FACULTAD DE CIENCIAS GRADO EN BIOLOGÍA TRABAJO FIN DE GRADO CURSO ACADÉMICO 2021-2022
TÍTULO:
EFECTOS MORFOGÉNICOS INDUCIDOS POR PULSOS DE LA AUXINA 2,4-D Y LA CITOQUININA TDZ EN BROTES AXILARES DE PLANTAS MICROPROPAGADAS DE BATATA
AUTOR:
JOSÉ IGNACIO JORDÁ LLORENS
RESUMEN
Ipomoea batatas es una planta trepadora con raíces tuberosas de alto valor nutricional y propiedades antioxidantes, arraigada a la cultura gastronómica de muchos países. En este proyecto, se estudia el proceso de micropropagación de esta especie.
Específicamente, se busca describir los cambios morfológicos inducidos por una exposición corta (de 24 horas) a distintas concentraciones de los fitorreguladores 2,4-D y TDZ en contraposición a que éstos formen parte del medio de cultivo de crecimiento, teniendo en consecuencia un mayor tiempo de exposición a reguladores. La concentración óptima para ambos reguladores fue de 1 mg/L, produciendo desdiferenciación en forma de callogénesis nodular en el caso de 2,4-D y una inducción de la brotación en el caso de TDZ.
ABSTRACT
Ipomoea batatas is a climbing plant with highly nutritional value tuberous roots and antioxidant properties, deeply connected to the gastronomic culture of many countries. In this essay, we study the micropropagation process of this species.
Specifically, morphological changes induced by short-term exposition (24 hours) to varying concentrations of the plant growth regulators 2,4-D and TDZ are reviewed, as opposed to having them form part of the growth culture medium which results in longer exposition. The optimal concentration was found to be 1 mg/L for both regulators, producing dedifferentiated nodal calluses in the case of 2,4-D and sprout induction in the case of TDZ.
PALABRAS CLAVE
Morfogénesis; micropropagación; TDZ; 2,4-D; batata.
KEYWORDS
Morphogenesis; micropropagation; TDZ; 2,4-D; sweetpotato
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS…………..……….2
1 INTRODUCCIÓN………4
1.1 Género Ipomoea………...4
1.2 Cultivo in vitro vegetal ……….………...7
1.3 Reguladores del crecimiento……….…….…11
2 ANTECEDENTES………...…………...15
3 OBJETIVOS………..………..15
4 MATERIALES Y MÉTODOS………...……..16
4.1 Obtención del material vegetal………...16
4.2 Preparación de las muestras y exposición a reguladores………..…...18
4.3 Crecimiento de las muestras………...18
5. CRONOGRAMA………..…….19
6. RESULTADOS………..……20
7. DISCUSIÓN………...…28
7.1 Efectos de la auxina 2,4-D………...28
7.2 Efectos de la citoquina TDZ………...29
8. CONCLUSIONES………..31
9. BIBLIOGRAFÍA………32
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, me gustaría darle las gracias a Abel Piqueras, mi tutor de TFG, puesto que sin él este trabajo no hubiera sido posible y además siempre ha estado a mi disposición para ayudarme en todo. Por otro lado, quiero mostrar lo muy agradecido que estoy a mi familia por todo el apoyo que me han brindado a lo largo de la carrera y sobre todo en esta recta final. Sin mis padres, esta experiencia en Biología no hubiera sido posible; y resulta muy tranquilizador saber que mi hermana ya ha pasado por donde estoy yo ahora y está dispuesta a prestarme su ayuda en todo lo que pueda. Finalmente, estoy muy agradecido a mis amigos por ayudarme a desconectar y aliviar el estrés que conlleva esta carrera, tanto mis compañeros de clase como mis amigos de fuera de la universidad.
Pero especialmente siento que he tenido mucha suerte con el grupo de amigos que he ido haciendo dentro de la carrera: habéis sido mi punto de apoyo a lo largo de estos años y sinceramente no sé dónde estaría ahora si no fuera por vosotros.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Género Ipomoea:
El género Ipomoea pertenece a la familia de las convolvuláceas, recogidas dentro de la clase Magnoliopsida. Este género es el más grande de las convolvuláceas, comprendiendo entre 500 y 600 especies distribuidas en regiones tropicales y subtropicales, principalmente en Sudamérica, América central y algunas zonas de África (Austin y Huáman, 1996). Se trata de unas hierbas generalmente perennes, con tallos subterráneos tuberosos o rizomatosos, de inflorescencias cimas dicasiales axilares y flores pentámeras cortamente pediceladas y que no ocultan el cáliz (figura 1). Un carácter muy distintivo de este género és que poseen unas células capaces de secretar glucósidos en la resina de los tejidos foliares y en las raíces (Wagner, 1973), sirviendo como marcador quimiotaxonómico de esta familia y siendo responsable de las propiedades laxantes de algunas especies de convolvulaceae.
Las propiedades de individuos de este género se han estudiado desde 1950. Entre sus actividades biológicas y químicas se encuentra un efecto analgésico, antimicrobiano, espasmolítico, alucinógeno o anticancerígeno. Las moléculas con principio activo más comunes son compuestos alcaloides, fenólicos y glicolípidos entre otros (Meira et al., 2012).
