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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
“Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”
TESIS PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE
MAESTRA EN CIENCIAS
MENCIÓN
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Autora : Br. Alva Castillo, Glenda Noheli Asesor : Dr. Zavaleta Verde, Edgar David
TRUJILLO – PERÚ 2022
Nº de registro ……
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MIEMBROS DEL JURADO
Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en concordancia con las Normas de la Escuela de Posgrado de la Universidad Nacional de Trujillo.
Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez PRESIDENTE
Dr. Juan Héctor Wilson Krugg SECRETARIO
Dr. Edgar David Zavaleta Verde ASESOR
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DEDICATORIA
A DIOS, mi guía y fortaleza en todo tiempo;
por mantenerme con vida y salud, y que por su infinito amor y misericordia me ha permitido cumplir con una de mis metas.
A mi amada hija VALERIA, por ser mi fuente de motivación e inspiración para poder superarme cada día más
y así poder luchar para que la vida nos depare un futuro mejor.
A mis padres LUCIO y MARTA, por ser el pilar fundamental de todo lo que soy;
gracias a su amor e invalorable entrega y dedicación en mi formación, tanto personal como profesional.
A mis hermanos TERESITA, LUCIO y ABEL; que por su amor, sus consejos y motivación constante me han permitido salir adelante y cumplir con mis objetivos.
A mis maestros, por sus enseñanzas impartidas, su tiempo compartido y por impulsar el desarrollo de nuestra formación profesional.
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AGRADECIMIENTOS
A mi asesor Dr. Edgar David Zavaleta Verde, Docente del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo, por aceptarme para realizar esta tesis bajo su dirección. Su apoyo y confianza en mi trabajo y su capacidad para guiar mis ideas ha sido un aporte invaluable, no solamente en el desarrollo de esta tesis, sino también en mi formación como investigadora. Asimismo, mi agradecimiento por haberme facilitado siempre los medios necesarios para llevar a cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de esta tesis.
Al Sr. Juan Luis Díaz, por brindarme información acerca de la apicultura y apoyarme en la obtención de muestras de propóleo.
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ÍNDICE
RESUMEN ... vii
ABSTRACT………... . ix
I. INTRODUCCIÓN ... 1
II. MATERIAL Y MÉTODO ... 6
2.1. OBJETO DE ESTUDIO………. 6
2.2. INSTRUMENTACIÓN ………. 6
2.3. MÉTODOS Y TÉCNICAS ……… 6
2.3.1. Recolección y transporte de muestras de propóleo ... 6
2.3.2. Análisis organoléptico del propóleo ... 7
2.3.3. Obtención del extracto etanólico de propóleo ... 8
2.3.4. Reactivación y estandarización del inóculo bacteriano ... 8
2.3.5. Determinación de la concentración mínima inhibitoria ... 8
2.3.6. Análisis estadístico ... 9
III. RESULTADOS ... 10
IV. DISCUSIÓN ... 14
V. CONCLUSIONES ... 17
VI. RECOMENDACIONES ... 18
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 19
ANEXOS ... 23
Anexo 1. Recolección de las muestras de propóleo, mediante el raspado de las partes superiores de las colmenas ... 24
Anexo 2. Ficha de recolección de datos con los parámetros ambientales y de las colmenas durante el proceso de muestreo del propóleo ... 25
Anexo 3. NORMA RUSA RST – RSFR – 317 – 77 ... 27
Anexo 4. Extracto etanólico de propóleo peruano concentrado. ... 28
Anexo 5. Cepa liofilizada de Streptococcus pneumoniae ATCC 6303 ... 29
Anexo 6. Sistema de tubos conteniendo diferentes concentraciones de propóleo peruano para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) sobre Streptococcus pneumoniae. ... 30
Anexo 7. Distribución porcentual del estudio: “Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”, según tratamiento y estado de crecimiento de la bacteria. Muestra procedente de Ferreñafe. ... 31
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Anexo 8. Distribución porcentual del estudio: “Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”, según tratamiento y estado de crecimiento de la bacteria. Muestra procedente de Contumazá ... 32 Anexo 9. Prueba Estadística Q de Cochran del efecto in vitro del extracto etanólico de
propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae ... 33 Anexo 10. Prueba Posthoc de Mcnemar, en la comparación de tratamientos del estudio
sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae según las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Ferreñafe,
Lambayeque, Perú. ... 34 Anexo 11. Prueba Posthoc de Mcnemar, en la comparación de tratamientos del estudio
sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae según las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Contumazá,
Cajamarca, Perú ... 35 Anexo 12. Número de ensayos con crecimiento de Streptococcus pneumoniae según
las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Ferreñafe, Lambayeque, Perú ... 36 Anexo 13. Número de ensayos con crecimiento de Streptococcus pneumoniae según
las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Contumazá, Cajamarca, Perú ... 37
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FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Mapa de localización de los puntos de muestreo del propóleo sobre el
área de estudio ... 7 Tabla 1. Tratamientos sometidos a las muestras de propóleo procedentes de Ferreñafe y
Contumazá ... 9 Tabla 2. Características organolépticas de muestras de propóleo peruano recolectadas
de apiarios ubicadas en las provincias de Contumazá y Ferreñafe, Perú. ... 11 Tabla 3. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae a diversas concentraciones del
extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Ferreñafe, Lambayeque, Perú ... 12 Tabla 4. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae a diversas concentraciones del
extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Contumazá, Cajamarca, Perú ... 13
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RESUMEN
El objetivo de este estudio fue conocer el efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae, mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI). Para ello se obtuvieron, mediante el raspado manual de las colmenas de Apis mellifera, dos muestras de propóleo peruano provenientes de las provincias de Contumazá y Ferreñafe, a dichas muestras se realizaron el análisis organoléptico y la obtención del extracto etanólico. Se determinó la CMI entre las concentraciones (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78 y 0.39 mg/ml), los tratamientos fueron incubados en condiciones de anaerobiosis por 18 horas a 37 °C, al término de este tiempo se registró la presencia o ausencia de crecimiento de S.
