Memoria de Investigación

Memoria de Investigación

Extracción de compuestos bioactivos en residuos de uvas tintas

Bioactive compounds extraction from red grape byproducts

Alumno:

María de los Ángeles Varo Santos

Línea de Investigación ENOLOGÍA

2012-2013

Tutor de Investigación: María Pérez Serratosa

Palabras clave: valorización, pomace, compuestos bioactivos, actividad antioxidante

Memoria de investigación titulada: "Extracción de compuestos bioactivos en residuos de uvas tintas" (Bioactive compounds extraction from red grape byproducts) realizada por María de los Ángeles Varo Santos, tutelado por: María Pérez Serratosa

Córdoba, 25 de December de 2022

Fdo. el/a alumno/a: VºBº Tutor de Investigación

Contenido

Resumen...3

Abstract...3

Introducción...3

Objetivos...4

Material y métodos...4

Resultados y Discusión...6

Conclusiones...14

Bibliografía...15

Extracción de compuestos bioactivos en residuos de uvas tintas

/

María de los Ángeles Varo Santos Resumen

En este trabajo se han medido parámetros de color, actividad antioxidante y concentración de taninos totales, antocianinas, derivados del flavan-3-ol y t-resveratrol en diferentes extractos etanólicos obtenidos a partir de pomace de uvas Syrah. Los resultados mostraron que el etanol acidificado fue el extractante que consiguió los valores más adecuados en la mayoría de las determinaciones realizadas, excepto en la extracción de compuestos antociánicos y de color de pigmentos poliméricos que dieron valores más altos en los extractos obtenidos con etanol puro, y los valores de tonalidad y actividad antioxidante que fueron más adecuados en los extractos de etanol al 50%. Teniendo en cuenta que las diferencias encontradas entre los valores obtenidos con el etanol acidificado y los otros dos extractantes, el etanol acidificado es un buen extractante para la valorización de residuos de prensa de la industria vitivinícola. El proceso de extracción se puede realizar con dos extracciones consecutivas, debido a que con dos extracciones es suficiente para obtener la mayoría de compuestos de interés.

Abstract

In this work, color parameters, antioxidant activity, total tannins, and anthocyanins, flavan-3-ol derivatives and t-resveratrol contents have been measured in different ethanolic extracts from Syrah pomace. The results showed that the acidity ethanol was the solvent that got the best values in most of the determinations, except in anthocyanin compounds and polymeric pigments color which were better in the pure ethanol extracts. The hue and antioxidant activity values were better in the 50% water ethanol extracts. The acidity ethanol is a good solvent to valorize byproducts from press in the wine industry. The extraction process can be carried out with two extraction steps, due to that in two steps were enough to obtain the most of the interesting compounds.

Introducción

La optimización de procesos alimentarios basada en la reducción de residuos se ha convertido en un estándar obligatorio entre los países desarrollados. La directiva de la unión Europea 2008/98/EC dice que “la prevención de residuos debería ser la primera prioridad de la gestión de los residuos y que la reutilización de los residuos y el material reciclado debería ser preferente para la recuperación de energía de esos residuos”^1,2. De acuerdo con esto, uno de los grandes desafíos en las regiones vitivinícolas es crear alternativas para el tratamiento de la gran cantidad de residuos que se generan durante la época de cosecha. Esto es importante para países productores como España, que es el cuarto gran productor de uvas en el mundo^2,3. Uno de los residuos que se obtienen de la industria vitivinícola se denomina pomace. El pomace es el residuo del prensado resultante cuando las frutas son procesadas para zumo, vino u otros productos. Consiste en pieles prensadas, residuos de pulpa, pepitas y tallos⁴. Los subproductos obtenidos de la industria del zumo y del vino pueden ser materias primas útiles para conseguir productos de alto valor añadido⁴, ya que contienen grandes cantidades de compuestos fenólicos⁵ y los extractos de orujo de uva y sus constituyentes son muy apreciados porque la capacidad antioxidante deriva de la gran concentración de flavanoides, como las catequinas, y estilbenos como el resveratrol, particularmente abundantes en la uva y que son considerados compuestos bioactivos^2,6,. Por ejemplo, existe creciente interés por sustituir los colorantes y antioxidantes sintéticos de los alimentos por otros naturales⁵. Los compuestos fenólicos del pomace pueden ser extraíbles o no extraíbles. La extracción se puede realizar usando disolventes como agua, metanol, etanol, acetona o sus mezclas⁴. Los compuestos fenólicos no extraíbles son principalmente taninos condensados o polifenoles de alto peso molecular⁴. Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios de las plantas y juegan un papel importante en la calidad sensorial y nutricional de frutas y vegetales^5,8. Los subproductos de la uva contienen gran cantidad de estos metabolitos que incluyen compuestos como ácidos fenólicos, flavanoles y antocianinas^9-11. Estos compuestos poseen propiedades antibacterianas, antivirales, antioxidantes, antiinflamatorias, anticancerígenas, y previenen de las enfermedades cardiovasculares^11-14.

