrade, Mayra Montero y Jess Cadena, amigos y compañeros con los que he aprendido a ser más competitiva, profesionalmente, y más divertida; Sarai Lara, creo que eres la persona que en realidad conoció y formó mucho mi carácter, te lo agradezco; Adriana Páramo e Hipatia Tapia, sé que son las personas más alegres que he conocido y las más locas, pero hicieron de mi vida una aventura; y al grupo de mi iglesia, porque sé que los momentos que pasamos fueron muy edificantes en Dios.

Proverbios 2: 1-2; 5-6 “1

(7)

i

ÍNDICE DE CONTENIDOS

PÁGINA

RESUMEN viii

ABSTRACT x

1. INTRODUCCIÓN 1

2. MARCO TEÓRICO 4

2.1.QUINUA 4

2.1.1. GENERALIDADES 4

2.1.1.1.Origen y Distribución geográfica 4

2.1.1.2.Taxonomía y Distribución nacional 4

2.1.2. GRANO DE QUINUA 6

2.1.2.1.Generalidades 6

2.1.2.2.Contenido nutricional 7

2.1.3. USOS TRADICIONALES E INDUSTRIALES 9

2.1.3.1.Usos tradicionales 9

2.1.3.2.Usos industriales 10

2.1.4. PRODUCCIÓN NACIONAL Y MUNDIAL 11

2.2.FERMENTACIÓN ÁCIDO LÁCTICA 12

2.3.YOGUR 13

2.3.1. GENERALIDADES 13

2.3.1.1.Datos históricos 13

2.3.1.2.Definición 14

(8)

ii

PÁGINA

2.3.2. ELABORACIÓN DE YOGUR 16

2.3.2.1.Mercado nacional y mundial 18 2.3.3. ALIMENTOS FUNCIONALES: CEREALES Y YOGUR 18

2.3.3.1.Yogur de quinua 19

2.4.PROBIÓTICOS 20

2.4.1. GENERALIDADES 20

2.4.1.1. Historia de la biotecnología y los probióticos 20

2.4.1.2.Definición 20

2.4.1.3.Uso de probióticos en los alimentos (yogur) 21

2.4.1.4.Bacterias ácido lácticas (BAL) 22

2.5.CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO 26

2.5.1. CONCEPTOS GENERALES 26

2.5.2. CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO 28

2.5.2.1. Métodos de desarrollo de la curva de crecimiento . .

microbiano 28

2.5.2.2. Fases y factores influyentes de la curva de .

. crecimiento microbiano 29

3. METODOLOGÍA 33

3.1.ELABORACIÓN DE YOGUR CON QUINUA 33

3.2.ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 34

3.2.1 TOMA DE MUESTRA 34

3.2.2 DILUCIONES SUCESIVAS 35

(9)

iii

PÁGINA

3.3.EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO

MICROBIANO 37

3.3.1 IDENTIFICACIÓN DE LA POBLACIÓN BACTERIANA 37 3.3.2 RECUENTO TOTAL DE LA POBLACIÓN BACTERIANA 38

3.4.ANÁLISIS ESTADÍSTICO 38

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS 40

4.1.CARGA MICROBIANA PROMEDIO DE LAS CUATRO

FORMULACIONES DE YOGUR 40

4.2.DINÁMICA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO INICIADOR

DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL YOGUR CON QUINUA 43 4.3.RECUENTO MICROBIANO A LO LARGO DEL

ALMACENAMIENTO 46

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 51

5.1.CONCLUSIONES 51

5.2.RECOMENDACIONES 53

BIBLIOGRAFÍA 54

GLOSARIO 64

(10)

iv

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA Tabla 1. Características físico-químicas del grano de

quinua en variedad “Pata de Venado” y

“Tunkahuan” 8

Tabla 2. Valores comparativos del contenido de algunas vitaminas del grano de la quinua y de otras fuentes vegetales (ppm en base de materia seca) 9

Tabla 3. Cuadro comparativo de la leche entera y el yogur

natural 16

Tabla 4. Factores que afectan al crecimiento bacteriano 30

Tabla 5. Pretratamientos de la Quinua (Chenopodium quinoa Willd.) para enriquecimiento de yogur

batido 33

Tabla 6. Carga microbiana promedio de los cuatro tipos de

yogur evaluados 41

Tabla 7. Recuento microbiano de E1, E2, E3 y E4 durante

la etapa de almacenamiento 47

Tabla 8. Recuento de G. candidum en E1, E2, E3 y E4 por

cada dosis de quinua 50

Tabla 9. Registro general del recuento en placa del cultivo iniciador (S. thermophilus y L. bulgaricus) de E1- yogur con harina de quinua lavada y E2- yogur

con harina de quinua tostada 65

Tabla 10. Registro general del recuento en placa del cultivo iniciador (S. thermophilus y L. bulgaricus) de E3- yogur con harina de quinua cocida y E4- yogur

(11)

v

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA Figura 1. Variedades de quinua mejoradas genéticamente

en el INIAP: A) “INIAP Tunkahuan” y B) “INIAP Pata de Venado” o “Taruka chaki” 6

Figura 2. Diagrama de flujos de la elaboración del yogur 17

Figura 3. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, lente

objetivo 100X 24

Figura 4. Streptococcus salivarius subsp. thermophilus,

lente objetivo 100X 25

Figura 5. Curva de crecimiento microbiano 29

Figura 6. Esquema para el muestreo de yogur con quinua durante la etapa de fermentación y

almacenamiento 35

Figura 7. Procedimiento de siembra por profundidad 37

Figura 8. A: Colonias de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, B: colonias de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y C: moho

Geotrichum candidum en Agar MRS 38

Figura 9. Tinción Gram de colonias de A. Lactobacillus

bulgaricus y B. Streptococcus thermophilus 41

Figura 10. Dinámica del crecimiento de los cultivos iniciadores durante la fermentación de: E1 ( ),

E2 ( ), E3 ( ) y E4 (x). 43

Figura 11. Dinámica del crecimiento de S. thermophilus y L. bulgaricus durante la fermentación de E1 (A),

(12)

vi

PÁGINA Figura 12. Moho Geotrichum candidum: A. Crecimiento en

agar MRS, B. Morfología y C. Estructura fúngica

(tinción simple). 49

Figura 13. Identificación y Recuento de S. thermophilus y L. bulgaricus: A) Toma de muestra, B) Diluciones sucesivas, C) Siembra por profundidad, D)

Identificación, E) Recuento en placa 67

Figura 14. G. candidum: A) Identificación y B) Recuento en

(13)

vii ÍNDICE DE ANEXOS

PÁGINA Anexo I. Resultado general del recuento en placa del

cultivo iniciador 65

Anexo II. Procedimiento de identificación y recuento de

S. thermophilus y L. bulgaricus 67

Anexo III. Procedimiento de identificación y recuento de

(14)

viii

RESUMEN

El empleo de alimentos andinos para la elaboración de nuevos productos, ha promovido la investigación y el desarrollo de alimentos que pueden brindar múltiples beneficios al ser humano, como el yogur con quinua. Se evaluó la cinética de crecimiento del cultivo iniciador (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) durante la fermentación y el almacenamiento de yogur con quinua. Se elaboraron tres tipos de yogur con harina de quinua sometida a tratamientos distintos (cocida, tostada y lavada) y un cuarto tipo con quinua entera tostada; en los cuatro casos se evaluaron la siguientes concentraciones 2.5, 5 y 7.5%. Se tomaron muestras durante la etapa de fermentación cada 45 minutos, hasta alcanzar un pH de 4.6. Además, en los días 7, 14 y 21 de almacenamiento se analizaron tres lotes diferentes. Se trabajó con la técnica de recuento en placa, se sembró 3 diluciones sucesivas por el método de profundidad en Agar MRS y se incubó por 48 horas a 30ºC. La confirmación del tipo de colonias según su morfología se realizó mediante tinción Gram; L. bulgaricus

(15)

ix tipo levadura con capacidad proteolítica y resistencia a pH bajos; producto de una posible contaminación en la materia prima.