pneumoniae. Los resultados evidenciaron que a 25 y 50 mg/ml del extracto etanólico de propóleo obtenido de la provincia de Contumazá y Ferreñafe respectivamente, no se observaron crecimiento de la bacteria evaluada. Se concluyó que el extracto etanólico de propóleo peruano tuvo efecto in vitro sobre el crecimiento de S pneumoniae.
Palabras clave: Extracto etanólico de propóleo, Streptococcus pneumoniae, Concentración mínima inhibitoria (CMI).
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ABSTRACT
The objective of this study was to determine the in vitro effect of the ethanolic extract of Peruvian propolis on the growth of Streptococcus pneumoniae, by determining the minimum inhibitory concentration (MIC). For this, two samples of Peruvian propolis from the provinces of Contumazá and Ferreñafe were obtained, by manual scraping of the Apis mellifera hives, to these samples the organoleptic analysis and the obtaining of the ethanolic extract were carried out. The MIC was determined between the experimental concentrations (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78 and 0.39 mg/ml), the experimental treatments were incubated under anaerobic conditions for 18 hours at 37 °C , at the end of this time the presence or absence of growth of S. pneumoniae was recorded.
The results showed that at 25 and 50 mg/ml of the ethanolic extract of propolis obtained from the provinces of Contumazá and Ferreñafe, respectively, no growth of the bacteria evaluated was observed. It was concluded that the ethanolic extract of Peruvian propolis had an in vitro effect on the growth of S. pneumoniae.
Key words: Propolis ethanolic extract, Streptococcus pneumoniae, Minimum inhibitory concentration (MIC).
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I. INTRODUCCIÓN
La neumonía es la principal causa de mortalidad infantil en todo el mundo. Esta enfermedad puede ser causada por virus, bacterias u hongos; ubicando a Streptococcus pneumoniae como el agente etiológico más común de neumonía bacteriana en niños, seguido de Haemophilus influenzae de tipo b; mientras que el virus sincitial respiratorio es la causa más frecuente de neumonía vírica (Keifer & Effenberger, 2018). Las infecciones neumocócicas severas y sus complicaciones se deben parcialmente a acciones directas de los determinantes de virulencia en el neumococo y, por otra parte, a la respuesta inmune del huésped a diversos componentes neumocócicos. Los determinantes de la virulencia neumocócica y las correspondientes respuestas inmunes producen cuatro efectos clave: la adhesión, la invasión, la inflamación y el shock (Gillespie & Balakrishnan, 2000)
Existen publicaciones relacionadas con la resistencia antimicrobiana de S. pneumoniae, en donde se demuestra que dicho microorganismo empieza a presentar una resistencia creciente a la penicilina y a otros antibióticos betalactámicos. Posteriormente, los estudios demuestran una resistencia compartida a la penicilina y a cefalosporinas, macrólidos, ciprofloxacino, trimetoprim- sulfametoxazol, cloranfenicol y tetraciclinas (Rodríguez- Noriega et al., 2014). En Perú, entre los años 2000 y 2016, el Instituto Nacional de Salud, a través de la vigilancia de neumonías y meningitis bacterianas, identificó 368 aislamientos de S. pneumoniae en niñas y niños menores de cinco años de edad con enfermedad neumococcica invasiva, evidenciándose un incremento de resistencia a los antibióticos:
eritromicina 64%, tetraciclina 61% y cotrimoxazol 60% (Morales & Fiestas, 2017).
Además, los datos preliminares de un estudio de resistencia antibiótica realizada por el Grupo Peruano de Investigación de Neumococo (GPIN) entre los años 2018 y 2019 en Hospitales de Lima, señalaron que de 68 muestras procedentes de niñas y niños, con enfermedad neumocócica invasiva (sepsis, neumonía) la resistencia a azitromicina es de 82%, a cotrimoxazol en 79% y a clindamicina 75%; todas las muestras fueron sensibles a cloranfenicol. También ha sido reportado que, la resistencia a penicilina para cepas causantes de neumonía según la concentración mínima inhibitoria es de 15.4% de resistencia intermedia y 3.8% de resistencia alta (19.2% no sensibles a penicilina) (Ministerio de salud, 2019)
El uso, y en ocasiones el abuso, extensivo de antibióticos ha ocasionado un aumento en la frecuencia de aislamiento de microorganismos resistentes; por lo que, en la actualidad se
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está investigando el uso de nuevas alternativas de tratamiento, que incluyen productos que provienen de la naturaleza como solución a los problemas médicos. Existen diferentes investigaciones sobre las propiedades farmacológicas del propóleo, principalmente propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antiinflamatorias y antioxidantes que se han atribuido a compuestos fenólicos (Sforcin & Bankova, 2011). Además, varios estudios indican que el propóleo no tiene toxicidad ni efectos secundarios en modelos animales o humanos (Demir et al., 2016). Es una sustancia conocida desde hace siglos por las innumerables propiedades que posee, gracias a su compleja composición química que depende de su origen geográfico, fuente vegetal, la especie de abeja y la estación (Ristivojević et al., 2016). En general, el propóleo está compuesto de 50% de resina vegetal, 30% de cera, 10% de aceites esenciales y aromáticos, 5% de polen y 5% de otras sustancias (Salatino et al., 2011).