Además, cabe destacar la especie Ipomoea batatas presenta un gran valor nutritivo por su raíz tuberosa. Por todos estos motivos las plantas del género Ipomoea se han cultivado y utilizado desde la antigüedad hasta hoy en día.
- Ipomoea batatas:
Ipomea batatas es una especie de planta trepadora de hoja perenne. Presenta tallos postrados ligeramente suculentos. Sus hojas son de forma variable entre lobuladas y cordadas, y sus flores simpétalas (figura 1). Posee unas raíces engrosadas tuberosas que son comestibles (figura 2). Prefiere los climas tropicales o subtropicales y se suele multiplicar mediante esquejes.
Figura 1: Flores, frutos, hojas y tallo de Ipomoea batatas. Imagen libre de derechos de autor.
Figura 2: Raíces tuberosas de Ipomoea batatas. Imagen libre de derechos de autor.
Comúnmente conocida como batata, boniato o camote, esta planta es originaria de América central según indican estudios moleculares (Loebenstein y Thottappilly, 2009) siendo domesticada a partir de su pariente silvestre Ipomoea trifida en Cañon de Chilca, Perú, aproximadamente en el año 8.080 a. C. (Engel, 1970). Posteriormente llegaría a Europa mediante las incursiones de Cristóbal Colón a finales del siglo XV, permitiendo que esta planta sea ampliamente cultivada en regiones de todo el mundo donde el clima es apto para ello. Actualmente, la mayor productora de batata es China, facturando un 80% de la producción mundial (Food and Agriculture Organization of the United Nations).
Ipomoea batatas tiene un gran valor nutricional debido a sus raíces, que contienen grandes cantidades de almidón, fibras, minerales como el potasio y vitaminas como la B1, C, E y provitamina A. Su gran contenido en fibras digeribles ayuda a prevenir el cáncer de colon y a controlar los niveles de glucosa, entre otros beneficios. Por otro lado, posee antioxidantes, los cuales son beneficiosos para prevenir diabetes, enfermedades cardíacas y cáncer. (Martí et al., 2011) Por lo tanto, se trata de una planta muy beneficiosa tanto por su valor nutricional como por sus propiedades antioxidantes, y está arraigada en la cultura gastronómica de muchos países del mundo.
Respecto a sus hojas, se sabe que tienen alto contenido en polifenoles, principalmente antocianinas y ácidos fenólicos. De estas antocianinas al menos 15 presentan un valor medicinal significativo para la salud humana y algunas pueden ser usadas como colorantes alimenticios naturales. En conjunto, estos polifenoles presentaron actividades fisiológicas tales como protección contra radicales libres, actividad antimutagénica, anti-cáncer, anti-diabetes y antibacteriana; in vitro o in vivo (Islam, 2006).
El conjunto de las características de esta planta la convierte en una especie interesante para nuestra sociedad por sus numerosos beneficios, por lo que consideramos interesante la posibilidad de optimizar la producción y accesibilidad de esta planta
1.2 Cultivo in vitro vegetal:
En este proceso, se utilizan un conjunto de técnicas que permiten el crecimiento de células, tejidos y órganos aislados de una planta madre en un medio artificial, bajo condiciones asépticas, controladas y libres de microorganismos. (Withers y Street 1977) (Calva y Ríos 1999)
Este concepto empieza en los años 1838-1839, cuando Schleiden en 1838 y Schwann en 1839 establecieron las bases de la teoría celular y postularon que la célula presenta autonomía y es totipotente, hecho observado en esporas u óvulos capaces de transformarse en un organismo entero. Sin embargo, se tardó mucho más en demostrar que las células somáticas también poseen esta cualidad. Trécul en 1853 describió el proceso de cicatrizado y formación de callo en plantas, y más tarde Sachs entre 1880 y 1882 sugirió que este proceso era posible debido a la existencia en las plantas de una sustancia inductora de organogénesis. Aún con todo, los cultivos in vitro se intentaron múltiples veces con resultados pobres, utilizando generalmente células únicas en el caso de Haberlandt en 1902 ; o las puntas de las raíces, con el cual se conseguía crecimiento y el cultivo se mantenía en el tiempo, pero había muy poca proliferación según observó White en 1934. Por otro lado, Ball en 1946 describió con detalle la multiplicación por meristemos, indicando qué partes conseguían dar una planta entera. Esto sentó las bases para lo que más tarde se conocería como micropropagación. Finalmente, Kögl y sus colaboradores describieron en 1934 el ácido indolacético ( IAA) como una de las sustancias con propiedades inductoras del crecimiento, fomentando así su uso como auxina en los cultivos y dando por fin la oportunidad a los autores del momento de cultivar tejidos vegetales por períodos de tiempo ilimitados. Finalmente, Murashige y Skoog en 1962 pudieron regenerar una planta de tabaco a partir de callos con la ayuda de su medio de cultivo (Thorpe, 2007).
El cultivo in vitro de tejidos vegetales es útil tanto para el sector agrícola como para su uso en el campo de la biotecnología vegetal. Gracias a esta técnica, se pueden realizar estudios de anatomía, fisiología y desarrollo de las plantas; aislamiento de protoplastos, producción de plantas haploides, embriogénesis somática, obtención de cultivos libres de patógenos, producción de metabolitos secundarios, técnicas de ingeniería genética y micropropagación (Levitus et al., 2012).
