MODULO : BIOLOGIA
Miguel Ubal Dahl
Ingeniería Genética
Actualmente es posible:
- cortar regiones específicas de la molécula de ADN - producir copias de cada fragmento que se corte - determinar la secuencia exacta de los nucleótidos
Es posible aislar y modificar un GEN
Ingeniería Genética
• La ingeniería genética es el proceso de insertar genes de interés en organismos específicos con fines médicos y científicos
• La terapia génica es el proceso de insertar un gen faltante o modificar un gen mutado
• Las bacterias se usan como fábricas pa ra producir una proteína a partir de un gen clonado(ej insulina)
• Para producir una proteína de interés el gen debe ser clonado en un vector de expresión, usualmente un plásmido
• En agricultura la Igenética se usa para producir cosechas resistentes
• FUNDAMENTO TEORICO : EL CODIGO GENETICO ES UNIVERSAL
Tecnología de Recombinación del ADN
Pasos para obtener un gen de
interés en cantidades
FRAGMENTACION DEL ADN:
Se corta la molécula de ADN en sitios específicos por medio de enzimas llamadas ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS:
Mezclar dos ácidos nucleicos distintos y fabricar uno solo respetando la complementariedad de las base
CLONACION MOLECULAR:
A partir de una molécula de ADN se pueden hacer millones de copias idénticas.
La clonación molecular consiste en insertar un
fragmento de ADN de interés en un vector (molécula capaz de replicarse en una célula), formando un clon molecular.
Objetivo
Generar una
genoteca
Fragmentación del ADN
-Se usan endonucleasas de restricción que son enzimas de origen bacteriano usadas por la bacteria como defensa antiviral
-Estas enzimas reconocen secuencias específicas PALINDRÓMICAS y allí cortan:
Cortes asimétricos generan extremos cohesivos Cortes siméticos generan extremos romos
ENDONUCLEASAS existen muchos tipos
LOS EXTREMOS COHESIVOS SEPARADOS PUEDEN VOLVER A LIGARSE POR UNA ADN LIGASA
Fragmentación y Separación
La enzima EcoRI bacteriana corta el ADN del virus fago Lambda en cinco sitios produciendo 6
fragmentos de ADN.
Por electroforesis se separan los fragmentos según su tamaño.
El ADN se tiñe con colorante
fluorescente y se fotografía para identificar los fragmentos.
Clonación de ADN
Se obtienen copias de un segmento de ADN utilizando un vector
Plásmidos
Se agrega al plásmido de una bacteria, un segmento de ADN que se desea clonar y la bacteria lo auto duplica junto con el plásmido.Virus
E segmento de ADN a clonar se une al cromosoma de un virus mediante tecnología de ADN recombinante. Elvirus inyecta ese ADN recombinado en una bacteria y los mecanismos normales de replicación del virus van a
producir copias.
YAC
Cromosoma artificial de levaduraBAC
Cromosoma artificial de bacteriaCósmidos
Es un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un virusPCR
Es una técnica de clonación de laboratorio denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa.Clonación
Las moléculas de ADN que contienen segmentos unidos covalentemente pero que se han derivado de dos o más fuentes de ADN, se llaman ADN recombinante
La producción de ADN
recombinante
fue posible gracias a que se lograron aislar las endonucleasas de restricción.Las copias que se obtiene son pocas para lograr grandes
cantidades se usan distintas técnicas para lograr segmento de ADN idénticos. Este proceso se llama CLONACION
Clonación
.Una de las técnicas de clonación es incorporar el fragmento de ADN de interés a una molécula de ADN que se autorreplica
miles de veces en corto tiempo.
La estructura que porta el Fragmento a multiplicar se llama VECTOR
Los vectores mas utilizados En Ing Genética son:
Los plámidos Bacteriófago l
Clonación : Vector un BACTERIÓFAGO
PCR
polymerase chain reaction
PRINCIPIO DEL MÉTODO
La PCR es una metodología, resultante de la aplicación práctica de tres conceptos 1. Desnaturalización del DNA para dar moléculas monocatenarias.
2. Hibridación específica de la molécula monocatenaria con un oligonucleótido. Ésta es la etapa que justifica por qué se debe conocer parte de la secuencia.
3. Replicación de la molécula monocatenaria mediante una DNA polimerasa que emplea el
oligonucleótido anterior como cebador: también se puede denominar elongación o extensión del cebador, o polimerización.
Desnaturalización y renaturalización del ADN
• Desenrollamiento y separación de las dos cadenas
• Calentamiento, álcalis fuertes, urea, formamida
• Renaturalización: restitución de las uniones entre las 2
cadenas
PCR
El ADN se puede amplificar mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
-Se usa una polimerasa bacteriana (polimerasa Taq) para obtener las copias del gen
- Se calienta el gen a 95º para separar las cadenas - Se enfría a 55º para permitir la unión de los
cebadores necesarios
- Se calienta nuevamente a 72º para que pueda actuar la Taq y completar la síntesis.