(16)

x

ABSTRACT

The use of Andean food in developing new products, has promoted research and development of functional, nutritional and bioactive foods that provide multiple benefits to humans, such as yogurt with quinoa. In the present investigation the kinetics of growth of the starter culture (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) was evaluated to during fermentation and storage of yogurt with quinoa. Three types of yogurt with quinoa flour subjected to different treatments (cooked, toast and washed) and a fourth type with whole toasted quinoa were developed; in all four cases the following concentrations 2.5, 5 and 7.5% were evaluated. Samples were taken during the fermentation stage every 45 minutes, until a pH of 4.6 and at days 7, 14 and 21 of storage three different batches were analyzed. We worked with the plate count technique, 3 serial dilutions were seeded by the method of depth in MRS agar and incubated for 48 hours at 30 ºC, the confirmation of the type of colonies according to their morphology was performed by Gram staining; L. bulgaricus

(17)
(18)

1

1. INTRODUCCIÓN

Antes de que el ser humano estudiara a los microorganismos, ya se utilizaban procesos tradicionales de fermentación como métodos de conservación de alimentos. Actualmente, la biotecnología ha demostrado que ciertas especies bacterianas son precursoras de la fermentación, conservación y producción de gran variedad de productos, entre los cuales destaca el yogur (Rivas & Garron, 2006).

El yogur es el resultado de la fermentación láctica de la leche, provocada por

Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus, microorganismos ácido lácticos que sintetizan lactosa en ausencia de oxígeno para producir ácido láctico o lactato (INEN:2395, 2011).

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus pertenece al grupo de bacterias anaerobias facultativas no mótiles propias del intestino humano que desaparecen en el período de la lactancia, por lo que su consumo es necesario para fortalecer al sistema gastrointestinal humano. Entre sus principales funciones se encuentran la reducción del pH, la disociación de ácidos y la producción de metabolitos antimicrobianos que le confieren propiedades excepcionales como: la digestión de lactosa e hidrólisis de sales biliares (Erdogrul & Erbilir, 2006).

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus es una bacteria anaerobia facultativa o aerotolerante homofermentativa, capaz de degradar caseína y formar ácidos, formiato y que confieren textura y nuevas propiedades organolépticas al producto final (Rivas & Garron, 2006).

(19)

2 probióticas como: facilitar la degradación de los alimentos, mejorar la digestibilidad, destruir toxinas e interferir en el desarrollo de microorganismos patógenos (Lourens & Viljoen, 2001).

Para estudiar el funcionamiento de los probióticos, se elaboró una curva de crecimiento microbiano que corresponde al incremento en el número de células o de masa celular microbiana por unidad de tiempo en un sustrato, es decir, muestra el comportamiento de los microorganismos durante sus cuatro fases de desarrollo: latencia, exponencial, estacionaria y muerte; y cómo los factores intrínsecos, extrínsecos, implícitos y explícitos afectan su crecimiento (Madigan, Martinko, & Parker, 1997).

El estudio de la curva de crecimiento durante las fases latencia y exponencial del cultivo iniciador es de gran importancia en la industrialización del yogur y en la producción de metabolitos primarios lácteos precursores de las propiedades y la calidad del producto final, al que se puede o no añadir un compuesto o alimento no lácteo de acuerdo a la Norma INEN 2395-2011 (Agatangelo, 2007).

La incorporación de compuestos o alimentos al yogur con el propósito de aumentar su valor nutricional y funcional, ha promovido la innovación y el desarrollo de nuevos productos como: el yogur de frutas, de soya, con fibra, mermeladas, cereales o probióticos (Boynton & Novakovic, 2013).

El yogur con cereal fue uno de los primeros productos comercializados en el mercado. Los cereales son semillas o granos que cuando se consumen en porciones adecuadas y en combinación con el yogur, crean un alimento funcional que ofrece componentes nutricionales y bioactivos que ayudan a las funciones fisiológicas normales del ser humano (INEN:2587, 2011).

(20)

3 La quinua (Chenopodium quinoa Willd.) es una planta alimenticia nativa de la región andina y cuyo grano es considerado un pseudocereal de alto impacto nutricional por su contenido de carbohidratos, su calidad como alimento, y su eficiencia proteica (Villacrés, Peralta, Egas, & Mazón, 2011).

Actualmente, en el Ecuador, el empleo industrial del grano de quinua se ha limitado a la producción de harina, productos de panificación, barras energéticas o a la comercialización directa del grano, por lo que su adición en el yogur promovería un producto innovador de alto valor nutricional y funcional, con capacidad de venta Nacional e Internacional.

Sin embargo, la FAO (2002), determinó que las características organolépticas y nutricionales de los alimentos adicionados al yogur, pueden afectar el comportamiento del cultivo iniciador y las características del producto final; entendiéndose que la adición del grano de quinua puede cambiar la cinética de crecimiento de los cultivo iniciador, por tal motivo, este proyecto tiene por objetivo “Evaluar la cinética de crecimiento del cultivo iniciador (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) durante la fermentación y almacenamiento del yogur de quinua elaborado con tres niveles (2.5; 5 y 7.5%)”.

Además, presenta los siguientes objetivos específicos:

 Determinar la cinética de crecimiento del cultivo iniciador durante la fermentación y almacenamiento de cuatro tipos de yogur: yogur con harina de quinua tostada, yogur con harina de quinua lavada, yogur con harina de quinua cocida y yogur con quinua entera tostada.

(21)
(22)

4

2. MARCO TEÓRICO

2.1. QUINUA

2.1.1. GENERALIDADES

2.1.1.1. Origen y Distribución geográfica

La quinua es una planta alimenticia nativa de la región andina y de origen Boliviano. Muchos creen que su consumo parte desde el Imperio Incaico, pero las culturas precolombinas fueron quienes la domesticaron, cultivaron y llamaron “grano de oro” debido a su color amarillo y a la diversidad de productos en los que se empleaba (Cazar & Alava, 2004).

Actualmente su cultivo se extiende por toda la Región Andina, desde el Norte de Colombia hasta el sur de Chile, donde la geografía irregular de la zona ha provocado que estos cultivos se produzcan desde los 1000 hasta los 4500m sobre el nivel del mar, soportando condiciones ambientales extremas, adaptándose al cambio climático y ofreciendo una gran variedad de especies (Mujica, Jacobsen, Izquierdo, & Marathee, 2001).

2.1.1.2. Taxonomía y Distribución nacional

Peralta (1985), en su boletín No. 175, menciona que: botánicamente, el nombre quechua de la planta Chenopodium quinoa Willd., es “quinua”, pero

(23)

5 La quinua es una planta con características excepcionales, que le han permitido adaptarse a temperaturas entre - 8 y 38 ºC con intervalos de humedad de 40 a 90 % y suelos de pH ácidos y alcalinos, promoviendo su diversidad fenotípica y genotípica (Peralta, 1985).

