Imagen elaborada por Mario Villagran
Claudy L. Villagrán Padilla
Alejandro C. Ruiz Tagle
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Una mirada hacia el mundo bacteriano
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Una mirada hacia el mundo bacteriano
Realizado en
Puebla, Pue. México.
Otoño 2019
Una mirada hacia el mundo bacteriano
Editores del Libro
M.S.P. Claudy Lorena Villagrán Padilla M.C. Alejandro César Ruiz Tagle
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Químicas
México 2019
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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Mtro. José Alfonso Esparza Ortíz Rector
Dr. José Jaime Vázquez López Secretario General
M.C.E. María del Carmen Martínez Reyes Vicerrectora de Docencia
Mtro. José Carlos Bernal Suárez
Vicerrector de Extensión y difusión de la cultura Dr. Ygnacio Martínez Laguna
Vicerrector de Investigación y Estudios de Posgrado Mtro. HugoVargas Comsille
Director General de Publicaciones Dr. Jorge Raúl Cerna Cortez
Director de la Facultad de Ciencias Químicas Primera Edición: 2019
ISBN: 978-607-525-629-0
DR © Benemérita Universidad Autónoma de Puebla 4 Sur 104, Col. Centro
Puebla, Pue., CP. 7200 Tel/Fax: 01 222 246 85 59
Dirección General de Publicaciones
2 norte 1404, Col. Centro Histórico, Puebla, Pue. CP 72000
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Diseño de la imagen de la portada: Mario Villagrán Revisor: DC Gerardo Santos López
Hecho en México Made in Mexico
AGRADECIMIENTOS
A Scarlette Lizeth Recio Cázares y Enrique Roberto Águila Ordoñez por su apoyo incondicional para la elaboración de este libro.
A los autores de cada uno de los capítulos que integran este ejemplar, ya que contribuyeron con sus valiosas aportaciones en el área de Bacteriología para los lectores de este libro.
A D.C. Gerardo Santos López por los conocimientos, experiencia y tiempo invertido para la revisión de este libro.
A Mario Villagrán Padilla por la elaboración del diseño de la portada.
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Prólogo
Los docentes del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas siempre han mostrado un gran interés por facilitar y enriquecer el aprendizaje de todos los alumnos que desean formarse en la parte médica de la Bacteriología. El aprendizaje siempre ha necesitado de la presencia de un objeto de conocimiento y un sujeto dispuesto a conocerlo, motivado y que participe activamente. El conocimiento se adquiere a través de distintas estrategias y una de ellas es el haber elaborado este libro con una información actual, sencilla y muy completa de algunas de las bacterias de interés médico. Queremos contribuir a este aprendizaje, guiando a los alumnos y dándoles una herramienta para que adquieran un nuevo conocimiento y puedan posteriormente integrarlo con otros conocimientos y logren un aprendizaje significativo.
Este aprendizaje puede ser utilizado en la resolución de problemas.
Los docentes del Departamento de Microbiología pretendemos empoderar a los estudiantes con habilidades y conocimientos del maravilloso campo de la Bacteriología.
Se pretende generar individuos preparados para el futuro, ofreciéndoles un apoyo oportuno en función a sus necesidades individuales de aprendizaje. Nuestro objetivo es lograr aprendices curiosos sobre sí mismos y del mundo.
Claudy Villagrán
Indice
Introducción 10
Acinetobacter
Juan Carlos Benítez Serrano Laura Martínez Pérez Carolina Zamora Martínez
11
Bacillus
Estibaliz Sansinenea Royano Jessica Vaca
30
Brucella
Nidia Gary Pazos-Salazar Erik Eliseo Martínez Farías
45
Campylobacter
María Elena Hernández Ramos Fausto Tejeda Trujillo
63
Corynebacterium
María de la Cruz Meneses Sánchez Ana Marta de los Angeles Lobo Sánchez
81
Escherichia coli
Edith Díaz Cabrera Alma Cuellar-Sánchez
92
Escherichia coli Enterohemorrágica (EHEC)
Gloria León Tello
Verónica Miroslava Martínez Ortiz
123
Haemphillus
Patricia G. Suárez Claudy L. Villagrán
137
Helicobacter
Scarlette Lizeth Recio Cázares Claudy Lorena Villagrán Padilla Alejandro César Ruiz Tagle
146
Listeria
María de la Cruz Meneses Sánchez Gloria León Tello
161
Neisseria
Claudy Lorena Villagrán Padilla Patricia Guadalupe Suárez Albores Ariana Carrillo Mendoza
185
- 9 - Nocardia
María de la Cruz Meneses Sánchez Ana Bertha Escobedo López
206
Pasteurella
Patricia G. Suárez Astrid R. Villagrán
216
Pseudomonas
Laura Martínez Pérez Juan Carlos Benítez Serrano Jesus Aldair Salinas Memije
222
Salmonella
Reyna del Consuelo Almiray Pinzón de Dios José Antonio Ticante Roldan
239
Vibrio
Fausto Tejeda Trujillo
María Elena Hernández Ramos
249
Yersinia
Alejandro C. Ruiz Tagle
Claudy Lorena Villagrán Padilla
265
Estrategias de sobrevivencia bacteriana al ambiente
Ramón Gudiño-Fernández Geolar Fetter
Lidia Meléndez-Balbuena Marta Lobo-Sánchez
275
Mecanismos de resistencia antimicrobiana en gramnegativos
Alma López García Alejandro C. Ruiz Tagle
300
Relación hospedero-parásito
Ana Bertha Escobedo López María de la Cruz Meneses Sánchez Patricia Guadalupe Suárez Albores
318
Seguridad biológica en el laboratorio
Carlos Cabrera Maldonado Marcos Flores Encarnación
335
Directorio de Autores 353
Introducción
La bacteriología es la ciencia que comprende el estudio de las bacterias como agentes causales de infecciones en el humano y animales. Es muy cierto que las bacterias como parte del ambiente son muy importantes para la salud humana, existen muchos ejemplos de cómo las bacterias directa o indirectamente son benéficas para el humano y así, sus diversas aplicaciones son estudiadas en otras disciplinas.
En este texto se abordan algunos géneros bacterianos que frecuentemente se asocian a enfermedades infecciosas. En los diversos capítulos se hace referencia a los métodos de identificación y el diagnóstico del agente etiológico en el laboratorio, a los mecanismos de patogenicidad por los cuales la bacteria interacciona con el hospedero, al tratamiento antimicrobiano y a los mecanismos de resistencia contra los mismos.
