Purificación de T Vivax y extracción de proteínas de membrana a partir de ovejas inoculadas experimentalmente

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(1)Cor221 r' cument00fl Certr0 de C. PURIFICACION DE T. VIVAX Y EXTRACCION DE PROTEINAS DE NEHEBRANA A PARTIR DE OVEJAS 1 NOCUL1ADAS EXPERIMENTALMENTE. ,,$L1OTECA A3ffOpEC*AI'. rr. Q48JA. DARLEY JANETH BONNETT IT... NON ICA PATRICIA LONDOÑ() B.. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVER [ANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS CARRERA DE BAcTERIOL0GIA SANTA FE DE BOGOTA 1995.

(2) 1'IJRT FI C/.cI OJJ DE T VTVAX Y. ON DE i'R(IyrE 1 DE flt1RLAiT A PART 1 J? I)E OVEJA 1 N FEOr/WAS EXJPER IHEN'rMj4Jq.

(3) 1. • uRIFic/cIoN w 'r VIVAX EXI'RAeCI N DE E'ROrE 1 NA DE fEHflRAA A AT IR DE OVEJA 1 NFECTADAS EXI'ERII1JXNALJ1ENTE. DARLEY JANETH BONNETT H. MONICA PATRICIA LONDOÑO B.. 1.. ar1os Corred Ph.D Decano Acadéy&co Facultad de/Ciencias r'. Neli'y Susana Rued1C. Directora Carrera de Bacteriología. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS CARRERA DE BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA 1995.

(4) I?U1I 1? 1 (ACI ON DE T- VI VAX Y EX"rRA€XT ON DE PRO'rE 1 HAB DE t1EtEI3RANA A I'AR IR DE OVEJAS 1 NFECTADAS EXPERIIENTALJ1EN'rE. DARLEY JANETH BONNETT H. MONICA PATRICIA LONDOO B.. arlo Due. /C4 Biól-Quim.,, MSa. ,Ph.D Director.. Dr. Jorge E. Almansa M. V., MSa Codirector. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS CARRERA DE BACTERIOIIOGIA SANTAJIE DE BOGOTA 1995.

(5) (7 7M -Lr CiroO bo. IE'IJR 1 FI (ACI ON DE T VI VAX Y EX'TRACCI ON DE FROTE 1 NAS DE IIEMI3RANA A J?A1rrIR DE OVEJAS 1 NFETA13AS EXPER It1ENTALz1EN'rE. DARLEY JANETH BONNETT H. MONICA PATRICIA LONDOÑO B.. I7. Dr. Oaoía A. M.V.Z., MSc., Ph.D Jurado. o. co J_4 Dra. Carmen Inés llora Bacterióloga Jurado. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS I3ASICAS CARRERA DE BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA 1995.

(6) Los criterios expuestos, las opiniones expresadas 'y las conclusiones anotadas son de responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la Pontificia Universidad Javeriana.

(7) AGRADECIMIENTOS. A CARLOS O. DUQUE. Biólogo - Químic o. PhD. Programa Nacional de Biotecnología Animal. Corporación Colombiana de Invesigación Agropecuaria CORPOICA, Centro de Investigación de Salud y Producción Animal CEISA. A JORGE E. ALMANSA, Médico Veterinario. MSc. Programa Nacional de Biotecnología Animal. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA, Centro de Investigación en Salud y Producción Animal .CE1SA. A ALVARO SANCHEZ, Au><iliar de Laboratorio. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA, Centro de Investigación de Salud y Producción Animal CE ISA. Al Programa Nacional de Biotecnología Animal. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA. Centro de Investigación de Salud y Producción Animal CE ISA. Al Programa Nacional de Salud Animal. CORPOICA-CEISA. A La PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA..

(8) TABLA DE CONTENIDO. 1. 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.2.1 1.3.2.2 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.5 1.5.1 1.5.2 1.6 1.6.1 1.6.2 1.6.3 1.7 1.8 1.9 2. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.3.1 2.4.3.1.1 2.4.3.1.2 2.4.3.2 2.4.3.3 2.4.3.3.1 2.4.3. .3.2 2.4.3.4 2.4.3.5. INTRODUCCION MARCO TEORICO GENERALIDADES FAMILIA TRIPANOSOMATIDAE Géneros C.iclo Biológico GENERO TRIPANOSOMA Características Clasificación Sección S te rcora r ja Sección Salivaria ESPECIE Iypanoso ma Vivax Historia Agente Etiol6gico Ciclo de Vida EP IDEMIOLOGIA Huéspedes Transmisión PATOLOGIA Anemia Chancro Sidrome Hemorrágico VARIABILIDAD ANTIGENICA DIAGNOSTICO PURIFICCION DEL T. viva>< MATERIALES Y METODOS UD ICAC ION UNIVERSO PARASITOS MATERIALES Equipos Elementos de Laboratorio Reactivas Soluciones Amortiguadoras Solución Buffer Fosfato Salino Solución Buffer Fosfato Salino 9 1 u c: osado DEAE Celulosa Reactiuvos de Ajuste de pH Hidróxido de Sódio al 20Y. Acido Ortofosfórico al 10/. Colorante de Giemsa Colorante de Wriqth. Pág. 1 5 5 5 6 7 8 8 8 9 9 11 11 14 14 15 15 16 18 18 20 21 21 24 30 32 32 32 33 33 33 34 35 35 35 36 36 37 37 37 38 38.

(9) 2.5 2.5.1 2.5.1.1 2.5.1.2 2.5.1.2.1 2.5.1.2.2 2.5.1.2.3 2.5.1.2.4 2.5.2 2.5.2.1 2.5.2.2 2.5.3 2.5.4 3 3.1 3i.1 4 4. .1 4.2 4.3 4.4 5 6 7. METODOS UTILIZADOS Método de Detección Directa Muestra Procedimiento Recuento de Lumsden Observación Directa en Fresco Método de Woo Coloración de Giemsa Cromatografía de Intercambio Jónico Muestra Procedimiento Extracción de Proteínas Determinación de Proteinas DES(RRCJLLO EXPERIMENT(W DISEÑO EXPFRIMENTÇL Dia cl ra ma del De rrnlln Fxpr'riment-al PIlE EíI'J FC i(1II DF. PE'JI 1 ñI)M5 FOSE INTCJ(L E ICOS 1 3 (R( 131 TFMJ CUS PtJRIFiCCION DEL PrRñSJTí) CU('INTIFICÇCION DE PRO TETN(S DISCUSION DE RESU[fflQ CONCLUSIONES D RL 1 U(ROF 1. 39 39. 39. 39 40. 40 41 41 42 42 43 45 46 47 47 19. 50 50 51 72 7 .•3 77 DL.. 95.

(10) LISTA DE FIGURAS Pág. FIGURA 1.. vivax coloreado mediante la técnica de Wri.qth.. 51. FIGURA 2.. Obtención de la muestra de sanqre por ven¡ punr i ón yu.t 1 a r. 52. FlG LIRA 3.. Tcnra. FIGURA 4.. Técnica. de I,iro. Proceso de centr i fuqac i ón. FIGURA 5.. Técnica do Nao. En la fase sea)ada por la aguja se encuentra 1 parásito. 55. FIGURA 6.. 'rnlc;3 Lámina coloreada medanI:e 1 de Wriqth. Montaje de la cámara en la técnica de Noo.. 56. FIGURA 7.. Técnica de Nao. Observación microscopica a 1OX dei parásito.. 57. FIGURA 8.. Observación directa en fresco del parásito.. 58. FIGURA 9.. Montaje de la muestra en columna de DEE celulosa.. 74. II.. dR. Non. MenLae de tubo capilar. 53 514. FIGURA 10. Purificación del parásito a través de una columna de DEE celulosa.. 75. FIGURA 11. Observación de la coloración do Wriqth en IOOX. 80. FIGURA 12. Observación de la coloración de Giemsa en IOOX.. 81.

(11) LISTA DE GRAFICAS Pág. 8RAFICA 1. Picos parasitémicos. Ovino 3855 Mes 1. 59. GRAFICA 2. Picos parasitémicos. Ovino 3855 Mes. 60. GRAFICA 3. Picos parasitémicos. Ovino 3855 Mes 3. 61. GRAFICA 4. Picos parasitémico. Ovino 3855 Mes. 62. GRAFICA 5. Picos parasitémicos. Ovino 3861 Mes. 63. GRAFICA 6. Picos parasitémicos. Ovino 3861 Mes. 64. GRAFICA 7. Picos parasitémicos. Ovino 3861 Mes. 65. GRAFICA 8. Picos parasitémicos. Ovino 3861 Mes. 66. GRAFICA 9. Picos parasitémicos. Ovino 3888 Mes. 67. GRAFICA 10. Picos parasitémicos. Ovino 3888 Mes. 63. GRAFICA 11. Picos parasitémicos. Ovino 3888 Mes. 69. GRAFICA 12. Picos parasitémicos. Ovino 3888 Mes. 7. GRAFICA 13. Ovino control 3951. 71.

(12) SI. Co ka. Cn2ro de. LISTA DE TABLAS Pág. TABLA 1. condiciones Generales del, Grupo Experimental. 50. TABLA 2. Concentracin de Proteínas Extraldas de los Parásitos Purificados. 76. -,.cf'.

