AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE JABUTICABA (MYRCIARIA CAULIFLORA) NO MODELO EXPERIMENTAL CAENORHABDITIS ELEGANS

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(1)AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE JABUTICABA (MYRCIARIA CAULIFLORA) NO MODELO EXPERIMENTAL CAENORHABDITIS ELEGANS.. Jean Boldori 1 Cristiane Casagrande Denardin 2. Resumo: O estresse oxidativo pode ser compreendido como um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e as defesas antioxidantes do organismo, sendo que este desbalanço origina danos teciduais que, ao se acumularem, geram distúrbios em uma escala maior e os produtos naturais como frutas e hortaliças conferem compostos bioativos que promovem a saúde e reduzem o risco do desenvolvimento de doenças, propriedades relacionadas com a capacidade de reduzir radicais a uma conformação mais estável e menos reativa. A jabuticaba é uma fruta nativa do Brasil e encontra-se em evidência devido a sua quantidade de compostos bioativos. O C. elegans é um modelo experimental para estudos preliminares devido suas vantagens como ciclo curto de vida, alta reprodutibilidade, facilidade de manutenção e homologia aos humanos. Neste contexto, o objetivo do estudo foi avaliar a atividade antioxidante in vitro e in vivo do extrato da jabuticaba. O extrato foi preparado a partir da fruta inteira, onde realizou-se uma extração etanólica, avaliou-se sua quantidade de compostos fenólicos e capacidade de capturar radicais DPPH e FRAP. Os animais passaram por um processo de sincronização com o objetivo de obter todos os vermes no mesmo estágio larval e após 14 horas foram expostos ao extrato por 30 minutos e aos estressores peróxido de hidrogênio e juglone por 30 minutos e 2 horas respectivamente. Obtiveram-se valores de 5.543,908 ± 1.047,7 para compostos fenólicos, 9,22 ± 3,73 para o DPPH e 45.954,58 ± 1.585,7 para o FRAP, observando uma alta capacidade em capturar radicais, relacionado com a alta quantidade de compostos fenólicos. Além disso, o extrato apresentou capacidade em proteger os animais frente à toxicidade da juglone e não apresentou atividade frente ao peróxido de hidrogênio, podendo estar relacionada a um mecanismo específico de defesa. As perspectivas do trabalho envolvem a avaliação de enzimas antioxidantes como a SOD e CAT para conseguir decifrar qual o mecanismo pelo qual o extrato desempenha o seu efeito.. Palavras-chave: C. ELEGANS JABUTICABA ESTRESSE OXIDATIVO.

(2) Modalidade de Participação: Iniciação Científica. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE JABUTICABA (MYRCIARIA CAULIFLORA) NO MODELO EXPERIMENTAL CAENORHABDITIS ELEGANS. 1 Aluno de graduação. ramos.boldori@gmail.com. Autor principal 2 Docente. cristianedenardin@unipampa.edu.br. Orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa | Santana do Livramento, 21 a 23 de novembro de 2017.