Toda esta información reunida en un texto cumple con el propósito fundamental de proporcionar un panorama general del curso de bacteriología y las bases para que los estudiantes de la licenciatura en Químico Farmacobiólogo comprendan las características de los diversos agentes bacterianos que con mayor frecuencia son responsables de infecciones humanas.
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Acinetobacter
Juan Carlos Benítez Serrano1 Laura Martínez Pérez1 Carolina Zamora Martínez1
(1) Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Químicas, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
En: “Una mirada hacia el mundo bacteriano”. Villagrán Padilla Claudy Lorena y Ruiz Tagle Alejandro César. (Eds.) 2019 Publicación de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México. pp. 11-29. ISBN 978-607-525-629-0
Acinetobacter
Juan Carlos Benítez Serrano Laura Martínez Pérez
Carolina Zamora Martínez
Taxonomía y clasificación
La taxonomía del género Acinetobacter ha sido amplia, compleja y cambiante a lo largo del tiempo, las especies que ahora son clasificadas como miembros de este género han sufrido una larga historia de cambios taxonómicos.
No se tienen datos precisos sobre cuándo ocurrió el primer aislamiento de Acinetobacter, pero se sabe que algunas de sus especies fueron reconocidas con otros nombres durante ciertos años de la historia. En 1911 Beijerinck propuso el nombre de Micrococcus calcoaceticus y en la década de los 40, por ejemplo, Acinetobacter lwoffii fue referenciada como Mima polymorphia y Acinetobacter baumannii como Herellea vaginicola [Wong et al., 2017]. En 1954 Brisou y Prévost designaron a este género como Acinetobacter, el cual incluía bacilos gramnegativos que pueden parecer cocoides, inmóviles, catalasa positiva, oxidasa negativa, que se distinguían de otras bacterias por su falta de pigmentación [Nodarse y Fuente, 2015].
En la actualidad, el género Acinetobacter se ubica taxonómicamente como una - Proteobacteria, de la familia Moraxellaceae y del Orden Pseudomonadales e incluye al menos 30 genoespecies distintas, de las cuales, sólo 18 han podido ser nombradas, pero existen aislamientos que aún no se han incluido en ninguna de las especies identificadas, por lo que es posible suponer la descripción de nuevas genoespecies en
un corto plazo [Muhammad et al., 2018;
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=469].
- 13 - Taxonomía
Dominio: Bacteria
Phyllum: Proteobacteria Clase: -Proteobacteria Orden: Pseudomonadales Familia: Moracellaceae Género: Acinetobacter
Generalidades
Entre las características generales que presenta este género podemos encontrar que comprende a bacilos gramnegativos pleomórficos, que pueden llegar a confundir al observador, ya que cuando se observan al microscopio, después de la tinción de Gram, se asemejan a formas cocoides dispuestas en pares, que oscilan entre un tamaño de 1 y 1.5 µm (Fig. 1), negativos a la prueba de oxidasa (en su mayoría), positivos a la prueba de catalasa, aerobios estrictos que no presentan pigmentos en su morfología macroscópica, además de entrar en el grupo de las bacterias no fermentadoras de glucosa (Fig. 2), no son microorganismos nutricionalmente exigente y crecen bien en los medios de cultivo de rutina como agar nutritivo, MacConkey, sangre de carnero y chocolate, además se sabe que puede usar una gran variedad de fuentes de carbono por diversas vías metabólicas [Wong et al., 2017].
Figura 1. Tinción de Gram de Acinetobacter baumannii a 100X y bajo aceite de inmersión. Se observan cocobacilos Gramnegativos agrupados en parejas.
Figura 2. Prueba de OF de una cepa de Acinetobacter baumannii. En la figura se puede observar el metabolismo oxidativo que presenta esta bacteria en el tubo abierto
(lado B).
El género Acinetobacter tiene la característica de ser complejo para su diferenciación de otros géneros bacterianos, ya que a menudo resiste a la decoloración completa en la tinción de Gram y puede ser engañosa y confundirse con cocos grampositivos [Allen y Hartman, 2005], la diferenciación puede ser aún más difícil entre ciertas especies.
En su morfología colonial (Fig. 3) normalmente son colonias lisas y su tamaño es comparable con el de las enterobacterias (0.5-3.0 mm de diámetro), son convexas, de bordes enteros, blanco grisáceas o amarillo pálido y mucosas brillantes (Fig. 3A).
Muchas cepas crecen bien en agar MacConkey y producen colonias rosa pálido (Fig.
3B); A. haemolyticus se caracteriza por exhibir colonias hemolíticas en placas de agar sangre de carnero a diferencia de otras especies que no generan hemólisis (Figura 3C).
La temperatura óptima de crecimiento oscila entre 33-35ºC, aunque A. baumannii es la única bacteria de este género que puede crecer a 44ºC.
A B
- 15 - Figura 3. Morfología colonial de Acinetobacter baumannii en diferentes medios de cultivo. 2A: Aislamiento de A. baumannii en agar soya tripticaseína. 2B. Aislamiento de
A. baumannii en agar MacConkey. 2C: Aislamiento de A. baumannii en agar sangre de carnero.
Epidemiología
A pesar de que se han identificado muchas especies de Acinetobacter solo algunas se han asociado a infecciones. Las más frecuentes son A. baumannii, A. calcoaceticus y A.
lwoffii, seguidas de otras especies que son reportadas ocasionalmente como patógenas tales como A. pittii, A.schindleri y A. ursingii [Wong et al., 2017].
El complejo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus (ABC) está conformado por cuatro especies indiferenciables por métodos fenotípicos, las cuales son: A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis (asociadas a infecciones intrahospitalarias) y A. calcoaceticus (presente en la naturaleza y como parte de la microbiota humana [Kamolvit et al., 2013].
Los tipos de infecciones que puede causar son usualmente intrahospitalarias como: neumonías, bacteriemia asociada a catéter, infecciones de vías urinarias y de tejidos blandos. Sin embargo, las infecciones de la comunidad cada vez son más frecuentes, debido, entre otras cosas, a que se trata de un microorganismo resistente a la desecación y a que es capaz de evadir la respuesta inmune [Wong et al., 2017].