Actualmente la producción de propóleo aún se realiza a pequeña escala, a través de su principal derivado, el extracto etanólico de propóleo (EEP). Los compuestos característicos del EEP son los polifenoles, incluido los flavonoides y ácidos fenólicos, siendo los flavonoides los más abundantes y efectivos, se considera que contribuyen más a los efectos antibacterianos, antivirales y antioxidantes en comparación a los otros constituyentes. Los principales flavonoides en EEP son pinocembrina, galangin, crisina, quercetina, kaempferol y naringenina; mientras que los componentes reportados en extractos acuosos del propóleo incluyen ácidos fenólicos, ácido cafeoilquínico, ácido cafeico, flavonoides, etc. Los compuestos volátiles del propóleo son alcohol bencílico, acetato de bencilo, alcohol cinámico, vainillina, benzoato de ciclohexilo y benzoato de bencilo, que son responsables de varias propiedades biológicas (Xu et al., 2009). Kumazawa et al. (2004) reportaron que las diferencias en la composición química del propóleo de diferentes fuentes cambian el espectro de la actividad biológica del mismo.
En una revisión realizada por investigadores de la Universidad Poznán de Ciencias Médicas en Polonia, analizaron resultados de estudios sobre la influencia del propóleo en más de 600 cepas bacterianas, en donde se confirmó que éste tiene una mayor actividad contra bacterias Gram positivas que Gram negativas (Przybyłek & Karpiński, 2019). Esto se explica por la composición de las porinas o lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa de las bacterias Gram negativas y la producción de enzimas hidrolíticas que descomponen los ingredientes activos del propóleo (Mirzoeva et al., 1997). Además, se comparó la actividad antimicrobiana del propóleo de diferentes regiones del mundo y
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como resultado se encontró una alta actividad antimicrobiana en propóleos provenientes del Medio Oriente en relación con las cepas Gram positivas (Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Escherichia coli); simultáneamente se demostró la actividad más baja para muestras de propóleos provenientes de Alemania, Irlanda y Corea (Przybyłek &
Karpiński, 2019).
La actividad antibacteriana del propóleo debe considerarse en dos aspectos, la acción directa sobre el microorganismo, y la estimulación del sistema inmune resultando en la activación de las defensas naturales del organismo (Sforcin & Bankova, 2011). El análisis de los mecanismos del propóleo permite inferir su efecto sobre la permeabilidad de la membrana celular de los microorganismos, interrupción del potencial de membrana y la producción de adenosina trifosfato (ATP), así como disminución de la movilidad bacteriana (Mirzoeva et al., 1997). Asimismo, se ha reportado que el extracto de propóleo aumenta sinérgicamente la eficacia de los antibióticos, especialmente aquellos que actúan sobre la síntesis de la pared celular (vancomicina y oxacilina) contra microorganimos resistentes a los medicamentos (Al-ani et al., 2018).
En una investigación se evaluó la actividad antimicrobiana del propóleo serbio por medio de concentración mínima inhibitoria (CMI), cromatografía de capa fina de alto rendimiento, bioautografía y quimiometría; en el cual se confirma que las muestras de propóleo con una cierta combinación de compuestos fenólicos predominantes como galangin, crisina y pinocembrina son efectivas contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. La cepa más sensible de las bacterias Gram positivas fue Listeria monocytogenes, mientras que las cepas de Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis y S.
aureus mostraron una amplia gama de valores de CMI (Ristivojević et al., 2016).
Se ha reportado un estudio sobre la actividad biológica del propóleo recolectado de diferentes zonas geográficas (Alemania, Irlanda y República Checa), en el cual se muestra un efecto antibacteriano moderado sobre S. pneumoniae con un CMI entre 0.08 mg/ml y 0.3 mg/ml (Al-ani et al., 2018). Datos similares a otro estudio, donde se evaluó la actividad antimicrobiana del propóleo en cepas aisladas del tracto respiratorio, entre ellas S.
pneumoniae logrando obtenerse un valor de CMI de 0.5 g/L, cuyo valor también fue bactericida (Drago et al., 2000). También se reporta datos de CMI muy bajos para S.
pneumoniae de los extractos etanólicos de propóleos búlgaro y brasileño, 25.6 ug/ml y 819.2 ug/ml, respectivamente. En este ensayo, el extracto etanólico de propóleos búlgaro
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fue mucho más activo que el extracto etanólico de propóleo brasileño; es posible asociar dicha actividad con el alto contenido de flavonoides, que es la principal diferencia entre los dos extractos (Salomão et al., 2004).