Según, Mujica & Jacobsen (2006) existen 7 parientes silvestres de la quinua en el banco de germoplasma de cultivos in situ de Perú: Chenopodium carnosulum (tolera la salinidad), C. petiolare (resiste a la sequía), C. pallidicaule (resiste al frío), C. hircinum, C. quinoa spp. melanospermum, C. ambrosioides y C. incisum, además de una gran diversidad de especies por cada pariente.

En el Ecuador, actualmente, el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), ha identificado morfológicamente cerca de 250 especies de quinua; cuatro cultivadas como plantas alimenticias o domesticadas: Imbaya, Cochasqui, Ingapirca e INIAP-Tunkahuan, destinadas a ofrecer seguridad alimentaria, y 246 en estado silvestre y en proceso de investigación (Bojanic, 2011).

(24)

6

Figura 1. Variedades de quinua mejoradas genéticamente en el INIAP: A) “INIAP TUNKAHUAN” y B) “INIAP Pata de Venado” o “Taruka chaki”

(Jacobsen & Sherwood, 2002)

“INIAP TUNKAHUAN” e “INIAP Pata de Venado”, actualmente son cultivadas en las provincias de Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Bolívar, Cañar, Azuay y Loja, cubriendo 900ha de superficie en todo el Ecuador con un rendimiento de 0.4 Ton/ha (toneladas por hectárea) de grano de quinua (Peralta, 2009).

2.1.2. GRANO DE QUINUA

2.1.2.1. Generalidades

El grano de quinua se considera un pseudocereal debido a su alto contenido de carbohidratos y su tamaño pequeño que oscila entre 1.8 y 2.6 mm; su color puede variar entre blanco, naranja y gris; y su sabor depende de la concentración del esteroide “saponina” que le confiere un sabor amargo e interfiere en el aprovechamiento biológico de los aminoácidos (Romo, Rosero, Forero, & Cerón, 2006).

(25)

7 La saponina es el principal componente del grano, esta permite clasificarlo en dulce (con niveles menores al 0,11 %) y amargo (con niveles mayores al 0,11 % de saponinas de peso en fresco); la misma que puede eliminarse durante los procesos de cocción o tostado del grano (Quelal, 2009).

2.1.2.2. Contenido nutricional

El grano de quinua, fue llamado por los indígenas “grano madre”, nombre que se debe a su similitud nutricional con la leche materna. Actualmente se mantiene este calificativo debido a sus propiedades nutricionales, su calidad como alimento y su eficiencia proteica medida en base al balance ideal de aminoácidos esenciales y su digestibilidad; que lo ubican como uno de los alimentos con capacidad de ofrecer seguridad alimentaria y de combatir el hambre mundial (Villacrés et al., 2011).

(26)

8

Tabla 1. Características físico-químicas del grano de quinua en variedades “Pata de Venado” y “Tunkahuan”

(Villacrés et ál., 2011)

Entre otros nutrientes importantes se encuentran albúminas y globulinas solubles en agua y soluciones salinas que promueven un alimento libre de gluten y apto para celiacos (reacción inmunológica a la gliadina), además de un alto contenido de vitaminas A, , C y E que resulta ser mayor al presente en los cereales comunes y algunos vegetales, como se observa en la Tabla 2 (Romo et al., 2006).

CARACTERÍSTICAS VARIEDAD PATA

DE VENADO

VARIEDAD

TUNKAHUAN

Color del grano seco Crema Blanco

Peso hectolítrico (kg/hl) 62-70 66

Tamaño del grano (mm) 1.7 a 2.1

Contenido de saponina

(%) 0.05 0.06

Forma del grano Redondo aplanado Redondo aplanado

Proteína (%) 17.45 16.14

Grasa (%) 7.14 9.43

Cenizas (%) 2.72 3.27

Fibra (%) 5.14 5.56

Calcio (%) 0.09 0.06

Fósforo (%) 0.65 0.73

Potasio (%) 0.69 0.68

(27)

9

Tabla 2. Valores comparativos del contenido de algunas vitaminas del grano

de la quinua y de otras fuentes vegetales (ppm en base de materia seca).

(Mujica & Jacobsen, 2006)

2.1.3. USOS TRADICIONALES E INDUSTRIALES

2.1.3.1. Usos tradicionales

De acuerdo a la Organización de las Naciones Unidas para los Alimentos y la Agricultura (FAO), algunas familias del altiplano han conservado la quinua como parte de su alimentación y la consumen en desayunos, almuerzos, cenas; y en ocasiones especiales en sopas, masas y bebidas, como la sopa de quinua, la kispiña o panecillo cocido a vapor, la q’usa o chicha de quinua, P’esque o granos de quinua cocidos sin sal y otros platos autóctonos de la zona (Bojanic, 2011).

Por lo contrario, las familias citadinas han perdido costumbres alimenticias autóctonas, motivo por el cual el uso de la quinua se ha limitado a sopas y

Vitaminas (a) Quinua

(a)

Arroz

(b)

Cebada

(b)

Frijol

(b)

Papa

(b)

Trigo

(b)

Niacina 10.7 57.3 56.3 25.7 51.8 47.5

Tiamina ( ) 3.1 3.5 3.3 5.3 4.4 6.0

Riboflavina ( ) 3.9 0.6 1.3 2.1 1.7 1.4 Ácido Ascórbico (C) 49.0 0 0 22.5 693.8 0 Alfa-Tocoferol (E) 52.3

Carotenos (Precursor

(28)

10 platos fuertes en escazas ocasiones. Estos factores han incentivado al sector industrial a desarrollar e innovar productos con el fin de mejorar la alimentación del ser humano y su salud, además de ofrecer nuevos productos.

2.1.3.2. Usos industriales

El desarrollo de una gran variedad de productos derivados de la quinua, así también como su empleo gastronómico y medicinal-industrial, han permitido el uso total de la planta y especialmente de su grano (Muñoz, Monteros, & Montesdeoca, 1990).

Su mayor acogida a nivel mundial se da en la industria alimenticia, cuyo objeto ha sido desarrollar bebidas fermentadas, cerveza, concentrados de proteína, harina, alimentos para bebés, quinua expandida, granola, cereales sin gluten y productos de panificación (Valcárcel & Caetano, 2012).

Por otra parte, el uso de la hoja de quinua en tratamiento de abscesos, hemorragias y luxaciones por los pueblos ancestrales, captó el interés de la industria médica para fabricar cicatrizantes, antinflamatorios y laxantes (Muñoz, 2013).

Adicionalmente, las propiedades químicas de la saponina han permitido su empleo en la elaboración de detergentes, jabón, extintores de incendios, pesticidas y antibióticos o inhibidores del crecimiento bacteriano (Barros, Spehar, & Vivaldi, 2003).

(29)

11 Complementariamente a esta producción, el Plan de Seguridad Alimentaria del gobierno ecuatoriano, ha incorporado el uso de alimentos autóctonos al Plan Nacional de Desayuno Escolar, con el objeto de posibilitar el acceso a alimentos de alto valor nutritivo (como la quinua) por parte de familias de escasos recursos económicos (Bojanic, 2011).

Adicionalmente esta iniciativa ha permitido que Perú, Bolivia y Ecuador promuevan el desarrollo de bancos de germoplasma, in situ y ex situ de diversos ecotipos de quinua situados en la Región Andina, con el objeto de mejorar sus propiedades genotípicas, brindar resistencia a plagas y al cambio climático, y combatir el hambre mundial (Fuentes, Maughan, & Jellen, 2009).

