Desarrollo de biosensor amperométrico en base a glucosa oxidasa inmovilizada por atrapamiento en quitosano

Rodríguez Andrade Eliana María

Desarrollo de biosensor amperométrico en base a glucosa oxidasa inmovilizada por atrapamiento en quitosano

Universidad de Los Andes-Facultad de Ingeniería-Postgrado en Ingeniería Química. 2007. p. 100 Venezuela

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Universidad de los Andes Facultad de Ingeniería Maestría en Ingeniería Química

Mérida, Venezuela

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DIGITALIZADA

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Tutor: Elaborado por:

Pro f. Hans V alenzuela Ing. Eliana M. Rodríguez A.

UNIVERSIDAD nJE J,OS ANDE'\

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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA

POSTGRADO DE INGENIERIA QUÍMICA MERIDA,VENEZUELA

DESARROLLO DE BIOSENSOR AMPER O MÉTRICO

EN BASE A GLUCOSA OXIDASA INMOVILIZADA

POR A TRAP AMIENTO EN QUITOSANO

TRABAJO ESPECIAL DE GRADO PRESENTADO POR LA

ING. ELIANA M. RODRIGUEZ A.

PARA OPTAR AL TITULO DE

MAGÍSTER SCIENTIAE EN INGENIERÍA QUÍMICA

TUTOR:

PROF.BANSVALENZUELA

DERECHO DE AUTOR

Por medio de la presente, cedo a la Universidad de Los Andes el Derecho de reproducir y difundir el presente trabajo, con las limitaciones que establece la legislación vigente en materia de Derecho de Autor.

En la ciudad de Mérida, a los 27 días del mes de Noviembre del2007.

Eliana Rodríguez CI: 13966841

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Il.l C>bjetivos generales y específicos... 7

C}\]>I1r~() III. ~C:() 1l~()RICO ... 8

III.1 BIOSENSORES... . . 9

III.1.1I>esarrollo de los biosensores... . . . 1 O III.1.2 Requerimiento de un biosensor de glucosa... 13

1111.3 C:lasificación de los biosensores... . . 13

III.l. 3.1 Clasificación de acuerdo al proceso biológico... . . 13

IIT.1.3 .1.1 Biosensores catalíticos. .. . . .. .. . .. . . .. . .. . . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . 14

IIT.1.3 .1.2 Biosensores de afinidad... .. . .. . . .. .. . . .. . . . .. . .. . .. . . .. .. . . .. .. 14

III.1.3.2 Clasificación en base al transductor... 14

III.1.3 .2.1 Biosensores potenciométricos... . .. . .. . .. .. . .. . . .. .. . . .. . .. .. 14

IIT.1.3 .2.2 Biosensores amperométricos... . . . .. . . .. . . . .. 15

III.1.3 .3 C>tros tipos de Biosensores... . . . 18

III.1.3.3.1 Biosensores ópticos... 18

III.l.3.3.2 Biosensores térmicos III.1.3.3.3 Biosensores FET's 18 18 III.1. 3.3. 4 Biosensores de célula entera. . . 19

III.1.3.3.5 Biosensores de laminas impresas... 19

III.1.3.3.6 Biosensores MIP's. .. . .. .. . . .. . .. . . . ... . . .. . .. . ... . .. . . ... 20

III.1.4lJsos y aplicaciones de los biosensores... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 21

111.2 ENZIMAS . . . 23

III.2.2 Propiedades enzimáticas... 25

III.2.3 Estructura y funcionamiento de las enzimas... 25

III.2.3.1 Desnaturalización de las enzimas . . . 26

III.2.4 Glucosa oxidasa (GOD)... .. . . .. . . .. . . .. . . .. . . 26

III.2.4.1 Características de la glucosa oxidasa... . . . 27

III.3 INMOVILIZACION DE ENZIMAS... . . 29

III.3.1 Métodos de inmovilización enzimática.... .. . . .. . . 30

III.3.1.1 Métodos de inmovilización de enzimas por retención fisica... . . 30

III.3.1.2 Métodos de inmovilización de enzimas por unión química... 31

II1.3.1.2.1 Unión covalente... 33

II1.3.1.2.2 Reticulado... ... .. . .. . .. . . .. .. . . .. .. . .. . . .. .. . .. . . .. . .. .. . .. . .. . 34

III.3.2 Reacción de polimerización y formación de la red... 40

III.3.3 Efectos de la inmovilización... 42

III.3.4 Aplicaciones de la enzimas inmovilizadas... 43

III.4 TECNICAS INSTRUMENTALES... 45

Ill.4.1 Voltametria cíclica... 45

II1.4.2. Cronoamperometría... 46

CAPITULO IV. MATERIALES Y METODOS... 48

IV.l Reactivos... 49

IV.2 Equipos... . . . 49

IV.3 METODOS... ... ... 50

IV.3.1 Método enzimático espectrofotométrico para la determinación de glucosa 50 IV.3.2 Preparación del biosensor compositum "ETC"... 51

IV.3 .2.1 Liofilización de las enzima GOD/POD... . . . 51

IV.3.2.2 Preparación de la pastilla "ETC"... 51

IV.3.2.3 Preparación del electrodo de trabajo "ETC"... . . . 52

IV.3.3 Construcción del electrodo enzimático "ETQ" y preparación de pastilla 53

IV.3 .3.1 Inmovilización de las enzimas. Preparación de pastilla 53

polimérica "ETQ" ... .

