Universidad Pablo de olavide. dePartamento de bio‑
logía molecUlar e ingeniería bioqUímica.
nuevos loci implicados en el control de la longevidad y la formación de dauer en Caenorhabditis elegans. el
papel de pkc-1.
tesis doctoral.
José manuel monje moreno, 2010.
nética de la Universidad Pablo de olavide,
certifica:
que el trabajo presentado por el licenciado José manuel monje moreno, titulado “nuevos loci implicados en control de la longe‑
vidad y la formación de dauer en Caenorhabditis elegans. el papel de pkc-1” ha sido realizado íntegramente por el mismo, bajo mi dirección y supervisión, y reúne las condiciones de originalidad y calidad científica necesarias para constituir una tesis doctoral y optar al grado de doctor por la Universidad Pablo de olavide.
Y para que así conste, expido el presente certificado.
manuel Jesús muñoz ruiz.
quiero empezar dando mi agradecimiento a todos aquellos que son pero que no van a estar en estas líneas. después de nueve años han sido innumerables las personas que han pasado de una manera u otra por este trabajo de tesis. siento no poder nombrarlos a todos, pero de cualquier forma, muchas gracias.
aunque se que debería empezar por mi director de tesis, también se que no le importará que comience agradeciendo y dedicando esta tesis a la persona que en gran medida la hizo posible. este trabajo se gestó en sus manos, en su esfuerzo y en su ilusión y estoy convencido de que estaría orgulloso de verlo por fin en forma de tesis y de artículo. así que va por ti fidalgo.
Por supuesto, el otro gran responsable de que estemos donde estamos es manolo muñoz, mi jefe, amigo y compañero. Hace mucho tiempo decidió abrirme las puertas de su laboratorio, bueno hace ya tanto que casi las abrimos juntos, y a pesar de todo lo vivido, de las incertidumbres, las dificultades, los malos momentos, siempre ha estado ahí. muchas gracias.
Pero sois muchos más los que habéis hecho posible este trabajo y me gustaría agradecéroslo. a mi primo fernando, parte ya inseparable de mi, que ha sido mi referente y mi apoyo desde el día que llegué a este laboratorio. a ramón, con el que un día planeamos la invasión del lab y con el que he vivido muchos de los mejores momentos de mi vida, entre risas, música y actividades mil que a eso no hay quien le gane. a alfonso, al que he ido queriendo cada vez más y con el que he tenido las más sesudas discusiones. a mis más que compis gusaneros. a mariquilla, por tan preciados besos de recién afeitado que me ha dado, por tantas horas gusaneando comparidas y por ser “su amma”. a la gran mer, de eterna
david, que aunque es “mu seguío” me alegra las mañanas de trabajo; a mi nueva vecina ale, riñonera en ristre y piropo en los labios, y a la última en llegar, rocío, que tiene que aguantar todos mis desordenes. a los que de verdad permiten que podamos trabajar, nuestros técnicos. victor (la ga‑
cela de montequinto), con el que he compartido mucho más que placas y medios. anabel, con la que entre pedido y pedido siempre podíamos arrancarnos por bulerías. a la maravillosa valle siempre cariñosa. a todos los genéticos. a rafita, el de los dedos vertiginosos, que a pesar de tener una guitarra con calaveras y katanas, es un sol. alberto que nos ha llevado a conocer las propiedades curativas del cocido maragato. a mery, que siempre está “pa risas” o “pa desahogos”. aurelia que ahora está lejos, pero no por eso ha estado menos presente, y ya va siendo hora de tenerla otra vez cerquita. a victor que ya ha vuelto y podemos volver a echarnos unas risas. a nacho flor, manolo y silvia con los que siempre puedes contar. a algunos que se fueron, Pepa, andrea, con las que eché buenos ratos. a los “jefes”. a Juan, por animarme siempre y permitirme formar parte de este grupo. a nacho, compañero de quesos, cervezas y algún que otro guiso que nos hemos “marcao”. a rafa, andrés y an‑
tonio, dispuestos siempre para lo que haga falta. a los gusaneros. an‑
tonio miranda, con el que he compartido hasta cama y siempre buenos momentos. a toda la gente de antonio y a Peter y su grupo, por hacer que seamos una pequeña familia gusanera. Y a angela por todas esas risas en los congresos. a mis guiris, marian, eli , ana mari y laura, porque las comidas en montequinto nunca serán lo mismo sin ellas. a mari que sin su ayuda no habría podido quitarle tiempo a mis prácticas para poder acabar esto. a belu, que es más salá que las pesetas, y a Katy por aguantarme en los microscopios.
Por supuesto a toda la gente del cabd, a los micros, a los baloncestistas, a los cinéfilos del seminario de la primera planta y en general a todos los que han hecho de este centro algo más que un lugar de trabajo.
desde el principio. sin su generosidad no podría haber terminado esta tesis.
al gran luisma, por hacer de madrid un sitio estupendo. Y también me gustaría dar las gracias a rosa o rosita si ella me lo permite, con la que me inicié en esto de la ciencia y con la que tantos buenos ratos compartí.
Pero no solo ha habido laboratorio. a mi madre y a mi Padre, que son y serán mis referentes vitales y que cada uno, a su manera, me ha dado lo mejor que tenían. a mis hermanos, antonio, manuel y dani, que me quieren y me apoyan, y que tienen que perdonarme que le eche tan poca cuenta. a mis abuelos a los que he tenido presente a diario, incluso a miles de kilometros y gracias a las llamadas a cobro revertido. a las que me aguantaron mientras hacía este trabajo, lali y Pilar. a miguelito, por seguir estando ahí siempre que lo llamo. a la “gordipandi” por dejarme entrar hasta la cocina y por regalarme tantas risas.
Y por último a la rubia que tiene mucha de la culpa de que haya con‑
seguido acabar esto, porque me ha dado todo el amor que necesitaba, todo el ánimo que me faltaba y todas las risas que no tenía. te quiero aurora.
Contenido
INTRODUCCIÓN.
1. 1
1.1 Caenorhabditis elegans, un pequeño gran modelo.
3C. elegans
• como organismo modelo. 7
Control de la formación de dauer.
1.2
9Percepción sensorial y el papel de las neuronas.
• 11
ruta de la insulina.
• 13
la ruta de la tgf‑β.
• 16
la ruta de las hormonas esteroideas.
• 18
El envejecimiento o control de la longevidad.
1.3
20control de la longevidad en
• C. elegans. 23
señales que promueven longevidad.
- 24
rutas que controlan la longevidad. la respuesta endocrina.
- 28
la tgf‑
- β y la ruta esteroidea. 31
restricción calórica y longevidad.
- 32
Proteínas quinasas tipo C. PKC‑1 en C. elegans.
1.4
34el papel de PKc‑1 en
• C. elegans. 36
RESULTADOS.
2. 39
Búsqueda de mutantes longevos
2.1
41mutagénesis y selección.
• 41
caracterización fenotípica de los aislamientos.
• 49
aislamiento 75.5 f3 -
otros mutantes longevos.
- 53
PKC‑1,
2.2 un elemento importante en la regulación
endocrina de C. elegans.
54trabajos previos y paralelos.
• 54
mutagénesis en busca de supresores de
• aap-1. 55
clonación del aislamiento
• asu-1(pv12). 57
mapeo de la mutación
- 57
complementación con cósmidos.
- 61
secuenciación de
- pkc-1 en asu-1(pv12). 62
efectos de
• pkc-1(pv12) en la formación de dauer. 63
supresión de la formación de dauer en la ruta de la ins/igf.
- 63
efecto de
- pkc-1 en la formación de dauer por parte de mutantes
de la ruta de la tgf‑β. 66
efecto de
- pkc-1 sobre daf-11. 68
complementación con promotores específicos.