2.1.4. PRODUCCIÓN NACIONAL Y MUNDIAL

El Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca (MAGAP), en el 2013, presentó un estudio de Demanda-Producción (proyectada) de quinua a nivel mundial entre los años 2003-2014, resaltando una demanda de 700.000Ton y una producción de 41.182Ton de quinua para el año 2012, cubierta por los países de Perú, Bolivia y Ecuador. Estos resultados revelan una demanda insatisfecha de aproximadamente 660000Ton anuales, llamando la atención de pequeños y grandes productores nacionales e internacionales (Tapia, 2013).

(30)

12 Para el 2014, Tapia, en su artículo publicado el 24 de septiembre, dio a conocer el aumento del precio del quintal de quinua a nivel mundial (el cual alcanza los $100) incentivando al Ecuador a que, a través del plan de comercialización que complementa el Programa de Fomento del Cultivo de Quinua del MAGAP, aumente la productividad de monocultivos de quinua e invierta en el mejoramiento de la calidad del grano y su rendimiento, con el objeto de expandir la comercialización internacional (Tapia, 2014).

Entre los países que han abierto sus fronteras comerciales están: Australia, India, Rusia y algunos países europeos y norteamericanos; convirtiéndose así en mercados potenciales para la venta de cultivos y productos derivados de la quinua, según la Unidad Nacional de Almacenamiento (UNA EP) (Tapia, 2013).

2.2. FERMENTACIÓN ÁCIDO LÁCTICA

La fermentación ácido láctica se define como un bioproceso que utiliza bacterias ácido lácticas (BAL) para sintetizar lactato a partir de lactosa en ausencia de oxígeno (Montville & Matthews, 2009).

Entre las principales especies asociadas a la producción de lactato se encuentran los Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus,

Lactobacillus, Oenococcus y algunas subespecies; encargadas de hidrolizar lactosa a través de la enzima L- y D- lactosa deshidrogenasa para generar energía en forma de ácido (Ray & Bhunia, 2008).

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13 Adicionalmente, estos microorganismos han demostrado tener propiedades funcionales y benefactoras dentro del organismo humano por lo que se consideran probióticos; por ejemplo S. thermophilus y L. bulgaricus, utilizados en la elaboración de yogur y algunos quesos, se encargan de proteger el organismo y facilitar la asimilación de proteínas y lactosa en el cuerpo humano (Adams & Moss, 2008).

2.3. YOGUR

2.3.1. GENERALIDADES

2.3.1.1. Datos históricos

Algunos investigadores mencionan que el yogur existió desde mucho tiempo atrás y que nació en Europa Orienta como un invento accidental; los datos más antiguos revelan su producción y consumo tradicional en Turquía hasta 1900, cuando el biólogo Ilya Metchnikoff da a conocer a los Lactobacillus

como progenitores de longevidad en los búlgaros (Adams & Moss, 1997).

Para 1908, Metchnikoff realizó su publicación: “La prolongación de la vida”, con el objeto de incentivar el consumo de alimentos fermentados, principalmente el yogur (del turco “jugurt”), puesto que creía que las bacterias ácido lácticas (BAL) cumplirían el mismo papel que en la inhibición de la putrefacción de los alimentos; pero no fue hasta los 70’s que su consumo e investigación toma mayor impulso y se logra comprobar su efecto inhibidor sobre ciertas bacterias (Parra, 2012).

(32)

14 más consumidos a nivel mundial, especialmente por Estados Unidos. Por esta razón se ha decidido ampliar la variedad de productos a través de la incorporación de nuevos sabores, frutas y cereales que complementan sus características sensoriales y su valor nutricional, ubicándolo dentro de los alimentos funcionales (Okafor, 2007).

2.3.1.2. Definición

La Norma INEN 2395 (2011) define al yogur como un “producto lácteo obtenido por fermentación de la leche entera, semidescremada o descremada, previamente pasteurizada o esterilizada y por acción de bacterias específicas: L. bulgaricus, S. thermophilus, libre de Bacillus pseudo lácticos proteolíticos”.

Biológicamente, el yogur es un producto lácteo fermentado que nació como un método de conservación de la leche, a través del uso de microorganismos específicos (L. bulgaricus y S. thermophilus) capaces de sintetizar carbohidratos (lactosa) en ácido láctico (Rivas & Garron, 2006).

Comercialmente se lo define como una masa semisólida o de baja viscosidad con sabor parecido a la nuez, textura suave-esponjosa debido a la coagulación que sufre durante la fermentación y de gran aporte nutricional (Ray & Bhunia, 2008).

2.3.1.3. Contenido nutricional y beneficios

(33)

15 fermentación de la leche para coagularla y facilitar su asimilación por enzimas humanas (Fesnad, 2013).

El contenido de grasa en el yogur, es relativamente bajo por lo que brinda una sensación de llenura; además presenta una actividad hipocolesterolemiante debido a las enzimas ligeramente lipídicas que favorecen el consumo de Colesterol LDL (sérico) presente en el producto y el humano (Adams & Moss, 1997).

El papel de las vitaminas es estimular el desarrollo de macrófagos, linfocitos y la concentración de inmunoglobulinas que actúan frente a organismos patógenos y en la actividad antitumoral o enzimática de células capaces de convertir pro-carcinógenos en carcinógenos (Adams & Moss, 1997).

(34)

16

Tabla 3. Cuadro comparativo de la leche entera y el yogur natural

(Salcedo, Font, & Martínez, 1998)

*Cal = kilocaloría

*Se recomienda revisar la tabla de composición nutricional de los alimentos del

INCAP (2006) para verificar el contenido nutricional de la leche y el yogur natural.

Además, se ha determinado que el consumo de lácteos, especialmente de yogur, fortalece a los sistemas óseo, digestivo, e inmunológico, ayudando a:

 Prevenir la osteoporosis e infecciones vaginales.

 Activar la microflora gastrointestinal para controlar el crecimiento de coliformes en el estómago y duodeno.

 Evitar el cáncer de colón.

 Reducir el riesgo de presión arterial (Agni, 2015).

2.3.2. ELABORACIÓN DE YOGUR

La Norma INEN 2608 (2012) determina que la tecnología aplicada en la elaboración de yogur es muy simple, y requiere de un componente básico, que puede ser la leche de vaca, cabra, oveja, camella o yegua, la misma que debe someterse a una pasteurización previa para destruir la mayor parte de microrganismos patógenos y obtener productos con mejores características higiénicas.

VARIABLES LECHE

ENTERA

YOGUR

NATURAL

Energía total (Cal/100 g) 69 71

Agua (g/100) 87.5 87

(35)

17 El proceso de elaboración de yogur inicia con la leche, que es sometida a 90 ºC por 5 min para destruir la microflora autóctona; se reduce la temperatura a 40 o 42 ºC para permitir la incorporación del cultivo iniciador (L. bulgaricus

y S. thermophilus) y su posterior incubación donde se produce ácido láctico hasta alcanzar un pH de 4.6, momento en que se disminuye la temperatura a 4 ºC para su almacenamiento (Rojas, Chacón, & Lourdes, 2007).

De acuerdo a Quinatoa (2011), al iniciar o finalizar el proceso de elaboración de yogur, se puede adicionar otros componentes no lácteos que complementen el contenido nutricional, bajo las especificaciones de la Norma INEN 2395-2011.

