Aislamiento e identificación de cepas de levaduras con elevada capacidad de producción de biodiesel

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y

PARASITOLOGÍA

Aislamiento e identificación de cepas de levaduras con elevada capacidad de producción de biodiesel

Tesis

para optar el Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo

AUTOR : Br. Méndez Polo, César Alexander

ASESORA: Dra. Soriano Bernilla, Bertha Soledad

Trujillo – Perú 2019

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Dedicatoria

A Dios

Por guiar mi camino y darme fuerza para salir adelante

A mis Padres

Por su paciencia y comprensión; y por apoyarme incondicionalmente

A mi Familia

Por su motivación y consejos brindados.

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Jurado dictaminador

Los profesores que suscriben, miembros del jurado, declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo aprobado por UNANIMIDAD.

______________________________

Ms. C. Wilson Krugg, Juan Presidente

_____________________________

Ms. C. Quintana Diaz, Anibal Secretario

_____________________________________

Dra. Soriano Bernilla, Bertha Soledad Vocal

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Agradecimientos

A mi asesora Dra. Bertha Soledad Soriano Bernilla y a mi co-asesor Dr. Victor Javier Vásquez Villalobos, por su apoyo, tiempo y sus buenos consejos que me ayudaron en la realización de la presente tesis.

A la Dra. Manuela Luján Velásquez, por su apoyo incondicional durante la preparación de los medios de cultivo empleados en esta investigación.

Al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica y a Cienciactiva por haber permitido mi capacitación en la Universidad Federal de Viçosa – Brasil, así como la ejecución y presentación de esta tesis.

Al laboratorio de biomoléculas de la facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Trujillo, lugar donde se llevó a cabo el desarrollo experimental de esta tesis.

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Índice

Dedicatoria ... ii

Jurado dictaminador ... iii

Agradecimientos ... iv

Índice ... v

De la Asesora ...vii

Presentación ... viii

Resumen ... ix

Abstract ... x

I. Introducción ... 01

II. Material y Métodos ... 05

2.1 Material de estudio ... 05

2.2 Procedimiento ... 05

2.2.1 Toma de muestras de suelo ... 05

2.3 Aislamiento de levaduras ... 05

2.3.1 Preparación de medio liquido de enriquecimiento ... 05

2.3.2 Siembra e incubación ... 05

2.3.3 Preparación del medio selectivo para levaduras oleaginosas ... 06

2.3.4 Cultivo en medio selectivo ... 06

2.3.5 Obtención de cultivos morfológicamente puros ... 06

2.4 Producción de aceite biodiesel en medio con baja concentración de nitrógeno .. 06

2.4.1 Preparación de medio liquido YPD ... 06

2.4.3 Preparación de tampón citrato fosfato pH 7,0 ... 07 2.4.4 Cálculo de porcentaje de carbono y nitrógeno en las fuentes utilizadas

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y la masa necesaria para lograr una concentración 100:1 ... 07

2.4.5 Preparación de medio C/N 100:1 ... 07

2.5 Selección de cepas con elevada capacidad productora de biodiesel por método gravimétrico ... 08

2.5.1 Obtención de biomasa seca inicial ... 08

2.5.2 Lisis de pared celular y adición de solventes ... 08

2.5.3 Obtención de biomasa seca final ... 08

2.5.4 Cálculo de porcentaje de producción de lípidos ... 09

2.5.5 Conservación de cepas con elevada producción de aceite ... 09

2.6 Identificación molecular de cepas con elevada capacidad productora de biodiesel ... 09

III. RESULTADOS ... 10

IV. DISCUSIÓN ... 15

V. CONCLUSIONES ... 18

VI. RECOMENDACIONES ... 19

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 20

ANEXOS ... 25

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De la Asesora

La que suscribe Dra. Bertha Soledad Soriano Bernilla asesora de la presente tesis titulada:

Aislamiento e identificación de cepas de levaduras con elevada capacidad de producción de biodiesel.

Certifica

Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con su correspondiente proyecto de Tesis y teniendo en cuenta las orientaciones pertinentes.

Que el informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas. Por ello, autorizo al Bachiller César Alexander Méndez Polo, para continuar con los procedimientos correspondientes según sus fines.

Trujillo, Septiembre del 2019

Dra. Bertha Soledad Soriano Bernilla Asesora

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Presentación

Señores miembros del jurado dictaminador

Cumpliendo con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grado y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a su consideración y elevado criterio la presente tesis titulada Aislamiento e identificación de cepas de levaduras con elevada capacidad de producción de biodiesel, con el objetivo de obtener el título de Biólogo- Microbiólogo.

Espero que este trabajo sea de su aprobación.

Trujillo, Septiembre del 2019

_____________________________

Br. Méndez Polo, César Alexander

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Resumen

Se evaluó la viabilidad de aislar del ambiente cepas de levaduras con elevada capacidad de producción de aceite (biodiesel). Para ello, se tomaron muestras de suelo de cuencas (márgenes y bosques) de cuatro ríos con diferentes pisos altitudinales, ubicados en las regiones de La Libertad, Lambayeque, Ancash y Cajamarca. Éstas fueron incubadas en 50 mL de medio liquido enriquecido con glicerol (30ºC/80 rpm/48 h), y posteriormente se incubaron en medio selectivo para levaduras (30ºC/96 h). Las colonias obtenidas fueron repicadas en el mismo medio para obtener cultivos puros. Se evaluó la capacidad de producción (acumulación) de aceite y para ello, las levaduras fueron sembradas en un medio con déficit de nitrógeno C:N 100:1, donde las fuentes de carbono y nitrógeno fueron xilosa y sulfato de amonio respectivamente. Se aplicó el método de ultrasonido para el rompimiento de la pared celular de las levaduras y se usó etanol absoluto, cloroformo y éter de petróleo como solventes de lípidos. El cálculo de porcentaje de acumulación de lípidos se realizó mediante gravimetría. Se obtuvieron 3 colonias de levaduras que sobrepasaron el 20% de acumulación de aceite. La identificación molecular de las levaduras oleaginosas aisladas se realizó amplificando la región ITS (internal transcribed spacer), del ADN ribosómico conservado, usando los primers ITS1 e ITS4, y los productos amplificados se secuenciaron utilizando la técnica de Sanger. Se identificó Rhodotorula Kratochvilova, Rhodotorula glutinis y Rhodotorula mucilaginosa con una producción de biodiesel de 29,7%, 31,55% y 23,1% respectivamente. Se concluye que las 3 cepas de levaduras con elevada capacidad de producción de biodiesel se aislaron a partir de muestras de suelo tomadas de cuencas de ríos de las regiones de La Libertad y Cajamarca.