IV.3.3.2 Construcción del electrodo de trabajo "ETQ"... .. 54

IV.4 Instrumentación... 55

IV.5 Determinación de potenciales de trabajo para los biosensores "ETC' y 56

"ETQ" ... .

IV.6 Curva de calibración para determinar glucosa mediante el uso de 56

biosensores "ETC" y "ETQ" ... .

IV. 7 Análisis Estadísticos... 57

IV.8 Estabilidad del biosensor enzimático "ETQ"... 57

CAPITULO V. ANALISIS DE LOS RESULTADOS... 58

V.1 CURVA DE CALffiRACION ESPECTROFOTOMETRICA PARA LA 59

DETERMINACION DE GLUCOSA. ... .

V.1.1 Calculo del limite de detección del método enzimático 60

espectrofotométrico para la determinación de glucosa ... .

V.2 CONDICIONES OPTIMAS DE TRABAJO PARA EL BIOSENSOR 63

"ETC" ... .

V.2.1 Curva de calibración para determinar glucosa mediante el uso del 65

biosensor "ETC" ... .

V.2.2 Calculo de parámetros estadísticos y limite de detección del biosensor 67

"ETC" para la determinación de glucosa ... .

V.3 CONDICIONES OPTIMAS DE TRABAJO PARA EL BIOSENSOR 69

"ETQ" ... .

V.3.1 Curva de calibración para determinar glucosa mediante el uso del 71

biosensor "ETQ" ... .

V.3.2 Calculo de parámetros estadísticos y limite de detección del biosensor 73

"ETQ" para la determinación de glucosa ...

V.5 ESTABILIDAD DEL BIOSENSORENZIMATICO "ETQ"... ... ... 74

V.5.1 Reproducibilidad del biosensor enzimático 7 4 "ETQ" ... .

V. 5.2 Repetibilidad del biosensor enzimático 75 "ETQ" ... .

V.6 COMP ARACION DE LOS ELECTRODOS ENZIMATICOS "ETC" Y 78 "ETQ" CON EL METO DO ENZIMATICO ESPECTROFOTOMETRICO ...

CAPITULO VI CONCLUSIONES 79

VI.lCONCLUSIONES... 79

REFERENCIAS... 81

lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll flllllflflltfllllllllllllllllllll Ul11111111llllllllllllllllllllll tlllllllllt Hlllllllll llllllllllllllllllllllllllllllltl IUUIIllllllllllllllllllllllllll llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll 111111111111

La,tendencia actual de las técnicas de análisis, es el diseño de métodos con nuevas tecnologías que permitan determinar compuestos a bajo costo y en corto

tiepípo; por esto, se desarrolló un biosensor enzimático de fabricación sencilla, lconómica y tiempos de respuesta cortos con una tecnología de inmovilización que

i

'permita mejorar la estabilidad de las enzimas.

El método propuesto para la fabricación de un biosensor de glucosa consistió en la inmovilización de la glucosa oxidasa en conjunto con la peroxidasa atrapadas en un sistema polimérico de quitosano y acrilamida entrecruzado con N,N metilendiacrilamida. El biosensor amperométrico consta de un cilindro de vidrio de 8mm de diámetro; en su interior se colocó la pastilla polimérica donde se encuentran las enzimas inmovilizadas. Para el uso adecuado del biosensor, se realizaron estudios de voltametría cíclica y cronoamperometría con la finalidad de definir los parámetros requeridos y realizar la curva de calibración respectiva. Se fijó un potencial de 200m V para realizar las cronoamperometrías. El tiempo de respuesta del biosensor

polimérico fue menor de 8 seg. y el límite de detección de 4,45 mM. Se encontró que éste dispositivo es capaz de medir glucosa mediante la relación encontrada entre carga vs. concentración en un rango lineal de concentraciones entre O, 1 - 4,0 mM. El biosensor exhibe estabilidad a largo plazo y buena reproducibilidad.

Introducción

UIIIIUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIJIIIIIUIIIIJIIIIIUIIIIIII Ulllllllllllllllllllllllllllllllllfllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll 011111111111111111111 UllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllliU lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

Las exigencias tecnológicas en todas las áreas de producción, sobre todo las que corresponden a la industria de alimentos, cuidado de la salud, ambiente,

farmacéutica entre otras, han impulsado la obtención de nuevos métodos de análisis que permitan obtener resultados cada vez más certeros en el menor tiempo posible. En la actualidad, existen numerosas técnicas para determinar concentraciones de compuestos; estás en su mayoría son lentas y costosas. La tendencia es diseñar nuevas tecnologías que permitan determinar los mismos compuestos a bajo costo y en corto

tiempo.

