Tipos de cultivos celulares Generalidades
Curso Introducción al Cultivo de Células Eucariotas
Año 2015
Dra. Romina Manarin
Wilhem
Wilhem RouxRoux 1885 1885
Alexis Carrel 1913
Ross Harrison 1907
Y así comenzó todo…
Cultivo celular Cultivo celular
Abarca al conjunto de técnicas que permiten el Abarca al conjunto de técnicas que permiten el
mantenimiento de las células
mantenimiento de las células in vitro in vitro, , conservando al máximo sus propiedades conservando al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Existen 3 formas principales de iniciar un cultivo celular:
CULTIVO DE ÓRGANOS
EXPLANTES PRIMARIOS
CÉLULAS
DISGREGADAS
Cultivo de órganos
• El tejido se coloca sobre una rejilla situada en la interfase
líquido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes.
• Representa una buena réplica del tejido de origen ya que se
conservan las interacciones histológicas.
• El crecimiento es limitado.
• Se necesita un nuevo explante
para cada experimento.
•Constituidos por fragmentos pequeños de tejidos u órganos que se adhieren a una superficie en la que generalmente crecen las células de la periferia del explante.
•Útil para pequeñas cantidades de tejidos, como biopsias de piel.
Explantes primarios
explante
crecimiento temprano de células (3 dpe)
crecimiento celular luego de la remoción del explante
(7dpe) Cultivo de un Explante primario de
carcinoma de piel de ratón
Cultivo de células disgregadas
•Este tipo de cultivo está formado por células dispersas disgregadas de un tejido vivo, de un cultivo primario, o de una línea celular, mediante distintos sistemas mecánicos, químicos o enzimáticos.
•Las células crecen en suspensión o adheridas a una superficie.
•Generalmente son cultivos que contienen un único tipo de célula y éstas suelen ser homogéneas genéticamente.
•Es el tipo de cultivo más utilizado en la actualidad debido a su capacidad de propagación, es decir de crecimiento mantenido.
Propiedades de los tipos de cultivos
Mecanismos de disgregación
• Enzimática
• Mecánica
1.tripsina fría
2.tripsina caliente
3.colagenasa
Tripsina caliente
• Pequeñas porciones
de tejido se incuban
con tripsina a 37°C y
las células disociadas
deben recolectarse
por centrifugación
cada media hora. La
tripsina se neutraliza
con suero en medio
de cultivo.
Tripsina fría
• Las porciones de
tejido se incuban en tripsina a 4°C
durante 6-18 hs permitiendo la
penetración con una mínima actividad
tríptica y la digestión
se puede hacer en
un tiempo corto de
20-30 min a 37°C.
Disgregación por colagenasa
Disgregación mecánica
SCRAPING O “RASCADO”
TAMIZADO
DISGREGACIÓN CON LA JERINGA
PIPETEO
Inicio de un cultivo celular
Puede derivar del crecimiento de las células disgregadas.
El cultivo primario es lo primero de una serie de
procesos selectivos que finalmente darán origen a una
línea celular.
Los cultivos celulares son los más utilizados
MONOCAPA SUSPENSIÓN
células hematopoyéticas, células madres
Cultivos primarios
LÍNEA CELULAR
Cuando las células o tejidos procedentes de un ser vivo crecen sin haber pasado previamente por una fase de crecimiento in vitro.
CULTIVO PRIMARIO CULTIVO
SECUNDARIO
Cuando el cultivo procede de una fase previa de
crecimiento in vitro
Subcultivos en monocapas
Tripsinización
Cuándo hacer un Subcultivo o Pasaje
1. Alta densidad del cultivo.
2. Agotamiento del medio de cultivo.
3. Tiempo desde el
último pasaje.
El origen de una línea celular
Algunos Conceptos LINEA CELULAR- CEPAS
Con los sucesivos pasajes o subcultivos, un cultivo primario forma una línea celular. Este término implica la presencia de varios linajes celulares de fenotipos similares o distintos.
Así, al seleccionar uno de los linajes celulares por
clonado o por separación celular física o por
cualquier otra técnica de selección, para tener
ciertas propiedades específicas que han sido
identificadas en la masa de células del cultivo, esta
línea celular se transforma en lo que se conoce
como cepa celular (o cell strain).
Evolución de una línea celular
Líneas celulares finitas y continuas
• Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo de célula, se puede prolongar entre 20 y 80 generaciones. Superado ese límite, las células entran en senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar, supuestamente por el acortamiento de los telómeros, y mueren.
• Sin embargo, algunas células (como las células de roedores y las células tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma espontánea (exposición a radiaciones ionizantes o a carcinógenos químicos) o inducida (infección vírica o transfección de ADN) y son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación.
• Las células transformadas se caracterizan porque son inmortales (crecen indefinidamente); su crecimiento es aberrante (se pierde la inhibición por contacto, la limitación de la densidad celular durante la proliferación y la dependencia del anclaje); son malignas (invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores); son genéticamente inestables y presentan aberraciones cromosómicas.
Líneas celulares más frecuentemente
utilizadas
Células en cultivo
fibroblastos mioblastos
Células de tabaco
Células VERO Células RAW 264.7
Epimastigotes de T. cruzi
Ventajas de los cultivos celulares
Ventajas de los cultivos celulares
Desventajas de los cultivos celulares
Desventajas de los cultivos celulares
Bancos y colecciones de cultivos celulares
• Los 2 bancos de líneas celulares más importantes son:
- American Type Culture Collection (ATCC)
- European Collection of Cell Cultures (ECACC)
• En Argentina:
- Asociación Banco Argentino de Células (ABAC) - Asociación Argentina de Bancos de Tejidos (para transplantes)
- Centro de Investigaciones en Química Biológica
de Córdoba (ciquibic)
Servicios de ABAC
• Venta de líneas celulares
• Control de Micoplasma en Muestras de Células
• Depósito de Ampollas en Nitrógeno Líquido
• Manual de ATCC
Designación de líneas celulares
Las nuevas líneas celulares deberían tener:
• un código o designación. Por ej. normal human brain, NHB
• una clase celular o número de línea celular . Si varias líneas
celulares fueron obtenidas de la misma fuente. Por ej. NHB1, NHB2, etc.)
• un número de clon. Por ej. NHB2-1, NHB2-2, etc.
• el número de duplicaciones de la población ( para líneas celulares finitas), debería ser estimado e indicado después de una barra. Por ej. NHB2/2.
• el número de pasaje desde el último descongelamiento (para una línea celular continua) Por ej. HeLa-S3/p4).
Es esencial que la designación de la línea celular sea única, para evitar confusiones en distintos trabajos de la literatura. Los bancos de células eliminan este inconveniente dando a cada línea celular un número de acceso.