Desgraciadamente, debido a una diversidad de factores, las cepas pertenecientes a este género bacteriano se muestran cada vez más resistentes a los tratamientos antibióticos, por lo que es necesario que se inicie de manera rápida una terapia efectiva para cada caso [Wong et al., 2017].
Diversos estudios en modelos animales y análisis de datos clínicos han demostrado que la especie más virulenta es A. baumannii, que es además la más frecuentemente aislada de infecciones en humanos [Chusri et al., 2014]. Esta bacteria ha sido recuperada de la cama de pacientes infectados hasta nueve días después de haber abandonado el hospital, lo que demuestra la capacidad que tiene para sobrevivir largo tiempo en superficies inanimadas [Catalano et al. 1999].
Por lo general, Acinetobacter spp. es aislada de ambientes húmedos tales como:
pantanos, estanques, aguas residuales, plantas de tratamiento de agua e incluso del mar, lo curioso es que incluso estas cepas ambientales presentan diversos mecanismos de resistencia a los antibióticos, tales como enzimas carbapenemasas y β-lactamasas de espectro extendido [Al Atrouni et al., 2016]. Algunas especies de interés clínico se han aislado también de vegetales, carne, productos lácteos, piel humana (sobre todo Acinetobacter spp. no baumanni) y varios tipos de ganado, lo que sugiere diversas vías de transmisión [Berlau et al., 1999; Zhang et al., 2013; Lupo et al., 2014, Al Atrouni et al., 2016].
En un inicio se consideró a Acinetobacter como un comensal oportunista, sin embargo, las infecciones intrahospitalarias (especialmente en las unidades de cuidados intensivos) por esta bacteria se han diseminado rápidamente en todo el mundo, de forma tal que hasta 2010 era la responsable del 1.8% de todas las infecciones asociadas a los cuidados de la salud [Sievert et al., 2013] aproximadamente un millón de casos por año a nivel mundial [Spellberg y Rex, 2013]
Las vías de transmisión reportadas para Acinetobacter incluyen: contacto con superficies contaminadas, a través de las manos de los cuidadores de salud, aerosoles [Spellberg y Bonomo, 2013] o por ruptura de barreras anatómicas (por ejemplo, catéteres, tubos endotraqueales, procedimientos quirúrgicos, quemaduras o traumas) así como por el uso prolongado de antibióticos de amplio espectro (por la alteración de la microbiota habitual).
Al encontrarse en sitios húmedos se ha asociado su presencia a climas cálidos y tropicales, o a épocas cálidas del año, causando por ejemplo neumonías, bacteriemias, meningitis, endocarditis y osteomielitis [McConnell et al., 2013].
- 17 - Mecanismos de patogenicidad
El género Acinetobacter es considerado como un agente de baja patogenicidad, sin embargo, ciertas características le permiten aumentar la virulencia en cepas involucradas en infecciones. En personas inmunocompetentes los microorganismos de Acinetobacter desempeñan un papel muy limitado en el desarrollo de infección humana.
La mayoría de los pacientes infectados por A. baumannii no presentan deficiencias en la cantidad o funcionalidad de los leucocitos [Guan et al., 2016]. Sin embargo, en personas inmunocomprometidas tiene la capacidad de producir infecciones supurativas en casi cualquier sistema del organismo [Rada, 2016].
Factores de virulencia
Al ser A. baumannii la especie más virulenta para el ser humano, se hará énfasis en los factores de virulencia que ésta presenta.
Aunque etimológicamente Acinetobacter viene del griego a-kineto que significa
“sin movimiento” (Fig. 4) muchas cepas que corresponden al género son móviles, siendo esta movilidad uno de los factores de virulencia hipotéticos del género. Como ya se mencionó, Acinetobacter es resistente a la desecación y a la desinfección. La presencia de etanol en los cultivos mejora su crecimiento, además se le considera un microorganismo tolerante a la sal [Smith et al., 2004]. La enzima bacteriana RecA media la reparación del ADN y la resistencia a la desecación, además de que previene la muerte de la bacteria dentro de los macrófagos [Aranda et al., 2011].
Figura 4. Prueba de movilidad de A. baumannii. En la figura se puede observar la falta de movilidad en medio SIM
No obstante son muchos los factores de virulencia que se han propuesto para esta bacteria, tales como aquellos involucrados en la formación de biopelícula, mecanismos de adherencia, adquisición de hierro, la actividad de los polisacáridos de membrana y de las proteínas de membrana externa, la alteración de las proteínas de unión a penicilina, las vesículas de la membrana externa y las fosfolipasas.
Uno de los factores de virulencia más importantes es la proteína de membrana externa A (OmpA) a la que se han asociado múltiples funciones, tales como: adhesión a las células epiteliales del tracto respiratorio del hospedero, la producción de biopelícula y la resistencia al complemento. Esta proteína además induce la expresión de la molécula proapoptótica citocromo C, lo que resulta en la muerte celular [Schweppe et al., 2015].
La secreción de vesículas de membrana externa que contienen diferentes proteínas relacionadas con la virulencia (proteasas, fosfolipasas, superóxido dismutasa y catalasa) en el sitio de la infección acelera la respuesta inmune innata local y en última instancia, conduce al daño tisular, además la secreción de vesículas de membrana externa favorece la formación de biopelículas en superficies abióticas [Nho et al., 2015].
Por otro lado, se ha observado que la sobreexpresión de bombas de expulsión codificadas cromosómicamente incrementa la multidrogorresistencia a los agentes antimicrobianos [Bonomo y Szabo, 2006].
La cápsula de polisacárido y su carga superficial negativa es uno de los factores de virulencia más importantes dado que sirve a la bacteria para evadir la fagocitosis [Russo et al., 2010]. Por su parte el lipopolisacárido (endotoxina) es otro factor de virulencia significativo, ya que actúa como agente quimiotáctico que recluta las células inflamatorias y las obliga a liberar su material citotóxico.
A. baumannii posee la proteína AmpC, que es una cefalosporinasa no inducible denominada ADC, que constituye el principal mecanismo de resistencia a los β- lactámicos en esta bacteria, en especial a ampicilina [Vila y Marco, 2010]. Se calcula que alrededor del 50% de las cepas de A. baumannii presentan hiperproducción de ADC, lo que le confiere resistencia a cefalotina, piperacilina, cefotaxima, ceftazidima y
- 19 - aztreonam; algunas de estas ADC tienen un espectro extendido, siendo activas contra cefepime.