Palabras clave: Rhodotorula, levaduras oleaginosas, biodiesel

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Abstract

The viability of isolating yeast strains with high oil production capacity (biodiesel) was evaluated from the environment. To do this, soil samples were taken from basins (margins and forests) of four rivers with different altitude levels, located in the regions of La Libertad, Lambayeque, Ancash and Cajamarca. These were incubated in 50 mL of glycerol-enriched liquid medium (30ºC / 80 rpm / 48 h), and subsequently incubated in selective medium for yeast (30ºC / 96 h). The single colonies were picked in the same medium to establish a pure culture. The production capacity (accumulation) of oil was evaluated, the yeast were inoculated in a medium with a C: N 100: 1 nitrogen deficit (carbon and nitrogen sources were xylose and ammonium sulfate respectively). Ultrasound method was used to disrupt cell walls and absolute ethanol, chloroform and petroleum ether were used as lipid solvents.

The lipid accumulation was determined using the gravimetric method. The gravimetric results indicated that three pure cultures were able to accumulate over 20% of lipid substances in their cells. Molecular identification of oleaginous yeast isolates was done by amplifying the internal transcribed spacer (ITS) region of the conserved ribosomal DNA using primers ITS1 and ITS4 and this amplified ITS products were sequenced using the Sanger method. Rhodotorula Kratochvilova, Rhodotorula glutinis and Rhodotorula mucilaginosa were identified with a biodiesel production of 29.7%, 31.55% and 23.1%

respectively. It is concluded that the 3 yeast strains with high biodiesel production capacity were isolated from soil samples taken from river basins in the regions of La Libertad and Cajamarca.

Key Words: Rhodotorula, oleaginous yeast, biodiesel

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Introducción

Actualmente existe una gran preocupación respecto al aumento de la contaminación ambiental y el calentamiento global, gran parte de este ocasionado por la emisión de gases con efecto invernadero. Incluso cuando la sociedad sabe que el principal responsable de esto es el empleo masivo de combustibles fósiles, no se puede evitar su utilización. En los últimos años se ha evidenciado una creciente demanda de éstos en la economía mundial, lo que conlleva al agotamiento de las reservas conocidas de hidrocarburos, elevando así, el precio de venta de combustibles en el mundo. ¹

Debido a esta situación, también se ha incrementado la demanda de fuentes alternativas de energía basadas en procesos sustentables, renovables y amigables con el medio ambiente.

Como respuesta a esta necesidad, se tiene a los biocombustibles como el bioetanol y el biodiesel, los cuales son una fuente alternativa bioenergética renovable que ha ganado especial interés, producto de las ventajas que aportan desde el punto de vista medio ambiental, social, económico y político. ²

Dentro de las ventajas que ofrece el biodiesel se encuentra su condición de fuente de energía renovable y biodegradable, es menos agresivo a la salud por no contener azufre y posee un contenido de hidrocarburos aromáticos bajo, es compatible con la mayoría de los motores diesel actualmente en el mercado; posee propiedades lubricantes que reducen el desgaste del motor, por lo que resulta menos tóxico; es más seguro que el diesel, pues puede transportarse, manipularse y mantenerse en condiciones menos exigentes debido a su punto de inflamación mayor (100 -170 °C). ³

El biodiesel consiste de una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos, los cuales pueden ser obtenidos por simple etapa de transesterificación de los triacilgliceroles (TGAs) ⁴ que comúnmente provienen de aceites vegetales y grasas animales; esto ha generado controversia debido a que su producción a partir de cultivos vegetales originalmente destinados al consumo humano, representa el 75% del costo de la producción de biodiesel. ⁵Este inconveniente ha llevado a buscar fuentes alternativas para la producción de biodiesel,

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siendo los aceites unicelulares (Single cell oils, SCOs), los candidatos potenciales, que pueden ser producidos por microorganismos oleaginosos como las bacterias, levaduras, hongos y algas, capaces de acumular por lo menos el 20% de su masa celular seca como lípidos. ⁶ Cuya producción no compite con el suministro de alimentos, ya que pueden utilizar residuos agroindustriales y subproductos, no necesitan tierras de cultivo, ni están a expensas de los cambios climáticos y sus tiempos de cultivo son más cortos que los cultivos tradicionales. Asimismo sus subproductos que son producidos concomitantemente con SCOs por los microorganismos, tienen altos precios, tales como los carotenoides y ácidos grasos poliinsaturados. ⁵

Investigadores han demostrado que las levaduras nativas tienen alta capacidad de producir lípidos, las que pueden ser aisladas de los ambientes naturales que ofrece nuestra gran biodiversidad microbiana. ⁷

Las levaduras oleaginosas conforman un grupo numeroso de microorganismos heterótrofos, productores de aceites capaces de crecer en fuentes carbonadas naturales con uso en la producción de biodiesel, estas levaduras tienen la capacidad de acumular un 20 % o más de su biomasa en forma de lípidos, generalmente triglicéridos. ⁸

Dentro de las especies de levaduras más prometedoras para la producción de grasas se encuentran: Rhodosporidium toruloides, R. gracilis, Lipomyces starkeii, L. lipofernus, L.

tetrasporus, Candida curvata, C. diddensiae, C. revkaufi, C. vernalis, C. pulcherrima, C.

tropicales, Cryptococcus curvatus, C. terricolus, C. albidus, C. laurentii, Endomycopsis vernalis, Hansenula ciferri, H. saturnus, Rhodotorula glutinis, R. gracilis, R. graminis, R.

mucilaginosa, Trychosporon cutancum, T. pullulans, Trigonopsis variables, Yarrovia lipolítica y Y. paralipolitica. 6, 9, 10, 11, 12, 13

En el año 2015 se investigó el potencial de producción de SCO en cepas de levaduras:

Yarrowia lipolytica, Cryptococcus curvatus, Rodosporidium toruloides y Lipomyces starkeyi. Determinando que R. turolides y L. starkeyi son potenciales productores de SCO. ⁷ En el mismo año se informó que Rhodosporidium sp. y Lipomyces sp., poseen alto

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rendimiento en lípidos de 42% y 48% respectivamente. ¹⁴ Se ha determinado que los azucares de madera pueden mejorar el crecimiento celular y la acumulación de lípidos en R.

toruloides. Debido a un aumento del coeficiente de transferencia de oxígeno en casi 15%, el que podría ser el principal mecanismo para este efecto. ¹⁵

Los ácidos grasos principales en los lípidos de levaduras son los ácidos mirístico, palmítico, esteárico, oleico, linoleico y linolénico. Esto se demostró al evaluar la composición lipídica de Rhodosporidium toruloides, R. Glutinis, Lipomyces starkeii, L. lipofera y Trichosporon Fermentans. Estos lípidos pueden ser empleados como materia prima para la producción de biodiesel, mediante la catálisis con el empleo de lipasas o de un catalizador químico. ^{16, 17}

Estudios realizados demostraron que algunas condiciones de cultivo como la relación molar Carbono/Nitrógeno (C/N), la fuente de nitrógeno, temperatura, pH, oxígeno disuelto y la concentración de sales trazas y sales inorgánicas tienen influencia en la acumulación de lípidos. ^18,19 Se puede establecer una relación inversamente proporcional entre el contenido de nitrógeno y la acumulación de lípidos. ²⁰ Se ha encontrado que las fuentes inorgánicas de nitrógeno favorecen el crecimiento microbiano, pero no la acumulación de lípidos, mientras fuentes orgánicas como la peptona favorecen la acumulación de lípidos, pero no el crecimiento celular ¹⁰. Tanto la biomasa celular como los lípidos pueden aumentar significativamente mediante la optimización de la concentración de los iones Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, y Ca²⁺. ¹⁹ El aumento de la concentración de oxígeno disuelto tiene una correlación positiva con la acumulación de lípidos. ¹³

Con el objetivo de reducir los costos de los aceites obtenidos de los microorganismos para la producción de biodiesel, es necesario encontrar otras fuentes de carbono además de la glucosa. En los reportes de la literatura aparecen xilosa, rabinosa, manosa, glicerol y otros desechos agroindustriales como fuentes de carbono para la acumulación de lípidos en levaduras. ²¹

En vista de que la información acerca del empleo de azucares de madera como fuentes de carbono que no solo optimizan el crecimiento, sino también, la producción de biodiesel en levaduras, se puede optar por emplear xilosa, la cual se encuentra en grandes cantidades

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dentro del bagazo residual de la caña de azúcar. El presente trabajo buscó aislar cepas de levaduras con alta capacidad de acumulación de aceite (biodiesel) a partir de muestras de suelo tomadas de márgenes y cuencas de ríos pertenecientes a las regiones de La Libertad, Lambayeque, Ancash y Cajamarca, con diferentes pisos altitudinales, en áreas específicas de vegetación arbórea.

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II. Material y Métodos 2.1. Material de estudio

Muestras de suelo recolectadas de márgenes y bosques de 4 ríos con distintos pisos altitudinales procedentes de Moche, Chicama, Jequetepeque y Santa (Anexo 01)

2.2. Procedimiento

2.2.1. Toma de muestras de suelo

Se muestrearon las cuencas de los ríos Chicama (Sausal y Punta Moreno), Santa (puente Panamericana Norte), Jequetepeque (presa Gallito Ciego y granja Porcon), y río Moche (Motil y El Paraiso). Los lugares fueron georeferenciados y se tomó las características del suelo. (Anexo 02)

Las muestras de suelo se recolectaron de 3 puntos aleatorios (formando un triángulo), se recolectó un total de 20 gramos de cada punto y se depositó en una sola bolsa de plástico. Este procedimiento se repitió 6 veces para cada zona evaluada. Las muestras se mantuvieron en refrigeración (4ºC), hasta el momento de su evaluación.

2.3. Aislamiento de levaduras potencialmente oleaginosas ⁴⁰ 2.3.1. Preparación del medio líquido de enriquecimiento

Se preparó 300 mL de medio de enriquecimiento (Anexo 03) en un matraz. El contenido fue repartido equitativamente entre 6 matraces de 250 mL. El medio se esterilizó en autoclave.

2.3.2. Siembra e incubación

Las muestras de suelo se homogeneizaron agitando fuertemente las bolsas que las contenían. Se agregó 1 g de cada muestra a los matraces con medio de enriquecimiento (Anexo 04). Se incubaron a 30º C, con una agitación constante durante 48 horas.

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2.3.3. Preparación del medio selectivo para levaduras oleaginosas

Se preparó 1 L de medio selectivo, en el que se usó xilosa como fuente de carbono (Anexo 05). El medio se esterilizó en autoclave, posteriormente se agregó el antibiótico cloranfenicol y se sirvió en placas Petri estériles (Anexo 06), estas se dejaron secar en la estufa a 20ºC por 12 horas.

2.3.4. Cultivo en medio selectivo

Se realizaron diluciones seriadas hasta obtener 10^-5 y 10^-6. Estas 2 últimas diluciones fueron sembradas por superficie en placas con medio selectivo para levaduras, las que fueron incubadas a 30ºC por 96 horas.

2.3.5. Obtención de cultivos morfológicamente puros

Las colonias de levaduras obtenidas fueron sembradas por estría en el mismo medio selectivo a 30°C por 96 horas, posteriormente se seleccionó una colonia de levadura al azar y se realizó una coloración simple y luego se observó microscópicamente para verificar su pureza. Se anotaron sus características macroscópicas (Anexos 07 -14), y fueron sembradas nuevamente en medio selectivo. Los cultivos obtenidos se mantuvieron en refrigeración a 4ºC.

2.4. Producción de aceite biodiesel en medio con baja concentración de nitrógeno ⁴⁰ 2.4.1. Preparación de medio líquido YPD (Yeast extract – Peptone - Dextrose)

Se preparó 300 mL de medio líquido YPD (Anexo 15) en un matraz. El contenido fue dividido entre 6 matraces de 250 mL. (50 mL por matraz). El medio se esterilizó en autoclave.