Pereira et al. (2008) investigaron la correlación entre la composición química y actividad antimicrobiana del propóleo brasileño, encontrando un rango de CMI de 0,2 a 0,8 μg ml -1 para S. pneumoniae, mediante una asociación positiva de la actividad biológica con derivados de p-ácido cumárico y de ácidos cafeoliquínicos, que corresponden a ácidos cafeicos esterificados con residuos de azúcares. Asimismo, se ha evaluado la actividad antibacteriana de algunos principios activos del propóleo de forma aislada, alcanzando una pureza mayor del 96%; obteniéndose una actividad notable del componente éster feniletílico del ácido cafeico, con un rango de MIC 32-128 mg/L contra S. pneumoniae en comparación con galangina, pinocembrina (rango de CMI 128-512 mg/L para ambos) y crisina (intervalo de CMI 256-1024 mg/L) (Speciale et al., 2006).
Dado que el propóleo presenta características particulares y su composición varía de acuerdo a la ubicación geográfica, como podemos observar en diversos trabajos de investigación el propóleo toma la designación de su origen geográfico. En el Perú podemos encontrar diferentes tipos de propóleo y su diversa vegetación se presta para el desarrollo de la apicultura. Es importante resaltar que en el 2004 se realizó un estudio en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) para estandarizar el propóleo del valle de Oxapampa, Departamento de Pasco - Perú, denominándolo Propóleo Peruano (López & Ubillus, 2004).
En un artículo de revisión de la literatura se plantea al propóleo peruano como una nueva alternativa terapéutica antimicrobiana en estomatología, concluyendo que independientemente de la zona geográfica de extracción del propóleo, éste presenta en su mayoría una acción antibacteriana debido a que las abejas protegen sus colmenas de las agresiones bacterianas (Mayta-Tovalino et al., 2014). Checalla y Sánchez-Tito (2021) evaluaron la actividad antibacteriana de un extracto etanólico de propóleo peruano frente a S. mutans mediante la prueba de difusión en disco, los resultados mostraron actividad antibacteriana significativa a las concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100% de EEP proveniente de la zona altoandina del sur del Perú; aunque los resultados fueron menores que los registrados para la clorhexidina al 0.12 %. Otros estudios donde se menciona al propóleo peruano son, por ejemplo, la investigación realizada por Millones (2021) en el
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cual evaluó el efecto antibacteriano de propóleos peruanos y acción de una fracción metanólica sobre un biofilm in vitro de S. gordonii y F. nucleatum, encontrándose que la muestra de propóleo de Oxapampa presentó efecto antibacteriano sobre ambas cepas estudiadas tanto en los extractos brutos, particiones clorofórmicas, butanólicos y fracción matenólica.
La composición química del extracto de propóleo, puede cambiar en base a la técnica de extracción y solvente (Xu et al., 2009). Es así que se realizó un estudio en Ecuador, donde se comparó la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos de propóleo proveniente de Tumbaco obtenidos por maceración y por metodología Soxhlet, frente a cepas de estudio E.coli ATTC 25922 y S.aureus ATCC 25923; donde se concluye que los extractos obtenidos por maceración presentaron mayor actividad antimicrobiana que los obtenidos por Soxhlet, el cual pudo deberse a que en éste último se somete a una temperatura de 70 a 80 °C comprometiendo así los metabolitos con posible actividad antimicrobiana. Además, la técnica de extracción del propóleo por maceración en frío utiliza equipos simples, una mínima energía es requerida para la separación básica, es económico y logra extraer los principios activos termolábiles (Vera & Vera, 2019).
Debido a que la actividad antibacteriana del propóleo peruano ha sido confirmada en diversas investigaciones; además, los resultados obtenidos serán de valiosa importancia para trabajos posteriores sobre la actividad del extracto etanólico de propóleo peruano, como un nuevo agente antimicrobiano o la posibilidad de establecer múltiples combinaciones sinérgicas condicionado por su riqueza en principios activos naturales; el objetivo de la investigación fue conocer el efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de S. pneumoniae, mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI).
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II. MATERIAL Y MÉTODO
2.1. OBJETO DE ESTUDIO
- Cepa de Streptococcus pneumoniae ATCC 6303.
- Propóleo peruano, recolectado de apiarios del sector Toledo de la provincia de Contumazá - Cajamarca y del bosque de Pómac de la provincia de Ferreñafe - Lambayeque, Perú.
Periodo de Tiempo: Durante los meses de Agosto a Setiembre del 2020.
2.2. INSTRUMENTACIÓN
Ficha de recolección de datos empleado durante la obtención del propóleo en los diferentes puntos de muestreo.
2.3. MÉTODOS Y TÉCNICAS
2.3.1. Recolección y transporte de muestras de propóleo
Se recolectaron 2 muestras de propóleo (Anexo 1), de forma aleatoria, a partir de 5 colmenas de Apis mellifera seleccionadas al azar en cada uno de los puntos de muestreo descritos en la Figura 1.
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Fuente:Google Earth-2021
Figura 1. Mapa de localización de los puntos de muestreo del propóleo peruano sobre el área de estudio.
Se siguió el método sugerido por Ayala y colaboradores, para lo cual se raspó las partes superiores de las colmenas, depositando el propóleo obtenido en frascos de vidrio estériles. Luego fueron colocados directamente en bolsas oscuras de polietileno y transportados conservando la cadena de frío y evitando la exposición a la luz. Durante todo el proceso se utilizó una ficha de recolección de información (Anexo 2).