A la hora de ejecutar esta técnica sin imprevistos, se debe de tener controlados los factores ambientales e intrínsecos en nuestros cultivos. Si no se lleva a cabo un seguimiento correcto, pueden aparecer problemas como mutaciones inesperadas, malnutrición del material vegetal, falta de crecimiento o de procesos como el enraizamiento, etc…
- Micropropagación
Es el procedimiento mediante el cual se multiplican plantas asexualmente de manera rápida, voluminosa y eficiente usando técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro (Castillo, 2004). Se suele realizar para obtener plantas libres de patógenos, replicar plantas con modificaciones genéticas o producir material vegetal a gran escala. El proceso de micropropagación se puede iniciar a partir de diversas partes de la planta madre (figura 3). En nuestro caso, utilizamos el método de propagación por brotes axilares.
Figura 3: Principales métodos de micropropagación. (George et al., 2008).
Esta técnica (George et al., 2008) se suele dividir en varias fases:
1. Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas: Es necesario que los cultivos se realicen en condiciones de asepsia y en condiciones óptimas, por lo que previamente al al cultivo in vitro se conserva la planta madre en condiciones nutricionales e hidratación adecuado para el desarrollo. De esta planta se obtendrán los explantes de donde se considere adecuado y se desinfectarán previamente al cultivo.
2. Introducción del material seleccionado in vitro: se inserta el material seleccionado en el medio de cultivo estéril. Después de una o dos semanas generalmente, empezará el proceso de germinación o regeneración del explante.
3. Multiplicación de los brotes: De los explantes que sobreviven se espera que aparezcan brotes con varias hojas y yemas que darán lugar a nuevos brotes. Estos brotes se subcultivan en un nuevo medio mediante divisiones y resiembra en ambiente estéril. De esta forma, se permite multiplicar el material vegetal de forma exponencial, dependiendo del número de brotes por explante que genere la especie en concreto con las condiciones en las que se tiene el cultivo.
4. Enraizamiento: Algunas plantas son capaces generar raíces directamente en el mismo medio donde se desarrollan los nuevos brotes. Sin embargo, otras especies necesitan ser trasladadas a un medio de enraizamiento con auxinas para promover este proceso.
5. Aclimatación: Los explantes recién enraizados son muy sensibles, ya que en esta etapa sufren cambios fisiológicos necesarios para adaptarse a las condiciones naturales. Se debe tener especial cuidado al retirar los restos de agar de las raíces de la planta y se debe de seleccionar un suelo adecuado para el desarrollo de ésta.
Se debe intentar que el cambio de in vitro a condiciones naturales sea lo más gradual posible para minimizar el estrés y aumentar la tasa de supervivencia.
En la siguiente imagen (figura 4) se ilustra el proceso y sus fases:
1.3 Reguladores del crecimiento
- Auxinas
Las auxinas son compuestos que actúan como hormonas vegetales caracterizadas generalmente por su capacidad de estimular el crecimiento de la planta. También se le suele llamar auxina a compuestos sintetizados por la planta con actividad fisiológica semejante a la del ácido indolacético (IAA), la primera auxina aislada. (Arteca, 1996). El término auxina proviene de la palabra griega “auxein”, que significa “crecer”.
La auxina más abundante en la naturaleza es el anteriormente mencionado ácido indolacético IAA, el cual se piensa que proviene del aminoácido triptófano. Las enzimas responsables de la biosíntesis de esta molécula son más activas en tejidos jóvenes como en meristemos apicales u hojas y frutos en crecimiento, viéndose la concentración de IAA aumentada en estos tejidos. Por ende, la concentración de IAA puede ser controlada por la biosíntesis de la propia molécula. Otra forma de controlar la concentración de éste es mediante la formación de conjugados, los cuales son derivados del IAA que no poseen actividad fisiológica, ya sea por modificaciones bioquímicas o por la unión del IAA a otro tipo de molécula. Los conjugados pueden ser rápidamente activados de nuevo dependiendo de estímulos y condiciones ambientales. El tercer y último método de regulación de auxinas en la planta es la degradación de éstas mediante procesos oxidativos. (Bandurski et al. 1995)
El mecanismo de acción de las auxinas por el que sucede la elongación celular viene dada por dos respuestas. En la primera y más rápida se estimula la síntesis de ATPasas y enzimas hidrolíticas de la pared celular. Las ATPasas bombean protones al espacio periplásmico, donde las expansinas (enzimas catalíticas) se activan debido al cambio de pH y contribuyen a la rotura de la pared. Por otro lado, la segunda respuesta.
más lenta, impide la inhibición de los genes que codifican para nuevos componentes de la pared celular, permitiendo que se renueve y expanda (Vanneste y Friml, 2009).
Las auxinas pueden causar una multitud de respuestas fisiológicas en las plantas.
Entre ellas se encuentran la estimulación de la elongación celular, la división de células
crecimiento secundario de raíces y crecimiento de flores; retardo de la senescencia de hojas y maduración de frutos, disminución o aumento de etileno y mediación de la respuesta de nastias y tropismos. (Mauseth, 1991) (Salisbury y Ross, 1992) Estos compuestos son, por tanto, muy útiles en agricultura e investigación ya que nos permiten la regulación de ciertos procesos fisiológicos en nuestras plantas de interés.