En los laboratorios de análisis de alimentos el método más común para cuantificar glucosa se basa en el poder reductor de esta: utilizando el reactivo de Fehling la glucosa reduce el Cu(II) del tartrato cuprico en Cu(I) que se convierte a oxido cuproso insoluble al calentarse a ebullición con una disolución del azúcar

reductor [1]. Esta metodología es poco precisa ya que se trata de una titulación, donde el punto de equivalencia se observa con el precipitado formado y reaccionan todos los azucares reductores [2].

Pero el principal inconveniente de esta técnica y de los demás métodos empleados en los laboratorios para medir glucosa es el largo tiempo de análisis y la dependencia de costosos e incómodos instrumentos; por esta razón se plantea la necesidad de crear un nuevo método capaz de medir con mayor exactitud, rapidez, y veracidad cantidades de glucosa; para lo cual seria apropiado un biosensor enzimático

puesto que combina la especificidad y sensibilidad de sistemas biológicos con técnicas electroquímicas apropiadas.

Un biosensor es un sistema analítico compuesto por un material biológico inmovilizado (tal como una enzima, anticuerpo, célula entera, orgánulo o combinaciones de los mismos), en íntimo contacto con un sistema transductor

Se clasifican de acuerdo al proceso biológico y en base al transductor; entre estos se encuentran los biosensores electroquímicos enzimáticos que son aquellos que

monitorizan las corrientes faradaicas resultantes de intercambios electrónicos entre el

sistema y un electrodo enzimático mantenido a un potencial apropiado constante.

Estos biosensores son ampliamente utilizados por su gran versatilidad y alta

sensibilidad, tienen la ventaja sobre otros sensores químicos ordinarios de que

permiten una gama amplia de tecnología de transducción para ser usada; en

particular los biosensores de glucosa electro enzimáticos se han usado en la

industria de alimentos para el control de calidad y aún más importante como un

indicador clínico de diabetes [4].

En los últimos años se han desarrollado numerosos biosensores para medir

glucosa basados en la transferencia de electrones generados por una enzima

óxido-reductasa como la glucosa oxidasa a la superficie del electrodo con el uso de

intermediarios naturales que promueven el paso de los electrones; uno de los más

recientes y más prometedores transportadores de electrones es el ferroceno y sus

derivados [ 16].

La inmovilización del elemento de reconocimiento sobre una membrana o

matriz, que a su vez se fija a la superficie del transductor, es una de las etapas claves

en la construcción del biosensor.

Inmovilizar un elemento biológico, consiste en convertirla en sitios activos de

una matriz a través de diferentes métodos. La inmovilización de enzimas se puede

realizar de diferentes maneras, incluyendo el atrapamiento fisico de un gel de

polímero, la adsorción física en un soporte inorgánico poroso o el enlace covalente de

la enzima a una superficie sólida como un polímero (6].

Recientemente se ha despertado un gran interés en las técnicas de

inmovilización sobre biopolímeros como el quitosano, puesto que este biopolímero

tiene una excelente habilidad para formar películas con buena adherencia, es

quitina no acetilada o parcialmente desacetilada y puede encontrarse en las paredes

celulares de la fungina y los dermatoesqueleto de muchos artrópodos como

cangrejos y camarones, por lo que es extensamente disponible y bastante barato,

razones por las cuales se ha incrementado su uso en la inmovilización de enzimas[?].

Uno de los problemas fundamentales en los biosensores es la estabilidad del

material biológico en el tiempo, por lo que ha sido necesario desarrollar nuevas

tecnologías de inmovilización para mejorar la estabilidad térmica y química del

elemento biológico, que en este caso son enzimas oligoméricas.

Así mismo otra limitación de los procedimientos enzimáticos es el elevado

costo de las enzimas, particularmente cuando se utilizan para medidas de rutina o en

continuo. Esta desventaja ha dado lugar a la utilización de medios con enzimas

inmovilizadas en los cuales una pequeña cantidad de enzima se puede utilizar para

análisis consecutivos de varias muestras.

Por lo expuesto anteriormente surge la necesidad de construir un biosensor

amperométrico, para determinar concentraciones de glucosa en soluciones acuosas

diluidas basado en una técnica de inmovilización de glucosa oxidasa sobre quitosano

que permita mejorar la estabilidad térmica y química de la enzima. La respuesta del

biosensor debe ser precisa, exacta, reproducible y lineal.

El método para la fabricación de biosensores de glucosa que se propone es

de muy fácil aplicación por la inmovilización eficaz de la glucosa oxidasa usando un

biopolímero simple como el quitosano. La glucosa oxidasa es, sin duda, la enzima

más utilizada como reactivo analítico debido, no solo a su eficacia en la

determinación de glucosa, especie de gran interés analítico, sino también debido a su

sistema glucosa/glucosa oxidasa un modelo muy conveniente en el campo de los biosensores [8].