Acinetobacter es uno de los microorganismos más resistentes que se encuentran en el ambiente clínico. Esta resistencia está dada, en general, por el bajo número y tamaño de las porinas de su membrana externa, lo que le da baja permeabilidad a los antibióticos, incluso mucho más baja que otros organismos gramnegativos [Vila y Marco, 2010]. Además, posee una isla masiva de resistencia constituida por 45 genes, aunado a su capacidad para adquirir rápidamente genes de otras especies y su capacidad de desarrollar resistencia a los antibióticos durante el tratamiento [Blackwell et al., 2016].
En muchos casos el uso de carbapenémicos ha dejado de ser una opción terapéutica debido a la expresión de diversos mecanismos de resistencia tales como la producción de oxacilinasas (OXA) y la ausencia de proteínas de unión a penicilina 2 (PBP2). Las oxacilinasas más frecuentemente halladas son OXA-23, OXA-24, OXA-40, OXA-51 (la cual le da resistencia intrínseca contra penicilinas y carbapenémicos), OXA- 58 y OXA-143, detectadas sobre todo en Estados Unidos, Latinoamérica, Europa y Asia [Adams-Haduch et al., 2011; Kamolvit et al., 2015; Labarca et al., 2016]. Acinetobacter también posee β-lactamasas de la clase B, llamadas metalo-β-lactamasas tales como IMP, VIM, SIM y NDM [Perez et al. 2007]. Otras proteínas que participan en la resistencia a los carbapenémicos son CarO y OprD [Siroy et al., 2005; Dupont et al., 2005].
La resistencia mediada por transposones incluye β-lactámicos, tetraciclinas, aminoglucósidos y sulfonamidas. Estos mismos transposones le dan la capacidad a la bacteria de mostrar resistencia a la mitad del tratamiento [Wong et al., 2017] .
Manifestaciones clínicas
En los pacientes susceptibles, especialmente en pacientes de cuidados intensivos con enfermedades subyacentes severas, las especies de Acinetobacter son capaces de causar un amplio rango de infecciones, que incluyen: septicemias, neumonías, meningitis, endocarditis, infecciones de heridas, e infecciones del tracto urinario. Estas infecciones oportunistas ocurren especialmente durante brotes epidémicos
nosocomiales y son causadas principalmente por cepas pertenecientes al complejo ABC.
Diagnóstico
La carencia de métodos fenotípicos estandarizados para su identificación es una limitante en el diagnóstico oportuno, sin embargo, puede ser útil para diferenciar entre algunas especies (Tabla 1) [Neetu et al., 2015].
Tabla 1. Características fenotípicas de especies de Acinetobacter Nombre de la prueba Especies de Acinetobacter
Complejo ABC
A.
lwoffii A.
haemolyticus A.
junii A.
radioresistens Tinción de Gram Cocos o cocobacilos gramnegativos
Catalasa + + + + +
Oxidasa - - - - -
Movilidad - - - - -
Ureasa V V - - -
Citrato + - + + -
OF Glucosa + - V - -
Prueba de reducción de nitratos
- - - - -
Hemólisis - - + - -
Hidrólisis de gelatina - - + - -
Crecimiento a 42ºC + - - - -
Sensibilidad a cloranfenicol
R S R R R
Hidrolisis de la arginina
+ - + + +
V: Variable, S: Sensible, R: Resistente, A. lwoffii: Acinetobacter lwoffii, ABC:
Acinetobacter baumannii-calcoaceticus, A. haemolyticus: Acinetobacter haemolyticus, A. junii: Acinetobacter junii, A. radioresistens: Acinetobacter radioresistens, OF:
Oxidación-Fermentación. Traducida de Neetu et al. 2015.
- 21 - Las limitaciones de las pruebas fenotípicas tradicionales y de la utilización de métodos semiautomatizados como API 20NE, Vitek 2, Phoenix y MicroScan WalkAway para la diferenciación de las especies pertenecientes al ABC, ha llevado a la implementación de pruebas moleculares tales como las que se basan en patrones de restricción de genes de ARN ribosomal o la proteína RecA [Joly-Guillou, 2015]; así como el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de genes asociados a la resistencia, como aquellos que codifican para las oxacilinasas, carbapenemasas y secuencias de inserción ISAba1.
Con respecto a las pruebas de sensibilidad, se ha optado por el CHROMagar Acinetobacter para la identificación de A. baumannii multirresistente, pues ha mostrado ser selectivo para esta bacteria y para aquellas cepas resistentes a carbapenémicos [Wareham y Gordoz, 2011].
Los métodos manuales como E-test, difusión en disco y microdilución han mostrado fallas en la detección de resistencia antimicrobiana. Y el problema se hace aún más evidente si se considera que no se cuenta con métodos fenotípicos estandarizados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para la detección de β-lactamasas, no obstante hay técnicas que se han aplicado con buenos resultados, como es el caso de la prueba de sinergismo con EDTA [Lee et al. 2003]; de igual forma se ha usado el test tridimensional (anteriormente empleado para la detección de AmpC) para el hallazgo de carbapenemasas, incluyendo KPC, oxacilinasas y metalo-β-lactamasas, con resultados satisfactorios [Spellberg y Bonomo, 2013].
Prueba de sinergismo con EDTA
Colocar dos discos de imipenem y dos de meropenem de 10 µg sobre un crecimiento masivo de la cepa estandarizada al 0.5 de McFarlan sobre una placa de agar Müeller Hinton adicionando a un disco con antibiótico 4µL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) a una concentración de 0.5 M [Lee et al. 2003]. Un resultado positivo está dado por el agrandamiento del halo de inhibición alrededor del disco que tiene el quelante. Si se combina EDTA con otros dos quelantes como ácido 2-mercaptopropiónico (MPA) (3µL) y ácido mercaptoacético de sodio (SMA) a un volumen de 3-6 µL con una
concentración de 300mg/mL se observarán mejores resultados para la detección de metalo-β-lactamasas en Acinetobacter.