Cabe destacar de entre las auxinas el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), el cual es un compuesto sintético utilizado a menudo como herbicida selectivo debido a que las monocotiledóneas no responden a este compuesto, matando solo a las dicotiledóneas debido a un crecimiento descontrolado y letal a altas concentraciones. (Clark y Pazdernik, 2016) Sin embargo, a concentraciones menores se puede utilizar como una auxina sin matar a la planta.
Será esta auxina 2,4-D (figura 5) la que utilizaremos en nuestro proyecto debido a que tiene un efecto desdiferenciador muy potente. Además, el hecho de ser sintética produce un efecto aún más fuerte y persistente debido a que los mecanismos de degradación naturales de la planta no son capaces de eliminar este compuesto (Peterson et al., 2016)
Figura 5: Estructura química del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Imagen de dominio público.
- Citoquininas
Las citoquininas son un tipo de fitohormonas que promueven la división celular y la diferenciación de células y tejidos; además de tener otras funciones similares a la kinetina, la primera citoquinina aislada. Su nombre proviene de la palabra “citocinesis”
que significa división celular (Plant-hormones info.).
Estas fitohormonas se encuentran en altas concentraciones generalmente en regiones meristemáticas y tejidos en crecimiento. La biosíntesis de estas moléculas viene dada por la modificación de la adenina, dando lugar generalmente a zeatina, la citoquinina más abundante en la naturaleza, aunque se pueden formar diferentes citoquininas con pequeños desvíos o modificaciones en la vía de síntesis de éstas. Por otro lado, la degradación de estas moléculas ocurre generalmente por la enzima citoquinina oxidasa, que elimina su cadena lateral y libera la adenina.
Los efectos fisiológicos de las citoquininas son muy diversos. En la célula, controlan el ciclo celular, controlan la diferenciación mediante la regulación de genes determinantes del destino celular; y controlan el desarrollo de los cloroplastos y la síntesis de pigmentos fotosintéticos, siendo común una alta cantidad de citoquininas en estos tejidos jóvenes fotosintéticos. Por otro lado, en la planta en sí regula la dominancia apical junto a las auxinas, teniendo un efecto antagónico entre sí ya que las citoquininas la promueven y las auxinas la inhiben. También participan en el retraso de la senescencia foliar al ralentizar la degradación de compuestos como las clorofilas, proteínas o lípidos de las hojas; y en la expansión de los cotiledones durante la germinación (Schaller et al., 2014).
Otra molécula con estas mismas propiedades es el thidiazuron (TDZ) (figura 6), la cual nos servirá para controlar estos procesos fisiológicos en el laboratorio. El TDZ es interesante por motivos muy similares al 2,4-D. De nuevo, se trata de una molécula con un efecto regulador muy intenso, induciendo la brotación. Este efecto tan intenso se debe en parte a que TDZ es una molécula sintética por lo que no puede ser eliminada por los sistemas de degradación naturales de la planta.
El mecanismo de acción de TDZ no se conoce en su totalidad. Hay 2 principales hipótesis: la primera es que la propia molécula se una a los receptores proteicos de citoquininas, actuando como tal y participando en los mecanismos reguladores de genes marcadores de destino celular; la segunda es que el TDZ estimule la producción de citoquininas en la propia planta o que cambie la conformación de citoquininas de desactivadas a activadas mediante la interacción con enzimas, teniendo a efectos prácticos el mismo resultado. Cabe la posibilidad de que estas dos hipótesis no se excluyan entre sí y en la realidad se den estos dos procesos a la vez (Ahmad y Faisal, 2018).
Figura 6: Estructura química de thidiazuron (TDZ). Imagen de dominio público.
2. ANTECEDENTES
Este estudio nace de la forma en la que se han propagado los cultivos de Ipomoea batatas hasta el momento. Por lo general, los explantes se insertan en medios de cultivo con el regulador formando parte de éste, dejando el tejido vegetal crecer durante semanas (Caputo et al., 2020) (Abubakar et al., 2018). Esto produce que los explantes pasen mucho tiempo expuestos a los efectos del regulador, lo cual puede inducir daños genéticos y afectar a la capacidad morfogénica, a la replicación y a la calidad general de la planta final (Ozkul et al., 2016).
En otras especies como pueden ser la caña de azúcar (Kumari et al., 2017), garra del diablo (Grabkowska et al., 2014) o rosa (Singh y Sayamal, 2001) se ha dado con éxito un efecto morfogénico con una exposición de tan solo 12, 24 o 48 horas. Estos hechos nos han llevado a preguntarnos si el mismo procedimiento podría ser utilizado en batata con el fin de reducir el tiempo de exposición a reguladores y mejorar así la calidad del producto final.
3. OBJETIVOS
En base a los datos mencionados anteriormente, los objetivos de este proyecto son:
1. Optimizar los medios de producción de Ipomoea batatas in vitro
2. Comprobar si administrar las fitoreguladores a los cultivos en pulsos de 24h en lugar de una exposición contínua tiene algún beneficio
3. Describir los cambios morfológicos experimentados por los cultivos de Ipomoea batatas debido a la administración de auxinas (2,4-D) y citoquininas (TDZ).