La inmovilización de la glucosa oxidasa se realiza por atrapamiento en quitosano, en este método de inmovilización la enzima queda atrapada en las cavidades interiores de una matriz sólida. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la dilución de la enzima en un sistema polimérico de quitosano y

acrilamida. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura y mediante la adición de un reactivo químico.

El objetivo principal de este trabajo de investigación es desarrollar un nuevo biosensor enzimático para la determinación de glucosa basado en la inmovilización de glucosa oxidasa por atrapamiento en quitosano. El biosensor resultante permitirá obtener una respuesta sensible y selectiva frente a la glucosa dejando abierta la posibilidad de desarrollar otros biosensores que involucren otras biomoléculas capaces de funcionar como elemento de bioreconocimiento.

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2.1 OBJETIVO GENERAL

Desarrollar un biosensor enzimático para la determinación amperométrica de glucosa basado en la inmovilización de glucosa oxidasa por atrapamiento en quitosano.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

2.2.1 Evaluar la respuesta espectrofotométrica del sistema de enzimas oxidoreductasas acopladas (GOD/POD) en presencia de glucosa.

2.2.2 Realizar determinaciones amperométricas con un biosensor tipo compositum de grafito, ferroceno y enzimas oxidoreductasas (GOD/POD) inmovilizadas en estructuras tridimensionales.

2.2.3 Desarrollar un método de inmovilización de glucosa oxidasa por atrapamiento en quitosano.

2.2.4 Fabricar un biosensor amperométrico para la determinación de glucosa basado en la inmovilización del elemento de reconocimiento en una pastilla polimérica de quitosano.

lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllltllllllllllllllllllllllllll\lllllllllllllllllllllllllltll

3. l Biosensores

La necesidad de llevar a cabo determinaciones analíticas de manera rápida, selectiva y con elevada sensibilidad ha dado lugar a la aparición y amplio desarrollo de los denominados biosensores. Estos dispositivos analíticos que incorporan un elemento biológico como fase sensorial asociado a un transductor físico-químico, presentan un enorme potencial para la detección de numerosos analitos tanto en el ámbito del análisis clínico, industria alimenticia o medioambiental.

Antiguamente se consideraba que un biosensor era cualquier sonda analizadora que introducida en un medio biológico produjera una señal cuantificable [3].

Hoy en día se da otra definición: "Un biosensor es una herramienta o sistema analítico compuesto por un material biológico inmovilizado (tal como una enzima, anticuerpo, célula entera, orgánulo o combinaciones de los mismos), en íntimo contacto con un sistema transductor adecuado que convierta la señal bioquímica en una señal eléctrica cuantificable"[3].

-

~

·

Figura (1) Esquema básico con los com1lonentes llrincipales de un biosensm·. El biocatalizador

(a) convierie el sustrato en producto. El tmnsductor (b) mide el desanollo de esta r·eacción y la

En una muestra de matriz compleja, el elemento de reconocimiento biológico es capaz de discriminar entre los distintos componentes de la misma e interaccionar con el compuesto a analizar. Una vez producida la interacción se dispara una señal que es conducida por el transductor. La señal así transmitida es convenientemente

registrada y almacenada para su tratamiento posterior.

Los biosensores difieren esencialmente de las técnicas existentes desde al menos tres puntos de vista muy útiles y fundamentales: primero en el contacto íntimo del material biológico (tanto si consiste en células enteras, orgánulos, anticuerpos o enzimas) con un transductor que convierte la señal biológica en una señal eléctrica cuantificable; segundo en su tamaño funcional, ya que la porción sensora de un biosensor es generalmente pequeña y eso permite pequeños tamaños de muestra, una interferencia mínima con los procesos existentes después de la implantación y, por último, el análisis de medios peligrosos o poco accesibles, sin interrumpir el flujo del

proceso [10].

3.1.1 Desarrollo de los biosensores

Numerosas investigaciones se han llevado a cabo para desarrollar biosensores enzimáticos para la cuantificación de glucosa. El primero en desarrollar un biosensor de glucosa fue el Profesor Leland C. Clark en el año 1956, reconocido posteriormente como padre del concepto de biosensor, publicó su artículo definitivo sobre el electrodo de oxígeno, basándose en este electrodo, y con el deseo de aumentar el número de sustancias analizables en el cuerpo humano, describió, en el año 1962, la manera de hacer más "inteligentes" estos sensores electroquímicos mediante el atrapamiento de transductores enzimáticos en su superficie. Bautizado con el nombre de electrodos enzimáticos, consistía en la inclusión de la enzima glucosa oxidasa en la superficie de un electrodo de oxígeno con una membrana de

diálisis. Este sensor permite relacionar directamente la concentración de glucosa con la disminución que se produce en la concentración de oxígeno [9].