- 70
efecto de
- pkc-1 en la formación de dauer por parte de mutantes
de neurosecreción. 73
efecto de
- pkc-1 sobre la formación de dauer en daf-9. 74
efecto sobre la formación de dauer de otros alelos de
- pkc-1. 76
la falta de actividad de la fosfolipasa c
- egl-8 imita los fenotipos
de la mutación en pkc-1. 78
Problemas en la secreción de neuropéptidos no suprimen la for‑
- mación de dauer en la ins/igf. 79
efecto de
• pkc-1(pv12) sobre la longevidad de mutantes de la
ins/igf. 82
relación de
• pkc-1 con daf-16. 87
localización de
- daf-16. 87
efecto sobre la expresión de
- sod-3. 89
relación de
• pkc-1(pv12) con daf-9/daf-12. 92
DISCUSIÓN.
3. 97
búsqueda de mutantes longevos.
• 99
el papel de
• pkc-1 en el control de dauer y longevidad en la
ruta de la ins/igf. 101
PKc‑1 regula la formación de dauer de manera endocrina
•
desde un grupo concreto de neuronas. 105 PKc‑1 regula la formación de dauer en la ins/igf por un
•
mecanismo diferente a la neurosecreción. 106 Un mutante en la fosfolipasa c afecta a la formación de
•
dauer de forma similar a pkc-1(pv12). 107 la naturaleza de la mutación en
• pkc-1(pv12). 108
el papel de daf‑9 en la regulación de dauer.
• 109
modelos de acción PKc‑1.
• 112
CONCLUSIONES.
4. 115
MATERIALES Y MÉTODOS.
5. 119
BIBLIOGRAFÍA.
6. 135
ANEXO.
7. 151
Anexo 1.
7.1
153Anexo 2.
7.2
163CAPÍTULO 1.
INTRODUCCIÓN
Caenorhabditis elegans, un peque‑ 1.1
ño gran modelo.
C
. elegans es un pequeño nematodo de la familia rhabditidae. la palabra nematodo proviene del griego “nema” que quiere decir hilo, así su nombre significa con aspecto de hilo. es uno de los filos con mayor número de especies, más de 25.000 hasta ahora descritas.los nematodos son organismos no segmentados, fusiformes y de sime‑
tría bilateral. Poseen una cutícula rígida, por lo que necesitan realizar mudas a lo largo de las diferentes fases del desarrollo. tienen un número fijo de células, característica que se conoce como eutelia, lo que conlleva que su crecimiento se produce por aumento del tamaño de las células y no por un aumento en el número de las mismas. todos poseen una es‑
tructura común, la de dos tubos concéntricos entre los que se encuentra una cavidad conocida como pseudoceloma, delimitada por la epidermis y la pared intestinal. carecen de sistema circulatorio. su tamaño varía enormemente, desde los más pequeños que rondan el milímetro de largo, C. elegans entre ellos, hasta los 8 metros que puede alcanzar Placentoma gigantisima, parásito de la ballena. Podemos encontrar tanto especies de vida libre, principalmente marinas, aunque también terrestres (este el caso de C. elegans), como especies parásitas de animales y de plantas.
también se les conoce como gusanos redondos, debido a que presentan un cuerpo cilíndrico y alargado.
como hemos mencionado C. elegans es un nematodo terrestre, de vida libre, que ronda el milímetro de largo durante su fase adulta. es transpa‑
rente y se alimenta de bacterias. Posee cinco pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales. Podemos encontrar dos sexos, hermafroditas y machos. la determinación sexual viene dada por el cromosoma X, siendo XX las hermafroditas y XØ los machos. la población es mayoritaria‑
menor al 1% de machos. las hermafroditas pueden autofecundarse o ser fecundadas por machos, pero no pueden fecundarse entre ellas. las hermafroditas adultas son ligeramente más grandes que los machos, po‑
seen una gónada con dos brazos y una vulva situada aproximadamente a la mitad del cuerpo. Por el contrario, los machos poseen una gónada con un solo brazo, son algo más pequeños y se caracterizan por tener una espícula u órgano reproductor al final del cuerpo que utiliza para la cópula. la progenie producida por una hermafrodita autofecundada puede rondar los 300 individuos y en el caso de ser fecundada por un macho puede llegar a los 1.000.
el ciclo de vida de C. elegans pasa por cuatro fases larvarias (l1 a l4), como es común en los nematodos, hasta alcanzar al madurez sexual y entrar en la fase adulta. durante esa fase de maduración sexual, los hermafroditas son proterándricas, es decir, pasan primero por una fase macho, acumulando los gametos masculinos en la espermateca, y después por una fase femenina, donde producen los óvulos que son fecundados por los espermatozoides almacenados en la espermateca. en condiciones normales el ciclo se completa entre 2 y 3 días.
existe una fase larvaria especializada conocida como dauer (del alemán
“dauern”, que podría traducirse como duradero). es un estadio de resis‑
tencia que aparece como desarrollo alternativo cuando las condiciones ambientales no son las adecuadas (falta de comida, sobrepoblación, altas temperaturas, etc.). como larva dauer, C. elegans puede aguantar varios meses, siendo especialmente resistente a situaciones de estrés, como la desecación. este estadio es reversible y el nematodo recupera su ciclo normal cuando las condiciones vuelven a ser las adecuadas.
Esquema del ciclo de vida de
Figura 1. C. elegans.
C.elegans posee un número de células fijas y la posición de las mismas también lo es. Un hermafrodita adulto tiene 959 y desde los trabajos de sulston a principios de los 80 se conoce completamente el linaje celular de cada una de estas células (sulston et al. 1983).
el sistema nervioso de C. elegans es lo suficientemente sencillo como para resultar abordable y lo suficientemente complejo como para resultar interesante. este fue uno de los puntos a su favor para que fuera elegido como un organismo modelo. las hermafroditas poseen 302 neuronas, mientras que los machos tienen 381, ya que presentan una serie de neu‑
ronas específicas relacionadas con el comportamiento de cópula. gracias a este simple sistema nervioso, C. elegans es capaz de realizar actividades relativamente complejas que van desde el necesario mantenimiento de
los sistema vitales, hasta las más diversas conductas relacionadas con la alimentación, la cópula, la evitación de peligros, etc.
desde finales de los 90 se conoce su genoma completo, siendo el del primer organismo pluricelular en completarse. con un 40% de homo‑
logía con el genoma humano, se estima que posee más de 19000 genes (Hodgkin et al. 1998).
a pesar de que C. elegans es el nematodo con diferencia mejor estudiado a nivel genético y fisiológico, no se sabe tanto de su hábitat natural o de su ecología en estado libre. la cepa que se considera como silvestre es la n2. se aisló en 1956 de detritos de hongos por Warwick nicholas en bristol, inglaterra, para más tarde pasar a california y de nuevo a inglaterra a manos de sydney brenner que podemos considerar sin lugar a dudas como el padre fundador de los estudios en C. elegans como modelo biológico. brenner tomó un hermafrodita, lo puso a crecer en una placa con E. coli y la descendencia de ese hermafrodita es la que hoy conocemos como estirpe silvestre.
Pero como decíamos antes, mucho sabemos de los descendientes de esa
“eva” gusanera, sin embargo poco de sus parientes salvajes. en recientes estudios se ha comprobado que no es tan fácil encontrar C. elegans campando libremente por los suelos. Principalmente, se puede encontrar asociado a materia orgánica en descomposición (compost) y también asociado a invertebrados, más concretamente a caracoles (barriere and felix 2005; caswell‑chen et al. 2005). tímidamente están apareciendo trabajos que toman a C. elegans en estado libre como sujeto de estudio, por ejemplo, en investigaciones sobre genética de poblaciones (dolgin et al. 2007; dolgin et al. 2008) o de comportamiento (Persson et al. 2009), pero sin lugar a duda la estrella sigue siendo el gusano de laboratorio.