Los antocianos son colorantes y antioxidantes naturales, con actividad antirradicalica y con efectos nutricionales y terapéuticos. Debido a su atractivo color, a su alta solubilidad en agua y a sus posibles efectos saludables, los antocianos pueden ser utilizados para reemplazar a los colorantes sintéticos^5,15,16. Los antocianos se localizan en el hollejo de las uvas, en las 3 ó 4 primeras capas celulares del hipodermo, contribuyen de manera preponderante al color de las especies tintas¹⁷. Numerosos estudios han demostrado que las antocianinas poseen numerosos beneficios para la salud que están asociados a su capacidad antioxidante, anticancerígena y sus propiedades antiinflamatorias^18-20.

En cuanto a los estilbenos, uno de los más importantes es el resveratrol que posee dos isómeros, de los cuales el trans- resveratrol es el que está presente en la piel de la uva^21-25. El isómero cis-resveratrol no está presente de forma natural en la Vitis vinifera, sin embargo, sí lo está en vinos^26-31. El isómero trans-resveratrol está presente en grandes concentraciones en variedades tintas^32,33. Numerosos estudios han demostrado los efectos antioxidantes del resveratrol y su capacidad para inhibir la agregación de las plaquetas, así como la oxidación del colesterol LDL (lipoproteínas de baja densidad)^33-35.

Los flavan-3-oles son compuestos que están presentes en la uva en estado de monómeros y bajo formas más o menos polimerizadas, que constituyen taninos catéquicos¹⁷. Se localizan principalmente en las semillas, aunque se han detectado trazas de monómeros y dímeros en la pulpa¹⁷. Los principales flavan-3-ol en la uva son (+)-catequina y su isómero (-)-epicatequina.

Objetivos

El objetivo del trabajo fue optimizar el proceso de extracción de restos de prensa o pomace de la industria vitivinícola para su valorización como fuente de compuestos bioactivos, determinando para ello parámetros de color, taninos totales, antocianinas, derivados del flavan-3-ol, y actividad antioxidante mediante el ensayo DPPH.

Material y métodos

Material: Se utilizó residuo de prensa (pomace) de uvas de la variedad Syrah cultivadas en Montilla-Moriles, sur de España. El etanol utilizado fue alcohol rectificado de vino suministrado por Alcoholes del sur S.A. (CE: 200-578-6). Los estándares comerciales fueron suministrados con una pureza del 95-99% por Sigma-Aldrich Chemical Co. (Madrid, Spain) y Extrasynthese (Genay, France).

Procedimiento de extracción: Se realizaron 3 extracciones consecutivas:

a) 100 g de pomace se le añadieron 100 mL del extractante, introduciendo la mezcla en ultrasonidos durante 15 minutos y dejándolo posteriormente reposar24 horas. Se retiró el líquido de la primera extracción que se denominó extracto 1 (Ext 1).

b) Sobre el resto del pomace se añadió de nuevo 100 mL del extractante y se realizó el mismo procedimiento anterior obteniendo el extracto 2 (Ext 2).

c) Se realizó el procedimiento por tercera vez (Ext 3).

Los extractantes utilizados fueron:

 etanol vínico.

 etanol vínico acidificado con ácido tartárico (pH 4.5).

 etanol 50% en agua con ácido tartárico (pH 3.5).

Medidas espectrofotométricas: las medidas espectrofotométricas fueron llevadas a cabo en un espectrofotómetro Lambda 25 de Perkin Elmer (Waltham, MA). Se usaron cubetas de cuarzo de 1 mm de paso de luz. Los extractos fueron filtrados previamente con filtros de papel Millipore HA (Billerica, MA) de 0.45µm tamaño de poro. Las medidas fueron corregidas a un paso de luz de 1cm.

- Absorbancias : se midieron las absorbancias a 420, 520 y 620 nm.

- Color de los pigmentos poliméricos (PPC) : se obtiene como la absorbancia a 520 nm de una muestra de 5 mL de extracto después de añadir 15 mg de Na2S2O5 y dejando transcurrir 45 min a 25 ºC. Los antocianos monómeros son inmediatamente decolorados por la adición de Na2S2O5 en exceso al pH del extracto, por lo que el color residual después del tratamiento se debe a las formas poliméricas de estos pigmentos³⁶.

Taninos: el índice de taninos totales fue determinado por medida de la absorbancia a 550 nm en una cubeta de 1 cm de paso de luz después de la hidrólisis ácida de las muestras. La medida fue multiplicada por 19.33 para calcular la concentración total de taninos en mg/g pomace ³⁷. Actividad antioxidante: la medida de la actividad antioxidante de los extractos se realizó según el ensayo DPPH de acuerdo al método propuesto por Alen-Ruiz et al.³⁸.

Identificación y cuantificación de compuestos antociánicos: las antocianinas fueron identificadas y cuantificadas mediante HPLC-Diodo-Array (Spectra-Physics UV6000LP) por comparación por los tiempos de retención de los patrones estándar, comparando el espectro UV obtenido por sistema de detección y calculando la razón de absorbancia UV después de la coinyección de las muestras y los patrones. La identificación fue confirmada por HPLC/ESI-MS en un espectrofotómetro de masas de quadrupolo AQA de ThermoQuest Finningan. El instrumento operó en modo de ión negativo y positivo. El voltaje de ión spray fue -4kV y el voltaje de orificio de -60V. Los datos de masa fueron adquiridos en modo scan (escaneando el rango de m/z 150-1066 en intervalos de m/Z). Cada compuesto fue cuantificado por comparación con una curva de calibrado obtenida con el malvidín-3-glucósido.