Ensayo tridimensional
El test tridimensional, usado previamente para la detección de AmpC, ha sido utilizado por varias instituciones hospitalarias y grupos de investigación para la detección de carbapenemasas, incluyendo carbapenemasas de Klebsiella pneumoniae (KPC), oxacilinasas y metalo-β-lactamasas con resultados satisfactorios, no solo para A.
baumannii, sino también para otras bacterias como Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa. En esta prueba se agrega un extracto bacteriano, obtenido por lisis mecánica, en una hendidura ubicada a 5 mm de un disco de imipenem en un agar Mueller Hinton sembrado con una cepa de Escherichia coli DH5α. Un resultado positivo está dado por una deformidad del halo de inhibición después de una incubación a 37ºC durante 18-24 horas [Spellberg y Bonomo, 2013].
El uso de la epidemiologia molecular a través de técnicas como electroforesis en campos pulsados, tipificación de secuencias multilocus y la tipificación de secuencias repetidas han resultado muy útiles para conocer el comportamiento clínico de las cepas [Fontana et al., 2008].
Tratamiento
La emergencia de cepas resistentes se debe sobre todo a la presión selectiva que ejercen los antimicrobianos empíricos que se usan de manera inapropiada y actúan eliminando las poblaciones susceptibles y seleccionando a las poblaciones resistentes.
La elección del tratamiento empírico debe basarse en la epidemiología local y en el riesgo que presenta el paciente para adquirir una cepa resistente.
Antes de iniciar una terapia, se debe considerar que Acinetobacter puede colonizar la piel, faringe, vía digestiva, uretra, conjuntiva y vagina, por lo cual, lo primero que se debe considerar es si la cepa aislada en el cultivo es la causante de una infección invasiva o solo se trata de una colonización, con la finalidad de evitar el sobre uso de antibióticos [Phillips, 2004; Allen y Hartman, 2009]. Acinetobacter MDR (multidrogorresistente) está definido como aquella cepa que presenta la resistencia a
- 23 - carbapenémicos o resistencia a tres clases de antimicrobianosy pan-resistencia cuando se incluye la resistencia a polimixinas [Segal et al., 2003; Falagas et al., 2015; Rolain et al., 2015].
Entre los antibióticos que se usan para el tratamiento de infecciones causadas por cepas de Acinetobacter podemos encontrar: ß-lactámicos: (cefalosporinas de tercera o cuarta generación como la cefotaxima, ceftriaxona o cefepima, carbapenémicos (imipenem y meropenem), inhibidores de ß-Lactamasas (sulbactam), aminoglucósidos (su empleo está limitado por su deficiente penetración al tejido pulmonar y sistema nervioso central), tigeciclina y minociclina (minociclina, doxiciclina y en menor escala la tetraciclina), polimixinas (colistina y polimixina B), las fluoroquinolonas (las cuales poseen moderada actividad antimicrobiana contra A.baumannii) y los tratamientos combinados [Rada, 2016].
Profilaxis
Algunas medidas de prevención contra infecciones asociadas a este microorganismo incluyen la utilización de desinfectantes para el lavado de manos antes y después de tocar a un paciente, evaluación del periodo de riesgo, vigilancia microbiológica, prescripción de antibióticos, normas y precauciones de contacto, desinfección de las superficies que se hallan en el ambiente del paciente, desinfección del equipo médico móvil [Rada, 2016].
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Bacillus
Estibaliz Sansinenea Royano1 Jessica Vaca1
(1) Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Químicas, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
En: “Una mirada hacia el mundo bacteriano”. Villagrán Padilla Claudy Lorena y Ruiz Tagle Alejandro César. (Eds.) 2019 Publicación de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México. pp. 30-44. ISBN 978-607-525-629-0
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Bacillus
Estibaliz Sansinenea Royano Jessica Vaca
Introducción
El género Bacillus contiene un buen número de especies relacionadas, las cuales tienen la característica de ser aeróbicas y formadoras de esporas y muchas de ellas tienen impactos importantes en agricultura y salud, ya que comprenden bacterias que son patógenas y otras que son benéficas. Muchas de ellas tienen incluso aplicaciones en la industria, como es la producción de enzimas, detergentes y conservadores de comida. La mayoría de especies de este género se encuentran distribuidas ampliamente en diferentes ambientes como el suelo, el mar y cadáveres de insectos.
La presencia de esta bacteria en ambientes tan diversos refleja su amplia y versátil capacidad metabólica, lo cual las hace de gran importancia a nivel industrial (Sansinenea y Ortiz, 2011).
Descripción y características generales
El género Bacillus (reino Eubacteria; phylum Firmicutes; clase Bacilli; orden Bacillales;
Familia Bacillaceae) está caracterizado por una alta diversidad de especies cuyo tamaño de genoma suele ser entre 3.35 y 5.5 Mb y cuyas propiedades metabólicas y nichos ecológicos varían significativamente. Actualmente más de 108 genomas han sido secuenciados muchos de ellos con interés clínico (Logan y Vos, 2015). El género bacteriano Bacillus sp incluye a un gran número de especies de bacilos grampositivos, aerobios, móviles, catalasa positiva, hemólisis variable y con capacidad para formar endosporas de morfología esférica, ovalada, elipsoidal o cilíndrica. Son bacterias aeróbicas, grampositivas, formadoras de esporas que se puede aislar de una gran cantidad de ambientes y puede crecer en muchos medios de cultivo de rutina como agar nutritivo, Luria Bertani, tripticaseína de soya o agar sangre. Su ciclo de vida es simple: las células vegetativas bajo condiciones favorables de pH, temperatura y nutrientes, comienzan a crecer y generar el septo que separa a las dos células hijas,
que en microscopía de contrate de fases se pueden observar como células solas o en pareja. La división que presentan las células vegetativas es por fisión binaria. Cuando alguno de los nutrientes como aminoácidos, azúcares o el oxígeno se vuelven insuficientes para crecer, la bacteria forma endosporas, no más de una por célula, las cuales son muy resistentes a muchas condiciones adversas como el calor, la radiación los desinfectantes y la desecación entre otros. La formación de las endosporas es una de las características más importantes en la identificación del género, ya que es el único género aeróbico formador de esporas. Se forman intracelularmente al final de la fase exponencial, normalmente cuando hay un decaimiento en los nutrientes y difieren de las células vegetativas en que son refringentes y visibles claramente en un microscopio de contraste de fases (Sansinenea, 2012).