C. elegans como organismo modelo.
el comienzo de C. elegans como modelo biológico se debe casi en exclu‑
siva a sidney brenner. a pesar de que existían algunos estudios sobre C.
elegans con anterioridad a los trabajos del citado Premio nobel, no es hasta el prolijo artículo de 1974 (brenner 1974) cuando comienza a per‑
cibirse la potencialidad del sistema que brenner había vislumbrado. la idea primigenia era la tener un modelo capaz de responder a preguntas relacionadas con el desarrollo animal, así como con el funcionamiento y arquitectura del sistema nervioso.
las características que hacían interesante a este modelo eran muchas, pero quizás podríamos destacar algunas:
es sencillo de mantener en el laboratorio y relativamente barato.
•
Puede crecer en placas petri con un simple césped de bacteria, incluso también en cultivo líquido, en un rango de temperaturas cercanas a la temperatura ambiente. además puede congelarse.
es un organismo simple pero pluricelular, con sistema nervioso
•
desarrollado. al ser transparente se puede seguir las divisiones em‑
brionarias con facilidad, así como el interior del propio individuo adulto.
Permite realizar abordajes genéticos clásicos de cruzamiento ya que
•
presenta una diferenciación sexual. Pero también permite el man‑
tenimiento de estirpes a partir de un solo individuo al presentar hermafroditas.
su ciclo de vida es relativamente corto, pudiéndose completar en 3
•
días.
todas estas fueron en parte las razones que llevaron a brenner a utilizar este modelo, pero en la actualidad se le han ido sumando otras tales como que su linaje celular está perfectamente definido, su genoma está completamente secuenciado, se pueden hacer mutantes funcionales transitorios mediante rnai, simplemente alimentándolos con bacterias productoras del mismo, existe una enorme batería de mutantes, al igual que de protocolos de biología molecular que se le pueden aplicar, etc.
C. elegans ha ido cobrando fuerza como modelo conforme han pasado los años, como quizás confirma el hecho de que hayan sido concedidos recientemente hasta 6 premios nobel a científicos que trabajan con este modelo. muchos son los campos en los que este nematodo juega un papel protagonista, entre ellos el desarrollo. incluso existen campos como es de la longevidad, en el que los descubrimientos realizados en C. elegans han supuesto un giro inesperado y han hecho del gusano el modelo por excelencia para ese tipo de estudios.
Control de la formaCión de dauer. 1.2
en 1975 se habla por primera vez de la “dauerlarva” (cassada and rus‑
sell 1975) como fase larvaria especial en C. elegans, aunque ya había sido descrito un estadio análogo en C. briggsae (Yarwood and Hansen 1969), también llamado “dauer larvae”. este tipo de larva se define como un estadio quiescente de resistencia, alternativo al desarrollo ordinario del nematodo. las características de la fase dauer son muy especiales, de ellas podríamos destacar:
Presenta una cutícula externa que le permite resistir condiciones ad‑
•
versas como la desecación.
Posee acúmulos de grasas con lo que su suministro energético está
•
asegurado, pudiendo vivir hasta 3 meses sin alimentarse.
se produce una adelgazamiento de todo el cuerpo, siendo especial‑
•
mente apreciable en la musculatura de la faringe.
Presenta comportamientos característicos, tendiendo a la dispersión
•
por un lado, aunque la mayor parte del tiempo la pasa sin moverse.
en cualquier momento si las condiciones son las adecuadas retoma su
•
desarrollo habitual sin cambios aparentes en su vida adulta, entre otras cosas.
todas estas características fisiológicas, morfológicas e incluso de com‑
portamiento, suponen dramáticos cambios en el desarrollo larvario de C. elegans, por lo que la entrada en dauer tiene que estar muy bien controlada y además debe conllevar la utilización de sistemas endocrinos
de plasticidad, de cómo los organismos interaccionan con el medio y actúan en consecuencia, permitiendo la supervivencia del individuo ante el estrés ambiental (existe una excelente y reciente revisión sobre el tema (fielenbach and antebi 2008)).
Fotos de un adulto rodeado de algunos huevos, L1 y L2 (A); y de unas Figura 2.
dauers (B). Se pueden apreciar las claras difernecias morfológicas entre las fases larvarias. Ambas fotos están tomadas con el mismo aumento.
desde la descripción de los primeros mutantes afectados en la formación de dauer (riddle et al. 1981), se han encontrado muchos genes y muy diversas rutas que están implicadas en el control de este proceso. los mu‑
tantes se han clasificado tradicionalmente entre formadores defectivos de la dauer larva (daf‑d), es decir no son capaces de formar el estadio de resistencia a pesar de que las condiciones ambientales así lo promueven, o bien formadores constitutivos de dauer (daf‑c), que entran en la fase larvaria especial aunque las condiciones ambientales no sean desfavora‑
bles. Una característica interesante de los mutantes daf‑c, es que muchos de ellos son mutantes condicionales dependientes de temperatura. estos mutantes entran de forma constitutiva en dauer a partir de una tem‑
peratura que podemos considerar como restrictiva, mientras que a una temperatura menor, que llamaremos permisiva, realizan un desarrollo normal. de aquí en adelante hablaremos de mutantes daf‑c y daf‑d para referirnos a estos fenotipos.
como era de esperar, el conjunto de mutantes relacionados con este pro‑
ceso es muy amplio. afectan desde la percepción sensorial, ya entre los
primeros mutantes descritos aparecían algunos con problemas estructu‑
rales en neuronas sensoriales (albert et al. 1981), pasando por una ruta que implica al gmP cíclico (birnby et al. 2000), las rutas endocrinas como la de la insulina (Kimura et al. 1997) o la tgf‑β (ren et al. 1996), hasta finalmente, la producción y recepción de hormonas esteroideas (antebi et al. 2000). vamos a describir algo más en detalle el papel de cada uno de estos procesos en la formación de dauer.
Percepción sensorial y el papel de las neuronas.
la formación de dauer es una respuesta a determinadas condiciones ambientales. el estímulo conocido que con más fuerza induce la entrada en dauer, es la feromona dauer (golden and riddle 1982), una sustancia secretada por los propios gusanos, que, de alguna forma, da una medida de la cantidad de individuos presentes en una zona determinada. re‑
cientemente se ha descubierto la identidad molecular de esta feromona, apareciendo al menos 3 compuestos con capacidad para inducir la for‑
mación de dauer (Jeong et al. 2005; butcher et al. 2007). Por otro lado la presencia o ausencia de alimento, unido a la temperatura, son también señales que afectan a la decisión de entrar en dauer. lo cierto es que estas señales no se suelen encontrar aisladas en la naturaleza, así que es el ba‑
lance entre ellas lo que desencadena la respuesta.