El análisis se realizó en una columna LiChrospher 100 RP-18 (250 mm long x 4.6 mm i.d., 5 µm de tamaño de partícula) usando ácido fórmico grado HPLC al 10% en agua (disolvente A) y ácido fórmico/acetonitrilo/agua 10:45:45 (disolvente B) con un flujo de fase móvil de 1 mL/min

Los antocianos fueron obtenidos por gradiente de elución de 15 a 30% de B en 17 minutos, gradiente hasta 73% de B en 28 minutos, gradiente hasta 100% de B en 3 minutos y la elución isocrática durante 3 minutos. La absorbancia utilizada para cuantificar los diferentes antocianos fue de 520nm.

Identificación y cuantificación de compuestos no antociánicos: Para el análisis de flavanoles, las muestras fueron previamente diluidas 10 veces con agua ultrapura. Para el t- resveratrol, 5 mL de muestra fueron evaporados hasta sequedad y redisueltos en 2 mL de una disolución de acetonitrilo/ácido acético al 5% (9:91). Todas las muestras fueron filtradas por 0.45 m antes de su inyección en HPLC. μ

Los flavanoles y el t-resveratrol se identificaron y cuantificaron en un cromatógrafo HPLC (Thermo Spectra Physic Series P100) acoplado a un detector de fluorescencia (Perkin Elmer Series 200a), utilizando una columna LiChrospher 100 RP-18 (250 mm x 4.6 mm i.d., 5 m deμ tamaño de partícula). Como fase móvil se utilizó acetonitrilo (disolvente A) y ácido acético 5%

(disolvente B), con un flujo de 1.4 mL/min y el siguiente programa de elución: gradiente de 9 a 25% de A en 22 minutos, seguido por un aumento hasta el 100% de A en 8 minutos y una elución isocrática de 2 minutos. Para el análisis de flavanoles se utilizaron λexc=280 nm y λem=320 nm, y para el análisis de t-resveratrol, λexc=324 nm y λem=370 nm.

Tratamiento estadístico: los resultados de todas las muestras fueron sometidos a un análisis de regresión lineal simple en triplicado utilizando el programa Statgraphics Computer Package v. 5.0 de Statistical Graphics Corp.

Resultados y Discusión

La Figura 1 muestra las absorbancias medidas a 420 (a), 520 (b), 620 (c) nm y tonalidad (d) de los tres extractos obtenidos con cada extractante. Respecto a la absorbancia a 420 nm, el extractante que presentó los valores más altos de A420 fue el etanol acidificado, seguido del etanol puro y por último el etanol al 50% en agua. Se puede observar que al aumentar el

número de extracciones va disminuyendo progresivamente el valor de esta absorbancia. En el caso del etanol acidificado, se obtuvo en la primera extracción (Ext 1) una absorbancia a 420 nm de 5.29 u.a., lo que supuso una recuperación del 44.5% del total obtenido por este extractante. En la segunda y tercera extracción este disolvente consiguió extraer un 32.6 y 22.9% del total, respectivamente. El valor de la absorbancia del extracto 1 obtenido con etanol puro fue de 4.73 u.a. representando un 45.9% del total y en la segunda y tercera extracción se recuperaron el 31.7 y 22.4 % respecto del total que este disolvente fue capaz de extraer. El extracto obtenido por el etanol al 50% dio un valor de absorbancia a 420 nm de 3.84 u.a.

disminuyendo progresivamente en la segunda y tercera extracción obteniendo valores de 3.07 y 2.14 u.a. respectivamente. Los porcentajes de recuperación en las tres extracciones sucesivas con este disolvente fueron 42.5, 33.8 y 23.7%, para la primera, segunda y tercera extracción. En general, los tres extractantes utilizados presentaron porcentajes de recuperación respecto del total extraído, del mismo orden de magnitud (45, 30 y 20% respectivamente en los extractos 1, 2 y 3).

En cuanto a la absorbancia medida a 520 nm se puede observar como el extractante que mostró el valor más alto en la primera extracción (Ext 1) fue el etanol acidificado seguido del etanol puro y por último el etanol al 50% en agua con valores de 10.0 u.a., 8.41 u.a. y 7.90 u.a., respectivamente. En la segunda extracción de nuevo el disolvente que obtuvo mayor valor fue el etanol acidificado (5.6 u.a.), seguido en este caso del etanol al 50% y por último del etanol puro (5.31 y 4.57 u.a., respectivamente). La última extracción, sin embargo, el extractante que mostró el mayor valor de absorbancia fue el etanol al 50% (3.22 u.a.) seguido del etanol acidificado y etanol puro. Los valores obtenidos en la última extracción fueron de 3.22, 2.55 y 2.27 u.a. para el etanol al 50%, etanol acidificado y etanol puro respectivamente. Es decir el etanol al 50% aumenta sus porcentajes de recuperación en las extracciones así, encontramos que para el etanol puro son 55.1, 30.0 y 14.9%, para el etanol acidificado 56.8, 28.7 y 14.5% y el etanol al 50% 48.1, 32.3 y 19.6%. En conjunto, el extractante que obtuvo una mayor absorbancia fue el etanol acidificado, en segundo lugar el etanol al 50% en agua, siendo el etanol puro el que obtuvo los menores valores de absorbancia en total.