2.3.2. Análisis organoléptico del propóleo
Cada muestra de propóleo fue fraccionada mecánicamente en trozos de 2 cm aproximadamente, luego se depositaron en un recipiente de vidrio y expuestos a 0
°C durante 12 horas. Posteriormente se trituraron en un mortero estéril y se mezclaron con espátula, la muestra se dividió en partes para la determinación de su
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estructura, aspecto, consistencia, color, olor y sabor; usando los descriptores establecidos en la literatura de propóleos de Sudamérica y otras partes del mundo contenidas en la Norma Rusa-1977 (Anexo 3) (Bracho et al., 1996; Maidana, 1999;
Ureña & Darrigo, 1999).
2.3.3. Obtención del extracto etanólico de propóleo
Se utilizó la metodología sugerida por Al-ani et al. (2018). Se mezcló 50 gramos de propóleo en 100 gramos de etanol absoluto y se maceró con agitación constante a temperatura ambiente durante 15 días. Luego el macerado se centrifugó a 5 000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se filtró con papel de filtro Macherey Nagel N° 4. Posteriormente, en una estufa se evaporó el etanol a 40 °C. El extracto de propóleo obtenido se conservó a 4 °C en oscuridad hasta su uso. Se diluyó en dimetilsulfóxido (DMSO) con una concentración final inferior al 1 % (Anexo 4).
2.3.4. Reactivación y estandarización del inóculo bacteriano
Se reactivó la cepa estándar de S. pneumoniae ATCC 6303 (Anexo 5) en los medios de cultivo Infusión Cerebro Corazón y Agar Soya Tripticasa a una temperatura de 37 °C y atmósfera microaerofílica. El inóculo bacteriano se obtuvo a partir de una suspensión directa de colonias incubado durante 16 horas y fue ajustado al tubo 0.5 estándar de turbidez McFarland (1.5 x 108 UFC ml -1).
2.3.5. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)
Se llevó a cabo mediante el método de dilución en caldo Mueller Hinton, bajo las recomendaciones de Clinical and Laboratories Standars Institute (Cavalier et al., 2005). Se preparó una solución stock de extracto etanólico de las muestras de propóleo a una concentración de 400 mg/ml diluido con dimetil sulfóxido (DMSO) al 1% y a partir del cual se realizaron diluciones al medio en una serie de 10 tubos conteniendo agua destilada estéril con un volumen de 1 ml en cada tubo.
Posteriormente, se agregó 1 ml de inóculo bacteriano previamente estandarizado a cada tubo de dilución de extracto etanólico de propóleo y al tuvo control de crecimiento. Se homogenizó la mezcla y esto produjo la dilución 1:2 obteniéndose las concentraciones de EEP: 200 mg/ml, 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5
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mg/ml, 6.25 mg/ml, 3.125 mg/ml, 1.56 mg/ml, 0.78 mg/ml y 0.39 mg/ml (Tabla 1).
Se incubó a 37°C por 18 horas en condiciones de microaerofilia. El valor de CMI se informó como la concentración más baja de propóleo que inhibió el crecimiento bacteriano (Anexo 6).
Tabla 1: Tratamientos sometidos a las muestras de propóleo procedentes de Ferreñafe y Contumazá.
Procedencia de la muestra
Código del Tratamiento
Concentración (mg/ml) del extracto etanólico de
propóleo peruano
Provincia de Ferreñafe - Lambayeque
T1 200
T2 100
T3 50
T4 25
T5 12.5
T6 6.25
T7 3.125
T8 1.56
T9 0.78
T10 0.39
Provincia de Contumazá - Cajamarca
T1 200
T2 100
T3 50
T4 25
T5 12.5
T6 6.25
T7 3.125
T8 1.56
T9 0.78
T10 0.39
2.3.6. Análisis estadístico
Los resultados fueron evaluados mediante la prueba estadística no paramétrica Q de Cochran, para comparar las diferentes concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de S. pneumoniae.
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III. RESULTADOS
A partir de muestras de propóleo peruano recolectadas de las colmenas de Apis mellifera de las provincias de Contumazá y Ferreñafe, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico del propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae.
En la tabla 2 se muestran las características organolépticas obtenidas a través del análisis sensorial del propóleo en las muestras recolectadas de las colmenas de Apis mellifera de las provincias de Contumazá y Ferreñafe respectivamente. Las muestras se presentaron en forma de trozos irregulares debido al método de recolección mediante raspado de las partes internas de la colmena. Las muestras exhibieron consistencia gomosa, predominó la tonalidad pardo grisáceo y pardo negruzco en las provincias de Contumazá y Ferreñafe, respectivamente. Respecto al aroma, las muestras procedentes de Contumazá presentan un aroma ligeramente mentolado y de Ferreñafe un aroma a melaza de caña, típico de propóleos con aceites esenciales. El sabor fue insípido en las muestras de Contumazá, predominando un moderado sabor amargo en las muestras de Ferreñafe, características que se relacionan con la presencia de resinas, fenoles y diversos flavonoides en el producto.
Las tablas 3 y 4, muestran el crecimiento de S. pneumoniae según las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Ferreñafe y Contumazá, respectivamente, y a su vez indican la CMI de cada muestra.
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Tabla 2. Características organolépticas de muestras de propóleo peruano recolectadas de apiarios ubicadas en las provincias de Contumazá y Ferreñafe, Perú.