Para que se produzca esta respuesta, es imprescindible el concurso de las neuronas sensoriales, nexo de unión entre el medio y el organismo.
gracias a la técnica de ablación de células individuales por láser ha sido posible estudiar el papel de neuronas concretas en diferentes aspectos
grupo de neuronas conocidas como “amphids” que están en contacto directo con el medio y desempeñan un papel fundamental. eliminando algunas de ellas como asi, adf o asg, obtenemos un fenotipo daf‑c transitorio (schackwitz et al. 1996). Pero no es solo el papel como recep‑
toras de la señal lo que las hace importantes, son también productoras de señales endocrinas fundamentales para controlar el proceso, cuyo papel trataremos más adelante.
dentro de las neuronas existe un amplio grupo de receptores tradicional‑
mente asociados con la interfase medio externo/sistema nervioso. son los receptores acoplados a proteínas g (gPcr, g protein couple receptor).
se ha visto que en C. elegans algunas de estos gPcr están implicados en la respuesta a la dauer feromona, aumentando la sensibilidad a la misma en algunos casos y en otros, disminuyéndola (Zwaal et al. 1997; lans and Jansen 2007).
otro de los puntos más importantes y mejor descritos dentro del papel que juegan las neuronas en la formación de dauer, es el del gmP cíclico (cgmP). Éste trabaja como mensajero intracelular en las cascadas de señalización de las neuronas sensoriales de animales y suele estar íntima‑
mente ligado a las proteínas g. en nuestro modelo se han identificado varios genes relacionado con el cgmP. el más importante de ellos es daf‑11, una guanidil ciclasa encargada de producirlo (birnby et al. 2000), cuya mutación posee un fenotipo daf‑c. estudios de interacción genética apuntan a que esta ruta de señalización trabaja por encima de las rutas endocrinas (insulina y tgf‑β) que como veremos más adelante, también controlan la entrada en dauer (vowels and Thomas 1992; Thomas et al.
1993; schackwitz et al. 1996).
Por otro lado se han descrito genes implicados en el proceso de neuro‑
secreción que también tienen un fenotipo daf‑c. dentro de este grupo encontramos proteínas claramente estructurales como Unc‑64, sin‑
taxina perteneciente al complejo snare necesario para la unión de las membranas, o también otras como Unc‑31, proteína que responde
a calcio y está relacionada con la exocitosis (richmond 2007). ambas están implicadas de alguna forma en el control de la formación de dauer.
mutaciones en las mismas, tienen fenotipo daf‑c (ailion and Thomas 2000). Por otro lado parece lógico que si afectamos al sistema encargado de poner en circulación las moléculas endocrinas vamos a afectar a los procesos controlados por las mismas.
todo esto nos permite decir que el sistema nervioso juega un papel esen‑
cial en el control de la formación de dauer, cosa por otro lado predecible, ya que es necesaria la integración de los estímulos provenientes del medio para dar una respuesta adecuada. la plasticidad de los organismos se ci‑
menta en gran parte es su sistema nervioso. además en C. elegans donde no existe una diferencia clara entre sistema nervioso y sistema endocrino esta premisa se hace aún más evidente.
Ruta de la insulina.
esta ruta, o de manera más genérica podríamos hablar de la insulina/
igf (insulin like growth factor), ha sido seleccionada como punto de control en muchas ocasiones a lo largo de la evolución. en general esta implicada en la decisión entre supervivencia o reproducción, como respuesta a las condiciones ambientales (fielenbach and antebi 2008).
Para lo que a nosotros nos interesa, forma parte esencial del control de la formación de dauer así como de la longevidad, punto que trataremos más adelante. además, y de una forma claramente relacionada, también está implicada en la resistencia a muy diferentes estreses como calor, estrés oxidativo, Uv y muchos otros (lithgow and Walker 2002).
a pesar de que se conocen hasta 38 moléculas del tipo insulina en C.
elegans (li et al. 2003), solo se ha descrito un receptor, daf‑2. muta‑
ciones en daf-2 provocan entre otras cosas, la entrada constitutiva en fase dauer. daf-2 es un gen bastante grande, ocupando aproximadamente 33 kb, generando una proteína de 1843 aminoácidos (Kimura et al. 1997).
se han descrito numerosos mutantes puntuales de daf-2, muchos de ellos con particularidades fenotípicas propias. en un intento de sistematizar esta variabilidad fenotípica gems et al (gems et al. 1998) clasificaron los alelos mutantes de daf-2 en dos tipos. Por norma general todos los alelos presentan un fenotipo daf‑c dependiente de temperatura (también existen algunos que son formadores de dauer completamente constitutivos que deben ser mantenidos en heterocigosis), incrementan la longevidad, y por último presentan un incremento de la resistencia a altas temperaturas.
gems et al consideraron como clase i a todos aquellos que solo presen‑
taban estos tres fenotipos, mientras que los clase ii además presentaban otros como defectos de movimiento, letalidad embrionaria o paradas constitutivas en fase l1. estos autores hablan de que la clase ii presenta un fenotipo más severo. la señal recibida por daf‑2 se transmite intra‑
celularmente gracias a la participación de una cascada de señales. age‑1 es una fosfoinositol 3 quinasa que junto a su unidad reguladora aaP‑ 1, controlan la formación de fosfoinositol trifosfato (PiP3) (morris et al.
1996; Wolkow et al. 2002). esta molécula señalizadora activará PdK‑ 1, una quinasa, y ésta, junto al propio PiP3, acabaran activando al conjunto de quinasas aKt‑1 Y aKt‑2 (Paradis and ruvkun 1998; Paradis et al.
1999). todo este sistema termina fosforilando el factor de transcripción tipo “forkhead” daf‑16. Por otro lado existe una fosfatasa, daf‑18/
Pten, que antagoniza a age‑1 promoviendo la desfosforilacion de PiP3 para formar PiP2 y regular el proceso. Podemos ver un esquema en la figura 3.
daf-16
age-1 daf-18 PI2P
PI3P pdk-1
akt-2 akt-1
daf-2
aap-1
Resistencia a estrés.
Formación de dauer.
Longevidad.
insulina
daf-16 daf-16
age-1
age-1 daf-18daf-18 PI2P
PI3P pdk-1
pdk-1
akt-2 akt-2 akt-1
akt-1 daf-2
aap-1 aap-1
Resistencia a estrés.
Formación de dauer.
Longevidad.
insulina
Esquema de la ruta de la insulina.
Figura 3.
daf‑16 es una pieza clave que controla procesos tales como la longevidad o la formación de dauer (lin et al. 1997; ogg et al. 1997). la partici‑
pación de daf‑16 es necesaria para la formación de dauer provocada por mutaciones en componentes de la ruta de la insulina, teniendo los mutantes en el propio daf-16, un fenotipo daf‑d. cuando las señales adecuadas llegan al receptor daf‑2, este activa la cascada de señales que acaban fosforilando a daf‑16, promoviendo su salida del núcleo (Henderson and Johnson 2001) y su retención en el citoplasma ayudado por otras proteínas. en estas condiciones, los individuos se desarrollan normalmente llegando a su periodo reproductivo. sin embargo, cuando no llegan las señales adecuadas al receptor daf‑2, o las que llegan son inhibitorias, la ruta permanece inactiva y daf‑16 entra en el núcleo pro‑
moviendo toda una serie de procesos, entre ellos la formación de dauer.
esto mismo ocurre cuando se elimina la actividad de cualquiera de los componentes de la cascada encargados de transmitir la señal inhibitoria
como respuesta a diferentes estreses ambientales (calor, tóxicos, falta de comida, etc.), lo que demuestra que esta ruta forma parte de la respuesta general de C. elegans a los cambios en las condiciones ambientales (Hen‑
derson and Johnson 2001). es importante matizar que la entrada en el núcleo es condición necesaria pero no suficiente para que se disparen los procesos controlados por daf‑16 (lin et al. 2001).
Un factor muy importante a tener en cuenta a la hora de analizar el papel de la ruta de la insulina en la formación de dauer es que este control se lleva a cabo de una manera “cell non autonomous” o endocrina, es decir, su acción en determinadas células es suficiente para promover un efecto en todo el organismo. la expresión de daf-16 utilizando un promotor específico de neuronas es capaz de restaurar la formación de dauer en un fondo mutante para la ruta de la insulina y para el propio daf-16. Un dato curioso es que, para el caso de la longevidad, ocurre algo parecido pero en tejidos diferentes, la expresión de daf-16 en las neuronas no es suficiente para recuperar la longevidad en un fondo doble mutante para daf-2 y daf-16, lo que nos indica que ambos fenotipos no son completa‑
mente paralelos y que aunque compartan rutas, poseen una regulación diferente dentro del organismo (libina et al. 2003).