(3) AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE JABUTICABA (Myrciaria cauliflora) NO MODELO EXPERIMENTAL Caenorhabditis elegans. 1. INTRODUÇÃO O estresse oxidativo pode ser compreendido como um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e as defesas antioxidantes do organismo, sendo que este desbalanço origina danos teciduais que, ao se acumularem, geram distúrbios em uma escala maior. Os radicais livres apresentam papel importante neste processo, pois devido ao seu elétron desemparelhado tornam-se extremamente reativos, permitindo interação com lipídios, proteínas, açucares e DNA em diversos mecanismos (CAMMERER, 2012). Para contrapor estes danos, as defesas antioxidantes atuam com o objetivo de manter a homeostasia e a função normal do organismo. Estas dividem-se em dois grupos: os enzimáticos que compreendem complexos enzimáticos como glutationa peroxidase, catalase e superóxido dismutase; e os não-enzimáticos que englobam vitaminas e compostos antioxidantes provenientes da dieta. Quando associados estes dois grupos conferem uma maior proteção aos tecidos (FERREIRA, 2009). Os produtos naturais como frutas e hortaliças conferem compostos bioativos que promovem a saúde e reduzem o risco do desenvolvimento de doenças. Estas propriedades estão diretamente relacionadas com a capacidade de reduzir radicais a uma conformação mais estável e menos reativa (GONÇALVES, 2008). A jabuticaba (Myrciaria cauliflora) é uma fruta nativa do Brasil e sua ocorrência se dá entre os estados do Pará até o Rio Grande do Sul (GARCIA, 2014). Esta pode ser utilizada na produção de vinhos, geleias e sucos devido a sua semelhança morfológica com a uva (ANDERSEN, 2009), além disso, encontra-se em evidência devido a sua quantidade de compostos bioativos e sua possível atuação na prevenção de doenças. Caenorhabditis elegans é um nematoide de vida livre utilizado como modelo experimental para estudos preliminares, pois apresenta inúmeras vantagens frente aos demais modelos, como um curto ciclo de vida (cerca de 20 dias), alta reprodutibilidade, facilidade de manutenção e genoma totalmente sequenciado, no qual apresenta uma alta homologia aos mamíferos (PARK, 2013). Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antioxidante do extrato da jabuticaba (Myrciaria califlora) in vitro e in vivo frente ao estresse induzido por peróxido de hidrogênio e juglone no modelo Caenorhabditis elegans. 2. METODOLOGIA O extrato de jabuticaba foi preparado a partir de 100g de fruta inteira, estas foram homogeneizadas em equipamento ultra-turrax com 300mL de etanol, procedimento realizado duas vezes. O sobrenadante obtido foi evaporado em rotaevaporador para remoção do etanol e o extrato restante foi ressuspendido em água milli-q para um volume final de 50mL..

(4) A avaliação in vitro foi realizada a partir do ensaio da captura do radical 2,2difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (RUFINO, 2007), redução dos íons ferro (FRAP) (BENZIE, 1996) e quantificação de compostos fenólicos presentes (SOUSA, 2007). Para os ensaios in vivo, os nematóides foram mantidos em placas de petri contendo o meio NGM e a bactéria E. coli como fonte de alimento. Para sua utilização nos ensaios, os vermes passaram por um processo de sincronização, onde a partir de uma solução de hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio rompeu-se a cutícula dos animais para obter os ovos, após 14 horas ocorreu a exposição as concentrações do extrato de jabuticaba e aos agentes estressores. Na avaliação da atividade in vivo, analisou-se a sobrevivência dos animais frente aos agentes estressores. Utilizando a juglone, foi realizado ensaio de proteção, visualizando o efeito do extrato antes a exposição de 2 horas a juglone 75mM. Utilizando o peróxido de hidrogênio (H2O2), foi realizado ensaios de reversão e proteção, onde verificou-se a atuação do extrato antes e após a exposição de 30 minutos ao peróxido de hidrogênio 0,5mM. As análises foram realizadas utilizando GraphPad Prism versão 7 (GraphPad Software). Para os ensaios foi utilizado one-way ANOVA, seguido do pos-hoc de Turkey. Todos os valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Em todas as figuras, as barras de erro representam o erro padrão. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO A atividade in vitro foi avaliada a partir dos ensaios do DPPH e FRAP, estes avaliam a capacidade de capturar radicais e impedir sua atuação oxidante, o extrato de jabuticaba apresentou uma alta capacidade em reduzir o ferro presente, aliado a isto, mostrou-se eficiente em reduzir os radicais DPPH (Tabela 1). Estes estudos in vitro permitem a avaliação do extrato sem a interferência do metabolismo presente em organismos vivos, desta forma os resultados mostram a total capacidade do extrato ao reduzir radicais. Tabela 1: Avaliação antioxidante in vitro do extrato de jabuticaba utilizando os ensaios FRAP, DPPH e quantificação de compostos fenólicos. COMPOSTOS FENÓLICOS FRAP DPPH (µg de -1 equivalentes (µmol FeSO4 g ) (mg de fruta/mL) de ácido gálico/mL) Myrciaria cauliflora. 45.954,58 ± 1.585,7. 9,22 ± 3,73. 5.543,908 ± 1.047,7. A juglone é uma quinona amplamente utilizada na agricultura como um herbicida, esta apresenta uma alta reatividade e é capaz de levar a morte prematura em concentrações altas, podendo interagir com diversas enzimas presentes no.