En relación a la absorbancia medida a 620 nm, los extractos que presentaron los mayores valores de absorbancia fueron aquellos obtenidos durante el proceso de extracción realizado con etanol acidificado (2.49, 1.42 y 0.814 u.a. respectivamente) seguidos del etanol puro (2.25, 1.37 y 0.721 u.a.) y por último el etanol acuoso al 50% (1.45, 1.17 y 0.763 u.a.). Los porcentajes de recuperación de los extractantes etanol acidificado y etanol puro fueron del mismo orden de magnitud (52, 31 y 17%), por lo que estos extractantes presentaron comportamientos similares en el proceso de extracción. El etanol al 50% presentó un comportamiento algo diferente, presentando además un mayor valor de absorbancia en el último extracto que el tercer extracto obtenido con etanol puro, los porcentajes de recuperación en las tres extracciones consecutivas fueron 42.9, 34.6 y 22.6%.

Los valores de tonalidad de los extractos obtenidos se muestran en la Figura 1d. La tonalidad representa la relación entre las absorbancias medidas a 420 y 520 nm. Como se puede observar, a medida que se realizaron las sucesivas extracciones la tonalidad fue aumentando lo que indicaría que al avanzar el proceso de extracción, los extractos obtenidos contenían mayor cantidad de compuestos pardos que rojos. El disolvente que mayor tonalidad alcanzó fue el etanol puro seguido del etanol acidificado. En el caso del etanol al 50% fue el disolvente que menos tonalidad obtuvo en las tres extracciones, con lo que estos extractos fueron más rojos (o menos amarillos). Es decir, este último disolvente extrajo menos compuestos pardos en proporción con los compuestos rojos, por lo que presentarían mayor color rojo.

Figura 1. Valores de absorbancias a 420, 520 y 620 nm y tonalidad obtenidas en los diferentes extractos

En general, todos los extractantes consiguieron en los dos primeros pasos del procedimiento extraer más del 75% del total de compuestos coloreados, siendo la tercera extracción prescindible. Además, el extractante que extrajo más cantidad de compuestos coloreados en todos los casos fue el etanol acidificado, siendo en algunos casos la suma de la absorbancia de las dos primeras extracciones igual o superior al total obtenido en tres extracciones en el etanol a 50% en agua.

Los taninos son compuestos que presentan astringencia, por lo que afectan a las propiedades sensoriales. Los denominados taninos totales incluyen taninos condensados, formados por polímeros de flavan-3-ol, y taninos hidrolizables entre los que se encuentran elagitaninos y galotaninos fundamentalmente³⁹. En la Figura 2 se muestran las concentraciones de taninos totales obtenidos en los diferentes extractos. Como se puede observar en la Figura, el disolvente que más taninos extrajo en la primera extracción fue el etanol acidificado. Sin embargo, en la segunda y tercera extracción el disolvente que más taninos recuperó fue el etanol al 50% en agua, seguido del disolvente etanol acidificado que extrajo más que el etanol puro. Por otro lado, en la tercera extracción estos dos disolventes extrajeron aproximadamente la misma concentración de taninos. Con las concentraciones totales de taninos extraídos por cada disolvente, se puede ver como el etanol acidificado extrajo un 13.5% más de concentración de taninos que el etanol puro y un 8.93% más que el etanol al 50% en agua. En este caso la extracción con etanol puro fue menos efectiva que con el etanol al 50%, en este sentido, algunos autores han encontrado que la extracción de taninos condensados en restos de frutas es más efectiva con etanol-agua 1:1 que con etanol puro, siendo además las diferencias mayores a más bajas temperaturas⁴⁰. En general, los tres extractantes utilizados consiguieron extraer alrededor del 80% del total de los taninos en las dos primeras extracciones por lo que se podría pensar que la tercera extracción no sería necesaria.

Figura 2. Concentración de taninos totales obtenidos en los diferentes extractos

La Figura 3 muestra el color de pigmentos poliméricos obtenida en las tres extracciones sucesivas realizadas con los diferentes disolventes usados. Como se puede observar, el extracto 1 que mostró los valores más altos fue el correspondiente al etanol acidificado, sin embargo, en las sucesivas extracciones los valores más altos fueron los obtenidos por el etanol puro. Los extractos que mostraron los menores valores fueron los de etanol al 50% en agua, aunque puede observarse que la segunda extracción fue más efectiva que la primera. La presencia de oligómeros de antocianos en hollejos de uva fue descrita por algunos autores ⁴¹. En conjunto, los mayores valores de color de pigmentos poliméricos se obtuvieron con el procedimiento de extracción con etanol puro, siendo los menores los obtenidos con etanol al 50%. El procedimiento de extracción con el etanol puro extrae aproximadamente 1/3 del color de pigmentos poliméricos en cada extracción consecutiva, con el etanol acidificado en las dos primeras extracciones obtiene el 73.2% del total de este parámetro, mientras que el etanol al 50% recupera el 71.4% en las dos primeras extracciones. Por lo que en este caso la tercera extracción no sería despreciable con ninguno de los disolventes.

Figura 3. Color de pigmentos poliméricos obtenido en los diferentes extractos

Tabla 1. Concentración de compuestos antociánicos ( g/g pomace) de los diferentes extractos (media,μ desviación estándar y grupos homogéneos de la suma total de los extractos consecutivos).