Posteriormente, Guilbault y Montalvo detallaron el primer electrodo enzimático potenciométrico basado en la inmovilización de la enzima ureasa sobre un electrodo selectivo de amonio. Estas ideas acabaron plasmadas en el lanzamiento comercial en 1975 de un dispositivo para el análisis de glucosa basado en la detección amperométrica de peróxido de hidrógeno, siendo así el primero de los numerosos biosensores comercializados posteriormente a lo largo de todo el mundo [9].

La utilización de transductores de tipo electroquímico, óptico, piezoeléctrico o térmico junto a la inclusión de enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, receptores celulares e incluso células enteras ha dado lugar a una amplísima variedad de configuraciones y alternativas para la resolución de numerosos problemas analíticos y aplicación en diversos campos como la salud, industria alimentaria, monitorización medioambiental, control de procesos industriales o seguridad y defensa [3].

En el campo de la medicina son innumerables los sensores de glucosa que han sido desarrollados, algunos hitos relevantes en la breve historia de los biosensores incluyen la utilización de transductores térmicos en 1984, que dio lugar a las denominadas sondas termoenzimáticas (termal enzyme probes) y termistores enzimáticos (enzyme thermistors). En 1985 la utilización de bacterias como elemento sensorial dio lugar a los electrodos microbianos para la determinación de alcohol. En 1986, un biosensor electroquímico se incorporó en un páncreas artificial, para la determinación de glucosa. Otro hito importante ha sido la utilización de mediadores electroquímicos para favorecer la transferencia de electrones desde el centro redox de una enzima a la superficie electrónica [3,9]. Este hecho dio lugar a una nueva generación de biosensores electroquímicos.

Basado en esta tecnología, en 1992 se describió la implantación subcutánea de un biosensor de glucosa. En 1996, la utilización de mediadores electroquímicos

inmovilizados en electrodos enzimáticos serigrafiados dio lugar a la aparición del "bolígrafo" para la monitorización personal de glucosa en sangre. En la actualidad son

muchos los trabajos que se han desarrollado en este campo [11].

En relación a la industria alimentaria se han realizado una gran cantidad de investigaciones relacionadas con biosensores; específicamente en la Universidad de los Andes importantes trabajos han sido llevados a cabo de manera exitosa.

Valenzuela y Ortiz (2003) desarrollaron un biosensor con un sistema dual de reconocimiento formado con las enzimas glucoxidasa (GOD) y peroxidasa (POD) acopladas e inmovilizadas en un material amorfo e integrado en conjunto con grafito y ferroceno para formar una pastilla a partir del material compuesto. Este biosensor se diseñó y se probó para medir glucosa y, luego con un grupo de enzimas diferentes, entre las cuales están la colesterol esterasa (CE) y la colesterol oxidasa (CO), se utilizó para medir colesterol [12].

Por otro lado, son numerosísimas las aplicaciones del quitosano en el campo de los biosensores, especialmente como soporte para la inmovilización de enzimas sensibles a un sustrato específico.

Un biosensor para la determinación de peroxido de hidrogeno fue diseñado por Wang Huai en el 2004 basado en la inmovilización de peroxidasa en una matriz de quitosano a través de un entrecruzamiento con glioxal [13].

En el 2004 Minghui y Yunhui diseñaron un biosensor de glucosa sobre quitosano entrecruzado con glutaraldehido para mejorar la selectividad y estabilidad del sensor [7].

En la actualidad se trata de adelantar algunos proyectos conjuntos entre los grupos de Electroquímica y Polímeros de la Facultad de Ciencias y el Laboratorio de Ciencias, Ingeniería y Biotecnología de los Alimentos de la Facultad de Ingeniería.

Dichos proyectos se fundamentan básicamente en utilizar el quitosano como soporte para inmovilización de especies macromoleculares: se ha venido adelantando un proyecto con el Laboratorio de Enzimología de Parásitos, del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias, relacionado con la inmovilización de biopolímeros y proteínas recombinantes selectivas, con el propósito de producir un biosensor para el mal de Chagas, que pueda ser usado directamente en muestras de

sangre [ 14].

Otros trabajos relacionados con la deposición de nanopartículas se comenzaron en el primer trimestre del 2006 en conjunto con el University College de Londres (Inglaterra) para depositar nanoparticulas de carbón con el propósito de desarrollar biosensores para glucosa en sangre, usando la enzima glucosa oxidasa [14].

3.1.2 Requerimientos de un biosensor de glucosa:

Un biosensor de glucosa debe ser altamente específico para el propósito de la aplicación y que su reacción sea independiente de factores tales como la agitación, la presión, la temperatura y el pH; además debe ser estable (permanecer sin cambios) en condiciones normales de almacenamiento y mostrar a su vez estabilidad luego de un gran número de pruebas. La respuesta debe ser precisa, exacta, reproducible y lineal en el rango de interés del análisis, y no poseer ruido eléctrico [ 11].

Por último, debe ser de bajo costo y haber un mercado para el biosensor. No tiene sentido desarrollar estos dispositivos si la tendencia es de mantener los métodos tradicionales en vez de descentralizar las pruebas en laboratorio.