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Obtención del material vegetal
El material vegetal utilizado en este proyecto proviene del Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura (CEBAS-CSIC) en Murcia. En estas instalaciones, se mantienen cultivos de forma continuada de especies útiles para las líneas de investigación del centro. En nuestro caso, pudimos trabajar con la especie Ipomoea batatas, la cual se mantiene en un cultivo de entrenudos en frascos de plástico aptos para cultivos (figura 8), siendo micropropagadas mediante subcultivos cada mes y medio aproximadamente (figura 9). Estos subcultivos se realizan en condiciones de esterilidad y parten de brotes que han alcanzado de 5 a 6 entrenudos con presencia de hojas y raíz, y se utiliza el medio de cultivo base MS (Murashige y Skoog, 1962) el cual contiene altas concentraciones de iones amonio NH4+ (20.6 mM), iones nitrato NO3- (39.4 mM), iones cloro Cl- (6.0 mM) y MoO4- (1.0 mM) (figura 7). Estos brotes se dividen en sesiones de 1 entrenudo y se introduce cada uno a un tubo de vidrio con medio de cultivo MS. Por último, se deja crecer una cámara de cultivo a 25ºC, 60% de humedad y 16 horas de luz diarias.
Para nuestro experimento, realizamos el procedimiento de propagación del material en el laboratorio de Ciencias Ambientales y Recursos Naturales de la Universidad de Alicante y recogimos 50 brotes del cultivo de Ipomoea batatas para realizar la experimentación.
Figura 8: Ejemplar de Ipomoea batatas micropropagada y cultivada in vitro.
4.2 Preparación de las muestras y exposición a reguladores
Los brotes obtenidos se cortaron en secciones de 1 entrenudo y se les retiró las hojas en campana de flujo laminar con la ayuda de pinzas, bisturí y placa petri; de forma que en un futuro queden mínimo 2 nudos enterrados en el medio base y otros 2 queden expuestos. Los entrenudos se traspasaron a 7 recipientes de vidrio con medio de cultivo líquido MS cada uno con un tratamiento distinto. Se utilizó un grupo control, al cual no se le añadió ninguna fitohormona en el medio líquido pero que siguió el mismo procedimiento con el fin de homogeneizar la experimentación. A los grupos 2, 3 y 4 se les añadió un suplemento al medio base líquido de 1 mg/L, 10 mg/L y 100 mg/L de la auxina 2,4-D, respectivamente. Por otro lado, a los grupos 5, 6 y 7 se les administró en el medio base 1 mg/L, 10 mg/L y 100 mg/L respectivamente de la citoquinina TDZ. Los 7 grupos de entrenudos permanecieron en suspensión y en agitación a 90 rpm durante 24 horas, de las cuales 16h fueron con luz y 8h fueron en oscuridad. Este procedimiento se lleva a cabo para exponer los brotes a “pulsos” de fitohormonas de muy corta duración.
Más adelante se evaluará qué resultados conlleva este proceso.
4.3 Crecimiento de los entrenudos
Al día siguiente, bajo una campana de flujo laminar, se secan los explantes con papel de filtro para retirar los residuos de fitohormonas presentes en el cultivo líquido anterior y se realiza un lavado en un medio líquido MS sin reguladores durante 10 minutos en agitación. Una vez realizado el lavado, los explantes son trasladados a tubos de vidrio con tapón aptos para cultivo in vitro (2,5 cm de diámetro, 15 cm de alto), los cuales contienen medio sólido MS (solidificado con agar 7’5 g/L) sin reguladores. Los tubos con las muestras se dejaron incubar durante 6 semanas para dar tiempo a que se lleve a cabo un crecimiento observable. Las condiciones de crecimiento fueron las anteriormente mencionadas en el proceso de micropropagación de batata. Pasado este tiempo, se volvió al laboratorio para observar el efecto que tuvo el procedimiento sobre el crecimiento de
5. CRONOGRAMA
6. RESULTADOS
● Grupo control
El grupo control muestra un patrón de crecimiento normal.
Figura 10: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento sin exposición a fitohormonas exógenas.
● Tratamiento 2,4-D
- 1 mg/L 2,4-D
La administración de esta concentración de 2,4-D indujo la formación de callos nodulares.
Figura 11: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 1 mg/L de la auxina 2,4-D durante 24 h.
- 10 mg/L 2,4-D
Al exponerla a una concentración un orden de magnitud mayor se desata una respuesta más fuerte aparente al observar las mayores dimensiones del callo.
Figura 12: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 10 mg/L de la auxina 2,4-D durante 24 h.
- 100 mg/L 2,4-D
A un nivel tan alto de concentración, la auxina tuvo un efecto inhibitorio del crecimiento debido a sus propiedades tóxicas, aunque aún se observa un vestigio de crecimiento calloso.
Figura 13: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 100 mg/L de la auxina 2,4-D durante 24 h.
- Comparación de los tratamientos con 2,4-D
Figura 14: Comparación visual del efecto morfológico que ha tenido la exposición a diferentes concentraciones de 2,4-D en los grupos 2 y 3 respecto al control.
● Tratamiento TDZ
- 1 mg/L TDZ
Al exponer los explantes a esta baja concentración de TDZ se observa un efecto inductor de la brotación-
Figura 15: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 1 mg/L de la citoquinina TDZ durante 24 h.
- 10 mg/L TDZ
A la concentración de 10 mg/L de TDZ se hace aparente un efecto inhibitorio del crecimiento.
Figura 16: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 10 mg/L de la citoquinina TDZ durante 24 h.