Se sembró una colonia de levadura de cada muestra en los matraces con medio YPD. Se incubó a 30ºC, con una agitación de 150 rpm durante 48 horas.

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2.4.3. Preparación de tampón citrato fosfato pH 7,0

Para su preparación se mezclaron las soluciones de ácido cítrico 0,1 M y fosfato de sodio bibásico (Anexo 16), en total se preparó 300 mL en un matraz.

2.4.4. Cálculo de porcentaje de carbono y nitrógeno en las fuentes utilizadas y la masa necesaria para lograr una concentración 100:1

Utilizando la masa molar de la xilosa y el sulfato de amonio, se obtuvo el porcentaje de carbono y nitrógeno en cada uno respectivamente. Obteniéndose 40% de carbono para la xilosa y 21% para el sulfato de amonio (Anexo 17).

2.4.5. Preparación de medio C/N 100:1

Se preparó 30 mL de solución de xilosa 40% (Anexo 18), la cual se adicionó a 270 mL de tampón citrato fosfato, junto al resto de reactivos (Anexo 19). El medio se preparó en un matraz de 1 L y posteriormente se sirvió en 6 matraces de 250 mL. Estos se esterilizaron en autoclave.

Utilizando una pipeta estéril, se tomaron 12 mL de los cultivos de levaduras enriquecidos en medio YPD y se adicionaron en tubos de plástico con tapa (previamente pesados), estos se llevaron a centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se obtuvo el peso de la biomasa para cada muestra. Toda la biomasa obtenida de cada muestra, fue adicionada a los matraces con medio C/N 100:1. Se incubó a 30ºC, con una agitación de 150 rpm durante 96 horas (Anexo 20).

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2.5. Selección de cepas con elevada capacidad productora de biodiesel por método gravimétrico ⁴¹

2.5.1. Obtención de biomasa seca inicial

Luego del periodo de incubación especificado anteriormente, se agregó 12 mL.

del cultivo en medio C/N 100:1 a 6 tubos de plástico con tapa (previamente pesados) (Anexo 21). Estos se llevaron a centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Se descartó el sobrenadante, los tubos destapados se colocaron en una gradilla de metal y se dejaron en la estufa a 50ºC durante 48 horas.

Posteriormente se taparon y se pesaron en una balanza analítica. El peso de masa seca se expresó en gramos (g), mediante la siguiente fórmula:

Biomasa seca inicial = Tubo con biomasa (g) – Tubo vacío (g)

2.5.2. Lisis de pared celular y adición de solventes

Se agregaron 5mL de solución sulfato de amonio 5% a los tubos con biomasa, estos se colocaron en hielo durante 2 minutos. Se llevó a ultrasonido por 2 minutos a 25ºC y 45 Khz. Se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante. Se agregó 3 ml de etanol absoluto y se agitó fuertemente durante 5 segundos, posteriormente se agregaron 1,25 mL. de cloroformo y 1,25 mL de éter de petróleo y se agitó en vortex durante 10 segundos.

2.5.3. Obtención de biomasa seca final

Los tubos se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Se llevaron a baño María dentro de un sistema de extracción de aire durante 2 horas a 50ºC. Posteriormente, se colocaron en una estufa a 50ºC durante 96 horas. Para el cálculo de biomasa final se usó la siguiente fórmula:

Biomasa seca final = Tubo con biomasa (g) – Tubo vacío (g)

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2.5.4. Cálculo de porcentaje de producción de lípidos

Luego del secado en estufa, los tubos se taparon y se pesaron en una balanza analítica. El porcentaje de producción de lípidos se calculó mediante la siguiente fórmula:

(Biomasa seca inicial –biomasa seca final) x 100

% Lípidos =

Biomasa seca inicial

2.5.5. Conservación de cepas con elevada producción de aceite

Las muestras que resultaron con un porcentaje de producción de aceite mayor a 20% fueron sembradas en medio sólido YPD y conservados en refrigeración a 4ºC.

2.6. Identificación bioquímica y molecular de cepas de levaduras con elevada capacidad productora de biodiesel

Se realizó una identificación bioquímica presuntiva (Anexo 25) y una confirmativa como la identificación molecular. Las cepas de levaduras con mayor porcentaje de producción de biodiesel (superior a 20%), fueron enviadas a Macrogen Inc., para su identificación molecular, en donde se amplificó la región ITS del ADN ribosómico conservado usando los primers ITS1 e ITS4, los productos amplificados fueron secuenciados utilizando la técnica de Sanger (Anexos 22, 23 y 24).

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III. Resultados

 De los 18 cultivos pertenecientes a los grupos de levaduras codificados como “POR”,

“CON” y “EP”, se obtuvieron 3 cultivos cuyo porcentaje de producción de aceite biodiesel supero el 20% estimado para ser consideradas levaduras oleaginosas (Tablas 1,2 y 3).

 La cepa de levadura codificada como POR-3 presentó un porcentaje de producción de aceite de 29,7% (Tabla 1).

 La cepa de levadura codificada como CON-5 presentó un porcentaje de producción de aceite de 31,5% (Tabla 2).

 La cepa de levadura codificada como EP-5 presentó un porcentaje de producción de aceite de 23,1% (Tabla 3).

 Según la identificación molecular (Anexos 22, 23 y 24), se determinó que las cepas de levaduras codificadas como POR-3, CON-5 y EP-5 pertenecen a las especies Rhodotorula kratochvilovae, Rhodotorula glutinis y Rhodotorula mucilaginosa respectivamente (Tabla 4).

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Tabla 1. Porcentaje de producción de aceite (biodiesel) por levaduras aisladas de la granja Porcón (POR), Cajamarca, obtenidos en base a la biomasa inicial (con aceite) y final (sin aceite).

Código de muestra

Biomasa inoculada (g)

Biomasa inicial (g)

Biomasa final (g)

Porcentaje de producción

POR-1 0,875 2,8142 2,5937 7,40 %

POR-2 0,868 2,6929 2,6306 14,0 %

POR-3 0,873 3,1933 2,2449 29,70 %

POR-4 0,911 2,472 2,3162 6,30 %

POR-5 0,887 2,863 2,7239 4,90 %

POR-6 0,891 2,5269 2,2775 9,90 %

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Tabla 2. Porcentaje de producción de aceite (biodiesel) por levaduras aisladas de los bosques de Porcón (CON), Cajamarca, obtenidos en base a la biomasa inicial (con aceite) y final (sin aceite).