3.1.3 Clasificación de los biosensores:

Existen diferentes puntos de vista para clasificar los biosensores, pero la más acertada y lógica parece ser la que se basa en la naturaleza del proceso biológico [15].

3.1.3.1 Clasificación de acuerdo al proceso biológico

3.1.3.1.1 Biosensores Catalíticos (enzimas, tejidos, células o

microorganismos):

Las enzimas son biocatalizadores que actúan con bastante especificidad; disminuyen la energía de activación d las reacciones que catalizan. La enzima

transforma el sustrato en producto formando previamente un complejo ES, que luego libera la enzima y el producto de reacción, la enzima liberada podrá tomar del medio

otro sustrato para seguir su transformación hacia el producto P. Existen otros casos de reacciones donde no solamente reacciona el sustrato sino también otro factor que se denomina cofactor o co-sustrato, que es necesario para generar los productos [15].

3.1.3.1.2 Biosensores de Afinidad (Inmunosensores y quimiorreceptores):

se construyen inmovilizando células enteras y los transductores son básicamente potenciométricos o amperométricos, poseen una respuesta lenta y frecuentemente responden a un amplio espectro de sustratos.

3.1.3.2 Clasificación en base al transductor:

3.1.3.2.1 Electroquímicos: Estos se dividen en potenciométricos, amperométricos y

conductimétricos.

3.1.3.2.1.1 Biosensores potenciométricos:

Los electrodos potenciométricos para el análisis de las moléculas de importancia biológica pueden fabricarse de forma similar a los electrodos sensibles a gases. La clase más frecuente de biosensores potenciométricos son los llamados electrodos enzimáticos, en los que una enzima queda atrapada en la superficie de un

electrodo selectivo de iones. La reacción del analito con la enzima da lugar a un producto cuya concentración puede medirse con el electrodo selectivo de iones.

También se han diseñado biosensores potenciométricos para otras especies biológicamente activas tales como anticuerpos o partículas bacterianas [3].

Ejemplos electrodos enzimáticos que han sido para la determinación de

nitrógeno uréico en sangre (BUN), un importante test clínico de rutina. En presencia de la enzima ureasa, la urea se hidroliza [3].

Los transductores más utilizados actualmente por su bajo costo son los electroquímicos especialmente los potenciométricos y más aún los amperométricos, razón por la cual nuestro estudio va a estar orientado a los biosensores

electroquímicos enzimáticos amperométricos.

3.1.3.2.1.2 Biosensores electroquímicos enzimáticos amperométricos

Los biosensores electroquímicos amperométricos son versátiles y de muy buena sensibilidad, los más usados son los electrodos enzimáticos. Estos biosensores monitorizan las corrientes faradaicas resultantes de intercambios electrónicos entre el

sistema y un electrodo enzimático mantenido a un potencial apropiado constante; estos biosensores son herramientas importantes en el análisis clínico, medioambiental, y de alimentos [ 15]. Ellos tienen la ventaja sobre otros sensores químicos ordinarios de que permiten una gama amplia de tecnología de transducción para ser usada, en particular los biosensores de glucosa electro enzimáticos se han usado en la industria de alimentos para el control de calidad y aún más importante como un indicador clínico de diabetes [7].

El concepto de un biosensor basado en sistemas redox surgió de la investigación básica llevada a cabo en células de combustible biológico. La clave en

la construcción de este tipo de biosensores es facilitar la transferencia de los electrones generados por una enzima óxido-reductasa (o un sistema enzimático) a la superficie del electrodo. Se han demostrado que los intermediarios naturales, promueven, de hecho, el paso de los electrones, pero uno de los más recientes y más

prometedores transportadores de electrones es el ferroceno y sus derivados[ 16].

Los biosensores amperometricos de primera generación para la detección de glucosa comprendían dos posibilidades. Primero; la reacción de glucosa en presencia de la glucosa oxidasa para obtener peróxido de hidrógeno y ácido glucónico, seguido de la medición amperométrica del peróxido de hidrógeno, mediante un electrodo de platino. En segundo, se podría monitorizar el consumo de ca-sustrato oxígeno mediante el electrodo de Clark.

GOD( ox) +

fJ-

Ec. (1)

Las mejoras en estos diseños han permitido sustituir el oxigeno por un aceptar de electrones no fisiológico que acelere el intercambio de electrones.

Un mediador redox debe participar en la reacción redox con ambos componentes, el elemento biológico y el electrodo; además debe ser estable sobre las condiciones de ensayo requeridas; no debe participar en la reacción durante la transferencia de electrones, debe tener un potencial redox apropiado lejos de los otros potenciales de las especies químicamente activas que pueden estar presentes en la muestra, así como permanecer inalterado en un amplio rango de pH y por supuesto no debe ser toxico [5, 16].

Por otra parte el uso de mediadores redox es muy ventajoso puesto que permite condiciones amperométricas independientes del oxigeno presente en la

disolución que contienen el sustrato o analito, así mismo el potencial del electrodo

está determinado por el potencial del par mediador ( ej: Ferroceno forma ox

-Ferroceno forma red) y como ventaja adicional permiten la regeneración de la enzima

en su estado oxidado [15].