- 100 mg/L TDZ
De nuevo, a concentraciones tan altas de TDZ se ha inhibido el crecimiento.
Figura 17: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 100 mg/L de la citoquinina TDZ durante 24 h.
- Comparación de los tratamientos con TDZ
Figura 18: Comparación visual del efecto morfológico que ha tenido la exposición a diferentes concentraciones de 2,4-D en los grupos 2 y 3 respecto al control. 1→ 0 mg/L TDZ, 5 → 1mg/L TDZ, 6→ 10 mg/L TDZ, 7→ 100 mg/L TDZ.
● Brotación por cada tallo propagado
Número de tallos por explante
Control (grupo 1)
1 1 1 1 1 1 1
1 mg/L TDZ (grupo 5)
7 3 3 2 4 3 2
10 mg/L TDZ (grupo 6)
0 0 0 0 0 0 0
100 mg/L TDZ (grupo 7)
0 0 0 0 0 0 0
Tabla 1: Recuento de tallos brotados por cada explante de los grupos control (sin reguladores), 5 (con 1 mg/L TDZ), 6 (10 mg/L TDZ) y 7 (100 mg/L TDZ).
● Análisis estadístico comparando el número de tallos respecto a la exposición con TDZ
Figura 19: Diagrama de barras que muestra las medias de tallos por muestra de cada grupo. Se compara el grupo control con el grupo que recibió 1 mg/L de la citoquinina TDZ. Se realizó un análisis estadístico ANOVA con la herramienta de análisis de datos del programa Excel con el resultado de un p valor = 0,0028 (<0,05), siendo n = 7 por cada grupo. La varianza es de 0 en el
7. DISCUSIÓN
7.1 Efectos de la auxina 2,4-D
Como se puede observar en la figura 11, no hay crecimiento de raíces, hojas o tallos. El único crecimiento que se ha llevado a cabo es en forma de callos. Este tipo de crecimiento contrasta drásticamente con el que ha tenido el grupo control (figura 10), haciendo evidente el cambio morfológico que ha producido el hecho de exponer los entrenudos del grupo 5 a 1 mg/L de 2,4-D durante 24 horas. Durante el desarrollo normal, se da lugar a la organogénesis, proceso por el cual los tejidos se diferencian y forman estructuras funcionales como pueden ser las hojas o las raíces. Sin embargo, la exposición a bajas concentraciones de 2,4-D ha producido un proceso de desdiferenciación, siendo evidente en la aparición de callos desdiferenciados en los brotes del grupo 5. Este efecto callogénico de 2,4-D sobre plantas en desarrollo se ha reportado en muchas especies, entre ellas el trigo (Mendoza y Kaeppler, 2002), donde además se reporta la capacidad de regenerar una planta entera a partir de estos callos con el tratamiento hormonal adecuado.
La exposición a esta auxina provoca una serie de divisiones mitóticas en las células madre del tejido, produciendo la aparición de los callos (Freire, 2003) El proceso donde a partir de células somáticas somos capaces de dar lugar a un embrión sin la fusión de gametos se conoce como embriogénesis somática, y éste proceso se ha podido llevar a cabo a partir de callos generados en cualquier parte de la planta (Copeland y McDonald, 1995) Esto abre una ventana de posibilidades muy grande, ya que se podría utilizar para realizar modificaciones genéticas en estas células indiferenciadas para más tarde regenerar y replicar los clones, o se podría diferenciar estas células manipulándolas mediante reguladores para obtener un tejido u órgano concreto. La estructura más granular de los callos producidos por el grupo 5 (figura 11) puede sugerir que sí puedan ser usados como precursores para la embriogénesis somática (Blazquez et al.,, 2009). Sin embargo, otros estudios serían requeridos para comprobar que de verdad tienen esta capacidad y hasta qué punto podría usarse en el laboratorio. Cabe destacar que el tratamiento con 2,4-D puede haber generado una variación genética en los tejidos, aunque cabría esperar que este efecto se haya minimizado debido a la corta exposición de las muestras con la auxina.
Por otro lado, en el grupo 3 de brotes (figura 12), el cual se expuso a 10 mg/L de 2,4-D durante 24 horas, también se ha producido un proceso de desdiferenciación, mostrando un crecimiento de callo unas 4 veces mayor que el grupo 2. Sin embargo, en apariencia parece más “acuoso”, por lo que parece menos embriogénico que los callos más granulares del grupo 2 y puede que no sean adecuados para los procesos de embriogénesis somática anteriormente mencionados, además de que una mayor exposición a 2,4-D puede haber generado una mayor variación genética . De nuevo, se necesitaría realizar más estudios para conocer el potencial de estos explantes y si su genoma está dañado.
Finalmente, observando el grupo 4 (figura 13), nos damos cuenta de que la exposición a 100 mg/L de 2,4-D resultó tóxica para esta especie debido a que no se aprecia prácticamente crecimiento. Por lo general, grandes concentraciones de auxinas resultan tóxicas para las plantas (Cline, 1996).
La forma tradicional de exponer un cultivo a una auxina era mediante su aplicación en el medio de cultivo donde crecerá. En nuestro caso, la exposición fue tan solo durante 24 horas y después se utilizó un medio de cultivo normal MS para su crecimiento. Para conseguir los cambios morfológicos vistos en los grupos 2 y 3 (figura 14) utilizando el método tradicional, tomaría entre 4 y 6 semanas de exposición, mientras que en nuestro caso conseguimos el mismo resultado con solo un día de exposición (Carvalho et al., 1997).