Etanol puro Etanol Acidificado Etanol 50% acidificado Compuestos Ext 1 Ext 2 Ext 3 TOT

AL Ext 1 Ext 2 Ext 3 TOTA

L Ext 1 Ext 2 Ext 3 TOTA L Delf-3-gluc 95.2±

8.23 49.7±

0.360 37.8±

0.611 183±

8.51^a 81.8±

4.20 53.2±

0.351 37.7±

0.737 173±

3.30^a 52.2±

0.611 47.3±

0.929 34.6±

0.099 134±

0.65 0^b Cian-3-gluc 52.1±

3.65 26.3±

0.101 24.1±

0.168 103±

3.65^a 32.1±

1.27 26.9±

0.305 23.6±

0.252 82.6±

1.53^b 26.2±

0.625 25.8±

0.611 24.3±

1.15 76.3

±0.3 80^c Pet-3-gluc 126±

5.80 73.3±

1.42 50.8±

1.91 250±

7.19^a 117±

5.29 75.5±

0.504 49.4±

0.458 242±

5.36^b 75.6±

2.71 72.5±

1.75 52.3±

0.401 200±

1.16^c Peon-3-gluc 111±

5.02 65.7±

1.71 46.0±

3.03 223±

7.51^a 98.9±

4.05 66.4±

0.494 44.9±

0.854 210±

4.58^b 68.6±

0.207 67.0±

1.01 49.1±

0.361 185±

1.10^c Malv-3-gluc 484±

23.3 316±

8.45 185±

3.72 984±

32.5^a 536±

20.5 306±

2.32 176±

1.86 1018

±16.3

a

349±

0.354 307±

7.6

200±

1.42 855±

9.25^b Total

Glucósidos

868±

42.6 531±

11.9 343±

9.40 1742

±55.

7^a

866±

34.9 528±

2.11 331±

2.38 1725

±30.6

b

571±

2.66 519±

11.8 360±

0.65 0

1450

±9.6 2^c Delf-3-

acetilgluc

62.8±

1.55 31.5±

0.252 25.4±

1.61 120±

2.65^a 44.9±

3.47 34.6±

1.91 26±0.

208 106±

3.81^b 31.5±

0.635 32.6±

0.208 26.8±

0.656 90.9

±0.4 60^c Cian-3-

acetilgluc

47.2±

0.608 24.2±

0.800 22.2±

1.47 94.0

±1.7 4^a

28.3±

1.36 25.5±

0.985 21.6±

0.153 75.4±

1.41^b 24.0±

0.451 25.4±

0.529 23.7±

0.8 73.1

±0.2 50^b Pet-3-

acetilgluc

72.3±

1.20 41.4±

1.72 31.3±

1.2

145±

2.62^a 56.5±

1.93 42.5±

1.62 30.5±

0.586 130±

1.44^b 39.6±

0.264 39.4±

0.794 31.4±

0.4

110±

0.20 0^c Peon-3-

acetilgluc

82.9±

1.40 47.7±

0.777 33.9±

0.814 165±

2.60^a 62.8±

1.51 46.5±

1.01 31.8±

0.709 141±

1.60^b 42.4±

0.557 43.3±

0.207 32.7±

1

118±

0.42 0^c Malv-3-

acetilgluc

256±

8.10 156±

3.43 94.7±

0.818 507±

11.8^a 263±

10.3 156±

2.12 97.6±

0.177 516±

8.21^a 172±

0.496 148±

0.293 97.6±

0.65 418±

0.85 0^b Total

Acetilglucósi dos

521±

9.58 301±

6.77 208±

5.78 1030

±19.

1^a

455±

12.1 305±

7.57 208±

1.39 967±

6.77^b 309±

0.65 0

289±

1.47 212±

0.90 2

810±

1.23^c Pet-3-

coumaroilglu c

64.1±

0.096 31.5±

1.25 25.6±

1.25 121±

1.46^a 39.9±

2.27 33.4±

1.38 27.4±

0.401 101±

1.40^b 28.8±

0.416 28.3±

1.14 nd

57.1

±0.7 20^c Peon-3-

coumaroilglu c

59.9±

0.724 31.5±

0.751 25.4±

0.635 117±

1.71^a 36.5±

1.02 31.7±

1.05 26.8±

0.451 95.0±

0.500

b

27.2±

0.152 27.8±

0.737 nd

55.0

±0.7 50^c Malv-3-

coumaroilglu c

124±

6.20 57.5±

1.21 39.1±

0.1

221±

7.45^a 107±

7.20 68.4±

1.74 44.6±

0.889 220±

5.15^b 53.7±

1.12 46.3±

0.361 28±0.

252 128±

0.60 0^c Total

Coumaroilgl ucósidos

248±

6.80 120±

3.20 90.1

±1.1 1

459±

10.3^a 183±

10.4 134±

4.16 98.8

±0.9 45

415±

6.13^b 110±

1.46 102±

2.07 28±0

.252 240±

0.85 4^c Malv-3-

cafeoilgluc

68.8±

0.757 44.5±

1.60 33.9±

0.503 147±

2.51^a 43.9±

2.03 39.6±

1.01 31.7±

0.302 115±

1.28^b 34.4±

0.777 38.5±

1.05 32.6±

0.351 106±

0.68 0^c ANTOCIANO

S TOTALES

1706

±59.

4

996±

23.5 675±

16.7 3377

±86.