La ruta de la TGF‑β.
la relación de esta ruta con la formación de dauer está ampliamente estudiada. antes de que se clonaran componentes de la ruta de la ins/
igf con fenotipo daf‑c, ya existían evidencias de la participación de esta ruta en el control de la entrada en dauer (georgi et al. 1990; estevez et al. 1993). la ruta la componen daf‑7, un ligando tipo tgf‑β que solo
se expresa en la neurona asi (ren et al. 1996), daf‑1 y daf‑4 que son receptores de la tgfβ con actividad quinasa (georgi et al. 1990;
estevez et al. 1993), las proteínas smad (se conoce con este nombre a las moléculas encargadas de transmitir la señal de la tgf‑β intracelu‑
larmente) daf‑8 y daf‑14 (Patterson et al. 1997; inoue and Thomas 2000), que llevan la señal al núcleo, y por último tenemos a daf‑5, un factor de transcripción del tipo sno/sKi, que interacciona con daf‑3 otra smad(da graca et al. 2004; tewari et al. 2004).
DAF-1 DAF-4
DAF-7
DAF-8 DAF-14
DAF-5 DAF-3
Formación de dauer
DAF-1 DAF-4
DAF-7
DAF-8 DAF-14
DAF-5 DAF-3
DAF-1 DAF-1 DAF-4
DAF-7 DAF-7
DAF-8 DAF-8
DAF-14 DAF-14
DAF-5 DAF-5 DAF-3 DAF-3
Formación de dauer
Esquema de la ruta de la TGF‑
Figura 4. β.
dibujando un modelo sencillo de esta ruta, tendríamos por una parte la expresión de daf‑7 dependiente de las condiciones ambientales como comida, feromona o temperatura, aumentando cuando estas son favora‑
bles. la molécula de tgf‑β se encarga de activar los receptores daf‑1/
daf‑4 y esta señal se transmite a las proteínas daf‑8 y daf‑14, pro‑
teínas tipo smad, que entran al núcleo. Una vez allí compiten con el
hasta alcanzar la etapa adulta. cuando las condiciones no son favorables desaparece la señal proveniente de la tgf‑β, y es el complejo daf‑3/
daf‑5 el que gana la partida promoviendo la entrada en dauer.
se sabe que la expresión de daf-3 o daf-5 exclusivamente en el sistema nervioso, es suficiente para revertir el fenotipo de formación de dauer provocado por la pérdida de los mismos (inoue and Thomas 2000; da graca et al. 2004). esto parece indicar que la tgf‑β sobre el sistema nervioso debe estar controlando un sistema endocrino responsable finalmente de los cambios morfogenéticos y fisiológicos necesarios. de hecho, estudios de expresión ponen de manifiesto que tanto diferentes ilPs (insulina like proteins) como daf-9, una citocromo P450 que par‑
ticipa en la formación de hormonas esteroideas, están regulados por la tgf‑β (liu et al. 2004). Por otro lado, mutaciones daf‑c de la tgf‑β se suprimen parcialmente por una falta de daf-16, y además, estas muta‑
ciones provocan el traslado de daf‑16 al núcleo (lee et al. 2001; shaw et al. 2007). todo ello sugiere la existencia de sistemas de coordinación entre las diferentes rutas que controlan la entrada en dauer.
La ruta de las hormonas esteroideas.
aunque en C. elegans existen más de 283 receptores nucleares, el más estudiado y mejor entendido es daf‑12, actor principal de la ruta de las hormonas esteroideas. daf‑12 es un receptor de hormonas nuclear que actúa como factor de transcripción y esta íntimamente relacionado con el receptor de vitamina d presente en vertebrados (antebi et al. 2000).
alelos nulos de daf-12 son daf‑d y capaces de suprimir a la mayoría de los alelos daf‑c conocidos (vowels and Thomas 1992; Thomas et al. 1993).
esto sitúa a daf‑12 por debajo del resto de rutas de control de la forma‑
ción de dauer y como un factor esencial y necesario para dicho proceso.
otro de los integrantes bien estudiado de la ruta es daf-9, una citocromo P450 que parece estar implicada en el proceso de formación o madura‑
ción de la hormona u hormonas a las que responde daf-12. mutaciones en daf-9 son daf‑c y este fenotipo solo es suprimido por mutaciones en daf-12. mientras que daf-12 se expresa en todo el organismo, daf-9 solo se expresa en un par de neuronas endocrinas (las células XXX), en la espermateca de las hermafroditas y en la hipodermis, estando esta última regulada por diversos factores como cantidad de alimento, temperatura o feromona. esta ruta, elemento clave en la regulación de entrada en dauer, integra la señalización de las otras rutas anteriormente descritas, obser‑
vándose así que mutaciones en la tgf‑β, la ruta del cgmP o la ins/
igf también afectan a los niveles de daf-9. a su vez, la expresión de este gen en hipodermis es también dependiente de daf-12, estableciéndose un bucle de interacción entre ambos genes, donde daf-9 regula a daf-12 ya que participa en la generación de su ligando y daf-12 regula los niveles de daf-9 (gerisch and antebi 2004; mak and ruvkun 2004).
existen otros genes descritos en esta ruta como daf-36 una oxigenasa tipo rieske que parece estar implicada en las primeras fases de produc‑
ción hormonal (rottiers et al. 2006) o din-1 un corregulador de daf-12 (ludewig et al. 2004).
se ha conseguido describir alguno de los putativos ligandos de daf-12, como el ácido dafacrónico, que consigue suprimir el fenotipo daf‑c de daf-9 mediante suplementación (motola et al. 2006).
el envejeCimiento o Control de la
1.3
longevidad.
el envejecimiento es probablemente uno de los problemas biológicos que más interés suscita y también uno de los menos conocidos. incluso de‑
finir lo que entendemos por envejecimiento puede resultar complejo y el número de teorías que intentan explicarlo son innumerables, medvedev recoge en su revisión de 1990 hasta 300 de estas teorías (medvedev 1990).
Kirkwood, uno de los referentes en el campo, define el envejecimiento como una progresiva y generalizada pérdida de función que conlleva una mayor vulnerabilidad a los condiciones ambientales y un aumento de las posibilidades de padecer enfermedades o de morir, asociado por lo general con un descenso de la fertilidad (Kirkwood 2005). Pero quizás el problema no es definir qué entendemos por envejecimiento, el problema reside en cómo explicar las causas de este proceso y el efecto que tienen factores como el genoma, el medio o el azar en el desarrollo del mismo. en este sentido, la utilización de organismos modelo, y muy especialmente de C. elegans, ha permitido avanzar mucho en la compresión del fenómeno, pudiendo probar de forma empírica muchas de las predicciones hechas por las diferentes teorías sobre el envejecimiento y generando nuevos paradigmas que han ayudado a lo consolidación o incluso creación de nuevas teorías sobre el envejecimiento.
actualmente, hay un par de conceptos que están relativamente aceptados.
el primero, es que el envejecimiento no está programado, es decir, no se ha seleccionado evolutivamente un conjunto de genes que activamente provoquen que los organismos envejezcan y mueran. esta idea se apoya en diferentes evidencias. Una de la más simples es que no se necesitan genes para deteriorar los mecanismos biológicos ya que esto ocurre sin necesidad de ellos. Pero existen más, como que en la naturaleza la mayoría de los individuos mueren por factores externos y no por envejecimiento, que los beneficios para la población frente a los individuos son complejos
de explicar en términos de selección natural, que individuos genética‑
mente idénticos pueden presentar vidas medias muy diferentes, etc.
el segundo es que el envejecimiento se produce por un proceso multifac‑
torial de daño a diferentes niveles (acumulación de mutaciones somáticas, acumulación de proteínas mal formadas o mal plegadas, problemas de replicación por acortamiento de telómeros, acumulación de mutaciones en el adn mitocondrial, acumulación de daños provocados por los radicales libres, etc.)