7.2 Efectos de la citoquinina TDZ
La figura 15 muestra el resultado de administrar 1 mg/L de TDZ durante 1 hora a los explantes. Se puede apreciar cómo hay un mayor número de tallos respecto al grupo control (tabla 1). Además, la diferencia en las medias de los tallos por explante resulta
un efecto menos morfogénico sobre los entrenudos explantados, promoviendo la proliferación axilar. (Singh y Sayamal, 2001). Los tallos tienen una apariencia más pequeña en el grupo 5 debido a que al haber múltiples tallos en el mismo medio, éstos compiten por los recursos disponibles. Esto no supone un problema, ya que los tallos pueden ser propagados individualmente a un medio normal para que cada uno de ellos dé lugar a una planta. También se observa cómo la génesis de raíces se encuentra algo reducida en el grupo 5 respecto al control. Esto se debe a que la planta pone su esfuerzo en la creación de nuevos tallos en lugar de expandir las raíces. De hecho, la producción de raíces detendría la multiplicación de los explantes. En este tratamiento no hay formación de callo, por lo que se descarta la posibilidad de que éste pueda crear variación genética o crecimiento adventicio.
El tratamiento de TDZ a concentración 1 mg/L durante 24 horas parece una forma muy eficiente de conseguir un gran índice de multiplicación de plantas de Ipomoea batatas debido a su gran capacidad embriogénica (Ahmad y Faisal, 2018). Utilizando este método, se podrían micropropagar grandes cantidades de esta planta en un corto período de tiempo, lo cual puede resultar beneficioso tanto para el cultivo agrícola de batata como para la investigación.
Por otro lado, los tratamientos de 10 mg/L (figura 16) y 100 mg/L (figura 17) no resultaron en ningún tipo de crecimiento. De igual forma que sucede con las auxinas, las citoquininas también resultan tóxicas a concentraciones mayores (Grabkowska et al., 2014), por lo que en estos casos se detuvo por completo el desarrollo de la planta dejando la concentración aproximada de 1 mg/L como la más viable (figura 18).
De nuevo, cabe mencionar que este procedimiento podría llegar a optimizarse si se experimenta con rangos de valores más cercanos a 1 mg/L sin llegar a exceder los 10 mg/L (para evitar el efecto tóxico) ya que cabe la posibilidad de que 1 mg/L no sea el valor con mayor tasa de multiplicación para Ipomoea batatas aunque sí que lo sea de entre las concentraciones elegidas para este proyecto.
8. CONCLUSIONES
Las conclusiones de este proyecto son las reflejadas a continuación:
1. Una corta exposición a los reguladores TDZ y 2,4-D en Ipomoea batatas produce efectos morfogénicos, por lo que no es necesario exponer los cultivos a estas sustancias por tiempos prolongados, potencialmente mejorando la viabilidad de éstos.
2. Las concentraciones, tanto de TDZ como de 2,4-D, que mostraron resultados más potencialmente interesantes fueron de 1 mg/L en ambos casos.
3. 2,4-D provocó un efecto altamente desdiferenciador sobre Ipomoea batatas. Por otro lado, el efecto de TDZ provocó una brotación axilar.
CONCLUSIONS
The conclusions learned from this project are as below:
1. A short exposition of the regulators TDZ and 2,4-D on Ipomoea batatas produces morphogenic effects, meaning that it is not necessary to expose the plants to this substances for long periods of time, potentially weakening their viability.
2. The concentrations that showed more potentially interesting results were 1 mg/L both in TDZ and in 2,4-D.
3. 2,4-D induced an highly dedifferentiative effect on Ipomoea batatas. On the other hand, the effect of TDZ induced axillary sprouting.
9. BIBLIOGRAFÍA
Abubakar A S, Yahaya S U, Shaibu A S, Ibrahim H, Lawan Z M, Isa A M. (2018) In vitro propagation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) cultivars. Sci. Digest 38(1): 17-21 pp.
Ahmad N, Faisal M. (2018) Thidiazuron: From Urea Derivative to Plant Growth Regulator. Springer. First edition. 489 pp.
Atreca R N. (1996) Plant Growth Substances: Principles and Applications (English Edition). Springer. Edición 1996. 350 pp.
Austin D, Huáman Z. (1996) A Synopsis of Ipomoea (Convolvulaceae) in the Americas.
Taxon 45: 3-38.
Bandurski R S, Cohen J D, Slovin J, Reinecke D M. (1995). Auxin biosynthesis and metabolism. Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology.
Dordrecht: Kluwer. 39-65 pp.
Blazquez S, Olmos E, Hernández J A, Fernández-García N, Fernández J A, Piqueras A.
(2009) Somatic embryogenesis in saffron (Crocus sativus L.). Histological differentiation and implication of some components of the antioxidant enzymatic system. Plant Cell Tiss Organ Cult 97:49–57 pp.
Calva C G, Rios L E. (1999). Cultivo de callos y acumulación de metabolitos secundarios. Aspectos aplicados de la biotecnología. Rodríguez V. R., Calva C. G., Ramos R. E. G., Salazar M. A. (Eds.). 267-301 pp.