9^a

1547

±57.

2

1006

±14.

8

669±

1.60 3223

±40.8

a

1024

±0.2 65

949±

10.0 633±

1.25 2606

±9.2 5^b

La tabla 1 muestra las concentraciones de todos los antocianos identificados en los diferentes extractos obtenidos durante el proceso de extracción y con los tres extractantes utilizados. En primer lugar, puede observarse que los compuestos mayoritarios extraídos de los residuos de prensa en todos los casos fueron los derivados 3-glucosilado, 3-acetilglucosilado y 3- coumarilglucosilado del malvidín, lo que es lógico debido a que estos son los antocianos mayoritarios en las uvas tintas. Si se tiene en cuenta las diferencias entre los diferentes disolventes, puede observarse que el etanol puro fue el extractante que disolvió mayor cantidad de antocianos de todas las familias a partir de los restos de prensa. Como se puede observar, este disolvente extrajo 1742 µg/g hollejo de derivados glucosilados, lo que representa un 49.9% del total de los mismos extraídos en todo el proceso, en la segunda y tercera extracción se extrajo el 30.5% y 19.7% respectivamente. En el caso del etanol acidificado el total de derivados glucosilados extraídos fue de 1725 µg/g hollejo, es decir, aproximadamente un 1% menos que el anterior. Este disolvente tuvo un comportamiento similar al anterior en cuanto al porcentaje de recuperación de los compuestos, ya que se recuperó un 50.2%, 30.6% y 19.2% del total en las tres extracciones consecutivas. El disolvente que se diferenció más fue el etanol al 50% en agua que extrajo 1450 µg/g hollejo de derivados glucosilados. En este caso, las extracciones consecutivas recuperaron el 39.4, 35.8 y 24.8%

respectivamente. Los extractos obtenidos con este último extractante presentaron diferencias significativas en el total de cada uno de los derivados glucosilados con respecto a los otros dos extractantes. El etanol puro y el etanol acidificado mostraron diferencias significativas en todos los compuestos de esta familia excepto en las concentraciones de los derivados del delfinidín y del malvidín. El total de derivados glucosilados obtenido con cada extractante presentaron diferencias significativas.

Respecto a los derivados acetilglucosilados, de nuevo el disolvente que extrajo mayor cantidad de compuestos fue el etanol puro, seguido del etanol acidificado y el etanol al 50% (1030, 967 y 810 µg/g hollejo respectivamente). Este último mostró mayores diferencias en las concentraciones de todos los compuestos con respecto a los otros dos. Los porcentajes de recuperación siguieron un comportamiento similar al observado en los derivados glucosilados, con valores aproximados al 50, 30 y 20% en la primera, segunda y tercera extracción para los dos primeros disolventes y de 38, 36 y 26% en las extracciones sucesivas del etanol al 50%.

Este mostró diferencias significativas en las concentraciones de todos los derivados acetilglucosilados con las obtenidas con los otros dos extractantes. El etanol puro y etanol acidificado mostraron diferencias significativas en todos los compuestos, excepto en el derivado del malvidín.

En relación a los derivados coumaroilglucósidos y cafeoilglucósidos, se encontraron mayores diferencias. El etanol puro extrajo en total 459 y 147 µg/g hollejo de estos derivados respectivamente, siendo los porcentajes de recuperación de 54.1, 26.3 y 19.6% en las tres extracciones consecutivas. El derivado cafeoilglucósido determinado se extrajo en proporciones similares al resto de familias con este disolvente, es decir sus porcentajes de recuperación fueron 46.8, 30.3 y 23.1% respectivamente. El etanol acidificado extrajo estos derivados en concentraciones algo inferiores al disolvente anterior (415 y 115 µg/g hollejo respectivamente), los porcentajes de recuperación fueron de 44.1, 32.1 y 23.8% para los derivados coumaroilglucosilados y de 38.1, 34.4 y 27.5% para el malvidín-3-cafeoilglucósido.

El etanol al 50% extrajo aproximadamente la mitad de derivados coumaroilglucósidos que el etanol puro, en concreto los derivados del petunidín y peonidín no se encontraron en el extracto 3. El malvidín-3-cafeoilglucósido también se encontró en menores concentraciones con este disolvente, siendo en este caso los porcentajes de recuperación muy similares en las tres extracciones consecutivas. La concentración de todos los compuestos obtenidas con los tres extractantes mostraron entre si diferencias significativas.

En conclusión, el etanol puro es el extractante que mayor cantidad de antocianinas extrajo (3377 µg/g) superando al etanol acidificado en un 4.7%, aunque sin diferencias significativas entre ellos. Respecto al etanol al 50% en agua el etanol puro extrajo un 29.6% más de antocianinas respecto del total que recuperó el etanol puro. Estas diferencias se deben a que los antocianos son más solubles en etanol que en agua. Lapornik et al. ⁵ demostraron que el

mejor disolvente para la extracción de compuestos fenólicos y en concreto antocianinas es el metanol, seguido del etanol, pero sin muchas diferencias entre ellos, por lo que en la industria alimentaria se prefiere el uso del etanol. Las antocianinas son solubles en ambos alcoholes, esta solubilidad depende del número, tipo y posición de enlace de los azúcares en la molécula de antocianina, sin embargo la solubilidad disminuye mucho en agua⁵. Así se observó que al aumentar la proporción de agua, disminuyó la extracción de antocianinas. Además, algunos autores han demostrado que las polifenoloxidasas degradan los polifenoles en los extractos de agua mientras que en los extractos de etanol y metanol puro esta enzima está inactiva⁴².