El ferroceno es uno de los mediadores más empleados, estos exhiben

potenciales redox entre 100 y 400 m V vs el electrodo de referencia.

Los biosensores amperometricos enzimáticos para la medición de glucosa, donde

se ha incorporado un mediador redox como el ferroceno se basan en la reacción de la

glucosa oxidasa y glucosa con un mediador aceptar de electrones como el ferro ceno:

Glucosa + GOD (ox)

GOD (red) + Ferroceno (forma ox) --¿

\' ·'

Acido glucónico + GOD (red)

GOD(ox) + Ferrocinio (forma red) + e·

~ .- 1 . 1 _¡l

¡•· ...

.. ·

.t' l .

.. ~ l

Ec.(2)

Figura (2) Mecanismo de reacción de biosensor de glucosa cuando se emplea fen-oceno como

mediador

En la figura se observa que cuando el ferroceno sustituye al oxigeno como

aceptar de electrones, este pasa a su forma reducida (ferrocinio) y luego entrega los

electrones al transductor para el procesamiento de la señal, siendo la intensidad de

3.1.3.3 Otros tipos de biosensores:

Otros tipos de biosensores han sido desarrollados para muchas aplicaciones

entre los cuales están:

3.1.3.3.1 Ópticos: Otro nuevo tipo de biosensores, basados en principios

ópticos, fue desarrollado alrededor de 1980 por Lowe y sus colaboradores, se le denomino sensor optoelectrónico. El componente biológico inmovilizado es una enzima ligada a un cromóforo que a su vez está ligado a una membrana. Un cambio de pH generado por la reacción enzimática cambia el color del complejo cromóforo/membrana. El sistema transductor consiste en un simple diodo electroluminiscente (LED), con una longitud de onda correspondiente al pico de absorción del cromóforo y un fotodiodo acoplado. La cámara de flujo representada era extremadamente estable y dio una señal muy aceptable [3].

3.1.3.3.2 Térmicos: Es una clase interesante de biosensores introducida en los

años 70. Utilizan un dispositivo termistor capaz de registrar las pequeñas diferencias de temperatura producidas por las reacciones bioquímicas. A menudo se obtiene una

respuesta lineal la temperatura, en el rango de 0.01 a 0.001°C. Los grupos americanos y suecos fueron pioneros en el análisis térmico enzimático en forma de sondas o sistemas de flujo, pero la miniaturización de los dispositivos todavía es esencial para obtener un biosensor de formato aceptable [9].

3.1.3.3.3 FET's: Durante los últimos años se han realizado esfuerzos para

producir un biosensor electroquímico miniaturizado, usando unos dispositivos electrónicos convencionales llamados transistores de efecto de campo (FET's),

ISFETs (dispositivos ion-selectivos) o CHEMFET (sensores químicos que miden la energía de reacción con moléculas simples). Sin embargo, todavía no se han resuelto los problemas fundamentales en la construcción de este tipo de biosensores. Las tecnologías requeridas de inmovilización y fabricación necesitan un mayor desarrollo.

Los mecanismos de este tipo de transistores químicos están caracterizados por un alto grado de miniaturización, respuestas rápidas, alta sensibilidad y la posibilidad de

obtener sensores multireconocidos. La estabilidad térmica y química del elemento sensible tiene que ser investigada. Estos "chips" sensores (aproximadamente 30 mm de diámetro) son similares a los usados en los ordenadores excepto que la puerta metálica que controla la corriente del transistor es reemplazada por un material orgánico o biológico. El material sensible responde a un cambio en el medio circundante, bien sea gaseoso o líquido. La respuesta ejerce un efecto de campo sobre la corriente de fuente a sumidero en el FET. Usualmente esta corriente se mantiene

constante mientras se registra la tensión de fuera necesaria para lograrlo[ 17].

3.1.3.3.4 Biosensores de célula entera: Un campo totalmente diferente en la

construcción de biosensores es aquel que utiliza orgánulos o células enteras inmovilizadas. Ejemplos de esta clase de biosensores usados en diferentes aplicaciones comerciales se muestran en la tabla. Estos biosensores son básicamente potenciométricos o amperométricos, pero tienen una lenta respuesta característica y a menudo responden a un amplio espectro de sustratos. Los biosensores de célula entera podrán llegar a constituirse en una clase en sí mismos cuando se disponga de células manipuladas genéticamente ex profeso para suministrar una secuencia enzimática determinada o regenerar factores complejos [9].

3.2.3.3.5 Biosensores de láminas impresas: La tecnología de impresión de

láminas (screen printing technology) es un procedimiento simple y rápido para la producción en serie de biosensores electroquímicos descartables. Esta técnica consiste en depositar láminas de tintas de diferentes propiedades electroquímicas y de forma y grosor controlados sobre un sustrato inerte. Luego se usan procedimientos de medición electroquímica tales como la potenciometría, la amperometría y la

voltamperometría. Las tirillas impresas permiten varias formas de operación distintas: pueden ser introducidas en la solución, se puede depositar un pequeño volumen en la

superficie del sensor para cronoamperometría o incluso se puede depositar una pequeña cantidad de hidrogel sobre ambos electrodos para producir un sensor de

gas[18].