Thorpe T A. (2007) History of Plant Tissue Culture. Molecular Biotechnology 37(2):
169-80.
Caputo G A, Wadl P A, McCarty L, Adelberg J, Jennings K M, Cutulle M. (2020) In Vitro Safening of Bentazon by Melatonin in Sweetpotato (Ipomoea batatas). Hort Science 55(9):1406-1410 pp.
Carvalho C H S, Bohorova N, Bordallo P N, Abreu L L, Valicente F H, Bressan W, Paiva E. (1997) Type II callus production and plant regeneration in tropical maize genotypes. Plant Cell Reports 17: 73–76 pp.
Castillo A. (2004). Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho tiempo. INIA. 8 pp.
Clark D P, Pazdernik N J. (2016) Biotechnology: Applying the Genetic Revolution.
Academic Cell. Second Edition. 461-492 pp.
Cline M G. (1996) Exogenous Auxin Effects on Lateral Bud Outgrowth in Decapitated Shoots. Annals of Botany 78(2): 255-266 pp.
Copeland L O, McDonald M B. (1995). Principles of Seed Science and Technology.
Chapman Hall. 3ª Edición. 409 pp.
Engel F. (1970). Exploration of the Chilca Canyon. Current Anthropology. 11: 55-58
Freire Seijo M. (2003) Aspectos básicos de la embriogénesis somática. Biotecnología Vegetal 3(4): 195 - 209 pp.
George, E.F., Hall, M.A., Klerk, GJ.D. (2008). Micropropagation: Uses and Methods.
George, E.F., Hall, M.A., Klerk, GJ.D. (eds). Springer, Dordrecht. 29-64 pp.
Grabkowska R, Sitarek P, Wysokinska H. (2014) Influence of thidiazuron (TDZ) pretreatment of shoot tips on shoot multiplication and ex vitro acclimatization of Harpagophytum procumbens. Acta Physiol Plant 36:1661–1672 pp.
Issa F H, NajiAlhasnawi A, Sabah S S. (2018) Influence od gamma radiation on in vitro growth microtubersation and hormonal content of some potato (Solanum tuberosum L.) cultivars. Plant Archives 18(2): 2317-2323 pp.
Islam S. (2006) Sweetpotato (Ipomoea batatas L.) Leaf: Its Potential Effect on Human Health and Nutrition. Journal of food science 71(2): 13-121.
Kumari K, Lal M, Saxena S. (2017) Enhanced micropropagation and tiller formation in sugarcane through pretreatment of explants with thidiazuron (TDZ). 3 Biotech 7:282 pp.
Loebenstein G, Thottappilly G. (2009) The Sweetpotato. Dordrecht : Springer Netherlands. 1ª Edición. 522 pp.
Levitus G, Echenique V, Rubistein C, Hopp E, Mroginski L. (2012) Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II. Ediciones INTA. 295-569 pp.
Martí H R, Corbino G B, Chludil, H. D. (2011). La batata, el redescubrimiento de un cultivo. Ciencia Hoy. 121
Mauseth J D. (1991) Botany : an introduction to plant biology. Philadelphia : Saunders College Pub. 720 pp.
Peterson M A, McMaster S A, Riechers D E, Skelton J, Stahlman P W. (2016) 2,4-D Past, Present, and Future: A Review. Weed Technology 30: 303–345 pp.
Meira M, Pereira da Silva E, M. David J, P. David J. (2012) Review of the genus Ipomoea: traditional uses, chemistry and biological activities. Revista Brasileira de Farmacognosia 22(3): 682-713.
Mendoza M G, Kaeppler H F. (2002) Auxin and sugar effects on callus induction and plant regeneration frequencies from mature embryos of wheat (Triticum aestivum L.).
Plant 38: 39–45 pp.
Monthony A, Page S R, Heasmi M, Jones A M. (2021) The Past, Present and Future of Cannabis sativa Tissue Culture. Plants 10(185).
Murashige T, Skoog F. (1962) A revised medium for the rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473– 497 pp.
Ozkul M, Alev Ozel C, Yuzbasioglu D, Unal F. (2016) Does 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) induce genotoxic effects in tissue cultured Allium roots?. Cytotechnology 68: 2395–2405 pp.
Salisbury F B, Ross C W. (1992) Plant Physiology, Hormones and Plant Regulators:
Auxins and Gibberellins. Wadsworth Publishing. 4th Edition, 357-381 pp.
Schaller G E, Street I H, Kieber J J. (2014) Cytokinin and the cell cycle. Curr Opin Plant Biol. 21: 7-15.
Singh S K, Syamal M M. (2001) A short pre-culture soak in thidiazuron or
forchlorfenuron improves axillary shoot proliferation in rose micropropagation. Scientia Horticulturae 91: 169-177 pp.
Wagner H. (1973) The chemistry of the resin glycosides of the Convolvulaceae family.
Medicine and Natural Sciences, Chemistry in Botanical Classification. Academic Press.
New York. 235-240 pp.
Withers L A, Street H E. (1977). Freeze-preservation of cultured plant cells. III. The pregrowth phase. Plant Physiol 39: 171-178.
Vanneste S, Friml J. (2009) Auxin: a trigger for change in plant development. Cell 136(6):
1005-16.
https://www.fao.org/faostat/
Food and Agriculture Organization of the United Nations
https://plant-hormones.info/cytokinins/
Plant hormones information.