Pero, si como hemos dicho, la muerte por envejecimiento no está gené‑
ticamente programada y se debe a un proceso relativamente estocástico,
¿cómo podemos explicar la aparición de genes que afectan a la longe‑
vidad? (de hecho el descubrimiento de mutantes recesivo longevos en C. elegans parecía estar dando la razón a los posibles defensores que la muerte programada) ¿Ha tenido algo que ver la evolución en el control de la longevidad? la respuesta se comenzó a esbozar con la teoría evo‑
lutiva sobre el envejecimiento propuesta por medawar en 1952, que se conoce como “mutation accumulation theory”. el autor señalaba que las mutaciones con efecto deletéreo o pernicioso durante la época adulta y postreproductiva, no podían ser seleccionadas, con lo que tendían a acumularse. más tarde, Williams amplía el concepto hablando de genes que pudieran tener un efecto beneficioso en etapas tempranas, pero que por el contrario sus efectos fueran adversos en etapas tardías, es lo que se conoce como “Theory of antagonistic Pleotropy” (Williams 2001). en este caso la selección actuaría favoreciéndolos a pesar de su efecto pos‑
trero. estas teorías acabaron siendo la base de la que hoy día es una de las más aceptadas visiones sobre el envejecimiento, la “disposable soma theory” de Kirkwood (Kirkwood and rose 1991). Partiendo de la idea de que los recursos disponibles para los organismos son limitados, esta teoría habla de cómo los éstos deben jugar con esa limitada cantidad de energía para sobrevivir y dejar descendencia de la manera más exitosa posible. así los organismos deben establecer un balance entre reparación
este balance se invierte principalmente hacia esta función, desatendiendo la reparación del soma, mientras que en condiciones desfavorables (por ejemplo disponibilidad de alimento reducido) se retrasa la reproducción, se invierte en reparación y por tanto en longevidad.
los puntos o predicciones clave de esta teoría son:
el proceso de envejecimiento es consecuencia de daño celular y mo‑
•
lecular no reparado que se va acumulando a lo largo de la vida de un organismo.
los mecanismo del envejecimiento en sí, son intrínsecamente esto‑
•
cásticos.
la longevidad se puede controlar a través de regular los niveles de
•
genes encargados de la reparación y el mantenimiento de las células somáticas.
Poseer una línea germinal “inmortal” debe requerir unos altos nive‑
•
les de reparación y mantenimiento.
los mecanismos que acaban dando lugar al envejecimiento son múl‑
•
tiples, así como existe una intrincada y coordinada red de respuesta en forma de reparación y mantenimiento.
Y por último, el juego entre los recursos dedicados a estas funciones
•
de reparación y mantenimiento, frente a otras actividades del organis‑
mo, ha sido optimizado evolutivamente por cada especie. además, la plasticidad en esta respuesta es una estrategia evolutiva a la hora de ha‑
cer frente a un medio cambiante.
Para una mejor comprensión del tema, existe una estupenda y amplia revisión (Kirkwood 2005).
Control de la longevidad en C. elegans.
Parece claro que nuestro gusano ha jugado un papel clave en el desarrollo de los estudios en el campo del envejecimiento en los últimos años. con la descripción de los primeros mutantes longevos, las perspectivas sobre el descubrimiento de las bases moleculares del envejecimiento y del po‑
sible control genético de la tasa del mismo, se ampliaron enormemente.
se conocen numerosos genes que afectan a la longevidad de C. elegans (gerontogenes). las primeras evidencias genéticas sobre que la vida media de C. elegans podía estar controlada proceden de la clonación de 2 mutantes longevos age-1 y daf-2 (friedman and Johnson 1988; Kenyon et al. 1993). estos descubrimientos reavivaron el campo de la biología del envejecimiento y abrieron, de alguna forma, uno nuevo, el control genético de la longevidad, cosa que hasta entonces no estaba claro que pudiera producirse. la existencia de genes capaces de controlar la vida media de los organismos planteaba una serie de problemas evolutivos, como hemos visto anteriormente, pero sobre todo comenzaba a aportar luz sobre los mecanismos moleculares capaces de modificar el proceso del envejecimiento.
de estos primeros mutantes salió la implicación de la ruta de la ins/igf en este proceso, que desde entonces se ha postulado como pieza clave en la regulación del envejecimiento. esta ruta se conoce por participar de forma esencial en la respuesta que ofrece un organismo a las condiciones ambientales como la temperatura, la sobrepoblación y muy especial‑
mente a la presencia o ausencia de alimento. Podríamos decir que es una punto de control clave que la naturaleza ha seleccionado, permitiendo el desarrollo de la plasticidad adaptativa que tienen los organismos, desde gusanos a ratones (tatar et al. 2003).
muy diversos factores son capaces de incrementar la vida media de C.
elegans. Una bajada en al actividad de la ruta de la insulina, la restricción calórica o una bajada en la función de las gónadas, entre otras. no es fácil sistematizar o generar un esquema capaz de sintetizar toda esta informa‑
ción, de hecho, cuando uno bucea por las diferentes revisiones sobre el tema, no se encuentra una fórmula básica a la hora de describir el control de la longevidad en C. elegans. en nuestro caso, vamos a centrarnos en dos puntos claves. Por un lado, hablar de qué situaciones o procesos son capaces de promover la longevidad en C. elegans, y por otro, qué rutas o qué factores moleculares que controlan esta respuesta en nuestro modelo se conocen.
Señales que promueven longevidad.
▶
Restricción calórica y la percepción del estado nutricional.
la restricción calórica o mejor dicho la restricción dietaria (de ahora en adelante dr, dietary restriction), que entendemos como la dismi‑
nución de la ingesta sin llegar a la malnutrición, es la forma conocida de incrementar la longevidad más conservada a lo largo de la evolución (mair and dillin 2008). en C. elegans se puede conseguir este efecto con diferentes aproximaciones, disminuyendo la cantidad de bacteria en un medio líquido, con medios sintéticos o también gracias a mutantes con problemas de deglución, como eat-2, entre otras. aunque el efecto pro‑
ducido siempre es el mismo, aumento de la longevidad, los mecanismos por los que se produce no siempre coinciden, ya que existen métodos que producen incrementos de longevidad dependientes de daf‑16 y otros que no (greer and brunet 2009). Éstos últimos dependen de elementos
como sKn‑1 y PHa‑1, ambos factores de transcripción, importantes para la longevidad en diferentes condiciones de dr (bishop and gua‑
rente 2007; Panowski et al. 2007). de ellos hablaremos más adelante.
tanto la respuesta a estrés como el estado energético de las células tam‑
bién parecen jugar un papel en los diferentes escenarios de dr. factores como la quinasa tor, que forma parte de la putativa ruta que mide el estado nutricional del organismo, respondiendo a la cantidad de ami‑
noácidos en el mismo, son importantes en alguna de las condiciones (Hansen et al. 2007). lo mismo ocurre con la amPK, encargada de controlar el ratio amP/atP y que también juega un papel importante en determinadas condiciones de dr (greer et al. 2009).