Características morfológicas (microscópicas y coloniales)
La morfología colonial y el tamaño varían entre especies. Las bacterias vistas a microscopía pueden aparecer individualmente, en parejas o en cadenas (a veces de gran tamaño). Algunas especies pueden tener inclusiones en el citoplasma que son visibles a microscopía de contraste de fases por ser menos refringentes que las esporas cuya posición suele ser central o subterminal. Las inclusiones de algunas especies pueden ser cristalíferas llamadas proteínas cristalíferas o -endotoxinas las cuales son a menudo tóxicas a insectos y a otros vertebrados. Los miembros del género Bacillus se describen como células generalmente redondeadas cuyo diámetro es de 0.4 a 1.8 m y una longitud de 0.9 a 10 m, aunque las bacterias de una misma especie suelen tener tamaños regulares. Las morfologías coloniales varían dependiendo el medio de cultivo, sin embargo, las colonias de Bacillus en un medio de rutina no son difíciles de identificar, ya que suelen ser grandes, con formas y bordes irregulares, de color crema y aspecto ceroso o brilloso y algunas incluso muestran rizos (B. mycoides) en los bordes. En la Figura 1 se muestran algunas imágenes del aspecto colonial en placa de diferentes especies de Bacillus (Logan y Tumbull, 2003).
- 33 - Figura 1: Colonias de las bacterias formadoras de esporas en placas de agar sangre [(a)–(c), (e)–(f), (h)] y agar nutritivo [(d), (g), (i)] después de incubarlas 24 horas a 37 oC. (a) Bacillus anthracis: colonias circulares a irregulares con bordes ondulados y crenados y textura de superficie granulosa; (b) Bacillus cereus: bordes irregulares, ondulados y crenados y textura granulosa; (c) Bacillus megaterium: colonias redondas a irregulares brillantes con márgenes ondulados; (d) Bacillus mycoides: colonias rizoides o de aspecto peludas las cuales pueden cubrir todo el agar; (e) Bacillus pumilus:
colonias arrugadas e irregulares con márgenes ondulados; (f) Bacillus sphaericus:
colonias lisas, brillantes, de redondas a irregulares con márgenes de enteros a ondulados; (g) Bacillus subtilis: colonias irregulares que podrían dar la apariencia de un cultivo mixto, mucosas y brillosas, que se pueden convertir en secas y arrugadas, con márgenes ondulados o fimbriados; (h) Bacillus thuringiensis: colonias circulares o irregulares con bordes enteros u ondulados y textura granulosa; (i) Microcolonias móviles asignadas usualmente como Bacillus circulans, pero que ahora se localizan como Paenibacillus sp. Fotografía tomadas de Bacillus Bergey y tomadas por N. A.
Logan(Logan y Vos, 2015).
Características fisiológicas y bioquímicas
La mayoría de especies de este género crecen muy bien en medios de cultivo de rutina como ya se ha comentado anteriormente. Sin embargo, algunos aislados particularmente aquellos de ambientes nutricionalmente pobres podrían crecer pobremente en medios de cultivo estándar, por lo que necesitarían un medio más nutritivo como infusión de cerebro corazón. La mayoría de especies son aeróbicas, aunque algunas pueden ser anaerobias facultativas. El pH óptimo de crecimiento es de 7 aunque existen algunas especies que crecen a pH ácidos de 5.5. La temperatura adecuada de crecimiento suele ser 30 oC aunque pueden crecer hasta los 37 oC ya que la mayoría de especies son mesófilas. Pero hay algunas especies aisladas de ambientes extremos que crecen a temperaturas de 68 oC o 18 oC. Muchas especies utilizan glucosa como fuente de carbono y energía.
Algunas utilizan ciertos aminoácidos y no producen ácido a partir de glucosa u otros carbohidratos. La especie más conocida, B. subtilis, utiliza muchos azúcares como fuentes de carbono (Logan y Vos, 2015). También las especies de Bacillus pueden utilizar fuentes de nitrógeno inorgánico u orgánico, como sales de amonio o aminoácidos incluso urea. Acerca de los requerimientos de vitaminas no hay mucha información y la mayoría no requiere de factores de crecimiento. Casi toda la información acerca de la bioquímica o el metabolismo está relacionada con B. subtilis que es la especie más estudiada. Se sabe que es capaz de crecer anaeróbicamente no solo con nitrato como aceptor de electrones sino también por fermentación. Puede usar amonio, nitrato, aminoácidos, algunas purinas, urea, ácido úrico, alantoína y péptidos como fuentes de nitrógeno. Otros Bacillus como B. cereus, B. licheniformis o B.
thuringiensis pueden fermentar carbohidratos en la ausencia de aceptores de electrones exógenos. Aunque el hierro es un nutriente esencial para muchos organismos, en los ambientes naturales está severamente restringido por su poca solubilidad. Por ello las bacterias de este género secretan sideróforos que quelatan el hierro para poder asimilarlo. Las habilidades de algunas cepas para metabolizar y transformar compuestos orgánicos complejos han sido de interés en la biorremediación y la producción farmacéutica (Logan y Vos, 2015).
- 35 - Grupo B. cereus
El grupo de B. cereus contiene seis especies: B. thuringiensis, B. cereus (sensu stricto), B. anthracis, B. weihenstephanensis, B. mycoides y B. pseudomycoides. De estas seis especies: B. cereus, B. thuringiensis y B. anthracis han sido las más estudiadas por estar filogenéticamente muy relacionadas, incluso la taxonomía de este grupo ha sido muy controversial y algunos investigadores han sugerido que estas bacterias deberían de ser agrupadas juntas. La única diferencia establecida entre estas tres especies es el contenido en sus plásmidos, ya que cuando B. thuringiensis y B. anthracis pierden sus plásmidos se vuelven indistinguibles de B. cereus (Økstad y Kolstø, 2012).
Morfología y genética
La morfología de estas tres especies B. thuringiensis, B. cereus y B. anthracis es muy parecida, con colonias de aspecto ceroso, color crema, redondas grandes y con bordes irregulares e incluso la caracterización bioquímica de los tres es muy similar por lo que no sirve como herramienta para identificarlas. B. thuringiensis es una bacteria entomopatógena y la bacteria más usada en el mundo como un biopesticida natural. B.
anthracis es una especie altamente monomórfica y causa el ántrax, la cual es una enfermedad principalmente de herbívoros pero que se puede presentar en humanos y otros mamíferos. B. cereus es una bacteria causante de síndromes de envenenamiento por comida, produce diarrea y vómito y es una bacteria oportunista en infecciones nosocomiales (Logan y Vos, 2015).