(13) RESUMEN. El T.vivax es un parásito enzoótico que causa infecciones principalmente en bovinos, provocando la disminución en la producción d leche, carne, con un aumento en los abortos y nacimientos prematuros. El impacto económico de la tripanosomiasis no ha sido completamente establecido en Colombia, debido a la falta de observaciones científicas sustentadas en pruebas diagnósticas, teniendose conocimiento de la ocurrencia de la enfermedad solo por informaciones provenIentes de los dueios da los hatos. Los efectos adversos causados por la enfermedad no solo en Africa, donde se presenta la situación más crítica, sino también en la costa caribe suramericana, han intensificado el estudio de la biología del parásito con el fin de identificar los factores que puedan ser manipulados para lograr su control. La habilidad que presenta el parásito para eludir la respuesta inmune del huésped está basada en su variabilidad antigénica, lo que dificulta además la elaboración de una vacuna convencional. Los estudios se encaminan en la actualidad a. buscar otros procesos escenciales físicos y químicos que tienen lugar dentro del ciclo de vida del psrsito y que pueden ser interrumpidos utilizando agentes terapéuticos. Con este estudio se pretendió establecer una base procedimental para, lograr el.

(14) aislamir'nto del par' ito y de esta manera favorecer las posteriores investigaciones sobre la inmunobiologla del T. vivax. La fase inicial del estudio consistió en el establecimiento de una línea base del estado general de la población de ovinos que, posteriormente estarían expuestos a una infección por T., cepa Montería 85. Cuando variables clínicas como temperatura rectal, carga de ectoparásitos, parásitosgastrointestinales, hematocrito y hemoglobina estuvieron dentro de los valores de referencia, se procedió a. dar. inicio. a. la. fase. experimental,. mediante. la. reactivación de la cepa en un ovino esplenectomizado.. Durante la fase experimental se realizó un seguimiento de los ovinos, mediante la determinación de la temperatura rectal, hematocrito y porcentaje de parásitos en lámina venosa coloreada con Wright. Estas mediciones se realizaron por un periodo de cuatro meses, para determinar los picos parasitémicos a partir de los cuales se obtendrían las muestras de sangre que posteriormente se pasarían a través de una columna de intercambio jónico DEAE Celulosa (Lanham y God frey. 1970) . La muestra de sangre se separ por centrifugacióna 2500 r.p.m. por 10 minutos. El paquete celular se diluyó en una proporción 1:2 en PBSG al 8%, mientras que el plasma se colocó en la columda de DEAE sin diluir.. Una. vez aislado el. parásito.. se realizó. la.

(15) extracción de proteínas utilizando un solución compuesta por SDS y 2-mercaptoetano1. La concentración de proteínas presentes en la mu'rtra se cuantificó. rnedinte la. técnica. de Bradford.. La técnica de cromatogra-fla de intercambio iónico demostró ser lo sufi.cientemente eficaz en la concentración del parsito, utilizando muestras de sangre separadas por centrifugación, disminuyéndose además el tiempo necesario para su elusión.. Las concentraciones de proteínas fueron directamente proporcionales a la densidad parasitaria, lo que confirmó la eficacia de la técnica de extracción de proteínas y la sensibilidad del método de cuantiflcción de Prad±ord.. Este estudio permitió establecer la base de futuras 1 1 investigaciones sobre ls características del parásito 1. tales como la variabilidad antigénica, isoenrimas y DNA que permitirán el mejoramiento de las medidas terapeuticas de control de la enfermedad..

(16) 1 NTROIMJCC ION. El psma vivax es un hemoparsito enzoótico en el Africa, en donde se transmite generalmente a través de la Glossina pp., un artrópodo hematófago que afecta varias especies animales entre las que vale mencionar la bovina, ovina, caprina y la, equina. En otras regiones tropicales y suhtrop ical es del mundo, aún no se encuentra ci rainente establecido su mecanismo de t r ansmisión, lo cual dificulta su control. La infección por el T. vivax se ha extendido desde Africa, en donde se ha estimado que produce pérdidas económicas millonarias (Godwjn, 1973), hacia las zonas tropicales de Suramérica, incluyendo algunas de las islas del Caribe. En Colombia se ha idefltjfjcrJo la presencia de este parásito en los Llanos flrj,enaJes la Costa Atlnt.jc 2 y el Valle del Cauca, en donde se estima produce prdida.s oconómlcas. 110. bien establecidas para el sector pecuario.. El lflStituto . Coljmhtano Agropecuario tlC, considera la tri panosomiasis, en el tercer lugar dç2 importancia por el.

(17) CA -. ,opECUA. impacto económico que produce a la industria pnadera, depués del daio inducido porlas garrapatas y el l)istoma hepático (Peía y colaboradores, 1980).. Debido a. la. falta de inveirjnc. que ovaluen el impacto. económico que representa para la industria pecuaria el Tripanosoma . vivax. no se. conoce. la real. magnitud de. los. daPos producidos. Adoms, el inventario realizado hasta ahora. está basado en Ill!.jchoO Casos en informad ones que provienen de los propiet-.arfos do los liat:ns y no de observaciones. cient-.l fi cas. sustentadas. en. pruebas. d ja g n ó s 1 cas.. El impacto que genera el T. vivax en e) campo se evalúa desde dos a:;prpct.c)s principales en primer 1 ligar los episodios clinicos, los cuales se pueden cuantificar en trinjnos del número d animales. infectados. cada a. y en. cada hato, mediante el seguimiento de la m n rhi --morialidad, el. descart.e. forzoso de anima les,. nacimiento de animales muertos,. lo s abortos y el la reducción en la. producción de leche y los gastos adicionales en media.mentos y servicios veterinarios. Sin embargo, en este aspecto no se dispone de datos realmente confiables. Un segundo aspecto importante, es la evaluación de los hatos afectados asintomáticos, lo cual genra un pr'ohlema de escasa identificación de la real magnitud y alcance de la infección..

(18) 3 t En 1980 el 1 CA estimó quia las posibles pi f d 1 da . anual es causadas por La tripanosomiasis ascendian a ms de 50 millones de dólares. En la actualidad es difiil establecer la magnitud real del impacto económico en I. rentabilidad de esta industria debido a los aspectos antes mencionados.. El. presente. trabajo. Inmunobiologla del. hace. L... parte. del. vivax, en el. proyecto. de. se efectuó una. separación y purificación del parásito, tomado de di férentes picos paras¡ témicos de un grupo de ovi. nos experimentales, a través de la técnica de cromatografia de intercambio jónico descrita por Lanhan. y. Codfrey en 1970.. Posteriorment se procedió a romp' el par'si to aislado, para liberar las proteínas de membrana a las cuales se les realiza elect.rriforésis en gel de poi iacrilamida; A partir de este gel . . se buscó montar una técnica de i nnnunobl ott a fin de determinar si algunas de las proteínas existentes permanecen constantes en los picos examinados, con lo cual se podría establecer la base de futuros estudios encaminados a.l control. y. prevención de la enfermedad a.. partir de proteínas inalterables.. El Instituto colombiano Agropecuario (ICA), la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA) y la faaultad de Ciencias de la Pontificia Universidad .Javerj.ana. pretenden entre otras cosas, • real izar un estudio de la vaTiación antigénica del. parásito para lo cual,. 1a.

(19) 4 metodología estandarizada, el establecimiento de los picos parasitémicos y la obtención de proteínas de membrana del tripanosoma, constituyen un avance en el logro de ese objetivo..

(20) ese Centr° d CEISA. 1. MARCO TEORICI). 1.1. GENERALIDADES. La tripanosomiasis se presenta en más de la tercera parte de Africa y es causada por infección con parásitos protozoarios, los cuales son transmitidos tanto a animales domésticos y salvajes como a personas, por la mosca tsetse, cuando ésta se alimenta con sangre de mamíferos contaminados.. En el Caribe y Suramrica en donde no existe la mosca tse-. tse, no está claramente establecido el vector de transmisión del parásito Tr yp anosoma vivax; aun cuando existen evidencias que señalan que esto ocurriría a través de artrópodos hematófagos como tábanos y Stomoxys app. (Otte and Ahuahara, 1991).. 1.2 FAMILIA TRYPANOSOMATIDAE. Los integrantes de la familia Trypanosomatidae tienen forma.

(21) alargada como de hoja o parcialmente redondeada, poseen un núcleo grande ovalado y central. Durante su ciclo biológico (o indirecto pasando por vertebrados o invertebrados), los miembros de un género Pueden pasar a formar estructuras similares a los miembros de otros géneros; para diferenciarlos se deben tener en cuenta los siguientes aspectos. - Existencia o no del flagelo y su longitud.. - La ubicación del corpúsculo basal y el kinetoplastO dentro. del parásito y su relación con el núcleo. celular.. 1.2.1 Géneros. - Leptomona, aparecen en invertebrados. - HerpetomOpas, típico de invertebrados. encontrado. - Crithidlla,. en. artrópodos. y. otros. invertebrados. -. de plantas y artrópodos.. - Leishmania, se localiza en artrópodos y vertebrados. - TripanosQJi, de vertebrados y artrópodo..