Percepción del medio externo.
desde hace ya más de 10 años se sabe que mutaciones en componentes de las neuronas sensoriales afectan a longevidad, sugiriendo que el control de la longevidad responde al menos en parte a estímulo externos. como la detección de las condiciones exteriores se producen a través del sistema nervioso, se han descrito muchos componentes neuronales capaces de incrementar longevidad (gPcr, canales iónicos, proteínas implicadas en transmisión sinaptica, etc.) (apfeld and Kenyon 1999; alcedo and Kenyon 2004; lans and Jansen 2007). la explicación más sencilla es que la función sensorial acaba afectando a los sistemas endocrinos, como el de la insulina, que ya sabemos que es una vía principal en el control de la longevidad. de hecho, el incremento que provocan es dependiente de daf‑16 (apfeld and Kenyon 1999).
se sabe de la participación directa de neuronas olfativas y gustativas en el control de longevidad (alcedo and Kenyon 2004), pero aún no se co‑
nocen con exactitud qué tipo de señales son las que promueven o inhiben el incremento de longevidad. Parece claro que determinados nutrientes, así como repelentes o atrayentes, van a jugar un papel esencial. esta idea
función conservada en la repuesta a las condiciones ambientales relacio‑
nadas con la alimentación.
Respuesta a estrés. Hormesis.
la hormesis es un fenómeno de dosis/respuesta ante determinados agentes tóxicos o nocivos. cuando sometemos a un organismo a pe‑
queñas cantidades de un agente que a mayores dosis resulta perjudicial, a veces se obtiene el efecto contrario, observándose una respuesta que mejora la situación normal del organismo. así, someter un organismo a pequeños estreses puede tener efectos beneficiosos. exposiciones transi‑
torias a temperaturas altas pueden incrementar la longevidad en gusanos y en moscas (Khazaeli et al. 1997; olsen et al. 2006). en el caso de C.
elegans estos incrementos son dependientes de daf‑16 (cypser and Jo‑
hnson 2003), como también lo son de aaK‑2, subunidad reguladora de la mencionada amPK (apfeld et al. 2004).
el resveratrol es una sustancia capaz de incrementar la longevidad de le‑
vaduras, gusanos y moscas. en C. elegans esta sustancia activa la respuesta a estrés del retículo endoplasmático y el incremento de longevidad obser‑
vado es independiente de daf‑16 pero completamente dependiente de sir‑2.1, una nad+ deacetilasa relacionada con la respuesta a estrés que incrementa la longevidad cuando se aumenta su dosis (bauer et al. 2004;
viswanathan et al. 2005).
existen otras rutas o factores directamente relacionados con al respuesta a estrés (factores de respuesta a choque térmico, rutas ras, maPK o JnK, etc.) que afectan de forma directa o indirecta a la longevidad en general o daf‑16 en concreto.
Estado reproductivo.
otro de los factores, conocido desde hace tiempo, que controla la lon‑
gevidad es el aparato reproductor. la falta de la línea germinal, bien sea
por ablación o gracias a mutantes deficientes en su formación, provoca un aumento de longevidad que va a ser dependiente tanto de daf‑16, como del receptor de hormonas nucleares daf‑12. sin embargo, cuando además se elimina la gónada somática, el efecto no se ve, lo que indica que no es un efecto secundario de la esterilidad provocada, si no más bien la existencia de señales, además contrapuestas, que provienen tanto de la línea somática como de la germinal (arantes‑oliveira et al. 2002).
Función mitocondrial.
Uno de los primeros mutantes longevos descritos en C. elegans fue clk-1, un mutante deficiente en la síntesis de ubiquinona, molécula a la postre fundamental para el funcionamiento de la respiración en mitocondrias (Wong et al. 1995). desde entonces se han descrito diversos mutantes longevos que tienen en común un déficit de la actividad mitocondrial.
Por lo general, todos presentan fenotipos comunes como el incremento en el tiempo de desarrollo o la disminución de la descendencia (artal‑sanz and tavernarakis 2008). no se conocen las razones moleculares por las que se produce este incremento de longevidad, pero se propone que una disminución en los niveles de respiración mitocondrial podría explicar una menor producción de ros (reactive oxygen species) y eso, un au‑
mento en longevidad, aunque este punto sigue siendo controvertido.
existen más factores relacionados con las mitocondrías que incrementan longevidad, como el complejo de las prohibitinas, que cuando se ve com‑
prometido en fondo mutante daf-2, entre otros, provocan un aumento de longevidad (artal‑sanz and tavernarakis 2009).
Rutas que controlan la longevidad. La respuesta endo‑
▶ crina.
La ruta INS/IGF y DAF‑16 en longevidad.
Ya hemos hablado de la ruta ins/igf con anterioridad y de su papel en el control de la formación de dauer. de hecho ambos procesos, formación de dauer y longevidad, están íntimamente ligados, aunque cabe destacar que se ha demostrado que son independientes. el descubrimiento de genes que afectan a uno de los procesos de forma exclusiva (Hertweck et al. 2004) o incluso de neuronas cuya función es necesaria para solo uno de esos mismos procesos (alcedo and Kenyon 2004), ha puesto de manifiesto que son dos procesos separables, aunque comparten ele‑
mentos reguladores e incluso, posiblemente, elementos estructurales o funcionales. también sabemos que daf‑16 es un factor clave en esta ruta y responsable final de la mayoría de los fenotipos que controla.
sin embargo, existen múltiples elementos que van a controlar daf‑16, además de la ruta clásica de la ins/igf.
dentro de la ruta canónica de la insulina podemos encontrar a la quinasa sgK‑1 que actúa de forma paralela a aKt 1/2 para controlar de igual forma a daf‑16, pero en este caso sólo tiene efecto sobre la regulación de la longevidad y no en dauer (Hertweck et al. 2004).
además de estas quinasas, se conocen otras que controlan a daf‑16.
JnK‑1, quinasa de la ruta JnK, es capaz de fosforilar a daf‑16 y acti‑
varlo, de forma que una sobreactivación de la misma provoca un aumento de longevidad. es interesante que dicha sobreactivación también es capaz de incrementar la longevidad en un fondo daf-2 mutante y que la pérdida de actividad de la ruta JnK no influye en la longevidad de daf-2, lo que indica que deben ser rutas diferentes que al menos comparten a daf-16 para controlar la longevidad (oh et al. 2005).
mst‑1, una proteína quinasa tipo ste‑20, se comporta de forma similar a JnK‑1 pero, en este caso, la longevidad de daf-2 si se ve afectada ante la pérdida de la misma (lehtinen et al. 2006).
aaK‑2, subunidad catalítica de la amPK, es capaz de fosforilar a daf‑16. se sabe que la función de este factor es importante tanto en la longevidad observada en mutantes daf-2, como en los procesos de hor‑
mesis, en determinadas condiciones de dr y la longevidad promovida por la falta de función de las prohibitinas (antebi 2007; greer et al.
2007; artal‑sanz and tavernarakis 2008).
las sirtuinas y las proteínas 14‑3‑3 parecen colaborar con daf‑16 en la localización en el núcleo, y su sobreexpresión provoca un aumento de longevidad dependiente de este gen (tissenbaum and guarente 2001;
berdichevsky et al. 2006).
de todos estos datos podemos sacar en claro que daf‑16 es una pieza clave en el control de la longevidad y que está finamente regulado por numerosas proteínas quinasas y otros elementos. a su vez, existen otros factores de transcripción que, de forma directa o indirecta, pueden dar es‑
pecificidad a la acción de daf‑16. Para el caso de la longevidad podemos destacar a Hsf‑1, un factor de transcripción de choque térmico cuya sobreexpresión incrementa longevidad dependiente de daf‑16 (Hsu et al. 2003). también smK‑1, un factor del que se desconoce su función molecular, pero que colocaliza con daf‑16 y esta relacionado con la respuesta inmune, a Uv y a estrés oxidativo (Wolff et al. 2006). más recientemente se ha demostrado que el factor de transcripción xbp-1 y su regulador ire-1, que pertenecen a la ruta de estrés de retículo conocida como “unfolding proteín response” son también necesarios para el incre‑
mento de longevidad observado en los mutantes de la ruta de la insulina (Henis‑Korenblit et al. 2010). todas estos factores de transcripción son necesarios para la longevidad de un mutante daf-2, sin embargo, cada uno esta implicado en la respuesta a diferentes tipos de estrés.
en la figura 5 podemos ver un esquema donde se representan todos estos elementos.