Por ello las técnicas genéticas han sido utilizadas para generar árboles filogenéticos que sirvan para diferenciar las diferentes especies. Para ello se han realizado análisis de las secuencias 16S ADNr, sin embargo, no son del todo apropiadas para clasificar las cepas a nivel especie (Janda y Abbot, 2007). Por ello se han complementado con estudios de polimorfismos en el tamaño de fragmentos de restricción (RFLP) de todo el genoma. Esto utiliza enzimas de restricción que corta en diferentes secuencias del genoma dando fragmentos de diferente tamaño que son comparados entre sí a través de un gel de campos pulsados (PFGE).
Los cromosomas de B. anthracis y B. subtilis codifican genes muy similares en cuanto a esporulación o genes de transporte y metabolismo, aunque tiene un mayor
número de genes que codifican para proteínas de unión a péptidos y para proteasas. B.
cereus también está bien equipado con enzimas proteolíticas y transportadores de aminoácidos. B. anthracis tiene 5.2 Mpb y 5.5 Mpb si se incluyen los plásmidos de virulencia, mientras que B. cereus tiene 5.4 Mpb. En el caso de B. anthracis se sabe que los plásmidos son esenciales para su virulencia ya que las cepas que han sido curadas y no tienen plásmidos no son virulentas. Muchos de los genes que se encuentran en B. anthracis tiene sus genes homólogos en B. cereus y B. thuringiensis salvo los plásmidos pXO1 y pOX2 que se encuentran en B. anthracis y son los responsables de su virulencia y que están ausentes en B. cereus y B. thuringiensis. Se ha realizado una comparación del genoma entre diferentes cepas de B. anthracis, B.
cereus y B. thuringiensis y se ha revelado una homología cromosomal entre un 66% y 92%.5 También existen muchos elementos móviles y repetitivos (Kristoffersen y col., 2011).
Principales patógenos: B. anthracis/B. cereus/B. thuringiensis
La mayoría de las especies de Bacillus tienen poca patogenicidad y muy pocas veces se asocian con enfermedades en humanos o en otros animales. Una excepción es B.
anthracis que es el bacilo causante de la mortal enfermedad del ántrax o carbunco. B.
cereus que es un contaminante en la comida y patógeno oportunista. La resistencia de las esporas al calor, radiación, desinfectantes o desecación, convierte a estas especies en un problema en las salas de operaciones o en el diseño de productos farmacéuticos.
B. thuringiensis es un entomopatógeno que causa la muerte de diferentes insectos por lo que ha sido ampliamente usado en agricultura (Sansinenea, 2016). Sin embargo, debido a la gran homología con B. cereus, también se han encontrado cepas de B.
thuringiensis con capacidad de producir las enterotoxinas causantes de enfermedades gastrointestinales (Logan y Vos, 2015).
- 37 - Epidemiología
El ántrax es una enfermedad bacteriana que ataca la piel. Su reservorio está constituído por los animales enfermos o muertos (herbívoros domésticos y salvajes) y sus subproductos (cuero, lana, cerda, harina de hueso) y medio ambiente contaminado (suelo). Las aves de rapiña que se alimentan de carroña infectada pueden diseminar el microorganismo de una zona a otra. El ser humano fallecido como consecuencia de la enfermedad constituye un reservorio. La enfermedad en su forma zoonótica es endémica, con incidencia variable, en la zonas agrícolas y ganaderas en los países en desarrollo. Entre veinte y treinta casos por año son notificados en Argentina. La infección ocurre cuando las endosporas entran al cuerpo desde el ambiente, ya que la espora es la forma primaria de infección (Logan y Vos, 2015). La infección de la piel se produce por contacto con tejidos animales (bovinos, ovejas, cabras, caballos, cerdos y otros más) que han muerto de la enfermedad, y tal vez por insectos picadores que se han alimentado parcialmente de dichos animales; por pelo, lana o cueros contaminados o por productos hechos con ellos como tambores, cepillos, etcétera; por tierra contaminada por animales infectados o harina de hueso contaminada que se usa como abono en horticultura y jardinería. El carbunco respiratorio es provocado por la inhalación de esporas en procesos industriales peligrosos como el curtido de cuero o el procesamiento de lana o huesos, en los que pueden generarse aerosoles con esporas de B. anthracis. El carbunco intestinal y el bucofaríngeo se deben a la ingestión de carne contaminada; no hay pruebas de que la leche de animales infectados transmita el carbunco. También puede ocurrir contaminación por aerosoles accidentales generados en investigaciones o por bioterrorismo (mediante sobres, paquetes, etc.). El contagio interhumano de carbunco es excepcional. Raramente puede ocurrir reinfección. El tratamiento se debe realizar con antibióticos, desde los comienzos de la enfermedad.
Históricamente la penicilina ha sido el tratamiento de elección para el ántrax y ésta ha sido aprobada por la Administración de Drogas en los Estados Unidos. También la doxiciclina, de la clase de las tetraciclinas, ha sido aprobada. Los datos in vitro sugieren que algunas fluoroquinolonas, especialmente la ciprofloxacina, tienen una eficacia equivalente en el tratamiento del ántrax (Logan y Vos, 2015).
Respecto a B. cereus, es el siguiente patógeno de importancia clínica para humanos, causa enfermedad transmitida por alimentos contaminados e infecciones oportunistas. Respecto a la enfermedad transmitida por alimentos es un agente etiológico de dos síndromes de intoxicación alimenticia diferentes: a) de tipo diarrea, caracterizada por dolor abdominal con diarrea entre 8 y 16 horas después de la ingestión de alimentos contaminados b) de tipo emético caracterizado por náuseas y vómitos entre 1 y 5 horas después de haber ingerido alimentos contaminados. Las esporas de B. cereus pueden sobrevivir a procedimientos de cocción normales y bajo condiciones de almacenamiento inadecuadas las esporas pueden germinar y las células vegetativas pueden multiplicarse. En los casos diarreicos las toxinas responsables se producen por el microorganismo en el intestino delgado mientras que las toxinas eméticas se ingieren en el alimento (Logan y Vos, 2015).