(22) .ILI0TECAGO:EC1J4ÑJA . 7 1.2.2 Ciclo Biológico. El. ciclo biológico de. los miembros de. la. familia. Tripanosomatidae comprende cuatro estadios:. - Estadio trypomastigote (estadio trypanosómico) . Forma lanceolada ..pon un kinetoplasto situado por detrás del núcleo y generalmente próximo al extremo posterior. A menudo se presenta una membrana ondulante bien desarrollada y un flagelo libre. Con frecuencia esta fase se encuentra en el hospedador vertrebrado, pero también se puede localizar en los artrópodos como la forma infectante del hospedador vertebrado.. - Estadio Epimastigote (forma crithidial), tanto el kinetoplasto como el axonema se encuentran por delante del núcleo, con una membrana ondulante corta. En unas pocas especies esta etapa aparece en el vertebrado hospedador como parte de su ciclo de desarrollo, pero principalmente se trata de un estado observable en los artrópodos.. - Estadio Promastigote (forma leptomonádica), el kinetoplasto y • el axonema se encuentran en el extremo anterior del cuerpo y no poseen membrana ondulante. Estas formas se presentan en artrópodos y/o plantas.

(23) - Estadio amastigote (forma leishmania}, el cuerpo del parásito aparece redondeado y no presenta flagelo o se encuentra reducido a una corta fibrilla. Es una forma típica de vertebrados y artrópodos con kinetoplasto.. 1.3 GENERO TR'zTANOSOMA. 1.3.1 Características. Poseen un único flagelo formado por microtúbulos, este nace de una estructura llamada corpúsculo basal que se encuentra en el extremo posterior, recorriendo todo el largo del parásito hasta el extremo anterior donde se hace libre. Cercá,del corpúsculo basal se encuentra otra estructura denominada kinetoplasto que contiene el DNA y hace parte de la única mitocondria alargada que posee este parásito. Dentro del citoplasma se encuentran organelos como el aparato de Golgi, retículo endoplásmico, ribosomas, lisosomas y vacuolas. El citoplasma es recorrido por un número variable de microtúbulos suhpeliculares.. 1.3.2 Clasificación. El género Trypanosoma se clasificó en dos secciones (Hoare, 1964) * Sección Stercoraria..

(24) .9 *.Sección Salivaria.. 1.3.2.1.. Sección Stercoraria... Conformada por cuatro. subgéneros: * Megatrypanum - Herpetosoma - Schizotrypajwn - Endotrypanum. Estos subgéneros no son patógenos, únicamente el primero tiene interés veterinario o médico.. 1.3.2.2. Sección. Salivaria.. Conformado. por. cuatro. subgéneros: a.. Subgénero Duttonella Especies: Trypanosoma vivax, forma alargada. Tr yp anosoma uniforme, forma corta.. b.. Subgénero Nannomonas Especies: Trypanosoma congolense, monomórfico (forma. corta) Trvpanosoma., dimorphon, monomórfico (forma larga) Trypanosoma simiae, polifórmico.. Estos subgéneros son patógenos para bovinos, ovinos, equinos y porcinos..

(25) CQr1trQ de Docurnenlcjcón. U ISA lo. o.. Subgénero Trypanozoon. De acuerdo a su biología- se. divide en dos subgrupos:. * Los que tienen desarrollo cíclico en el intestino medio y glándulas salivares de glossina SPP. Incluye las especies:. - Trypanosoma brucej: Infecta tanto a los animales domésticos -. como a los antílopes. biense: Infecta principalmente al. hombre. - Trypanosoma. ambiense:. Infecta. principalmente al. hombre.. * Los que tienen desarrollo no cíclico en artrópodos con transmisión mecánica. Las especies incluidas son:. - Trypanosoma evansi: Afecta a bovinos, caninos, equinos y camélidos. - Trypanosoma eipjnurn: Se presenta en equinos. - Trypa.n qama ea u¡ p s— :ind-tj-m: Se presenta en equinos.. d. Subgénero Fycnomonas. Especie: Tr yp anosoma suis: Afecta principalmente a porcinos..

(26) •1 1 1.4 ESPECIE llryoanosoma Vivax. 1,4.1 Historia. Los tripanosomas han llamado la atención de los Investigadores desde la segunda mitad del siglo XVII. Sin embargo, solohasta 1880, Grif-fith Evans reconoció por primera vez en la India su potencial patógeno en caballos y camellos.. En 1964, teniendo en cuenta el ciclo de vida en el vector y en el huésped mamífero, Hoare estableció dos grupos de tripanosomas en mamíferos los cuales se denominaron sección Stercoraria y sección Salivaria. Los parásitos patógenos para el ganado son los pertenecientes a. la sección al ivaria.. Hacia 1919 se detectó por primera vez la presencia del T. Vivax en Suramérica, cuando Leger y Vienne lo observaron en la Guyana Francesa. Posteriormente en 1943, Curason consideró que el parásito ingresó desde Senegal a través de una importacion de ganado en 1830, en la cual perecieron 22 de los 80 animales. Su posterior y casi inmediata presencia en las islas de . Guadalupe y Martinica es la natural consecuencia de los movimientos de ganado. La crono'ogía de aparición del parásito en los diferentes países, es accidental y solo en 1976, Clarkson consideró que la.

(27) 12 presencia del T. vivax abarcaba no solo los países ya descritos, sino que también se encontraba ya en Panamá, la. costa caribe Suramericana y el Brasil. En Colombia, Zapata en 1931 envió unas láminas a Uribe para confirmar la presencia por primera vez del L. vivax, cuando se presentó una tripanosomiasis en bovinos en la costa Atlántica, en donde murieron casi 12000 animales en un lapso de tiempo de no más de dos aos. Uribe y Plata, en ese mismo aío confirmaron que los parásitos correspondían al grupo yivpx. Virviescas en 1932, quien consideró que los primeros casos de presencia del parásito ocurrieron en 1929 en ' la región cercana a Cartagena, luego de importaciones de ganado de Apure en la vecina Venezuela, estimó que la similitud de síntomas entre la tripanosomiasis y la naplasmosis se constituía en un factor distractor en la determinación exacta de la cronología de aparición de la enfermedad. Estas importaciones se registran desde el ao de 1927.. El movimiento de la enfermedad por los departamentos de la costa atlántica y su posterior aparición en el interior del país, se debe a los continuos desplazamientos de ganado y es así como en 1935 se registra la presencia del parásito en el norte de los llanos orientales y entre 1951 y 1955 en el Valle del Cauca; finalmente, Wells consideró que en cercanías de Neiva en 1979 la presencia del parásito estaba.

(28) ARJ _c. 13 asociada a una epidemia que había causado mortal ¡dad en la población bovina en varias fincas de la región.. Solo hasta 1967, se inició el estudio de la enfermedad a través de la patologia hemática utilizando animales experimentales y en 1969 a través de estudios en la mayoría de las regiones del país mediante la observación de sintomatología clínica y confirmación por gota gruesa, se especuló sobre la distribución endémica de la enfermedad en regiones como la Costa Atlántica, en los Llanos Orientales y en el sur del Valle del Magdalema (Ra y e, 1967).. La técnica de lnmunofluoresceñcia indirecta, fué utilizada por primera vez en el Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT en el Valle del Cauca en 1974, con el fin de evidenciar la presencia de anticuerpos contra el I vivax. En 1976, se modificó la técnica para mejorar la lectura y así lograr mayor detección de casos positivos, con lo cual se concluyó que todo el Valle del Cauca era endémico para. el L. vivax.. En estudios realizados por el Instituto Colombiano Agropecuario ICA en 1976, utilizando las técnicas de inmunofluorescencia indirecta y gota gruesa, cubriendo un 50% de áreas tropicales y subtropicales y un 75% de las principales áreas ganaderas se confirmó la presencia del par'io en estas regiones del pafs..

(29) 14 En 1992, García determina la endemicidad de la enfermedad en el Valle del Slnú utilizando para ello la técnica IFAT en 101 fincas ganaderas de la región.. Como puede colegirse.de esta información, la aparición del Tryoanosoma vivax en Colombia fue una consecuencia de las importaciones., de ganado desde el ao de 1927 y su diseminación ha obedecido a los diferentes movimientos que la población bovina ha tenido en el interior del país.. El desarrollo de nuevas y mejores técnicas de detección del parásito en forma directa o indirecta, ha permitido tener 'un panorama mas claro en cuanto a la distribución de la enfermedad y se ha constituido en una valiosa herramienta para su diagnóstico y control.. 1.4.2 Agente etiológico. Es una especie monomórfica de 20-26 Um x 3 hm (Hoare and Broom, 1938). Su porción posterior es bulbosa y ancha, con un kinetoplasto grande y un flagelo terminal libre de 3 a 6 Um de longitud. El parásito es muy móvil en sangre fresca desplazándose rápidamente a través del campo.. 1.4.3 Ciclo de vida. El insecto vector Glossina spp se infecta al alimentarse.

(30) 1•5 con sangre de un animal enfermo que presenta formas trypomastigote, las cuales se localizan en la porción posterior del intestino medio del vector en donde se multiplica. Inicialmente las formas que se dividen en el intestino medio son anchas, con un kinetoplasto situado entre el núcleo y el extremo posterior. A continuación se producen las formas más delgadas y largas, que emigran hacia atrás penetrando en el proventrículo. Posteriormentevan al esófago y a la faringe y se ubican finalmente en la pro boscide donde se multiplican los epímastigotes a partir de cuales se producen las formas metaciclicas o infectantes (Vickerman, 1973).. Al. picar. las. moscas. al. huésped. le. inyectan. los. trypomastigotes metacíclicos, los que en la sangre y ganglios linfáticos del hospedador definitivo, se reproducen por fisión binaria o múltiple; la división comienza en el kinetoplasto, sigue en el núcleo y finalmente en el citoplasma.. I.S. EPIDEMIOLOGIA. 1.5.1. Huéspedes. .. Los estudios epidemiológicos realizados hasta hoy, selialan a los bovinos como los principales portadores de la enfermedad. Algunos investigadores han reportado casos.