Se puede repetir el proceso múltiples veces, duplicando la cantidad de ADN en cada ciclo.
Esquema PCR
Hibridación
Se pueden unir dos polinucleótidos que provengan:
- del mismo ADN - de distinto ADN
- un polinucleótido de ARN con otro de ARN - uno de ARN con uno de ADN
Si se coloca ADN, en una solución a 100ºC y pH 13, las bases complementarias se separan porque se rompen los puentes de H, y los polinucleótidos quedan totalmente separados, éste proceso se denomina DESNATURALIZACION DEL ADN .
Cada polinucleótido separado puede reunirse con otro, siempre y cuando las bases sean complementarias, si se baja la temperatura. Este proceso se denomina RENATURALIZACION .
renaturalizacion
hibridacion
Principio básico del ensayo de hibridación
Todos los ensayos de hibridación se basan en la gran especificidad de la interacción entre bases complementarias.
Para que la hibridación permita identificar en un genoma, u otra muestra cualquiera de ácido nucleico, una secuencia particular se requieren dos elementos básicos:
• La presencia de la secuencia diana en uno de los fragmentos de la muestra de ácido nucleico, generalmente obtenidos usando enzimas de restricción.
• El empleo de una sonda (sonda molecular, sonda de hibridación), que es un oligonucleótido (fragmento corto de ácido nucleico) de secuencia conocida, marcado de forma que permita su detección. La secuencia de la sonda ha de ser complementaria a la secuencia diana que se pretenda detectar, y su marcaje puede ser con un isótopo radiactivo, un cromóforo, un
fluoróforo, una enzima, etc.
Southern blot (transferencia Southern
)SECUENCIACION METODO SANGER
El método clásico de terminación de cadena requiere una plantilla de ADN
monocatenario, un cebador deADN , una ADN polimerasa ,
desoxinucleótidotrifosfatos normales (dNTP) y di-desoxinucleótidotrifosfatos modificados (ddNTP), el último de los cuales termina la elongación de la cadena de ADN. Estos
nucleótidos que terminan la cadena carecen de un grupo 3'- OH necesario para la
formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, lo que hace que la ADN polimerasa cese la extensión del ADN cuando se incorpora un ddNTP
modificado. Los ddNTP pueden marcarse de forma radiactiva o fluorescente para su detección en máquinas de secuenciación
CRISPR-CAS y Terapia GENICA
Toda la técnica de manipulación de genes, con sus grandes avances a quedado desdibujada, y casi anacrónica con la nueva técnica Llamada
CRISPR-CAS
La tecnología CRISPR es una tecnología que permite, editar el material genético de las células. A modo de tijeras, puede cortar secuencias de DNA humano (y también de todas las especies,
supuestamente) y sustituirlas por otras que puedan corregir errores genéticos o dar propiedades mejoradas respecto las secuencias iniciales. ES UN PROCESADOR DE TEXTOS!!!!
CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, que en español significa
"Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas”
Cas es el nombre de una serie de proteínas, principalmente unas nucleasas
CRISPR-CAS
Como se desarrollo este sistema.
Se descubrió que CRISPR/Cas es el sistema inmune de las
bacterias frente al ataque viral y que además de va adaptando
a nuevas infecciones víricas con diferentes genomas
GENOMA DE LA BACTERIA
ESPACIADORES:SECUENCIAS
IDENTICAS A SECUENCIAS VIRICAS
PROTEINA CAS
Cuando un virus infecta un
organismo el virus interaccionará con su material genético y otros componentes celulares. Los genes de la secuencia CRISPR sintetizan un ARN que interacciona con las proteínas Cas.
Este complejo interacciona con el material genético del virus y lo inactivará.
El sistema va más allá y es capaz de coger un trozo del material genético del virus e integrarlo a la secuencia CRISPR, de manera que, si la bacteria o el organismo reciben la misma infección de nuevo, esta podrá ser combatida más rápidamente. Esto es similar a un sistema inmune de memoria.
Funcionamiento del sistema CRISPR/Cas.
Un virus ha introducido su DNA en la bacteria. A ese DNA se le ha unido un complejo que consiste en un tipo de proteína Cas (verde) que lleva unido un
pequeño crRNA ("cr" por CRISPR). Esa unión inactiva al DNA viral y así puede ser degradado. El pequeño crRNA proviene del procesamiento de un crRNA de mayor tamaño por parte de otro tipo de proteína Cas (azul). Ese RNA es el producto de la transcripción de todas las secuencias CRISPR presentes en el genoma de la bacteria.
En paralelo a la inactivación del DNA viral, otro tipo de proteínas Cas (rojo) reconocen al DNA viral y a partir de él crean un pequeño segmento que
integraran en las secuencias CRISPR, de esa forma la bacteria formará complejos crRNA/Cas mucho más eficientes en su unión al DNA viral en caso de una