Esquema de la regulación de longevidad por DAF‑16. Recreación de una Figura 5.
figura de la revisión de A. Antebi.
a pesar de que tanto daf-2 como daf-16 se expresan en numerosas células, su papel en longevidad parece estar ligado a un grupo de ellas, aunque estos datos no están exentos de controversia. según Wolkow, se puede
complementar la longevidad de un mutante daf-2 mediante promotores neuronales (Wolkow et al. 2000). este hecho está apoyado por experi‑
mentos de animales mosaicos, donde la pérdida de expresión de daf-2 en un reducido grupo de neuronas, ya hacía longevos a los individuos (apfeld and Kenyon 1999). sin embargo, el rnai de daf-2 aumenta la longevidad a pesar de lo refractario del sistema nervioso a esta técnica (libina et al. 2003). estos datos apuntan a un papel importante de la ins/igf en el sistema nervioso. Por otro lado, daf-16 parece ser nece‑
sario en más sitios que en las neuronas. su sobreexpresión en el intestino es capaz de incrementar la vida media en un 50% (berdichevsky et al.
2006), algo parecido a lo que ocurre en Drosophila melanogaster pero en el tejido adiposo (giannakou et al. 2004). como podemos suponer, deben existir sistemas endocrinos capaces de coordinar toso el proceso.
Un punto importante dentro de esta idea de control endocrino (también encaja el papel que desempeñan las hormonas esteroideas como veremos más adelante), es la existencia de mecanismos de retroalimentación del propio sistema, ya que determinados genes tipo insulina, como ins-7, están controlados por daf-16 (murphy et al. 2003). este tipo de control permite aumentar y dirigir las respuestas del organismo completo ante eventos externos o internos.
La TGF‑
▶ β y la ruta esteroidea.
el papel de la tgf‑β en longevidad es algo novedoso. Hasta hace muy poco uno de los grandes paradigmas era que tanto ins/igf como la propia tgf‑β controlaban la entrada en dauer, pero que sólo la primera afectaba a longevidad. Un reciente artículo demuestra que mutaciones en daf-7 o daf-4, que comprometen la actividad de la tgf‑β, provocan un aumento de longevidad dependiente de daf‑16 (shaw et al. 2007).
el papel de la ruta de las hormonas esteroideas en longevidad es, cuando menos, complejo. como vimos anteriormente, daf‑12 es un factor esencial para el control de la formación de dauer, de hecho, era el punto donde confluían las diferentes rutas. sin embargo, su papel en longe‑
vidad no parece ser tan clave como lo es el de daf‑16. se sabe que la eliminación de las células precursoras de la línea germinal conlleva un aumento de la longevidad y ésta es dependiente tanto de daf‑16 como de daf‑12 (arantes‑oliveira et al. 2002). en este caso, la eliminación de la línea germinal provoca el enriquecimiento de daf‑16 en el núcleo que es dependiente de daf‑12, daf‑9 y de un tercer elemento conocido como Kri‑1, lo que podría explicar que la falta de estos factores suprima la longevidad cuando eliminamos la línea germinal. sin embargo, la entrada de daf‑16 en el núcleo por problemas en la ruta de la ins/igf, no es dependiente de estos mismos factores, lo que indica un papel di‑
ferencial de daf‑12 en la señalización desde la línea germinal (berman and Kenyon 2006).
daf‑12 también tiene un papel en la longevidad provocada por mutantes de la ruta de la ins/igf. daf-12(m20) es capaz de suprimir la longevidad de ciertos alelos mutantes de daf-2, aquellos clasificados como tipo i, mientras que por el contrario incrementan la longevidad de los tipo ii (gems et al. 1998). de otra parte, mutaciones en daf-9 también incre‑
mentan longevidad y esta es dependiente de daf-12, pero no de daf-16, al menos no completamente (Jia et al. 2002).
Restricción calórica y longevidad.
▶
como ya comentamos, determinadas condiciones de dr provocan un aumento de longevidad independiente de daf‑16 pero dependiente de los factores de transcripción PHa‑4 y sKn‑1. mutaciones en estos genes
no tienen efecto sobre la longevidad de mutantes de la ins/igf. esto sugiere que los mecanismos moleculares que participan en el incremento de longevidad por la ruta de la insulina son independientes de los obser‑
vados en dr.
PHa‑4 es otro “forkhead” muy similar al foXa de mamíferos. cu‑
riosamente, smK‑1, citado anteriormente como posible colaborador de daf‑16, también es necesario para el incremento de longevidad por dr dependiente de PHa‑4 (Panowski et al. 2007).
sKn‑1 es un factor de transcripción del tipo nrf2. la actividad de sKn‑1, única y exclusivamente en 2 neuronas, es capaz de mediar el in‑
cremento de longevidad por dr (bishop and guarente 2007). esto im‑
plica que, al menos en parte, debe existir una actividad endocrina como respuesta al estímulo por falta de comida y no solo un efecto general o inespecífico de la menor ingestión de calorías en la longevidad por dr.
la actividad de tor en la respuesta a restricción calórica ha sido de‑
mostrada tanto en levaduras como en moscas. los incrementos de longe‑
vidad en un fondo mutante con problemas de deglución que mimetizan la dr y los observados por una falta de tor no son sumatorios, lo que podría indicar que en C. elegans también es importante su papel para la longevidad en dr (Hansen et al. 2007).
proteínas quinasas tipo C. pKC‑1 1.4
en C. elegans.
Una vez hemos hablado de forma general de C.elegans y de aspectos interesantes para el desarrollo de esta tesis, como son la longevidad y la formación de dauer, sólo nos queda contextualizar el gen sobre el que ha versado parte de este trabajo, pkc-1.
la familia de las PKcs (Protein Kinase c) es un grupo de proteínas del tipo serina/treonina quinasas que, como muchas otras de este tipo, están especializadas en la transmisión de señales intracelulares tras la activación de algún receptor de membrana, como los gPcrs (g Protein coupled receptor). Una seña de identidad de esta familia, además de poseer una región catalítica conservada por otro tipo proteinas quinasas como las a o las g (PKa, PKg), es su capacidad de activarse en respuesta a lípidos, más concretamente al dag (diacilglicerol) producido por la fosfolipasa c (Plc), aunque también a un análogo del mismo como el Pma (phorbol 12 myristate 13 acetate) (steinberg 2008).
Hasta no hace mucho se tendía a pensar en estas proteínas como qui‑
nasas genéricas, siendo su situación espacio temporal la que marcaba su especificidad. sin embargo, recientes estudios han puesto de mani‑
fiesto la existencia de diversos mecanismos que controlan y afectan a la actividad de las PKcs, como por ejemplo la fosforilación de ciertos residuos que promueven su estabilidad, o cambian su susceptibilidad a fosfatasas, o modifican su localización, etc (steinberg 2008). todos estos mecanismos, unidos a la existencia de al menos 12 isoformas (mackay and twelves 2007), están comenzando a explicar la enorme cantidad de funciones y procesos en los que aparecen implicadas las PKcs .
existen 3 subgrupos básicos dentro de esta familia proteica, las conven‑
cionales (cPKc), las nuevas (nPKc) y las atípicas (aPKc). todas tienen