Por otro lado, en los primeros extractos se recuperaron aproximadamente el 80% de total de antocianos al realizar el proceso con etanol puro y etanol acidificado, por lo que se podría considerar que la tercera extracción no es necesaria. Esto está de acuerdo con lo recogido por otros autores que establecen que la extracción en dos etapas es adecuada y supone un menor tiempo y coste de disolventes5, 43, 44. En el caso de usar etanol al 50% en los dos primeros extractos se recogió el 75.7% del total de antocianos extraídos con este disolvente.

La Tabla 2 muestra la concentración de t-resveratrol y derivados del flavan-3-ol medida en los tres extractos obtenidos con cada uno los tres extractantes utilizados. El resveratrol es un estilbeno que está presente en el hollejo de las uvas en forma del isómero trans ²¹, el isómero cis aparece en vinos debido a la acción de la luz ultravioleta. En los últimos años se están realizando numerosos estudios debido a su influencia en las enfermedades coronarias⁴⁵. Como puede observarse en la tabla, el etanol acidificado fue el disolvente que mayor cantidad de t- resveratrol extrajo, seguido del etanol puro. El etanol al 50% en agua extrajo mucho menos de lo que recuperaron el etanol puro y etanol acidificado. Esto puede ser debido a que los dos isómeros del resveratrol presentan baja solubilidad en agua, pero son solubles en etanol⁴⁶. Algunos autores han encontrado que este compuesto se extrae mejor al disminuir la proporción de agua en mezclas etanol/agua, aunque con resultados no concluyentes⁴⁷. En general, las extracciones realizadas con etanol acidificado y etanol al 50% obtuvieron en los dos primeros extractos aproximadamente el 80% del total de este compuesto, por lo que se podría decir que la última extracción se podría eliminar. Sin embargo, el proceso realizado con etanol puro en las dos primeras extracciones recogió aproximadamente el 70% del total, siendo la última extracción más significativa.

Respecto a los derivados del flavan-3-ol, puede observarse que en todos los extractos el derivado mayoritario fue (+)-catequina. Las concentraciones de monómeros del flavan-3-ol y de procianidinas fueron mayores en los extractos obtenidos con etanol acidificado. Los monómeros se extrajeron menos con etanol al 50%, aproximadamente el 55% de lo que lo hizo el etanol acidificado. Sin embargo, las menores concentraciones de procianidinas se obtuvieron en los extractos de etanol puro, aproximadamente un 26 % menos que lo que se obtuvo con el etanol acidificado. En general, el etanol acidificado obtuvo el 76% de los monómeros del flavan-3-ol y de las procianidinas en los dos primeros extractos, por lo que se podría decir que este extractante fue efectivo en dos ciclos de extracción. El etanol puro extrajo en los primeros extractos el 71 y 78% de los monómeros y de dímeros respectivamente, por lo que en el caso de los dímeros se podría prescindir de la tercera extracción. El etanol al 50% recogió en los dos primeros extractos el 74 y 77% del total de compuestos extraídos, por lo que se podría eliminar el tercer paso del proceso de extracción.

Etanol Etanol acidificado

Ext 1 Ext 2 Ext 3 Total Ext 1 Ext 2 Ext 3 Total

t-Resveratrol 0.178±0.01

1 0.110±0.004 0.112±0.00

1 0.400±0.014^a 0.312±0.010 0.120±0.007 0.077±0.001 0.509±0.017

(+)-Catequina 9.3±0.530 7.2±0.050 6.4±0.110 22.9±0.260^a 14.3±0.299 11.9±0.299 7.9±0.092 34.1±0.287

(-)-Epicatequina 7.9±0.914 6.7±0.305 6.2±0.187 20.8±0.564^a 10.4±0.692 10.2±0.195 7.3±0.489 27.9±0.697

Total

monómeros 17.1±1.02 13.8±0.251 12.6±0.056 43.6±0.824^a 24.6±0.278 22.0±0.279 15.2±0.411 61.9±0.410^b Procianidina B1 2.9±0.070 2.1±0.011 1.5±0.017 6.5±0.046^a 4.00±0.385 2.90±0.208 2.30±0.445 9.14±0.734

Procianidina B2 1.6±0.188 0.884±0.021 0.648±0.06

7 3.12±0.165^a 1.8±0.350 1.00±0.040 0.861±0.368 3.69±0.018

Total dímeros 4.46±0.083 2.99±0.023 2.13±0.059 9.58±0.119^a 5.77±0.025 3.88±0.119 3.18±0.573 12.8±0.716^b

Tabla 2. Concentración de resveratrol y derivados del flavan-3-ol (µg/g pomace) en de los diferentes extractos (media, desviación estándar y grupos homogéneos de la suma total de los extractos consecutivos).