(31) 16 accidentales en cabras, búfalos de agua y venados sin que esto constituya real evidencia de ocurrencia de posibles endemias (Fernandez en 1931, Fiasson en 1948, Wells en 1980).. En Colombia se ha considerado que los bovinos Criollos y Cebú son los 4 .más resistentes al parásito, comparados con los importados de razas Holstein y Pardo Suizo (Wells et al 1970). Los diferentes cruces de razas europeas con ganado criollo, han demostrado ser más resistentes a la enfermedad en evaluaciones sobre sintomatología clínica (Betancourt, 1978). 1.5.2. Transmisión. En Suramérica un amplio espectro de insectos picadores de bovinos han sido y tendrán que seguir siendo investigados a fin de tratar de determinar el vector de la enfermedad, ya que como es sabido la mosca tsetse es la responsable de la transmisión en el Africa y este insecto no se encuentra en América.. La transmisión mecánica del parásito parece esta'r asociada con una parasitemia. alta en el huéped, a la presencia de.

(32) 17 un elevado número de moscas picadoras que se alimentan dentro de un corto periodo de tiempo en diferentes huéspedes (Page, 1972).. Entre los vectores diferentes a la Gtossina spp, que se han estudiado, se ha identificado el tábano como potencial transmisor deL parásito, dado que en las estaciones lluviosas su presencia aumenta y esto se ha relacionado con e) incremento en la prevalencia de infecciones por T. vivax en el ganado (Betancourt, 1978). Sin embargo, en un estudio real 1izdo con el tábano Cryptotylus unicolor, se logró establecer que aunque es posible transmitir la enfermedad de manera experimental , esto no es evidencia suficiente que confirme su habilidad para transmitirla en el campo (Wells, 1972).. Betancurt por otra parte, disectó 1020 tábanos en el Valle del Cauca y no encontró tripanosomas en ninguno de los especímenes. Trabajos posteriores realizados por López y otros (1979), con garrapatas del tipo Boophilus microplus, lograron observar en una garrapata de treinta evaluadas, parásitos en los ovarios, en las piezas bucales y en las glándulas salivares, pero no lograron encontrarlo en la hemolinfa. Por otra parte, tampoco fue posible detectar el parásito en las larvas provenientes de garrapatas alimentadas en un ternero infectado..

(33) 18 Otro vector evaluado ha sido la mosca Stomoxys la cual fue hallada por Clarkson en Venezuela en 1971 en el curral de un ternero infectado. En este estudio se logró determinar que el parásito es rápidamente destruido en el intestino del- artrópodo, aunque se observó un tripanosoma vivo en la proboscis en uno de los cien artrópodos evaluados.. Otros mecanismos de infección tales como la transmisión intrauterina, han sido reportados como una evidencia de que la transmisión del tripanosoma es posible por esta vía (Betancourt, 1978). Las consecuencias epidemiológicas de este tipo de transmisión no son contundentes; sin embargo, su efecto en la fertilidad aumenta la morbilidad y mortalidad debido a los síntomas y signos patológicos. tales como anemia,. fiebre y caquexia (Lesos y Ikede, 1972; Anosa, 1983).. 1.6. PATOLOGIA. 1.8.1. Anemia. Este es uno de los, cambios patológicos más importantes en la tripanosomiasis animal. En la mayoría de los casos se presenta en forma normocítica normocrómica, con ausencia de reticulocitos;. sin embargo,. Wei1s y otros en 1974.

(34) 1.9 reportaron anisocitosis y policromácia. Se observa leucopenia que se puede asociar con síndromes de coagulación intravascular diseminada (Sekoni y otros, 1990). Muchos estudios se han concentrado en los cambios ocurridos en sangre periférica, pero muy pocos han examinado la médula ósea en respuesta a la infección. En la anemia que ocurre durante la tripanosomiasis aguda se presenta inicialmente remoción de un gran número de células rojas por macrófagos, posiblemente mediante los siguentes mecanismos:. - La membrana de los glóbulos rojos puede ser físicamente daí'ada durante la infección debido a que la respuesta febril disminuye la vida media del eritrocito por un incremento de la fragilidad osmótica, disminución de la plásticidad y aumento en 1a permeabilidad de la membrana. En altas parasitémias puede ocurrir coagulación intravascular diseminada por ladestrucción acelerada de glóbulos rojos (Wells y colaboradores, 1959), estos coágulos se depositan en pequ8ios vasos y los glóbulos rojos son dañados por el bloqueo de los capilares.. - Los glóbulos rojos son fagocitados por macrófagos activos. En la infección temprana el número de rnacrófagos aumenta en todo el cuerpo y remueven células rojas en.

(35) 20 vasos, tejidos y órganos com eÍ hígado, bazo, pulmones, nódulo linfoide y. médula ósea reduciendo de esta manera la vida media de los glóbulos rojos.. Se ha observado un incremento en el número de células de la línea monocltica, en la médula ósea, con destrucción de las células.inmaduras de la sangre, lo que sugiere que la infección tripanosomial puede causar defectos en la producción de células sanguíneas.. - La formación del complejo antígeno-anticuerpo puede atrapar glóbulos rojos. Se ha reportado la presencia de anticuerpos y complemento en la superficie de glóbulos rojos en infecciones con tripanosoma. El proceso de opsonización puede completarse por activación del complemento. La eritrofagositosis se estimula por la presencia en los glóbulos rojos de varios componentes del complemento que son necesarios para el enlace y la ingestión por los macrófagos (Woodruf y colaboradores, 1973). 1.6.2 Chancro. La formación de Chancro es uno de los primeros signos de tripanosomiasis animal. y consiste en una. reacción. localizada en el lugar de picadura de la mosca Vse-tse. El tamaño de la lesión después de 5 a 8 días de infección es.

(36) 21 de 18 a 24 mm., -observándose un gran número de tripanosornas en ecciones histológicas entre las fibras de colágeno en la superficie de la dermis. Las células mas abundantes en el chancro son los linfocitos y macr'ófagos y en menor proporción se ohsevan leucocitos polimorfonuclear'es. Tras la. introducción de pequeía.s cantidades de formas metacici icas .en la piel , éstas se dirigen a los nódulos linfoides y 1e allí a la sangre.. 1.6.3 Síndrome hemorrágico. El síndrome hemorrágico es una de las grandes secuelas de la anemia. En altas parasitemias de 10 y lO r, tripanosonias por mililitro de sangre se puede presentar fiebre, anemia severa y hemorragia generalizada de las vísceras y superficie de las mucosas especialmente en el tracto gastrointestinal. La anemia que se presenta es aguda, con trombocitopenia y aumento de la fagocitosis de glóbulos rojos y plaquetas por macrófagos ubicados en los sinusoides de la médula ósea. La hemorragia es de tipo petequial, particularmente evidente en la esclerótica., conjuntiva del ojo y mucosas de la cavidad oral y nasal. 1.7 VARIABILIDAD ANTIGENICA. En la actualidad se ha intensific'ado el estudio de la.

(37) 22 biología de los tripanosonias, con el fin de identificar los factores que puedan ser manipulados para lograr el control del parásito. Esta manipulación busca también hacer más vulnerable al tripanosoma frente a la respuesta inmune del huésped.. La habilidad..que presenta el parásito para eludir la respuesta variabilidad. inmune del. huésped,. está basada en su. antigénica y se constituye en una de las. principales dificultades para lograr su control.. En condiciones normales cuando un animal sano es invadido por un agente patógeno, el sistema inmune del animal reconoce algunas de las partes antigénicas del invasor fabricando anticuerpos contra ellas. Posteriormente, se presenta la unión del antígeno-anticuerpo que busca neutralizar la acción patógena del agente invasor o de su destrucción en algunos casos. Sin embargo, los tripanosomas aluden la destrucción total por la respuesta inmune del huésped, gracias a los repetidos cambios que se presentan a nivel de las proteinas antignicas en la superficie de la membrana celular. Estas proteínas llamadas glicoproteínas variables de superficie (VSG), forman una capa gruesa que recubre la membrana celular.. La infección por tripanosoma se manifiesta por oleadas sucesivas de pa.rasitemia en intervalos relativemente cortos.

(38) 23 de tiempo en1T'e ellas. Cuando un animal resulta infectado, su si st.ema i. ninune produce tos ant i cuerpos contra las VSG expresadas en la pri niera oleada o pi en parasi témico; como resultado de esto, la mayoría de los parsitos mueren. Sin embargo, antes de que todos los ti- ipanosomas sean dstruidos, algunos de el los logran expres r nuevas VSG que ya no son reconocidas por los anticuerpos circulantes, por lo cual se logra formar una nueva población de parásitos. El animal produce nuevos anticuerpos contra este segundo pico parasiténiico, logrando destruir la mayoría cJe ellos. Nuevamente unos pocos parásitos, 1 np,ran expresar nuevas VSG,. dando. asi. origen. a.. una. nueva. población. de. trj paIinsoriia:; . F. 1) 1'ç)e:c:n sr' 1 r'pi 1 r rs 11 ('njua cons(-'(nt iva hasta que el par itci logra confundir el sistema, inmune del hnésped.. Debido a la gran variedad antigénica que di-ficulta - la elaboración de una vacuna convencional, los estudios se encaminan en la actualidad a buscar otros procesos escenciales. físicos y químicos, que tiene lugar dentro del ciclo de vida, del parásito y que pueden ser interrumpidos utilizando agentes terapéuticos, que se harían más vulnerable el parásito a la. respuesta inmune del huésped.. Dado que el parásito depende tota.lmnte del huésped, la. evaluación de su proceso alimenticio, llamado endoci tos is, r econstituye en otra importante herramienta para su.