A continuación, en la Figura 2 se presenta el proceso de elaboración del yogur.

Figura 2. Diagrama de flujos de la elaboración del yogur (Zielinski et al., 2013)

Esterilización de la leche

Pasteurización

Homogenización

Concentración

Siembra

Envasado

Incubación o Fermentación

Almacenamiento

Leche 90 ºC

85 ºC 5min

Cultivo iniciador (Inóculo)

40 – 42 ºC

(36)

18 Al finalizar el proceso de fermentación se reconoce que el cultivo iniciador continúa con un crecimiento lento, por 4 semanas aproximadamente, tiempo de vida útil del producto y período en el cual estos cultivos pueden ser reinoculados mediante un proceso denominado “back sloppings” al transferir una porción activa a un nuevo proceso (Harris, 1998).

2.3.2.1. Mercado nacional y mundial

El Instituto Nacional de Estadísticas y Censos (INEC) dio a conocer, el 2012, que el yogur ocupa el puesto 21 de los 51 productos alimenticios más importantes en la dieta de los ecuatorianos y el doceavo puesto entre los productos más consumidos, formando parte de la canasta básica de 2 de cada 100 familias del Ecuador y se estima que para el 2019 esta taza aumente en un 50% (Loor & Mendoza, 2010).

Este grado de importancia que se está dando al yogur ha permitido el incremento de la demanda nacional de yogur y proporcionalmente de la leche en un 50%, sin embargo, la cultura de consumo de yogur bajo en azucares y enriquecidos con microorganismos probióticos y productos funcionales, recién esta tomado importancia en la vida de los ecuatorianos, principalmente de aquellas que sufren problemas de diabetes, enfermedades de colón, cáncer y problemas gastrointestinales. Además, se espera que este factor se esparza en la población, con el fin de prevenir este tipo de enfermedades (Véle, 2012).

2.3.3. ALIMENTOS FUNCIONALES: CEREALES Y YOGUR

(37)

19 de forma regular tiene, además de compuestos nutricionales, componentes bioactivos que ayudan a las funciones fisiológicas normales y/o contribuyen a reducir o prevenir el riesgo de enfermedades (INEN:2587, 2011).

Tanto el yogur como los cereales son considerados alimentos funcionales debido a su composición nutricional y su bioactividad. Los cereales comprenden un amplio grupo de plantas cuyos granos o semillas son aptos para el consumo humano (Parra, 2012).

La incorporación de alimentos funcionales conjuntamente con el programa de Seguridad Alimentaria Mundial, ha permitido que Latinoamérica impulsara la recuperación de cultivos autóctonos como la quinua, el amaranto, vegetales, tubérculos, frutas y otros alimentos de alto valor nutricional, bajo costo y larga duración (Latham, 2002).

2.3.3.1. Yogur de quinua

Arenas, Zapata, & Gutierrez (2012) elaboraron un yogur enriquecido con quinua, cuyo recuento final de bacterias se comparó con dos muestras de yogur tradicional tipo I y tipo II. Se estableció que la quinua actúa como un perfecto estimulante del crecimiento de L. acidophilus, S. thermophilus y

(38)

20

2.4. PROBIÓTICOS

2.4.1. GENERALIDADES

2.4.1.1. Historia de la biotecnología y los probióticos

En 1900 Ilya Metchnikoff explicó los efectos positivos de las bacterias ácido lácticas (BAL) presentes en la fermentación de la leche, afirmando que estas permitían la prolongación de la vida de microorganismos benéficos; para 1906 Henry Tissier logró aislar por primera vez una bacteria bífida (Bifidobacterium) de un lactante, promoviendo la idea de que estos microorganismos desplazaban a bacterias proteolíticas causantes de diarrea; sin embargo, no fue hasta 1960 que Lilly y Stilwell, expresan por primera vez el término probiótico como “microorganismos que estimulan el crecimiento de otros microorganismos” (OMGE, 2008).

Para los 70s, ya se realizaban estudios genéticos sobre las BAL, abriendo puertas a la biotecnología, la misma que permitió, en 1980, obtener cultivos puros de probióticos que ponen al descubierto sus beneficios para la salud humana, además de revelar su intervención sobre las características reológicas y organolépticas del producto, y su capacidad antagónica para generar ambientes poco favorables para el desarrollo de microorganismos patógenos (FAO & OMS, 2006).

2.4.1.2. Definición

(39)

21 que cuando son administrados a un huésped en cantidades adecuadas, le confieren beneficios a la salud” (FAO, 2002).

La Organización Mundial de Gastroenterología (OMGE) los define como microorganismos vivos que se administran en cantidades adecuadas en alimentos, medicamentos y suplementos para conferir beneficios a la salud del huésped (OMGE, 2008).

2.4.1.3. Uso de probióticos en los alimentos (yogur)

Estudios médicos revelan que el tracto gastrointestinal cuenta con un ecosistema de bacterias benéficas de aproximadamente 400 especies, incluidos los microorganismos probióticos (Lourens & Viljoen, 2001).

La ISAPP determina que los probióticos que se empleen en la elaboración de productos alimenticios deben ser puros además de presentar las siguientes características:

 Facilidad de reproducción

 Capacidad para sobrevivir a las condiciones ambientales actuales

 Ser genéticamente estables

 Presentar resistencia genética a antibióticos

 No presentar toxinas, ni reacciones cancerígenas

 Ser viables durante la elaboración del producto

 Ser capaces de fijarse y colonizar el ambiente en el que se encuentren activos

 Brindar beneficios a la salud del huésped (Parra, 2012).

(40)

22 gastrointestinal del consumidor, brindar beneficios para la salud y no provocar daños o enfermedades colaterales (Majchrzak, Lahm, & Dürrschmid, 2009).

Estos beneficios generaron la necesidad de incorporar probióticos en los alimentos y transformarlos en “alimentos funcionales”. Entre los principales productos con probióticos se encuentran los lácteos fermentados, tales como el yogur y otros productos de diferente origen en los que se emplean microorganismos benéficos (Cáceres & Gotteland, 2010).

2.4.1.4. Bacterias ácido lácticas (BAL)

Las bacterias ácido lácticas son los primeros y primordiales probióticos que se han encontrado hasta la actualidad; estos microorganismos corresponden a un amplio grupo de cocos y bacilos Gram positivos mesófilos, inmóviles, catalasa y oxidasa negativos, que requieren del carbono de aminoácidos y vitamina B para su crecimiento, además de azúcares como medio de energía (Parés & Juárez, 2002).

Su principal característica es la producción de bacteriocinas (nisina) que afectan a la membrana de microorganismos patógenos inhibiendo su crecimiento, es decir actúan como agentes antimicrobianos (Doyle et al., 1997).

Adams & Moss (1997) determinaron que las principales especies utilizadas en la elaboración de productos fermentados son los Lactobacillus,

(41)

23 recomienda el consumo diario de estos productos para observar sus beneficios.

2.4.1.4.1. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus son microorganismos anaerobios facultativos o microaerófilos no mótiles propios del intestino humano y que desaparecen en el período de lactancia (Rivas & Garron, 2006).

Para su crecimiento requieren de temperaturas entre los 30 y 45 ºC, con una temperatura óptima de crecimiento entre los 37 y 45 ºC, propiciando su desarrollo en el tracto intestinal de mamíferos, aves y humanos, y en algunos alimentos de origen animal y vegetal (Rivas & Garron, 2006).