Procedencia de la muestra
Características organolépticas Estructura -
Aspecto Consistencia Color Olor Sabor
Provincia de Contumazá - Cajamarca
Trozos irregulares (briquetas), masa heterogénea, opaco más zonas brillantes
Blando gomoso
Pardo grisáceo con tonalidades leves de caoba
Mezcla de olores de la miel con hierbas aromáticas
Ligeramente picante
Provincia de Ferreñafe - Lambayeque
Masa compacta, heterogénea, resinosa, opaco más zonas brillantes
Gomoso - pastoza y porciones duras
Pardo
negruzco con tonalidades leves de pardo ocre
Aroma a melaza de caña, resinoso
Amargo moderado, ligeramente picante
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Tabla 3. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae a diversas concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Ferreñafe, Lambayeque, Perú
Concentraciones (mg/ml) de extracto etanólico de
propóleo peruano
Crecimiento de Streptococcus
pneumoniae
200 -
100 -
50* -
25 +
12.5 +
6.25 +
3.125 +
1.56 +
0.78 +
0.39 +
*Concentración Mínima Inhibitoria (+) positivo, (-) negativo
p<0.05
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Tabla 4. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae a diversas concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Contumazá, Cajamarca, Perú
Concentraciones (mg/ml) de extracto etanólico de
propóleo peruano
Crecimiento de Streptococcus
pneumoniae
200 -
100 -
50 -
25* -
12.5 +
6.25 +
3.125 +
1.56 +
0.78 +
0.39 +
*Concentración Mínima Inhibitoria (+) positivo, (-) negativo
p<0.05
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IV. DISCUSIÓN
La determinación de las propiedades organolépticas de las muestras de propóleo constituye una parte importante de un conjunto de estudios de control de calidad requeridos para este producto por las normas internacionales. Las características organolépticas descritas en la Tabla 2 coincide con el estudio de estandarización del propóleo peruano realizado por López y Ubillus (2004), donde se observa la consistencia gomosa o dura a menos de 20°C, el color que varía entre las tonalidades pardo grisáceo y pardo negruzco; así como el sabor ligeramente picante, amargo moderado y el olor característico a hierbas aromáticas obtenidas en las muestras de propóleo como valores aceptados por la NORMA RUSA RST – RSFR – 317 – 1977 (Anexo 3). Este análisis de la determinación del color, olor y sabor están directamente relacionados con la flora dominante de la zona de recolección, en el caso de Contumazá la flora más abundante es el Eucalyptus (eucalipto) y en Ferreñafe es Prosopis pallida (algarrobo).
Concerniente a la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), el rango de CMI alcanzado entre 25 mg/ml y 50 mg/ml, para las muestras de propóleo provenientes de Contumazá y Ferreñafe, respectivamente; concuerdan con los datos de Focht et al.
(1993) que reportan concentraciones bactericidas que oscilan desde 6.25 a 100 mg/ml contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. Sin embargo, los valores de CMI obtenidos en el presente estudio difieren de otros autores, como Al-ani et al. (2018) quienes evaluaron la actividad biológica del propóleo recolectado de diferentes zonas geográficas (Alemania, Irlanda y República Checa), en el cual se muestra un efecto antibacteriano sobre Streptococcus pneumoniae con un CMI de 0.08 mg/ml para las muestras procedentes de República Checa e Irlanda y 0.3 mg/ml para la muestra procedente de Alemania; dicha actividad está relacionado con el contenido total de fenoles y flavonoides. En otro estudio, donde se evaluó la actividad antimicrobiana del propóleo en cepas aisladas del tracto respiratorio, entre ellas S. pneumoniae se logró obtener un valor de CMI de 0.5 mg/mL, cuyo valor también fue bactericida (Drago et al., 2000). Asimismo, se reporta datos de CMI muy bajos para S. pneumoniae de los extractos etanólicos de propóleos búlgaro y brasileño, 25.6 ug/ml y 819.2 ug/ml, respectivamente; es posible asociar dicha actividad con el alto contenido de flavonoides, que es la principal diferencia entre los dos extractos (Salomão et al., 2004). Por lo tanto, se puede confirmar el amplio espectro de bioactividades de los extractos etanólicos de propóleos, cuyos constituyentes mayoritarios son los polifenoles y flavonoides; pero se cree que la actividad sinérgica entre
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estos diversos ingredientes activos es un factor principal para lograr la compleja actividad antimicrobiana del propóleo.
Realizando la comparación del valor de CMI obtenido para las muestras de propóleo provenientes de Contumazá y Ferreñafe, 25 mg/ml y 50 mg/ml, respectivamente; se observa una mejor actividad en la muestra proveniente de la provincia de Contumazá (zona sierra) con un valor de CMI más bajo. Esto se debe a que, la composición química del propóleo depende de su origen geográfico, fuente vegetal, la especie de abeja y la estación (Ristivojević et al., 2015). La fuente vegetal más abundante en dicha zona es el Eucalyptus, en una revisión sobre su composición química se detalla un alto porcentaje de 1,8-cineol o eucaliptol (70 - 85%), taninos, flavonoides, ácidos fenólicos, entre otros; responsables de la actividad antibacteriana en donde S. pneumoniae fue una de las bacterias más sensibles (Carretero & Ortega, 2018). Entre tanto, la fuente vegetal dominante en la zona costa (Ferreñafe) es P. pallida (algarrobo), cuyos principios activos están constituidos por alcaloides, esteroides, aminoácidos no proteicos, fenoles, flavonoides, quinonas, cumarinas, taninos y terpenoides; los cuales han demostrado tener efecto inhibitorio y bactericida sobre Enterococcus faecalis (Alvarado, 2017).