(39) 24 control. Se han encontrado VSG junto a nutrientes endocitados, por lo que se podría especular que las VSG son rcicladas y no sintetizadas y destruidas. Este proceso de reciclaje representaría un aspecto vulnerable del parásito frente a la terapia inmunológica.. Otro aspecto relevante es el anclaje de las VSG a la membrana celular; se ha demostrado que un fragmento de las moléculas de VSG no presenta variación y es 1 lamado Cruce Reactivo Determinante (CF?D). Este cruce está conformado por U11. complejo lpídi.co que contiene gli.cocil-fnsfatidi.l--. inocitol. Sin embargo, este CRD no est:. en capacidad de. inducir inmunidad natural ni. de ser utilizado en la elaboración de una vacuni. debido a que no está expuesto en IR. membrana a 1 os anl.i rnr'rpos riel hir"spr'r1. 1.8 DIAGNOSTICO. La mayor dificultad en el diagnóstico de la. tripanosomiasis ha sido la multiplicidad de síntomas rlue presenta, los cuales son comunes con otras enfermedades tales como la anaplasmosis y la hahesiosis. En muchos casos los Propietarios de los hatos sospechan la presencia de la enfermedad cuando se presentan di smi niici niies considerables en la producción lechera asociadas con la pérdida continua de peso, el aumento en el número de abortos,. 1119. yor.

(40) 25 mortalidad de recién nacidos y adultos. La presencia del parásito se puede establecer con presición con la realización de pruebas diagnósticas de tipo directo o indirecto.. Otro aspecto C.¡. ue dificulta la identificación de la enfermedad es, el hecho de que comunmente es posible encontrar mezclas de agentes infecciosos en asocio con el T. vivax (Hill y Esuruoso, 1976), lo cual obliga, a que los métodos que se utilicen para su determinación deban ofrecer la suficiente sensjhljdad. La habilidad del método utilizado para determinar con presición la infección por L. vivax determina en gran medida el conocimiento sobre la epidemiología del parásito.. El tripanosoma puede ser identificado a través de métodos parasitológicos directos dada su movilidad y morfología (Hoare 1972) , tales como: análisis de sangre fresca, gota gruesa y extendidos coloreados con Giemsa. Mac. Lennan en 1971 logró detectar hasta 11 organismos por mililitro de sangre por medio del método de gota gruesa. Sin embargo, estas pruebas solo permiten establecer que está ocurriendo la enfermedad, pero no son capaces de establecer el estado inmunológico del hato.. La técnica de centrifugación en tubo de microhemá'tocrito es comunmente utilizada debido a que aprovecha las diferencias.

(41) 26 en peso específico entre los tripanosomas y los componentes celulares de la sangre. Woo en 1969, introdujo esta técnica como ayuda diagnóstica, y en 1972 Walker mejoró su eficiencia a través de la adición de glicerol al medio de dilución, con lo cual logró detectar hasta 35 organismos por mililitro de sangre.. Según Robson y Rickman (1972), la técnica de gota gruesa aumenta su eficiencia en un 52%, cuando se realiza con j untamente con la técnica de centrifugación en tubo de mIematocr1to. En el caso Colombiano, esta combinación de técnicas logró detectar los parásitos tres días más temprano y el número de organismos observado fue superior al determinado por los métodos de la gota gruesa y extendidos en fresco (Betancourt y Julio, 1979).. La microtécnica 'de intercambio iónico y centrifugación presenta la gran ventaja de permitir su utilización en zonas tropicales a campo abierto. Esta técnica se utilizó con éxito en la purificación de parásitos a partir de 5 ml de sangre obtenida de la vena yugular, que se pasaron a través de una columna que contenía DE52 celulosa a un pH de 8.0. El sistema permite establecer infecciones con niveles de parasitemia muy . bajos (Lanham y col, 1981).. Una prueba de diagnóstico poco frecuerte es la punción ganglionar para detectar infeccions subpatentes de T..

(42) 27. vivax. Es una técnica aún mas eficiente que la observación de sangre yugular, gracias a que se observa una mayor cantidad de parásitos, pero debido a que requiere de personal especializado para la toma de la muestra en campo, es poco utilizada en la actualidad (Robson y Ashl<ar, 1972).. Entre los métodos serológicos indirectos utilizados para la detección del L Jvax están: la prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes, la prueba de ELISA (enzymelinked inmunosorbent assay), fijación de complemento, hemoaglutinación pasiva y aglutinación capilar. Estas pruebas solo indican la exposición previa al parásito y son de gran importancia en estudios epidemiológícos. Sin embargo, Molineaux en 1975, depués de realizar un estudio de estas técnicas serológicas, concluye que a nivel de campo se pueden presentar limitaciones a causa de las necesidades de equipo y personal especializado además de la variedad antigénica del parásito.. La prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes es la mas utilizada por su facilidad de ejecución, sensibilidad, especificidad y rapidez. LaIFI está basada en la detección de anticuerpos contra el T.. utilizando un marcador. fluorescente. Platt y Adams la utilizaron con una eficiencia del 96.4%, sin encontrar falsos positivos al examinar sueros de animales sanos.

(43) 25 En 1978 Betancourt, en Colombia, mejoró la técnica péimitiendo mayor fluorescencia y mejor detección del vi vax.. La prueba de ELISA es un método sensible que permite detectar si un hato ha sido expuesto o no al parásito, conocer la eficiencia de un tratamiento quimioterapéutico a través del análisis de los títulos de anticuerpos después de un período determinado de tiempo y establecer las fluctuaciones de anticuerpos en cada uno de los animales infectados (Luckins, 1977).. En 1975 Voller, demostró que la prueba ELISA llevada acabo en microplacas (micro ELISA), era eficaz para el diagnóstico de tripanosomiasis humana. Esta técnica se presenta con ventaja sobre la IFI en cuanto a que utiliza menores cantidades de antígeno, lo que permite su uso en muestreos a gran escala. Con esta técnica pueden ser detectados anticuerpos después de 7 días de infección y tres meses de tratamiento con Beneril (Luckins. 1977). No se presentaron reacciones cruzadas utilizando este método entre los antígenos de T. vivax y los sueros de ganado Infectado con Theileria, Anaplasma o Babesia.. Es importante tener en cuenta que la. micro ELISA por si sola no permite conocer el estado real de la infección y por lo tanto se requieren pruebas cómplementarias..

(44) 29 Otra . modalidad de la prueba de ELISA conocida como Sandwich, se realiza utilizando anticuerpos monoclonales para reconocer una mayor cantidad de especies de tripanosomas (Nantulya y col., 1986).. En 1979, Staaks y Lohding encontraron que la prueba de fijación de complemento se .constituía en una ayuda para el diagnóstico de tripanosomiasis en ganado. Se pudo determinar que la baja de anticuerpos fijadores de complemento era menor depués del tratamiento de infecciones por T. vivax, comparado con infecciones provocadas por L. brucei y L. congolence. Posteriormente se demostró que los niveles de anticuerpos subsecuentes son enmascarados por títulos residuales, con lo cual se dificulta interpretar la prueba en la. determinación de la eficacia de la. quimioterapia.. La hemoaglutinación pasiva y la aglutinación capilar fueron evaluadas como técnicas diagnósticas en Venezuela por Benitez en 1980, utilizando un antígeno soluble de L. evansi el cual fue adsorbido con eritrocitos tratados con ácido tánico. La presencia de reacciones cruzadas entre el antígeno de T. y los anticuerpos contra el L. vivax, impidieron determinar cual de los dos parásitos era el causante de la infección..

(45) U0. AGOPEC1J$ P,. -. jo 1.9 PURIFICACION DEL 1. vivax.. El procedimiento para separar el I vivax de los elementos celulares sanguíneos consiste en pasar sangre infestada a través de una columna de intercambio jónico. La se paración depende fundamentalmente de las diferencias en la carga de la superficie o.elular.. El DEAE adsorbe los componentes sanguíneos que están cargados muy negativamente y permite la elución de aquellos no tan negativos tales como los parásitos.. La carga jónica de los parásitos generalmente es diferente a la de los elementos celulares, pero la negatividad de los eritrocitos puede variar de una especie a otra, razón por la cual las condiciones para la separación del parásito son diferentes y dependen específicamente de la especie animal del huésped.. Es muy importante el mantenimiento constante del pH y de la carga jónica para permitir la adsorción y elución en el proceso. Lanham y Godfrey en 1970, recomiendan un pH de 8.0 Y una carga iónica de 0.145 para la separación del parásito a partir de sangre ovina.. E1 mantenimiento del pH se logra adicionando hidróxido de sódio o ácido fosfórico según se requi'era y la carga iónica.