Código de levadura aislada

CON-1 0,432 1.4394 1.3919 3.30 %

CON-2 0,448 1.6971 1.6967 0.02 %

CON-3 0,455 1.2650 1.2647 0.02 %

CON-4 0,461 1.3441 1.3433 0.05 %

CON-5 0,428 1.6937 1.1594 31.55 %

CON-6 0,431 1.5727 1.4654 6.80 %

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Tabla 3. Porcentaje de producción de aceite (biodiesel) por levaduras aisladas de los bosques de El Paraiso (EP), La Libertad, obtenidos en base a la biomasa inicial (con aceite) y final (sin aceite).

EP-1 0,451 1,3631 1,1150 18,20 %

EP-2 0,453 1,4881 1,3244 11,0 %

EP-3 0,438 1,1640 1,1582 0,60 %

EP-4 0,443 1,2757 1,1800 7,50 %

EP-5 0,501 1,1331 0,8718 23,10 %

EP-6 0,469 1,3649 1,2462 8,70 %

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Tabla 4. Identificación molecular de las cepas de levaduras con mayor producción de biodiesel.

Cepas

POR-3 Rhodotorula kratochvilovae

CON-5 Rhodotorula mucilaginosa

EP-5 Rhodotorula glutinis

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IV. Discusión

Las zonas muestreadas fueron elegidas debido a que existen evidencias de que levaduras de los géneros Rhodosporidium y Rhodotorula, conocidas como potenciales productores de aceite, tienen un papel importante como saprofitos o parásitos en bosques coníferos y caducifolios ²² y en suelos aluviales ²³, estas características se encuentran representadas en los bosques de pino de Porcon. Existen estudios que demuestran la presencia de levaduras capaces de producir material de reserva lipídico, en hábitats con bajos niveles de pH y con presencia de residuos de metales pesados o combustibles fósiles; dichos requisitos fueron cumplidos con la zona muestreada de los bosques de El Paraiso, debido a que este se encuentra ubicado cerca de un río contaminado con relaves mineros.²⁴ Las levaduras del género Rhodotorula, poseen un rango de hábitat amplio que incluye suelos, cultivos de cereales y la filósfera en general ²⁵, en el caso de la especie Rhodotorula glutinis, esta es comúnmente aislada de zonas con bajas temperaturas, y elevada altitud. ²⁶

En esta investigación se empleó como fuente de carbono a la xilosa, un monosacárido del tipo aldopentosa, derivado de la hemicelulosa, también conocido como azúcar de madera ²⁷. Se decidió emplear este azúcar debido a que el principal objetivo de la producción de biodiesel, es hacerlo usando deshechos agroindustriales como sustrato. En este caso, la xilosa puede ser obtenida a partir de la hidrólisis de bagazo de caña de azúcar, cáscara de piña, entre otros. ²⁸

La técnica de cultivo esencial para la producción de biodiesel es la relación C/N, dado que mientras mayor sea el contenido de nitrógeno, menor será la acumulación de lípidos ⁶. Investigaciones de los últimos años reportan que una relación C/N proporcional a 75:1 aumenta el contenido de aceite de las especies oleaginosas hasta en un 250% ²⁹. La

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acumulación de lípidos en un cultivo con déficit de nitrógeno se debe a que éste es utilizado para la síntesis de proteínas y crecimiento celular, pero al agotarse rápidamente, las células entran en un estado de supervivencia en el que deben aumentar su material de reserva, esto lo logran transformando el sustrato en grasas. ³⁰En esta investigación se utilizó una proporción de C/N 100:1, con el fin de optimizarla producción de lípidos, además de ser una proporción con pocos antecedentes.

Las levaduras identificadas a la par de ser oleaginosas, también coincidieron al ser microorganismos carotenogénicos, y aunque no existe una relación exacta entre los carotenoides y la producción de lípidos, se conoce que Rhodotorula glutinis puede producir β-caroteno, el cual es considerado un compuesto valioso en la industria de la salud y tiene propiedades anticancerígenas y antioxidantes. ^{31, 32}

Las grasas producidas por las levaduras son de carácter intracelular, por lo que se recurrió al ultrasonido como método de rompimiento de pared celular éste tiene un mecanismo de acción basado en la cavitación, la cual consiste en la formación de burbujas en el medio líquido, las cuales colapsan liberando energía mecánica en forma de ondas de choque equivalente a varios miles de atmosferas de presión, este efecto rompe las células presentes en la suspensión, además tiene un efecto adicional actuando sobre los cúmulos sólidos de grasa, volviéndolos líquidos. ³³ Posteriormente se adicionaron 3 solventes orgánicos: Etanol absoluto, cloroformo y éter de petróleo, los cuales actúan como solventes de los lípidos intercelulares liberados después de la exposición a ultrasonido ³⁴, estos fueron elegidos basándonos en cuatro requisitos: alta capacidad de solubilizar grasas, bajo punto de ebullición, sin residuos al evaporarse, alta penetración en la muestra.

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En el año 2017 se usó bagazo de caña de azúcar como sustrato en un evaluación de producción por parte de Rhodotorula mucilaginosa, en este caso se utilizó una concentración C/N de 85:1, resultando en un porcentaje lipídico de 33%.³⁵ Ese mismo año se evaluó esta especie, utilizando melaza como fuente de carbono, lo que dio como resultado una producción de 69%, también se estudió el desempeño de Rhodotorula glutinis, utilizando como sustrato aceite de palma, lo cual arrojo un porcentaje de producción de 38%. ³⁶

En el año 2007 se evaluó a Rhodotorula glutinis, utilizando glucosa y extracto de levadura en una proporción de 95:1, de la cual se obtuvo un porcentaje de producción de 60,9% ³⁷, el caso de esta levadura es especial debido a que las investigaciones que lo implican están mayormente orientadas a la producción de carotenoides. ³⁸

Finalmente, Rhodotorula kratochvilovae ha sido objeto de un número menor de investigaciones en el campo de la producción de biodiesel, de estos se puede destacar, un trabajo realizado en 2017 en el que se utilizaron glucosa y sulfato de amonio en una concentración de 100:1, aquí se logró obtener un porcentaje de acumulación de 56,06%.³⁹

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V. Conclusión

 Se aisló Rhodotorula kratochvilovae, Rhodotorula glutinis y Rhodotorula mucilaginosa, cepas de levaduras con elevada capacidad de producción de biodiesel, a partir de muestras de suelo tomadas de cuencas de ríos de las regiones de La Libertad y Cajamarca.