También necesitan de un medio rico en carbohidratos, con pH de 4.5 – 6.4, condiciones de anaerobiosis o pequeñas dosis de que estimulen su crecimiento, además de peptonas, extractos de carne y levaduras; compuestos incluidos en el agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS) para

Lactobacillus (Samaniego & Sosa, s.f.).

(42)

24

Figura 3. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, lente objetivo 100X. (Rivas & Garron, 2006)

Entre sus funciones asociadas con los alimentos se encuentra la reducción del pH, la disociación de ácidos y la producción de metabolitos antimicrobianos, permitiendo la digestión de lactosa e hidrólisis de sales biliares, es decir, actúan como un probiótico (Erdogrul & Erbilir, 2006).

Otra de sus características es la degradación de lactosa, sacarosa y fructosa para producir isómeros DL, L y D de ácido láctico, alcohol, peróxido de hidrógeno y dióxido de carbono, obligando a la proteasa presente en su pared celular a suministrar péptidos y aminoácidos necesarios para el crecimiento de S. thermophilus y la producción de las características organolépticas propias del yogur (Samaniego & Sosa, s.f.).

2.4.1.4.2. Streptococcus salivarius subsp. thermophilus

(43)

25 Para estimular su crecimiento es necesario un medio con extracto de carne, peptona, triptona y carbohidratos como la sacarosa y lactosa (empleados como fuentes de energía) por lo que se encuentran en la leche cruda, además requiere de temperaturas entre los 37 y 42 ºC, medios ácidos (pH 5.5) y bajo ciertas dosis de promoviendo la fermentación inicial (Sherman & Stark, 1938).

En medio sólido se observan como colonias de forma circular, convexa, opacas, sin pigmentos y de bordes enteros. Microscópicamente se observan como cocos o cocobacilos Gram positivos de 0.7 - 1 µm de diámetro y asociados en pares, cadenas cortas o medias, como se observa en la Figura 4 (Alarcón, 2011).

Figura 4.Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, lente objetivo 100X. (Alarcón, 2011)

(44)

26

S. thermophilus, además, requieren de pequeñas dosis de péptidos y aminoácidos libres como glicina, valina, histamina, leucina y metionina para su crecimiento, y para la formación de formiato y ácido pirúvico que estimulan el crecimiento de L. bulgaricus (Adams & Moss, 1997).

2.4.1.4.3. Relación protocooperativa

Ambos microorganismos viven en una relación protocooperativa o sinergismo no dependiente, es decir que pueden crecer por separado pero cuando están en un mismo sustrato pueden estimular el crecimiento el uno del otro, por lo que ambos son utilizados en bioprocesos (Ray & Bhunia, 2008).

L. bulgaricus y S. thermophilus se desarrollan en simbiosis durante la fermentación; los iniciadores de la reacción son S. thermophilus capaces de: usar la urea de la leche para producir , permitir la síntesis de caseína, la formación de ácido fórmico y la reducción del pH y del oxígeno; factores favorables para el crecimiento de L. bulgaricus, que gracias a su ligera actividad proteolítica reducen el pH del medio e interfieren en la liberación de aminoácidos esenciales que estimulan el crecimiento de S. thermophilus y otros probióticos (Rivas & Garron , 2006).

2.5. CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

2.5.1. CONCEPTOS GENERALES

(45)

27 microbiana, el cual se produce por la replicación de material genético, síntesis de componentes celulares, desarrollo al doble del tamaño y división celular a través de procesos de gemación y fisión binaria; que se resume como la suma de ciclos celulares de todos los individuos de una población (Agatangelo, 2007).

Para el crecimiento microbiano se requiere de cultivos microbianos puros en medios específico, entendiéndose como cultivo microbiano puro a la capacidad de proporcionar condiciones físicas, químicas y biológicas adecuadas para un microorganismo; y como medio de cultivo al lugar o medio con nutrientes necesarios para aportar la energía y los elementos necesarios para la síntesis de constituyentes celulares en un tiempo determinado (Parker, Madigan, & Martinko, 2009).

Cada microorganismo tiene su propio curso de crecimiento microbiano, que hace relación a la medición cuantitativa del crecimiento equilibrado de microorganismos en relación al número de células vivas o masa celular en un tiempo determinado (Agatangelo, 2007).

(46)

28

2.5.2. CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

2.5.2.1. Métodos de desarrollo de la curva de crecimiento microbiano

Para que un microorganismo se desarrolle adecuadamente en un medio de cultivo, es importante incorporar los nutrientes necesarios y generar las condiciones adecuadas para su desarrollo, las mismas que se basan en las condiciones naturales de su crecimiento; además es necesario usar medios selectivos y enriquecidos para evitar el crecimiento de especies que puedan alterar los resultados del estudios del crecimiento bacteriano, analizados en la curva de crecimiento (Schlegel, 1997).

Schlegel (1997), determinó que los métodos utilizados para la cuantificación del crecimiento bacteriano debían ser clasificados en base a:

 Número de células: recuento en celda o directo del número de células (cámara de Neubauer), recuento en placa o conteo del número de colonias (contador de colonias), nefelometría de acuerdo a la dispersión de la luz (electroforesis) y N.M.P. como un método estadístico.

 Masa celular: peso seco o medición directa, turbidez a través de la transmisión de la luz (método Mcfarland), volumen empacado o centrifugación, físico-químicos (uso de reactivos) y de acuerdo al balance de masa o conservación de masa.

(47)

29

2.5.2.2. Fases y factores influyentes de la curva de crecimiento microbiano

La curva de crecimiento microbiano se subdivide en cuatro etapas o fases: latencia, exponencial, estacional y muerte, como se observa claramente en la Figura 5; etapas que dependen de factores intrínsecos, extrínsecos, implícitos y explícitos del proceso, como se muestra en la Tabla 4; los mismos que pueden ser modificados de acuerdo a las necesidades de la industria para obtener diversos productos o resultados (Agatangelo, 2007).

(48)

30

Tabla 4. Factores que afectan al crecimiento bacteriano

(Agatangelo, 2007)

2.5.2.2.1. Fases de la curva de crecimiento microbiano

La fase de latencia (lag) es la etapa de ajuste o adaptación química del microorganismo a las condiciones del medio, mediante la síntesis de ARN, ribosomas y enzimas que darán paso al crecimiento celular o fase exponencial-logarítmica (Stanier, Ingraham, Wheelis, & Painter, 1992).

Esta etapa se caracteriza por la abundancia de nutrientes, la carencia del aumento en las células viables y el tiempo en el que ocurre, que va desde la inoculación hasta el momento en el que se alcanza la fase de división (Prescott et. al., 2002).

FACTORES INTRINSECOS FACTORES IMPLICITOS

Actividad del agua pH Potencial redox Componentes antimicrobianos Estructura antimicrobiana Nutrientes

Tasa de multiplicación específica Sinergismo Antagonismo Comensalismo FACTORES EXTRINSECOS FACTORES DEL PROCESO Humedad relativa Temperatura

(49)

31 La fase exponencial o logarítmica (log) es la etapa donde la velocidad de crecimiento aumenta hasta su máxima expresión, permitiendo un crecimiento lineal al tiempo y una duplicación regular (intervalos constantes) balaceada con la cantidad de nutrientes del medio (Parker et al., 2009).