Pereira et al. (2008) investigaron la correlación entre la composición química y actividad antimicrobiana del propóleo brasileño, encontrando un rango de CMI de 0,2 a 0,8 μg ml-1 para S. pneumoniae, mediante una asociación positiva de la actividad biológica con derivados de p -ácido cumárico y de ácidos cafeoliquínicos. Posiblemente los resultados de CMI altos que se obtuvieron en las muestras de propóleo provenientes de Contumazá y Ferreñafe, se debe a una baja concentración de los derivados de p -ácido cumárico y de ácidos cafeoliquínicos que disminuyó la actividad biológica del propóleo. Dicha proposición se ajusta con otro estudio, en que se evaluó la actividad antibacteriana de algunos principios activos del propóleo de forma aislada, obteniéndose una actividad notable del componente éster feniletílico del ácido cafeico (CAPE) con un rango de MIC 32-128 mg / L contra S. pneumoniae en comparación con galangina, pinocembrina (rango de CMI 128-512 mg / L para ambos) y crisina (intervalo de CMI 256-1024 mg / L) (Speciale et al., 2006). Por lo que, es probable que las muestras de propóleo utilizadas en esta investigación contengan un bajo porcentaje de los principios activos mencionados anteriormente.
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Según el p-valor de significancia asociado a la prueba no paramétrica Q de Cochran fue menor que 0.05 (p=6.55e-07<0.05), rechazando la hipótesis de igualdad de proporciones de los tratamientos, concluyendo que las proporciones de crecimiento de la bacteria S.
pneumoniae entre los tratamientos presentó diferencia significativa, así mismo, tomando como referencia a las tablas 3 y 4, se muestra que los tratamientos que presentaron el mayor porcentaje del total de repeticiones en el experimento, donde no se evidenció el crecimiento de la bacteria, para la muestra procedente de Ferreñafe fueron las concentraciones experimentales de 200, 100 y 50 mg/ml y para la muestra procedente de Contumazá fueron las concentraciones experimentales de 200, 100, 50 y 25 mg/ml.
El extracto etanólico de propóleo peruano demostró tener un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae, por tanto, los mecanismos para la actividad bactericida permite inferir su efecto sobre la permeabilidad de la membrana celular de los microorganismos, interrupción del potencial de membrana y la producción de adenosina trifosfato (ATP), así como inhibición de síntesis de proteínas (Mirzoeva et al., 1997). Este resultado muestra la posibilidad de utilizar preparados naturales, por sus propiedades antimicrobianas y antiinflamatorias, para potenciar terapia antibacteriana.
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V. CONCLUSIONES
El extracto etanólico de propóleo peruano tuvo efecto in vitro sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae, encontrándose que la concentración mínima inhibitoria (CMI) del propóleo procedente de la provincia de Contumazá - Cajamarca es 25 mg/ml, y del propóleo procedente de la provincia de Ferreñafe - Lambayeque es 50 mg/ml.
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VI. RECOMENDACIONES
Aunque podemos confirmar los resultados de esta investigación y de otros autores en actividad antimicrobiana del propóleo peruano sobre agentes patógenos del tracto respiratorio como S. pneumoniae, todavía estamos distantes de concretar su uso como tratamiento. Es necesario ensayos clínicos controlados para definir su eficacia real, y se deben realizar más estudios in vitro para aclarar los mecanismos de acción del propóleo.
Además, se recomienda, realizar estudios para determinar las Concentraciones Mínimas Bactericidas (CMB) del extracto etanólico de propóleo peruano, conocer la composición química del extracto etanólico de propóleo peruano y las propiedades sinérgicas con antibióticos, así como también realizar estudios con extracto de propóleo peruano de diversas regiones del Perú y comparar la actividad antibacteriana entre ellos.
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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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ANEXOS
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Anexo 1. Recolección de las muestras de propóleo, mediante el raspado de las partes superiores de las colmenas
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Anexo 2. Ficha de recolección de datos con los parámetros ambientales y de las colmenas durante el proceso de muestreo del propóleo
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Anexo 3. NORMA RUSA RST – RSFR – 317 – 1977
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Anexo 4. Extracto etanólico de propóleo peruano concentrado.
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Anexo 5. Cepa liofilizada de Streptococcus pneumoniae ATCC 6303
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Anexo 6. Concentraciones de extracto etanólico de propóleo peruano para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) sobre el crecimiento de S. pneumoniae.
200 mg /ml 100
25 50 12.5 6.25
3.12 1.56
0.78 0.39
Concentraciones (mg/ml)
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Anexo 7. Distribución porcentual del total de ensayos: “Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”, según tratamiento y estado de crecimiento de la bacteria. Muestra procedente de Ferreñafe.
Tratamiento
Estado de crecimiento de la bacteria Con
crecimiento % Sin
crecimiento % Total de
ensayos %
T1 0 0.0% 4 100.0% 4 100.0%
T2 0 0.0% 4 100.0% 4 100.0%
T3 0 0.0% 4 100.0% 4 100.0%
T4 1 25.0% 3 75.0% 4 100.0%
T5 3 75.0% 1 25.0% 4 100.0%
T6 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
T7 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
T8 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
T9 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
T10 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
Elaboración propia con los resultados obtenidos el software libre RStudio
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Anexo 8. Distribución porcentual del total de ensayos: “Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”, según tratamiento y estado de crecimiento de la bacteria. Muestra procedente de Contumazá.