(46) 31 se consigue mediante la adición de 2.6% P/V de glucosaen el buffer utilizado.. Las columnas de vidrio recomendadas para procesar muestras mayores de 3 mi, tienen 12.0 cm de ancho y 8.0 cm de alto, utilizando Whatman número 41 tanto sobre el -filtro de caliza de la columna como en la parte superior del DEAE.. Es de especial importancia el mantenimiento de estrictas condiciones de esterilidad durante el proceso para lograr una separación efectiva..

(47) 2. MATERIALES Y METODOS. 2.1 UBICACION 1 1. 1. La fase experimental de este estudio se llevó a cabo en el laboratorio de Análisis químico y en las unidades de aislamiento de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA, en el Centro de Investigación en Salud y Producción Animal CEISA, a cargo del programa Nacional de Biotecnología Animal, en la ciudad de Santafé de Bogotá entre junio de 1994 y junio de 1995.. 2.2 UNIVERSO. En este estudio se. utilizaron ovinos puesto que. representan un buen modelo para la infección con el. parásito, además de ser mas sencillo su manejo y mantenimiento. Se emplearon ovinos pertenecientes a la raza Romy Marsh, con una edad aproximada de dos aíos, provenientes de la granja San Jorge de propiedad del ICA de Soacha. ubicada en el municipio.

(48) 33 La fase inicial del estudio consistió en establecer una linea base para el estado general de los ovinos en los sitidntes. aspectos:. temperatura. rectal,. carga. de. ectoparásitos, parásitos gastrointestinales, hematocrito y hemoglobina.. Luego de haber practicado los análisis clínicos correspondientes se encontró la necesidad de suministrar a los animales drogas como ivermectina y complejo B, que ayudarán a mejorar su estado general. Una vez corregidos los aspectos clínicos que se encontraban por fuera de los valores normales, se consideró viable efectuar la fase experimental. 2.3 PARASITOS Para efectuar el estudio se utilizó la cepa de Trypanosoma vivax Monteria 55 congelada a -90 QC en nitrógeno liquido, obtenida a partir de un bovino infectado naturalmente en la ciudad de Montería en el departamento de Córdoba.. 2.4 MATERIALES. 2.4.1 Equipos Balanza Analítica. Mettler AE 200.. Potenciómetro. Sargent-Welch pH 8000..

(49) .34 Agitador magnético. 1 KMAG-RCT.. Centrifuga. DAMON/IEC. DIVISION.. Centrífuga. MINOR 35 MSE.. Microcentrí fuga. DAMON/IEC DIVISION MICROHEMATOCR IT.. Lector de microhematocr'ito. International.. Microcapi-. ilary Reader IEC. Microscopio de luz. Olympus CH-2.. Cámara de Newbauer. Clay Adams.. Contdor de células. Clay Adams.. Nevera. Westell.. 2.4.2 Elementos de Laboratorio. Vasos de precipitado. 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000 ml.. Erie nmeyer. 100, 300 y 500 inI.. Pipetas graduadas. 0.1, 1.0, 5, 10 y 50 ml.. Probetas. 100, 500 y 1000 MI.. Pipetas Pasteur. 1.0 mi.. Tubos de vidrio Vacutainer con anticoagulante Heparina. 5.0y 10.0 ml.. Tubos de vidrio Vacutainer sin anticoagulante. 5.0 y 10.0 ml.. Tubos centrífuga graduados. 40.0 ml.. Tubos capilares.

(50) 35 Láminas portaobjetos Laminillas cubreohjetos Columnas de vidrio. 13.5 cm x 3.0 cm. día.. Jeringas plásticas. 5.0 y 10.0 ml.. Agujas Venojot Espátulas. Grandes y pequeas.. Viales de criopreservación. 1.8 ml.. Dispensador de caucho Película de parafina. Papel parafilm. Papel aluminio Papel filtro. Whatmari 42. 2.4.3 Reactivos 2.4.3.1 Soluciones amortiguadoras (Buffer). Solución madre de buffer fosfato salino (PS) pH 8.0, 1=0.362.. Na 2HPO 4 . 12H20. 38.20 gr.. NaH 2PO 4 . 1-120. 0.78 gr.. NaCI. 4.25 gr.. H20. 1000 ml.. El ajuste del pH se realizó con ácido orto-fosfórico al 10% (H 3PO 4 ) o hidróxido de sódio al 20% (NaOH).. 2.4.3.1.1 Solución buffer fosfato salino PES. La preparación de la solución de PBS dependerá del origen de la sangre que se requiera procesar. Esta normalmente se.

(51) 36 prepara a partir de una dilución en agua destilada de la solución madre de buffer fosfato (PS), en donde la proporción más apropiada depende de la carga jónica necesaria para efectuar la elución. En el presente estudio, y por tratarse de sangre ovina, la dilución recomendada por Lanham y Godfrey en 1970 para el PBS fue de 4:6; donde: 4 es el volumery. de PS y 6 es el volumen de agua en la solución. Finalmente se debe esterilizar a una temperatura de 110 p C por 10 minutos en autoclave.. 2.4..1.2 Solución buffer fosfato salino glucosado (PBSG). Es una solución buffer obtenida a partir del buffer fosfato salino (PBS) esteril y adicionado con glucosa en una cantidad especifica para mantener la carga jónica en 0,145 y la osmolalidad del buffer en 293 miliosmoles. El pH se debe mantener en 8,0. La cantidad final de glucosa que debe estar presente en la solución es de 2,6% peso/volumen. La glucosa es agregada al buffer en condiciones de esterilidad en el momento del uso y a temperatura ambiente.. 2.4.3.2 DEAE- Celulosa (Dietilaminoetil Celulosa). Rl DEAE celulosa es una recina compuesta por dietilaminoetil celulosa, está cargada aninicamente y sirve para el fraccionamiento de proteínas séricas, la cual se debe estabilizar de acuerdo con su uso especifico. Para realizar el presente estudio se utilizó dietilarninoetil celulosa DE52 de Whatma.n descrito en el método de Lanham y Godfrey en.

(52) .37 1970, en una proporci6n de 100,00 gr. de DEAE celulosa por 250,00 ml. de PBS.. Es de especial importancia mantener el pH en 8.0, para lo cual se puede utilizar ácido ortofosfórico concentrado (H 3PO 4 ) o hidróxido de sódio (NaOH).. Posteriormente, se debe dejar en reposo la mezcla ya descrita por un tiempo aproximado a 30 minutos y a oontinuación se descarta el sobrenadante, a fin de eliminar las impurezas contenidas en el DEAE. Este procedimiento de lavar y descartar se repite al menos en tres oportunidades verificando que el pH final se mantenga en 8,0. Una vez lavado el DEAE con PBS, se lleva a esterilizar por 10 minutos a 110 QC en autoclave. A temperatura ambiente, se agregan 250 mi. de PBSG fresco, se deja en reposo por aproximadamente treinta minutos, luego se descarta el sobrenadante y se repite esta operación al menos tres veces. El pH final deberá estar en 8,0.. 2.4.3.3 Reactivos de ajuste de pH. 2.4.3.3.1 Hidróxido de sódio (NaOH), al 20%. El hidróxido de sódio al 20% se recomienda para: aumentar el pH del PBS y el DEAE celulosa.. 2.4.3.3.2 Acido orto-fosfórico al 10% (H 3PO 4 ). El ácido.

(53) 38 ortofosfórico al 10% se recomienda para disminuir el pH del P135 y el DEAE celulosa.. 2.4.3.4 Colorante de Gieiisa. El colorante de Giemsa es un reactivo utilizado en coloración de -frotis sanguíneos para la identificación morfológica de hemoparásitos. Está compuesto porGiemsa en polvo, glicerina pura y alcohol metilico puro en las siguentes proporCiones:. Giemsa en polvo. 0,75 gr.. Glicerina pura. 35,00 ml.. Alcohol metilico puro. 65,00 ml.. 1a solución colorante de trabajo se prepara agregando un volumen de colorante a nueve volumenes de buffer de Gjemsa.. 2.4.3.5 Colorante de Wright. Es un reactivo utilizado para la coloración de frotis sanguíneos. Aunque no es un método específico para utilización. en. la identificación de parásitos,. su. a. la. esta. investigación. obedeció. precipitación que presentó el colorante de Giemsa al realizar la técnica. Está compuesto por polvo de Wright, glicrin y metanol en le s1 que ntes p ropo re. 1onee Polvo de Wright Glicerina Metano 1. 1.00 gr. 25.00 ml. 600.00 MI..

(54) 39 2... FIETODOS UTILIZADOS. 2..S.1 Método de detección directa.. 2.6.1.1 Eluectra. v efljpuncjn yncul a. muestra ce óhtiena a partir de. L.. 1 os )vi ti ns i nfectdos conL. vivax.. d. realizadas diariamente, en las horas de la maí'ana.. La cantidad de canr-e que ce extrajo fue de 1 ml utilizando. como. anti.coauI ante. hepari na. en. 1-11-119,. final da j.C) UI/ml.. Tanto la detección del pars i t.o como la d e trrmi nación del Indice parasitmico, ce llevaron a cabo inmediatamente después de la f o m a de muestra para cvi lar que éste mur jera, lo cual hubiera dificultado su observación en movimiento al realizar técnicas como la detección directa en fresco.. 2.5.1.2 Procedimiento. La determinación de la presencia. del parásito y el Indice de parasitemia se midieron mediante los siguientes métodos:. * Recuento de Lumsden. * Observación en fresco. * Recuento de Woo. * Coloración de Giemsa..