El crecimiento equilibrado en esta fase hace que los constituyentes celulares (metabolitos primarios) se produzcan constantemente y que las células se encuentren en un estado fisiológico sano y uniforme para su empleo en estudios enzimáticos y estructurales (Totora, Funke, & Case, 2012).

La fase estacionaria producida por la escasez de nutrientes esenciales provoca un desequilibrio en el crecimiento bacteriano que promueve la formación de metabolitos secundarios que actúan como inhibidores celulares, que cesan la velocidad de crecimiento (Prescott et al., 2002).

Es así, que el número de células no aumenta ni disminuye, pero todas se mantienen viables; sin embargo, el crecimiento crítico de la población en esta fase puede provocar formación de estructuras resistentes a condiciones adversas como las esporas (Parker et al., 2009).

La fase de muerte se traduce como la incapacidad de las bacterias para reproducirse por agotamiento de reservas de energía, o como lisis celular producida por la privación de nutrientes y acumulación de toxinas (Madigan, et al., 1997)

(50)

32

2.5.2.2.2. Factores que influyen en la curva de crecimiento microbiano

Varios factores pueden afectar de manera positiva o negativa al crecimiento microbiano en los alimentos y muchos de ellos pueden trabajar en sinergismo o antagonismo con estos, por lo que su estudio es de vital importancia para la industria alimenticia (Agatangelo, 2007).

Entre los factores de mayor influencia están los intrínsecos y explícitos, puesto que dependen directamente de la materia prima y del proceso (manipuladores). Estos factores presentan variaciones rápidas en el tiempo por lo que su control debe ser estricto y constante; por el contrario los factores extrínsecos e implícitos solo requieren de un control a largo plazo, puesto que no presentan variaciones significativas en el tiempo (Romero, 2015).

Factores intrínsecos, hacen referencia a todas las características físicas, químicas y biológicas de los alimentos y que pueden afectar o favorecer al crecimiento de varias o ciertas bacterias. Entre estos factores tenemos: actividad del agua (agua disponible para reaccionar), pH (ácidos o bases), potencial redox (intercambio de electrones), componentes antimicrobianos (sustancias inhibidoras), estructura antimicrobiana (coberturas o cáscaras) y nutrientes (Olof, 2008).

(51)

33 Factores implícitos, comprenden todas las interacciones microbianas, tales como: el sinergismo que promueve el crecimiento conjunto de dos o más microorganismos; el antagonismo donde el desarrollo de un microorganismos promueve un efecto inhibidor o letal sobre otro; o comensalismo donde el crecimiento de un microorganismo no altera ni favorece el crecimiento de otros (Adams & Moss, 2008).

Factores explícitos o provenientes de los procesos industriales de los alimentos son aquellos que pueden afectar a los microorganismos durante el proceso o almacenamiento del producto, dando oportunidad a contaminaciones cruzadas y desarrollo o muerte de microorganismos benefactores (Jay, Loessner, & Golden, 2005).

Una vez que se ha controlado estos factores y se conoce las condiciones de crecimiento microbiano de una bacteria específica o un grupo de ellas; se pude generar un control sobre la curva de crecimiento a través de sistemas discontinuos o continuos de fermentación, dependiendo de los metabolitos o productos que se desee obtener (Romero, 2015).

Los sistemas discontinuos o batch son aquellos en donde se cumplen todas las etapas de la curva de crecimiento, y son muy empleadas en centros de investigación y medicina, con el objeto de obtener varios metabolitos específicos para la creación de sustancias antimicrobianas, vacunas, entre otros (Adams & Moss, 2008).

(52)
(53)

33

3. METODOLOGÍA

3.1. ELABORACIÓN DE YOGUR CON QUINUA

El proceso general de elaboración del yogur se detalla en el diagrama de flujo correspondiente a la Figura 2.

La materia prima (leche semidescremada) procedente de la Fábrica San Antonio, Nutri Leche UHT, se sometió por 5 min a 85ºC, temperatura a la que se incorporó la formulación de quinua que se presenta en la Tabla 5, con agitación constante para homogenizar la mezcla y destruir la microflora autóctona de la quinua.

Tabla 5. Pretratamientos de la Quinua (Chenopodium quinoa Willd.) para enriquecimiento de yogur batido.

Variables Pretratamiento

Formulación-Dosis (%) Código

Harina de quinua Cocida 2.5 E1 5 7.5 Tostada 2.5 E2 5 7.5 Lavada 2.5 E3 5 7.5

Quinua entera tostada

2.5

E4 5

(54)

34 Para la adición del inóculo Yo Flex (Thermophilic Yoghurt culture), se enfrió la mezcla a 40 – 42 ºC, considerando las recomendaciones establecidas por el fabricante, y se envasó en un frasco de vidrio estéril de 1000 ml que posteriormente se sometió a baño maría a 42 ºC x 6 horas o hasta alcanzar un pH de 4.6 (final de la fermentación). Finalmente se enfrió el yogur hasta alcanzar una temperatura de 4 ºC, para su almacenamiento por 21 días en el cuarto frío de la Planta Piloto de Alimentos de la UTE.

3.2. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

3.2.1 TOMA DE MUESTRA

El muestreo del yogur de quinua se realizó según las especificaciones establecidas en la Norma INEN 004 (1984) para leches y productos fermentados.

La toma y el procesamiento de las muestras se llevó acabo en el área de Transferencia e Inoculación del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Ingeniería, el mismo que se realizó por cada pre-tratamiento (E) al que se sometió la quinua tanto en la etapa fermentativa como en los días de almacenamiento (7, 14 y 21).

(55)

35 En la Figura 6 se muestra el esquema de muestreo de yogur con quinua durante la etapa de fermentación y almacenamiento.

Figura 6. Esquema para el muestreo de yogur con quinua durante la etapa de fermentación y almacenamiento

Las muestras recogidas se sellaron y conservaron en cadena de frío hasta el momento de la última toma de muestra (pH 4.6); para su posterior análisis.

3.2.2 DILUCIONES SUCESIVAS

Durante el proceso se trabajó bajo condiciones de esterilidad en una cámara de flujo laminar marca Teistar. Se realizaron análisis preliminares para determinar el número de diluciones necesarias por cada pretratamiento y

H . C o c id a (E 1 ) H . T o s ta d a (E 2 ) H . L a v a d a (E 3 ) Q . e n te ra t o s ta d a (E 4 )

1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

3

3

1 2 3

E

1

1 2 3

2

1 2

E: Pretratamiento de la quinua

D: Dosis de quinua equivalentes a: 1 (2.5%), 2 (5%) y 3 (7.5%)

L: Lotes o día (1), día (2) y día (3) de muestreo

R: Replicas por día

(56)

36 dosis de quinua, de acuerdo al procedimiento establecido por Mossel & Moreno (1991).

Para la preparación de diluciones se midió 10 ml de la muestra con un pipeta graduada estéril y se transfirió a un frasco con 90 ml de agua peptonada tamponada (este proceso formó parte de la toma de muestra); se homogenizó por agitación durante 20 s (dilución ) y a partir de esta

dilución se realizaron diluciones sucesivas ( ) con una micropipeta al transferir un 1 ml de la dilución anterior a un tubo con 9 ml de agua peptonada tamponada estéril que posteriormente se homogenizó, en un homogeneizador tipo “vortex” por 20 s.