(5) metabolismo, amplificando o dano tecidual e a formação de espécies reativas. O extrato da jabuticaba conseguiu proteger do dano causado pela juglone (Figura 1),isto pode ser atribuído a quantidade de compostos fenólicos presentes em sua composição (Tabela 1) ou pela ativação de enzimas antioxidantes responsáveis pela inativação de radicais livres.. Figura 1. Exposição dos nematóides C. elegans ao extrato de jabuticaba e ao estressor juglone (75mM). O peróxido de hidrogênio é o precursor para a formação do radical hidroxila (OH ) que podem ainda se transformar em outros radicais a partir de outras reações metabólicas. Além disto, o peróxido de hidrogênio está envolvido nas reações de Fenton, que a partir do íon férrico levam a oxidação de biomoléculas (FERREIRA, 1997). O extrato de jabuticaba não apresentou efeitos frente aos danos causados pelo peróxido de hidrogênio (Figura 2), não sendo capaz de reduzir as reações que resultam em dano tecidual. -. Figura 2. Exposição dos nematóides C. elegans ao extrato de jabuticaba e ao estressor peróxido de hidrogênio (H2O2) 0,5mM. (A) ensaio de proteção e (B) ensaio de reversão..

(6) 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS O extrato de jabuticaba apresentou atividade antioxidante frente a juglone 75mM no modelo experimental Caenorhabditis elegans e capacidade de capturar radicais de ferro e DPPH, mostrando-se um produto natural útil para a prevenção de danos oxidativos. O futuro da pesquisa envolve a avaliação de enzimas envolvidas nas defesas antioxidantes como SOD e CAT utilizando o modelo experimental Caernorhabditis elegans, visando compreender por qual mecanismo o extrato está atuando. 5. REFERÊNCIAS ANDERSEN, O.; ANDERSEN, V. U.; (1988) As Fruteiras Silvestres Brasileiras. Rio de Janeiro, Brazil: Globo. BENZIE, I. The ferric reduciQJ DELOLW\ RI SODVPD )5$3 DV D PHDVXUH RI ³$QWLR[LGDQW SRZHU´ 7KH )5$3 DVVD\ Analytical biochemistry, 1996. CAMMERER, M. Efeitos de uma dieta rica em flavonoides sobre o estresse oxidativo, inflamação e perfil lipídico em pacientes submetidos a angioplastia coronária com implante de stent: ensaio clínico randomizado. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde: Cardiologia e Ciências cardiovasculares).Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2012. FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 43, n. 1, 1997. FERREIRA, G. Avaliação antioxidante de espécies de Pterocaulon (ASTERACEAE). Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas), Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009. GARCIA, L. Aplicabilidade tecnológica da jabuticaba. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia dos Alimentos), Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014. GONÇALVES, A. Avaliação da capacidade antioxidante de frutas e polpas de frutas nativas e determinação de teores de flavonóides e vitamina C. Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos), Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. PARK, Sang-Kyu et al. Electrolyzed-reduced water increases resistance to oxidative stress, fertility, and lifespan via insulin/IGF-1-like signal in C. elegans. Biol Res, 46: 147-152, 2013. RUFINO, M. Determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do radical livre DPPH. Comunicado técnico Embrapa, 2007. SOUSA, C. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química nova. São Paulo, 2007..

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