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VI. Recomendaciones

 Se recomienda mantener una réplica constante de los cultivos con un periodo máximo de refrigeración de 30 días.

 Para lograr una buena disolución de la xilosa en los medios empleados, se recomienda emplear un vortex a 2000 rpm y posteriormente someter el medio a calor.

 Evaluar la producción de lípidos en diferentes concentraciones de C:N.

 Emplear el método de rompimiento celular empleando el equipo TissueLyser II, utilizando perlas de tungsteno.

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Referencias Bibliográficas

1. Meng, X., Yang, X., Xu, X., Zhang, L., Nie, Q., Xian, M. Biodiesel production from oleaginous microorganisms, Renewable Energy. Renew Energy 34: 1-5. 2009

2. Rodolfi, L., Zittelli, G.C., Bassi, N., Padovani, G., Biondi, N., Bonini, G., Tredici, M.R. Microalgae for oil: strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a lowcost photo-bioreactor. Biotecnol Bioeng. 102: 100-112. 2009 3. Knothe, G. Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl

esters. Fuel Process Technol. 86: 1059-1070. 2005

4. Ghosh S, Banerjee S, Das D. Process intensification of biodiesel production from Chlorella sp. MJ 11/11 by single step transesterification, Algal Res. 2017; 27: 12-20.

5. Koutinas, A, Chatzifragkou A, Kopsahelis N, Papanikolaou S, Kookos I. Design and techno-economic evaluation of microbial oil production as a renewable resource for biodiesel and oleochemical production. Fuel. 2014; 116: 566-577.

6. Li W, Du W, Li YH, Liu DH, Zhao ZB. Enzymatic transesterification of yeast oils for Biodiesel Fuel Production. Chin J Process Eng. 2007; 7(1): 137-140.

7. Tchakouteu S, Kalantzi O, Gardeli C, Koutinas A, Aggelis G, Papanikolaou S. Lipid production by yeasts growing on biodiesel-derived crude glycerol: strain selection and impact of substrate concentration on the fermentation efficiency. J Appl Microbiol.

2015; 118(4), 911-27.

8. Chatzifragkou A, Makri A, Belka A, Bellou S, Mavrou M, Mastoridou M, Mystrioti P, Onjaro G, Aggelis G, Papanikoloao S. Biotechnological conversions of biodiesel derived waste glycerol by yeast and fungal species. Energy. 2011; 36 (2): 1097–1108.

9. Li Y, Liu B, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture Enzyme Microbial Technol. 2007;

41(3): 312-317.

10. Kazuyoshi K, Masakazu Y, Yasushi K. Inhibition of lipid accumulation and lipid body formation in oleaginous yeast by effective components in spices carvacrol, eugenol, thymol and piperine. Agric Food Chem. 2006; 54(10): 3528-3534.

BIBLIOTECA

DE CIENCIAS

BIOLOGICAS

(31)

11. Wang L, Sun Y, Wang P, Zhao Z. Effects of metal ions on lipid production by fermentation with Trichosporon fermentans. J Dalian Institute Light Indust. 2005;

24(4): 259-262.

12. Huang, J, Shi, Q.Q., Zhou, X, Lin, Y, Xie, B, Wu. Microbiology. 1998; 25 (4):187- 191.

13. El-Fadaly, HA, El-Ahmady N, Marwan EM. Single Cell Oil Production by an oleaginous yeast strain in a low cost cultivation medium. Res J Microbiol. 2009; 4:

301-313.

14. Bonturi N, Matsakas L, Nilsson R, Christakopoulos P, Alves E, Arvid K, Rova U.

Single Cell Oil Producing Yeasts Lipomyces starkeyi and Rhodosporidium toruloides:

Selection of Extraction Strategies and Biodiesel Property Prediction. Energies. 2015;

8(6): 5040-5052.

15. Xua J, Dub W, Zhao X, Liu D. Exploration of sodium lignosulphonate’s effects on lipid production by Rhodosporidium toruloides, Process Biochemistry. 2015; 50: 424- 431.

16. Liu B, Zhao Z. Biodiesel production by direct methanolysis of oleaginous microbial biomass. J Chem Technol Biotechnol. 2007; 82: 775-780.

17. Ma Y. Microbial oils and its research advance. Chin J Bioprocess Eng. 2006; 4 (4): 7- 11.

18. Biodiesel FAQ’s [Internet]. 2010. [Consultado Febrero 2018] Disponible en:

http://www.biodiesel. org/resources/faqs/

19. Kong X, Liu B, Zhao ZB, Feng B. Microbial production of lipids by cofermentation of glucose and xylose with Lipomyces starkey. Chin J Bioprocess Eng. 2007; 5 (2):

36-41.

20. Santamauoro F, Whiffin FM, Scott RJ, Chuck CJ. Low-cost lipid production by an oleaginous yeast cultured in non-sterile conditions using model waste resources.

Biotechnol Biofuel. 2014; 7: 34.

BIBLIOTECA

DE CIENCIAS

BIOLOGICAS

(32)

21. Hu C, Wu S, Wang Q, Jin G, Shen H, Zhao ZK. Simultaneous utilization of glucose and xylose for lipid production by Trichosporon cutaneum. Biotechnol. Biofuels.

2011; 4: 25.

22. Sláviková E, Vadkertiová R. The ocurrence of yeast in the forest soils. J Basic Microbiol. 2000; 40 (3):207-12

23. Wuczkowski M, Prillinger H. Molecular identification of yeasts from soils of the alluvial forest national park along the river Danube downstream of Vienna, Austria (Nationalpark Donauauen). 2004; 159 (3): 263-75

24. Gadanho M, Libkind D, Sampaio P. Yeast Diversity in the Extreme Acidic Environments of the Iberian Pyrite Belt. 2006; 52 (3): 552-563

25. Hernández A, Montanez J, Aguilar M, Martínez C, Rodríguez R, Aguilar C.

Rhodotorula glutinis as source of pigments and metabolites for food industry. Food Bioscience. 2014; 5: 64-72

26. Hocking A, Pitt J. Fungi and food spoilage. 2nd ed. Gaithersburg: Aspen publication;

1999.