(55) 40 2.5.1.2.1 Recuento de Lumsden. La base de este método consiste en hacer una dilución 1:100 de la sangre infectada con el parásito y su posterior conteo en los cuadrantes que corresponden al los glóbulos blancos en la cámara de Niewbauer. El cálculo del número de parásitos por mililitro fue tomado de la siguiente ecuación:. LOGARITMO DEL RECUENTO - 0.621 + 6. Donde: Logaritmo del recuento:. Logaritmo del número de parásitos observados.. 0,621. R. 6. Constante de Lumsden.. Dilución 1/100. El antilogaritmo del valor obtenido es el número de parásitos por mililitro de sangre (Lumsden, 1970).. 2.5.1.2.2 Observación directa en fresco. Para la observación directa del parásito en fresco se colocó una gota de sangre contaminada entre lámina y laminilla yse observó al microscopio utilizando un objetivo de 40X por un minuto. La calificación del índice de parásitos se estableció de la siguente manera:.

(56) II 1 O. No se encuentran parásitos durante el tiempo do observación.. + Menos de 10 par-ás i tos durante el tiempo de observación. Esta calificación es aproximadamente igual a lo s parásitos por mililitro.. ++. Valores intermedios entre 4- y -l-4-+.. 41-1-. rx-rni1 rlr. tiampo. do. m:3. de. 20. oser-vación.. ar;i içi. Í1HJaflI. EqiTi valettt.e. ol. a. pat-si tos por mililitro.. 2.5.1.2.3 Método de Won. El mtodn de Woo consiste en llenar las 3/4 partes de un tubo capilar con sangre contaminada, luego, se centrifuga a 3000 rpm durante 3 minutos.. Se debe observar al micioscópio con un objetivo de IOX la capa superior- a la capa de glóbulos blancos, la cual contiene los parásitos en movimiento. La calificación se da en forma apreciativa en el intervalo de + a -l--l-4-4-, en donde + representa escasa presencia del parásito y ++++ Indica un número incontable de parásitos.. 2.5.1.2.4 Coloración de (3iemsa.. En. la obtención de. extendidos coloreados por el método de Giemsa se realizó un. 4.

(57) 42 frot.is en una lámina portaobjetos de una gota de sangre contaminada. Posteriormente se realizó la coloración con Giemsa. La observación al microscopio se llevóa cabo con objetivo de inmersión (100X). La calificación fue dada por el número de parásitos por 100 glóbulos blancos expresada en porcentaje.. 2.5.2 Cromatografía de Intercambio Iónico. Esta es una técnica muy utilizada en la separación de proteínas por medio de resinas de intercambio jónico corno el DEAE celulosa, utilizando un mecanismo de. adsorción. reversible que consiste en la fijación de la sustancia a separar a una resma estabilizada, seguida de su remoción con eluyentes de pH y carga jónica determinada.. El DEAE celulosa adsorbe los componentes cargados mas negativamente como los glóbulos rojos y eluye aquellos no tan cargados, como lo son los parásitos. 2.5.2.1 Muestra. Las muestras de sangre se obtuvieron por medio de punción yugular, a partir de picos parasitérnicos de los ovinos infectados experimentalmente con T. vivax cepa Montería 85, calentada en un ovino esplenectomizado. La heparina se utilizó como anticoagulante en una proporción de 10 UI/ml.

(58) 43 Una vez extraídas las muestras se realizó una dilución proporción 1:2 en bufer salino glucosado, manteniéndose a 10Q C mientras se iniciaba la separación.. 2.5.2.2. Procedimiento. Una vez preparadas las soluciones buffer y equilibrado el DEAE celulosa, se procedió a montar l as columnas de intercambio iónico. En este procedimiento es de gran importancia el uso de soluciones frescas, as¡ como el mantenimiento de condic'jones de esterilidad a lo largo' de todo el proceso, para evitar la contaminación del parásito con bacterias y levaduras.. Inicialmente, se instala en la columna de vidrio un disco de papel Whatman 42 sobre el filtro de caliza. A continuación, la columna se instala en soportes y se realiza un lavado con PBSG a temperatura ambiente, con el fin de eliminar cualquier residuo que pudiera obstruir la. filtración o alterar el pH de la resma. Utilizando una pipeta Pasteur, se inicia el llenado de la columna con el DEAE celulosa previamente estabilizado, teniendo cuidado de. que el nivel de buffer siempre. sea superior al de la resma para evitar su desecación.. El nivel de DEAE celulosa en la columna se determina con. base en los estudios realizados por Lanham y Godfrey en 1970 y los ensayos llevados a cabo en el laboratorio con d iferentes cantidades de DEAE celulosa y muestra. En este.

(59) /4. estudio se utilizaron columnas de vidrio de 13.5 cm de. altura por 3.0 cm de diámetro, las cuales fueron llenadas hasta una altura de 5 cm, teniendo en cuenta que un gramo de DEAE celulosa ocupa un volumen aproximado de 1.5 ml.. Antes de pasar la muestra de sangre a través de la columna,. ésta se diluyS en una proporción de 1:2, en donde un volumen de sangre infectada se aiade a dos volúmenes de PBSG. A continuación se coloca la muestra en la columna de vidrio observando que su distribución sea uniforme, para evitar la formación de cráteres o declinaciones en la superficie del DEAE celulosa, lo cual disminuiría en gran medida la eficacia de la. purificación.. Una vez colocada la muestra, se abrió la llave de control de flu5o de la columna y se inició la recolección del eluato en tubos de centrífuga graduados e instalados en recipientes con hielo; este eluato, presenta un aspecto transparente o turbio de acuerdo con la concentración de parásitos en la muestra. A continuación, el eluato se centrifugó a 42 C por 20 minutos a 1800 g., y una vez descartado el sobrenadante se resuspendió el sedimento en un pequeío volúmen de PBSG.. Se observó el sedimento al microscopio para determinar la presencia del parásito puro, en caso de observarse glóbulos blancos o glóbulos rojos en la muestra., se pasó el eluato.

(60) .45 a través de una nueva columna.. Cuando la purificaciónes efectiva, se deben practicar tres lavados con PBSG, centrifugando a 1800 g por 5 minutos, el sedimento suspendido en PBSG se guarda en viales de criopreservación a 4Q C mientras se inicia el proceso de extracción de..proteinas.. A nivel experimenta¡, se realizaron variaciones en la prepración de la muestra: se practicaron ensayos pasando a través de la columna sangre completa y en columnas separadas plasma y componentes celulares. Además se realizaron ensayos a fin de determinar la dilución óptima de la muestra.. 2.5.3 Extracción de proteínas. La extracción de las proteínas del parásito se logró mediante su rompimiento, utilizando para ello la adición de buffer que contiene SDS y 2-Mercaptoetanol. Esta solución se llevó a ebullición por 5 minutos, luego de lo cual se centrifugó por 10 minutos a 1800g. Para verificar si el rompimiento era efectivo, se observó al microscopio el sedimento. El rompimiento se constató al no estar presentes cuerpos enteros de los parásitos..

(61) 46 EL sobrenadante contenía las proteínas liberadas y.el sedimento los fragmentos celulares de los parásitos. Este sobrenadante se almacenó a 49 O hasta la determinación de proteínas, la que en todos los casos se realizó en el mismo día.. 2.5.4 Determinación de proteínas N. La determinación de proteínas se relizó de acuerdo con el método de Bradford, utilizando para ello el colorante correspondiente que contiene. Azul Comassie Brillante Etanol al 95%. 100.0 gr. 50.0 ml.. Acido fosfórico al 85% p/v. 100.0 ml.. Agua destilada. 100.0 ml.. Pr ' ¿iontar esta prueba es necesario realizar una curva de calibración con un patrón de BPGG en concentración de 1.53 microgramos por mililitro.. Una vez hecha la calibración, se tomaron 50 microlitros de sobrenadante de la extracción de proteínas y se agregaron 2.5 mililitros del reactivo de Bradford. Se incubó por 5. minutos a temperatura ambiente y se . leyó en espectrofotómetro a 595 nm..

(62) 3. DESARROLLO EXPERIMENTAL. 3,1 DISEÍIO EXPERIMENTAL. Para desarrollar el estudio propuesto, se inoculó un ovino previamente esplenectoniizado, con la cepa Monteria 85 de I vivax, con el fin de reactivarla ya que se encontraba almacenada en nitrógeno liquido. Se nionitoreó el ovino mediante pruebas clínicas tales como temperatura rectal, hematocrito, observación directa en fresco, técnica de Woo y coloración con Giemsa o Wright.. Debido a dificultades presentadas con el colorante de Giemsa, se utilizó lacoloración de Wright para identificar el parásito y determinar su porcentaje.. Después de 7 días. de. la inoculación del ovino, se. estableció la presencia del primer pico parasitémico a partir del cual, por punción venosa del animal, se obtuvo una muestra de sangre heparinizada, que se dosificó en volumenes de 3 ml. con un indice parasitémico de 10 parásitos por ml., determinado mediante el recuento de.