B. thuringiensis está filogenéticamente muy relacionada con B.cereus por lo que se han encontrado algunas especies de B. thuringiensis implicadas en casos de gastroenteritis, ya que porta algunos genes que codifican para las enterotoxinas de B.cereus. También puede ocurrir que si B. thuringiensis crece a 37 oC pueda perder los genes cry insecticidas y ser indistinguible de B.cereus al perder los plásmidos que contiene los genes que codifican para las proteínas insecticidas (Logan y Vos, 2015).
Mecanismo de patogenicidad
Para el caso del ántrax la infección ocurre cuando las esporas entran en el cuerpo. Las esporas son rápidamente fagocitadas por los macrófagos, algunos de los cuales sufren lisis, los cuales son llevados hacia los nódulos linfáticos. Estas esporas fagocitadas podrían no germinar inmediatamente sino hasta en el lapso de 6 a 8 semanas. La germinación se dispara por algún químico germinante que sigue sin ser identificado al día de hoy. Un nivel elevado de CO2 y la temperatura corporal del hospedero causan que el microorganismo active sus genes tóxicos. Estos genes están codificados en dos plásmidos: pOX1 que codifica los genes tóxico y pOX2 que codifica los genes de la cápsula; la pérdida de cualquiera de estos plásmidos implica la pérdida de la virulencia. El complejo de la toxina del ántrax tiene tres componentes: el factor edema (FE), el antígeno protector (AP) y el factor letal (FL), ninguno de los cuales
- 39 - es tóxico por sí solo. El FE y FL son activos en una combinación binaria con AP. La molécula AP se une a ciertos receptores de la membrana celular de la célula hospedero y forman oligómeros heptaméricos. Entonces la molécula AP se rompe y se activa por una proteasa y el AP activo se puede unir a las moléculas de FE y FL. Este complejo entra a la célula por endocitosis. La toxina binaria AP-FE interactúa con la proteína calmodulina y se convierte en una adenil ciclasa activa lo cual eleva los niveles de AMP cíclico y esto guía a un choque hipovolémico o choque hemorrágico (Logan y Vos, 2015).
Respecto a la patogenicidad de B.cereus, se sabe que esta especie produce seis toxinas, cuatro de las cuales son enterotoxinas, citotoxina K y la toxina emética. Las enterotoxinas son: 1) hemolisina, una proteína que tiene actividades dermonecróticas y permeabilidad vascular y causa una acumulación de fluídos, por lo que se sugiere que es el factor de virulencia primaria en la diarrea causada por B. cereus; 2) enterotoxina no-hemolítica, otra proteína parecida a la hemolisina; 3) y 4) enterotoxinas T y FM, proteínas cuyas funciones específicas se desconocen; también está la citotoxina K parecida la -toxina de Clostridium perfringens. La toxina emética cereulida es un péptido resistente al calor, al pH y a la proteólisis, pero no es antigénica. El mecanismo de acción de esta toxina se desconoce, aunque se sabe que estimula el nervio vago aferente mediante el enlace con el receptor 5-HT3. B. cereus también es un patógeno destructivo ocular, ya que puede penetrar a través de un trauma ocular como consecuencia de una operación provocando endoftalmitis y si no, se da un tratamiento a tiempo se puede perder la visión o incluso el ojo. Otras infecciones por B.cereus pueden ocurrir en personas inmunocomprometidas o con diversas complicaciones como bacteriemia, septicemia, sepsis fulminante con hemólisis. Los neonatos pueden ser susceptibles sobre todo por infecciones del cordón umbilical (Logan y Vos, 2015).
Por otro lado, la especie B. thuringiensis, filogenéticamente relacionada con las dos anteriores, es una cepa patógena de insectos ya que produce cuerpos proteicos parasporales y cristalinos que son tóxicos para diferentes insectos, lo que ha hecho de esta bacteria una de las más utilizadas mundialmente en biotecnología. Las - endotoxinas se producen en el momento de la esporulación y son codificadas por lo genes cry en plásmidos extracromosomales. Existen más de 80 clases de proteínas Cry
con capacidades insecticidas específicas para cada especie de insecto (George y Crickmore, 2012). La protoxina ingerida se disuelve en el intestino medio alcalino de la larva del insecto y sufre una activación proteolítica. Bajo condiciones altamente ácidas en el estómago de muchos vertebrados, incluyendo humanos, las proteínas Cry y Cyt (Cristal y Citotóxica) pueden disolverse, pero una vez en solución son rápidamente degradadas a péptidos no-tóxicos por los jugos gástricos en menos de dos minutos. Las toxinas activadas se unen a los receptores (glicoproteínas o glicolípidos) localizados en las membranas de las células epiteliales del intestino medio. Para algunas toxinas se han descrito al menos cuatro diferentes sitios de unión en diferentes insectos del orden lepidóptero: una proteína tipo cadherina (CADR), una N-aminopeptidasa (APN) anclada a glicosilfosfatidil-inositol (GPI), una fosfatasa alcalina anclada a GPI (ALP) y una proteína glicoconjugada. Después de la unión, la toxina adopta una conformación que permite su inserción en la membrana celular y forma un canal selectivo para cationes.
Subsecuentemente ocurre una oligomerización y estos oligómeros forman un poro o canal iónico inducido por un incremento en la permeabilidad catiónica. Una vez que se ha formado un número suficiente de canales entra en la célula una gran cantidad de cationes, lo cual causa un desbalance osmótico que conduce a la ruptura celular.
Cuando un número suficiente de células se han destruido, el epitelio del intestino medio pierde su integridad. Esto permite que los jugos alcalinos penetren en el intestino provocando así la muerte por una bacteriemia por B. thuringiensis y una colonización del tejido en el insecto (Bravo y col, 2007).
Metodología para identificar especies del género de importancia médica
Los esquemas actuales para identificar las diferentes especies de Bacillus se pueden dividir en cuatro categorías: 1) caracteres bioquímicos, morfológicos y fisiológicos tradicionales, 2) las versiones en miniatura de los test bioquímicos tradicionales (test API, cartas VITEK y placas Biolog), 3) caracteres quimio- taxonómicos, como los perfiles de ésteres metílicos de ácidos grasos, 4) caracteres genómicos (Logan y Vos, 2015).
En general, antes de tratar de identificar cualquier cepa de Bacillus en el nivel de especie es importante establecer que el aislado sea un organismo aeróbico formador de