27. Martín Del Campo, J. S.; Rollin, J.; Myung, S.; Chun, Y.; Chandrayan, S.; Patiño, R.;

Adams, M. W.; Zhang, Y. -H. P. (2013). "High-Yield Production of Dihydrogen from Xylose by Using a Synthetic Enzyme Cascade in a Cell-Free System". Angewandte Chemie International Edition. 52 (17): 4587.

28. Ramirez K, Rojas O, Alvarado P, Vega J. Xylose from lignocelulosic waste in the production and industrial processing of pinneaple (Ananascomusus). 2012.

Uniciencia. 2012; 26: 75-89

29. Hassan, M., Blanc, P.J., Granger, L.-M., Pareilleux, A., Goma, G. Influence of nitrogen and iron limitations on lipid production by Cryptococcus curvatus grown in batch and fed-batch culture Process Biochem. 31 (4): 355-361(7) 1996

30. Meesters, P.A.E.P., Huijberts, G.N.M., Eggink, G. High-cell-density cultivation of the lipid accumulating yeast Cryptococcus curvatus using glycerol as a carbon source Appl Microbiol Biotechnol 45 (5): 575-579.

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DE CIENCIAS

BIOLOGICAS

(33)

31. Gupta A, Vongsvivut J, Barrow C, Puri M. Molecular identification of marine yeast and its spectroscopic analysis establishes unsaturated fatty acid accumulation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2012; 114: 411–417.

32. Yen, H.-W., Liao, Y.-T. & Liu, YX The growth of oleaginous Rhodotorula glutinis in an airlift bioreactor on crude glycerol through a non-sterile fermentation process. Bioprocess and Biosystems Engineering. 2015; 38: 1541–1546.

33. Gogate P, Kabadi A. A review of applications of cavitation in biochemical engineering/biotechnology. Biochemical Engineering Journal. 2009; 44 (1): 60-72.

34. Wade L. Organic Chemistry. 6th ed. Pearson. 2006

35. Khot M, Ghosh D. Lipids of Rhodotorula mucilaginosa with biodiesel potential: Oil yield, fatty acid profile, fuel properties. J Basic Microbiol. 2017; 57 (4): 345-352 36. Martinez E, Raghavan V, Gonzales F, Gomez X. New Biofuel Alternatives:

Integrating Waste Management and Single Cell Oil Production. Int J Mol Sci. 2015;

16 (5): 9385-9405

37. Dai C, Tao J, Xie F, Dai Y, Zhao M. Biodiesel generation from oleaginous yeast Rhodotorula glutinis with xylose assimilating capacity. Afr J Biotechnol. 2007;

6:2130–2134.

38. Kot A, Blazejak S, Kurcz A, Gientka I, Kieliszek. Rhodotorula glutinis potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Appl Microbiol Biotechnol. 2016; 100: 6103-6117

39. Milkessa T, Groenewald M, Pohl C, Steyn L, Kiggundu N, Abate D. Optimization of cultivation conditions for biotechnological production of lipid by Rhodotorula kratochvilovae SY89 for biodiesel preparation. 3 Biotech. 2017; 7 (2):145

40. Vieira N, Santos R, Ribeiro I, Silveira F, Nunes A, Fietto L, Silveira W. Selection of oleaginous yeast isolated from brazilian national parks soils. In: III International Symposium on Microbiology and Biotechnology; 2016, Viçosa. Anais do III International Symposium on Microbiology and Biotechnology.

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(34)

41. Tejeda L, Henao D, Alvear M, Castillo C. Characterization and lipid profile of oil from microalgae. Revista Facultad de Ingeniería. 2015; 24 (39), 43-54.

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Anexos

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Anexo 01. Muestras de suelo tomadas en bolsas plásticas.

Anexo 02. Características del suelo y la zona muestreada.

Zona

muestreada

Altura (msnm)

Humedad Relativa (%)

Presión (BAR)

Temperatura (ºC)

pH del suelo

Coordenadas

Sausal 315 31 1,01 28,7 4,9 7°43'50.0"S

79°00'39.4"W Punta

Moreno

455 46 0,99 28,4 5,1 7°35'34.9"S

78°53'13.2"W Puente río

Santa

455 30 1,00 29,5 6,8 7°35'34.9"S

78°53'13.2"W

Gallito ciego

263 57 0,71 18,6 6,8 7°15'58.47"S

79°15'36.08"O Porcon

(granja)

3148,5 69 1,01 16,1 5,1 7°02'10.69"S

78°38'04.39"O Porcon

(bosque)

3303,4 62 1,01 17,4 5,3 7°02'32.66"S

78°38'28.87"O

El Paraiso 3398 63 1,01 16,2 4,5 8°00'07.25"S

78°27'51.27"O

Motil 2840 47 1,01 23,0 4,8 7°59'55.88"S

78°30'22.66"O

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(37)

Anexo 03. Composición del medio líquido para enriquecimiento en gramos por litro. ⁴⁰

Medio líquido para enriquecimiento (g/L)

Glicerol 100

(NH4)2SO4 1

KH2PO4 1

MgSO4.7H2O 0,5

Extracto de levadura 0,2

Anexo 04. Matraces con 50 mL. de medio líquido de enriquecimiento y 1 g. de muestra.

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Anexo 05. Composición del medio selectivo para levaduras oleaginosas en gramos por litro. ⁴⁰

Medio selectivo para levaduras oleaginosas (g/L)

Xilosa 20

(NH4)2SO4 5

KH2PO4 1

MgSO4.7H2O 0,5

Agar 20

Agua destilada 1000 mL

Cloramfenicol 0,05

Anexo 06. Placas Petri con medio selectivo para levaduras oleaginosas.

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Anexo 07. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de Sausal (S).