Tratamiento
Estado de crecimiento de la bacteria Con
crecimiento % Sin
crecimiento % Total de
ensayos %
T1 0 0.0% 4 100.0% 4 100.0%
T2 0 0.0% 4 100.0% 4 100.0%
T3 0 0.0% 4 100.0% 4 100.0%
T4 0 0.0% 4 100.0% 4 100.0%
T5 1 25.0% 3 75.0% 4 100.0%
T6 3 75.0% 1 25.0% 4 100.0%
T7 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
T8 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
T9 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
T10 4 100.0% 0 0.0% 4 100.0%
Elaboración propia con los resultados obtenidos el software libre RStudio
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Anexo 9. Prueba Estadística Q de Cochran del efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”
Q = 64.8122
Degrees of Freedom = 19 Significance Level = 0.05 The p-value is 6.55e-07
Elaboración propia con los resultados obtenidos el software libre RStudio
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Anexo 10. Prueba Posthoc de Mcnemar, en la comparación de tratamientos del estudio sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae según las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Ferreñafe, Lambayeque, Perú.
1° Grupo 2° Grupo 3° Grupo 4° Grupo
T1: 200 mg/ml T2: 100 mg/ml T3: 50 mg/ml
T4: 25 mg/ml
T5: 12.5 mg/ml
T6: 6.25 mg/ml T7: 3.125 mg/ml
T8: 1.56 mg/ml T9: 0.78 mg/ml T10: 0.39 mg/ml
Nota: Elaboración propia con los resultados obtenidos el software libre RStudio
*Los tratamientos que se encuentran en el mismo grupo, no presentan una diferencia significativa al 95% de confianza
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Anexo 11. Prueba Posthoc de Mcnemar, en la comparación de tratamientos del estudio sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae según las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Contumazá, Cajamarca, Perú.
1° Grupo 2° Grupo 3° Grupo 4° Grupo
T1: 200 mg/ml T2: 100 mg/ml T3: 50 mg/ml T4: 25 mg/ml
T5: 12.5 mg/ml
T6: 6.25 mg/ml
T7: 3.125 mg/ml T8: 1.56 mg/ml T9: 0.78 mg/ml
T10: 0.39 mg/ml
Nota: Elaboración propia con los resultados obtenidos el software libre RStudio
*Los tratamientos que se encuentran en el mismo grupo, no presentan una diferencia significativa al 95% de confianza
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Anexo 12. Número de ensayos con crecimiento de Streptococcus pneumoniae según las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de Ferreñafe, Lambayeque, Perú
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Anexo 13. Número de ensayos con crecimiento de Streptococcus pneumoniae según las concentraciones del extracto etanólico de propóleo peruano procedente de
Contumazá, Cajamarca, Perú.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO DECLARACIÓN JURADA
Los autores suscritos en el presente documento DECLARAMOS BAJO JURAMENTO que somos los autores responsables legales de la calidad y originalidad del contenido del proyecto de investigación científica, así como, del informe de la investigación científica realizado.
TITULO: “Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA INFORME DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA PROYECTO DE INVESTIGACIÓN ( ) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN (PREGRADO) ( ) PREGRADO
PROYECTO DE TESIS PREGRADO ( ) TESIS PREGRADO ( )
PROYECTO DE TESIS MAESTRIA ( ) TESIS MAESTRÍA (
x
)PROYECTO DE TESIS DOCTORADO ( ) TESIS DOCTORADO ( )
El equipo investigador integrado por:
N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD
CONDICIÓN (NOMBRADO, CONTRATADO, MERITO, estudiante,
OTROS)
CÓDIGO docente Número de matrícula
del estudiante
Autor coautor
asesor
1 Alva Castillo Glenda Noheli Posgrado Estudiante 820109419 Autora
2 Zavaleta Verde Edgar David Posgrado Docente 6223 Asesor
………
FIRMA DNI 45917043
………
FIRMA DNI 43506585
Código ORCID (ASESOR): https://orcid.org/0000-0003-0382-8420
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CARTA DE AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN EN REPOSITORIO DIGITAL RENATI – SUNEDU
Trujillo, 31de Marzo de 2022 Los autores suscritos del INFORME DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA
Titulado: “Efecto in vitro del extracto etanólico de propóleo peruano sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae”
AUTORIZAMOS SU PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO DIGITAL INTITUCIONAL, REPOSITORIO RENATI – SUNEDU, ALICIA-CONCYTEC, CON EL SIGUIENTE TIPO DE ACCESO:
A. Acceso abierto:
B. Acceso restringido (datos del autor y resumen del trabajo) C. No autorizo su publicación
Si eligió la opción restringido o No autoriza su publicación sírvase justificar
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ESTUDIANTE DE PREGRADO: TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TESIS
ESTUDIANTE DE POSGRADO: TESIS MAESTRIA TESIS DOCTORAL
DOCENTE: INFORME DE INVESTIGACIÓN OTROS
El equipo investigador integrado por:
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OTROS)
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Autor coautor
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1 Alva Castillo Glenda Noheli Posgrado Estudiante 820109419 Autora
2 Zavaleta Verde Edgar David Posgrado Docente 6223 Asesor
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FIRMA DNI: 45917043
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