(63) 48 Lurnsden, para inoeu ,lar. ida. restantes ovinos de la muestra.. Luego de la inoculación, se practicó un seguimiento a los ovinos por un período de cuatro meses durante los cuales se controlaron las variables de temperatura, parasitemia y heriiatocrito, lográndose establecer la duración de cada uno de los picos y las variaciones en temperatura y hematocrito.. Cuatro de los ovinos infectados fallecieron entre los 12 y 20 días después de la inoculación, fechas que coincidieron con la presentación de su primer pico parasitmico.. Las muestras' de sangre se obtuvieron en el momento en que cada uno de los ovinos presentó un pico parasitémico; inmediatamente obtenida la muestra se pasó a través de la columna de intercambio jónico. Una vez purificado el parásito se procedió a realizar la extracción de las proteínas mediante SDS y 2-mercaptoetanol . La determinación de la cantidad de proteínas extraidas se realizó mediante la técnica de Bradford..

(64) :49 3.1.1 Diagrama del desarrollo experimental. Inoculación de T. vivax en un ovino esplenectomizado. Detección del primer pico parasitémico. Determinación del indice parasitémico. Inoculación de ovinos inmunocompetentes. Seguimiento de los ovinos infectados. Obtención de muestras de sangre durante los picos parasitémicos. Purificación del parásito en una columna de intercambio jónico de DEAE celulosa. Extracción de proteínas del parásito mediante SDS y 2- mercapLoetanol. Cuantificación de proteínas del parásito mediante técnica de Bradford.

(65) 1. C -Corpp entro cra C. b. 4. PRESENTAC ION DE RESULTADOS. 4.1 FASE INICIAL. El objetivo de la -fase inicial del estudio fue establecer una línea base para el estado general de los ovinos, hasta determinar qué los aspectos clínicos se se encontraban dentro de los valores normales. Esta información se encuentra consignada en la tabla NP 1.. TABLA 1. Condiciones generales del grupo experimental. VARIABLE. VALOR FI 1 N 1 [lO. VALOR MAX 1 MO. Temperatura Rectal. 35,6 QC. 3E1,4 PC. 1-lematoor i to. 31,0%. 34,0%. Hemoglobina. 10,5 g/dl.. 11,8 g/dl. Globulos blancos. 5900 /mm,. 8600 ¡mm3. Coprol ógico. 15 PGI/gr.. 60 PGI/gr.. Ectoparási tos. Negativo. Negativo.

(66) 51 4 2 P 1 CÍJS. El. rf\. F?A5 1 TEM 1 flí)F. monitoro. df'cnin. y. parsitémico:,. ov:no control. 9 n1. e 1lev5. varia.blos como la porcentaje. d. 1. d. 1 ns,. difrn+. ovinos irifctdo S como del. cho mcdinto la. npmr.ur. picos. de. t'ec1, ml hmmtocrito y el. de paritos .n lmin. coIoreri. con Wr5ht. (Figura 1.).a partir de s p iigre obtrnidn por venipunc6n yi_ul ir. Vi. 1. F1'URA 1. T.vivx c- n 1 n reado mediante 1. t'onicEl.. de Wright..

(67) 52. F 1 GURP 2. (lb I: p ricin de 1 yI.Ic) I i 1 i. A mL. U a ci p rqrr pnr'. vnipunci,n.

(68) II F)3 En. las grATíces. 1. p. 12. 1 os rcmjl VnrIns. prí ' ntn. infnnfadno y rrfl In Kr1ficn 13.. vi no. obtenidos con los. P. seguimiento enbre r] nvjrir' cnntrnl.. ArlemA s se ri1 y71y1a. Ci. ron 1i Í• V1 fl. trnni nP. da Wori (F i pu rn u 3. 4, F. 6. j 6n rl i r m a f a u n r. fl. 1 E i e". fir de complmontr la corifirm rucin de parásito en I g o muesTr9s. l 9. r'. fl ) ,. presencia. de sangre.. FIGURA 3. Tlenien do Won. Nnnljç. íln f.. no n. iuhn rnpi liT.. riel.

(69) II. 5. FIGURA 4. Tcnic. cntiifuai5n. r3i \Vco, de Froc;o.

(70) 0 ola. :e.. --. -. -. -e - •!•,,_ •-;.. FIGURA S. Técnica de Woo. En la fase seai1ada por la aguja se encuentra el parásito..

(71) P.. técnica de WríghL. FiGURA 6. Lámina coIorda mediante Montaje de la cámara en a técnica do Woo..

(72) 57. FIGURA 7.. Técnica de Woo del. p8ritO.. Observación. jcroSCópiC& a. 1OX.

(73) 55. rt OcoÇ L. ,rt. g. 1. c. Tip. ø. '. -J. •. •. -:•. '. a 0. tç. J. ._..•çL4_. -.. FIGURA 8. Observar--¡ ¿In directa en fresco del parásito.. Çtr.

(74) 59. PICOS PARASITEMICOS OVINO 5655 MES 1 42. 2.6 2.4. 41. 2.2 1Ç.'. cc. i.L 40. cc a: LLJ. o 4-. 1.4. >. 1.2. cc. w 10.8 0.6 0.4. '. £... •'. ./•'.. u-0.2 1011 12131415161712192021 22232'l25282722.25O31 1 2 3 4 5 6 7 g DIAS HEMATOCRITO -- DE PARASITOS -- TEMPERATURA ->.... o GRAFICA 1.. Picos prasitémicos Ovino 3855 Mes 1. 1.

(75) 60. PICOS PAP1ASITEMICOS OVINO 355 ME2 42. 41 cc. o. LL. Ui Li. 3 lo. o. LU. LU. 39. 39. Ui -r. 7 9 2 10 11 12 13 14 1 pi 1€ 17 19 12 20. 1 2 3 4. 21 22. 23. 24 25. 26 27 29. DIAS?. -m-- TEMPERATURA. GRPFICA 2.. HEMATOCRITO. —4'.... DE PARASITOS. Picos parasitmicos. Ovino 3855 Mes 2.

(76) 1. PICOS PARASITEMICOS OVINO 55 MES-33 42. cri. cl. 41. -3. ow 40. o 1.) -3. w 1. 39. 1 2 3 4 5 6 7 9 9 1011 12 13 14 115 16 17 19 19 20 21 22232422627 2922301 F-51 A-', -u— TEMPERATURA. GRAFICA 3... - HEMATOCRITO -- DE PARASITOS-. Picos paraitmicos. Ovino 3855 Mes 3. 6.

(77) 62. PICOS PARASITEMICOS c!r.Jc: 355 MES 4 42. 2.9 2.6 CP) ..J. 41. 2.2 -. o. -a Cr «. a1.9 w c-J 1.8. CC. CC. o. 40. 1.4 > o 1.2 CC. 1 •. 1. (. .. (. . )w. ,,.....-:........................Ja. ,a......,.,M....t ..........I...Jib.,dikÇ.tt;. .'C........la. 39. 1. 2 3 4 1,5 6 7 9 9 10 Ii 12 13 14 1 1817 19 19 20 21 22 23 24 2 2€ 27 20 2930 DIA3 -a-- TEMPERATURA --- HEMATOCRITO -»- % DE PARASITOS. GRAFICA 4.. Picos parasitémicos. Ovino 3855 Mes 4. -. 0 o. 1-a. w. 1.

(78) 63. PICOS PARASITEMICOS OVINO 3661 MES. 42. ¡1. ID. 41. 1-. u. a. w 3 1-. /. w cL. Lii. V. d. /'. /. 1 2 3 4 5 6 7 9 9 1011 12 1314 11817 19 192021 22232422;2729293031 DIAS --- TEMPERATURA --- HEMATOCRITO -- % DE PAPA3ITO3. QIDLIO7(C4 ijc4j op r. CLj4pj4 .. GRAFICA 5.. .-. Picos parasitémicos. Ovino 3861 Mes 1. Lii. 1.

(79) 64. PICOS PARASITEMICOS CV!NO 3681 MES -2. .8. 42. .4. II /'. 1. 41. 1-. CC. ,./ I. ,. 1 /. \. Lii. \\. .2 ci. 1 /. .8 o 1. 1. 1 3. i\. ¡. '. 1 \J. 1\ ¡ ' í 1.a..\.f...w(._. .4. \. 1-. £____. \. ji. ............................................. 1 2 3 4 li. ..*,___•j.__44f. 6 7 2 2 10 11 12 13 14 1 15 17 12 12 20 21 22 25 24 2 26 27 22 OlAS. -- TEMPERATURA «'- HEMATOCRITO -- % DE PAPATOS. GRAFICA 6.. Picos parasitémicos. Ovino 3861 Mes 2. 2L1 1.

(80) PICOS PARASITEMCOS c:vÑ) E;i MES 3 42. .8 4. It.. .'-. 41. 1l Çf. u Lii. .2 o 1-. .6 o. Ui. E-. Lii 1-. .. 32 •. 3211 1 2 3 4 1,5 6 7 2 21011 12 13 14 1l617 19 192021 2223242262729292031 DIA. -- TEMPERATURA -'-- HEMATOCRITO -- % DE PARASITOS. GRAFICA 7.. Picos parasitémicos. Ovino 3861 Mes. Lii. 1.

(81) PICOS PARASITEMICOS ovÑo 361 MES. 1. .6. 42 1. 1-1.4 fl -. 41. 1— CID. cc 'u. .9 c.. cr 1•«. 'u. .6 o. Ui. .4. 1-. 1. 39 1-0.2 6 7 9 9 lO 11 12 13 14 l 16 1719 19 20 21 22 2324 23 2627 29 29O 1 2 3 4 DIA -- TEMPERATURA «- HEMATOCRITO -- DE FAPASITO3. GRAFICA S.. Picos prasitmicos. Ovino 3861 Mes 4.