La Figura 4 muestra la actividad antioxidante (mmol TE/L) medida en los tres extractos obtenidos con cada uno de los diferentes disolventes utilizados. Como puede observarse, en la primera extracción fue el extracto obtenido con etanol acidificado el que mostró una mayor actividad antioxidante (4.73 mmolTE/L) siendo los valores algo menores para los otros dos disolventes (4.49 y 4.27 mmol TE/L para etanol puro y etanol al 50% respectivamente). Sin embargo, en las sucesivas extracciones el valor de la actividad antioxidante del extracto obtenido con etanol al 50% fue muy superior al de los demás extractos, siendo este extracto, obtenido con etanol al 50%, el que en conjunto mostró la mayor actividad antioxidante, seguido del etanol acidificado y etanol puro. Esto no estaría de acuerdo con lo comentado anteriormente de los antocianos, donde el extracto que mostró la mayor cantidad de estos compuestos fenólicos fue el etanol puro y sin embargo es este el que mostró una menor actividad antioxidante. La actividad antioxidante no siempre presenta relación con el contenido de antocianos. En este sentido, algunos autores encontraron que la actividad antioxidante se relaciona principalmente con los compuestos de alto peso molecular y solo encontraron relación con alguna familia de antocianos^{38, 48}.

Figura 4. Actividad antioxidante obtenida en los diferentes extractos

Para ver la relación existente entre la actividad antioxidante y la composición de los extractos se ha realizado un análisis de regresión lineal con los valores de actividad antioxidante y las diferentes familias de compuestos obtenidos en los diferentes extractos. El análisis mostró una ausencia de correlación con los monómeros del flavan-3-ol y los valores de PPC y una correlación significativa al 99.9% (p < 0.001) con los valores de taninos, dímeros del flavan-3- ol y los derivados glucosilados y acetilglucosilados de los antocianos, también hubo relación significativa al 99% (p< 0.01) con el resveratrol y los derivados coumaroilglucosilados y cafeoilglucosilados de los antocianos (Tabla 3). Es de destacar que la mayor relación se obtuvo con los valores de taninos (0.9125), donde la relación es relativamente fuerte y por lo tanto serían estos compuestos los que más influyeron en la actividad antioxidante de los extractos.

Algunos autores han encontrado que existe una fuerte relación entre la actividad antioxidante y los compuestos más polimerizados⁴⁸. A continuación se encontró que los que presentaron mayores coeficientes fueron los derivados glucosilados y acetilglucosilados de los antocianos y los dímeros del flavan-3-ol (0.8405, 0.7930 y 0.8206 respectivamente). Katalinic et al.⁴⁹ encontraron una correlación significativa entre la actividad hidrofílica medida por el ensayo DPPH y el contenido en antocianos totales en uvas tintas y Xu et al.⁵⁰ en hollejos de uvas tintas.

El resto de derivados de los antocianos y el t-resveratrol mostraron coeficientes más pequeños influyendo menos en los valores de actividad antioxidante de los extractos.

Tabla 3. Análisis de regresión lineal simple entre el contenido en compuestos fenólicos y/o polimerizados y la actividad antioxidante de los diferentes extractos.

Coeficiente de correlación p

Taninos 0.9125 <0.001

Total glucósidos 0.8405 <0.001

Total acetilglucósidos 0.7930 <0.001

Total coumaroilglucósidos 0.5757 <0.01

Total cafeoilglucósidos 0.5369 <0.01

Dímeros del flavan-3-ol 0.8206 <0.001

Resveratrol 0.5068 <0.01

Monómeros del flavan-3-ol n.s

PPC n.s

*(n.s) no significativo estadísticamente.

Al objeto de evaluar finalmente la eficacia de los extractantes utilizados para la obtención de compuestos bioactivos y coloreados a partir de restos de prensa o pomace de la industria vitivinícola la Tabla 4 muestra un resumen de los resultados obtenidos para todos los parámetros, y que serán utilizados para extraer las conclusiones.

Tabla 4. Valores más adecuados de las medidas realizadas y obtenidas con los extractantes utilizados.

Etanol puro Etanol acidificado Etanol 50 %

A520 x

A420 x

A620 x

Tonalidad x

Taninos x

PPC x

Antocianos x

t-Resveratrol x

Flavan-3-oles x

Actividad antioxidante x

Conclusiones

En relación al disolvente utilizado:

 El etanol acidificado fue el extractante que obtuvo los mayores valores de absorbancia a 520, 420 y 620 nm, mayor concentración de taninos, t-resveratrol y derivados del flavan-3- ol.

 Los extractos obtenidos con etanol puro fueron los que contenían mayor cantidad de compuestos antociánicos y mayores valores de pigmentos poliméricos coloreados.

 Los extractos obtenidos con etanol al 50% fueron los que presentaron la mayor actividad antioxidante y la menor tonalidad.

En relación al procedimiento de extracción

 Para los valores de las absorbancias a 420, 520 y 620 nm, los taninos y los compuestos antociánicos, todos los disolventes utilizados consiguieron en los dos primeros extractos, al menos el 75% de los valores totales que cada uno alcanza, por lo que en estos casos el procedimiento podría simplificarse a dos extracciones consecutivas.

 En los valores de pigmentos poliméricos coloreados el tercer extracto no sería despreciable, ya que este supuso alrededor del 30% del total en todos los casos.

 En relación al t-resveratrol, la extracción realizada con etanol puro y acidificado podría hacerse en dos pasos, mientras que el etanol al 50% precisaría de tres pasos.

 Los derivados del flavan-3-ol, el procedimiento podría simplificarse en el caso de realizarlo con etanol acidificado y etanol al 50%.

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