Código levadura

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz S-1 ^Lisa ^Circular Êntero ^Convexa ^Rojo ^Cremoso ^Brillante S-2 ^Lisa ^Circular Êntero ^Convexa ^Rojo ^Cremoso ^Brillante S-3 ^Lisa ^Circular Êntero ^Convexa ^Blanco ^Cremoso ^Brillante S-4(1) Lisa Circular Entero Convexa Blanco Cremoso Brillante S-4(2) ^Lisa ^Circular Êntero ^Convexa ^Rojo ^Cremoso ^Brillante S-5(1) ^Lisa ^Circular Êntero ^Convexa ^Blanco ^Cremoso ^Brillante S-5(2) ^Lisa ^Circular Êntero ^Convexa ^Rojo ^Cremoso ^Brillante S-6(1) Lisa Circular Entero Convexa Rojo Cremoso Brillante S-6(2) Lisa Circular Entero Convexa Rojo Cremoso Brillante

Anexo 08. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de Punta Moreno (PM).

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz PM-1 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante PM-2(1) Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Opaco PM-2(2) Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante PM-3 Lisa Circular Circular Convexa Rojo Cremoso Brillante PM-4 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Opaco PM-5 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante PM-6(1) Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Opaco PM-6(2) Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Opaco

Anexo 09. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de río Santa (RS).

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz

RS-1 SIN CRECIMIENTO

RS-3 CRECIMIENTO CONTAMINANTES

RS-5 CRECIMIENTO CONTAMINANTES

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Anexo 10. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de la presa Gallito Ciego (GC).

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz

GC-1 SIN CRECIMIENTO

GC-3(1) Lisa Circular Circular Planoconvexo Transp. Cremoso Brillante GC-3(2) Lisa Circular Circular Planoconvexo Transp. Cremoso Brillante GC-3(3) Lisa Circular Circular Planoconvexo Transp. Cremoso Brillante GC-3(4) Lisa Circular Circular Planoconvexo Transp. Cremoso Brillante GC-4 Lisa Circular Circular Planoconvexo Rojo Cremoso Brillante

GC-6 Lisa Circular Circular Planoconvexo Rojo Cremoso Brillante

Anexo 11. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de la granja Porcon (POR).

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz POR-1 Lisa Circular Circular Convexa Transparente Cremoso Brillante POR-2 Lisa Circular Circular Convexa Transparente Cremoso Brillante POR-3 Lisa Circular Circular Convexa ^Rojo Cremoso Brillante POR-4 Lisa Circular Circular Convexa Transparente Cremoso Brillante POR-5 Lisa Circular Circular Convexa Transparente Cremoso Brillante POR-6 Lisa Circular Circular Convexa ^Blanco Cremoso Brillante

Anexo 12. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de los bosques de Porcon (CON).

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz CON-1 Lisa Circular Circular Convexa Transp. Cremoso Brillante CON-2 Lisa Circular Circular Convexa Transp. Cremoso Brillante CON-3 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante CON-4 Lisa Circular Circular Convexa Crema Cremoso Brillante CON-5 Lisa Circular Circular Convexa Rojo Cremoso Brillante CON-6 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante

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Anexo 13. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de El Paraíso (EP).

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz EP-1 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante EP-2 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante EP-3 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante EP-4 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante EP-5 Lisa Circular Circular Convexa Rojo Cremoso Brillante EP-6 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante

Anexo 14. Características macroscópicas de las colonias de levaduras aisladas en medio selectivo para levaduras oleaginosas, a partir de muestras de suelo recolectadas de Motil (M).

Características morfológicas de las colonias de levaduras aisladas Superficie Forma Borde Elevación Color Consistencia Luz M-1 Lisa Circular Circular Convexa Transp Cremoso Brillante M-2 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante M-3 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante M-4 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante M-5 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante M-6 Lisa Circular Circular Convexa Blanco Cremoso Brillante

Anexo 15. Composición del medio YPD (yeast extract-peptone-dextrose), en gramos por litro. ¹⁴

Medio YPD (g/L)

Extracto de levadura 10

Peptona 20

Glucosa 20

Agua destilada

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1000 mL

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Anexo 16. Composición del tampón citrato fosfato pH 7.0. ⁴⁰

Tampón citrato-fosfato pH 7.0 (mL/L) Solución ácido cítrico 0,1 M 823,5

Solución fosfato de sodio bibásico 176,5

Solución ácido cítrico 0,1 M (g/L)

Ácido cítrico 29,41

Solución fosfato de sodio bibásico (g/L)

Fosfatos de sodio bibásico 28,39

Anexo 17. Cálculos realizados para la obtención de los porcentajes de carbono y nitrógeno de los reactivos xilosa y sulfato de amonio respectivamente.

Reactivo: Xilosa C5H10O5

Masa molar (g/mol)= 12(5) + 10(1) + 16 (5) = 150 g/mol

60 g/mol

% Carbono = x 100 = 40%

150 g/mol

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Reactivo: Sulfato de amonio (NH4)2SO4

Masa molar (g/mol)= [14 + 1(4)](2) + 32 + 16(4) = 132 g/mol

28 g/mol

% Nitrógeno = x 100 = 21%

132 g/mol

Anexo 18. Composición de la solución de xilosa 40%.

Solución xilosa 40% (g/L)

Xilosa 400

Anexo 19. Composición del medio C/N 100:1 en gramos por litro. ⁴⁰

Medio C/N 100:1 (g/L)

Solución xilosa 40% 100 mL

(NH4)2SO4 0,762

NaCl 0,1

MgSO4 0,5

CaCl 0,1

Buffer citrato fosfato 900 mL

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Anexo 20. Matraces con medio C/N 100:1 en incubación rotatoria.

Anexo 21. Tubos de plástico con las muestras cultivadas en medio C/N 100:1.

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(45)

Anexo 22. Informe enviado por Macrogen, en referencia a la identificación molecular de la cepa de levadura codificada como “POR-3”.

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(46)

Anexo 23. Informe enviado por Macrogen, en referencia a la identificación molecular de la cepa de levadura codificada como “CON-5”.

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(47)

Anexo 24. Informe enviado por Macrogen, en referencia a la identificación molecular de la cepa de levadura codificada como “EP-5”.

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Anexo 25. Prueba bioquímica presuntiva de asimilación de compuestos carbonados de las cepas de levaduras oleaginosas.

Código levadura

Compuestos carbonados

Glucosa Fructosa Maltosa Galactosa Lactosa Sacarosa Rafinosa Xilosa

POR-3 + + D L D + L L

CON-5 + L L L D L L D

EP-5 + + L L L + D D

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