3.2.3 SIEMBRA EN PLACA EN PROFUNDIDAD

Al igual que las diluciones sucesivas, este proceso se llevó a cabo en la cámara de flujo laminar y bajo las especificaciones establecidas por Gamazo, Lopez, & Díaz (2009).

(57)

37

Figura 7. Procedimiento de siembra por profundidad (Beltram, 2010)

3.3. EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO

MICROBIANO

3.3.1 IDENTIFICACIÓN DE LA POBLACIÓN BACTERIANA

Finalizado el tiempo de incubación, se procedió a la identificación morfológica detallada por Rivas & Garron (2006) de las colonias de

Streptococcus thermophilus, circulares o lenticulares, compactas y con bordes uniformes; y las colonias de Lactobacillus bulgaricus, como alargadas de aspecto rugoso o con bordes irregulares.

Se comprobó esta clasificación, a través de una tinción diferencial Gram de las colonias, de acuerdo al procedimiento de Gamazo et al. (2009), como se puede observar en la Figura 8. Las muestras se observaron en un microscopio marca OLIMPUS, utilizando el lente objetivo de inmersión (100X) para confirmar la presencia de cocos y bacilos Gram positivos pertenecientes a las colonias asignadas de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus y Lactobacillus delbruechii subsp. bulgaricus.

(58)

38

Figura 8. A: Colonias de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, B: colonias de Lactobacillus delbruechii subsp. bulgaricus y C: moho

Geotrichum candidum en Agar MRS.

Para la identificación de mohos se realizó una tinción simple con azul de Lactofenol de acuerdo a Gamazo et al. (2009). Se cortó un segmento de cinta adhesiva transparente y se tomó una muestra pegando la parte adhesiva a la superficie del moho seleccionado; se preparó un portaobjetos con una gota de azul de lactofenol y se pegó la muestra sobre la gota; finalmente se observó en el microscopio con el lente de 100 X, para visualizar la estructura fúngica. Se prosiguió a la identificación mediante el manual para identificación de hongos de Samson, Hoekstra, Frivad, & Filtenborg (1995).

3.3.2 RECUENTO TOTAL DE LA POBLACIÓN BACTERIANA

Identificadas morfológicamente las bacterias se prosiguió al recuento en placa, utilizando el método establecido por Ahmed & Carlstrom (2006). Se contó todas las células viables superficiales y las incluidas en el medio MRS, y se consideró el factor de dilución y un rango de recuento de 30-300 colonias. Los resultados se expresaron en logaritmo natural de unidades

A

B

(59)

39 formadoras de colonias por unidad de volumen o log (UFC/ml) por cada pretratamiento, para posteriormente desarrollar su respectiva curva de crecimiento microbiano revisar Anexo I.

Se realizó el mismo procedimiento para mohos, con un rango de recuento de 10-150 según la Norma ISO 7954 (1993) y su resultado se reportó en logaritmo natural de unidades formadoras de mohos por unidad de volumen o log (UFM/ml).

3.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados fueron procesados en un diseño factorial (ANOVA) AxB, siendo las variables A: Dosis de quinua pretratada y B: tiempo; los datos fueron comparados con el test de Tukey al 0.05 de diferencia significativa, en el Software INFOSTAD versión estudiantil, para evaluar el efecto de la adición de quinua, sometida a diferentes tratamientos, en el crecimiento de los Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus salivarius

subsp. thermophilus, durante la etapa de fermentación y almacenamiento del yogur.

(60)
(61)

40

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

En este capítulo se presentan y discuten los resultados obtenidos en el estudio de la cinética de crecimiento de Streptococcus thermophilus y

Lactobacillus bulgaricus, durante la fermentación y almacenamiento del yogur con quinua. Los cuatro tipos de yogur utilizados se codificaron como: E1- yogur con harina de quinua cocida, E2- yogur con harina de quinua tostada, E3- yogur con harina de quinua lavada y E4- yogur con quinua entera tostada.

4.1. CARGA MICROBIANA PROMEDIO DE LAS CUATRO

FORMULACIONES DE YOGUR

Para determinar y comprobar la diferencia morfológica de las colonias de

(62)

41

Figura 9. Tinción Gram de colonias de A. Lactobacillus bulgaricus y B.

Streptococcus thermophilus

Los resultados obtenidos en relación a la carga microbiana promedio de los cuatro tipos de yogur, se presentan en la Tabla 6.

Tabla 6. Carga microbiana promedio de los cuatro tipos de yogur evaluados.

Yogur Formulación o Dosis (%)

Streptococcus salivarius subsp.

Thermophilus

Lactobacillus delbruechii subsp.

Bulgaricus

Log (UFC/ml)1

E1 2.5 4.03 ± 0.46 a 3.70 ± 0.43 a 5 4.97 ± 0.49 b 4.68 ± 0.51 b 7.5 6.12 ± 0.49 c 5.69 ± 0.48 c

E2 2.5 4.28 ± 0.35 b 3.97 ± 0.37 b 5 4.11 ± 0.35 a 3.72 ± 0.34 a 7.5 4.21 ± 0.40 b 3.86 ± 0.67 ab

E3 2.5 4.28 ± 0.35 a 4.03 ± 0.30 a 5 4.54 ± 0.40 b 4.06 ± 0.36 ab 7.5 4.62 ± 0.38 b 4.23 ± 0.37 b

E4 2.5 5.33 ± 0.46 b 4.97 ± 0.46 b 5 4.87 ± 0.49 a 4.52 ± 0.49 a 7.5 5.28 ± 0.49 b 4.98 ± 0.39 b

1

media ± desviación estándar (n=18)

*Letras diferentes significan diferencia significativa entre dosis de quinua por yogur

B

(63)

42 De acuerdo a la carga microbiana promedio se puede observar que E1 alcanzó diferencia significativa entre las tres dosis, logrando un mayor crecimiento para la dosis de 7.5%, sin embargo, E2 y E4 presentaron similitud estadística para las dosis 2.5 y 7.5% y diferencia significativa entre estas dos con la dosis 5%; E3 logró similitud estadística para las dosis 2.5 y 5% y diferencia significativa entre estas dos con la dosis 7.5%. Los resultados de E2, E3 y E4 demostraron que la dosis de quinua no posee influencia directa sobre el crecimiento del cultivo iniciador pero promueven un mayor crecimiento que en el yogur natural con cultivo Yo-Flex ® de acuerdo al estudio realizado por Rodríguez, Serna, Uribe, Klotz, & Quintanilla (2014).

(64)

43

4.2. DINÁMICA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO INICIADOR

DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL YOGUR CON

QUINUA

En la Figura 10, se muestra la dinámica de crecimiento del cultivo iniciador durante la fermentación de E1, E2, E3 y E4.

Figura 10. Dinámica del crecimiento de los cultivos iniciadores durante la fermentación de: E1 ( ), E2 ( ), E3 ( ) y E4 (x).

En el caso de E2 y E4 la fase logarítmica inicia de forma acelerada con la incorporación del cultivo (0 a 0.06 horas) y se mantiene constante conforme se reduce el pH (0.22 a 0.25 horas), este comportamiento vuelve inadvertida a la fase de latencia y promueve una similitud en la dinámica de crecimiento de ambos yogures, comportamiento que pudo atribuirse a los nutrientes liberados durante el tratamiento de tostado de la quinua que estimularon la adaptación y división celular de las BAL al mezclarse con los nutrientes de la leche. Por otra parte, E3 mantuvo una cinética de crecimiento tenue todo el

E1

E2

E3

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