3.1.3.3.6 MIPs: una nueva generación de biosensores (Polímeros que

contienen una memoria molecular impresa) tienen unas propiedades únicas que los hacen especialmente sensibles a la tecnología de sensores. Exhiben buenas especificaciones de varios componentes para el interés medico, medioambiental y de industria; y tienen una excelente estabilidad operacional. Sus propiedades reconocidas no son afectadas por ácidos, bases, calor o tratamiento en fase orgánica, haciéndolos altamente aceptables como elementos de reconocimiento en sensores químicos [ 17].

Los biosensores basados en enzimas, en algunos casos, son mostrados para ser superiores en selectividad para la afinidad de los biosensores. Esta tendencia se explica por la conversión del analito, la cual ocurre después del paso de unión inicial en conjunción con el movimiento de la amplificación y hace posible obtener gran sensibilidad en transductores amperométricos que también son menos sensibles a las interferencias no específicas de las uniones[19].

Los polímeros conductores han sido usados como una selectividad rudimentaria en la partición de fases sobre electrodos y han sido mostrados como retención de memoria aniónica que se usa para el doping. Este efecto ha sido usado amperométricamente y potenciométricamente y pueden ser correlacionados con los radios iónicos y la carga de los aniones testados. Los materiales exhibidos predeterminadamente para el reconocimiento molecular selectivo en combinación con la conductividad eléctrica se pueden usar en sensores electroquímicos y proveer las bases para una nueva línea de desarrollo de sensores introduciendo una nueva fusión de materiales constituidos e integrados para el reconocimiento de elementos y

3.1.4 Usos y aplicaciones de los biosensores:

El uso de biosensores en los procesos industriales es de gran utilidad puesto que proporciona la posibilidad de respuesta rápida y, por lo tanto, un control feedback mejorado. Por otro lado los biosensores no interfieren en el flujo del proceso y tiene una vida útil potencial de días, a veces semanas, lo que permite dedicar al personal

técnico a otras tareas.

Entre otras de las ventajas están que facilitan el muestreo rápido y el rechazo de

materias primas por debajo del estándar durante la misma entrega así como

proporcionan un método de monitorización de bajo costo para materias primas y

productos almacenados.

Los biosensores pueden ser utilizados ampliamente en el análisis clínico,

terapéutica, veterinaria, agricultura, monitorización de procesos industriales y control de polución y medio ambiental. Tienen el atractivo de ser de bajo costo, pequeños,

sensibles, y fáciles de usar[3].

En el área de química clínica, medicina y terapéutica los biosensores de mesa

de tipo electroquímico se usan en los laboratorios de bioquímica clínica para determinar glucosa, ácido láctico, etc [3].

Otra área de la medicina clínica y terapéutica donde los biosensores entrarán

con fuerza es la monitorización fuera de las horas de visita.

En el campo de la veterinaria, agricultura y alimentación hay muchas áreas donde ni siquiera se dispone de sistemas de análisis convencionales. La introducción

de biosensores adecuados repercutirá con éxito en las siguientes áreas: cuidado de animales; control de la fertilidad y de enfermedades infecciosas. Industrias tácticas: leche (proteínas, grasa, anticuerpos, hormonas, vitaminas) frutas y verduras:

diagnosis viral y de hongos. Alimentos: contaminación y toxinas (Salmonella). Fermentaciones: mejora la producción y control de calidad [9].

Además de la fermentación alcohólica hay un número considerable y cada vez mayor de sustancias que se están produciendo a escala a partir de cultivos de células eucariotas y procariotas. La monitorización de estos delicados y caros procesos es

esencial para reducir y mantener bajos costes de producción. Además, pueden diseñarse biosensores específicos para medir la generación de un producto de fermentación.

Debido a que pueden ser miniaturizados y automatizados, los biosensores pueden desempeñar muchos papeles en el campo de la polución y control medio ambiental. Un área donde los biosensores de célula entera pueden llegar a ser importantes es el control de aguas, para combatir el creciente número de polucionantes encontrados en las aguas superficiales y, por tanto, en las aguas de bebida. Actualmente aparecen tantos materiales no deseados en las aguas superficiales que el análisis de una única sustancia es insuficiente, se requiere un biosensor de amplio espectro. Este tipo de biosensor, para la determinación de la DBO, ya está en el mercado [9].

Esta área del desarrollo de biosensores está aumentando progresivamente su interés militar. Por ejemplo, una compañía ha producido un biosensor enzimático para

detectar gas nervioso. Con las recientes tendencias hacia el desarrollo de arsenales biológico sofisticados esta área de la investigación en biosensores debe recibir una atención prioritaria.

La inmovilización del elemento de reconocimiento sobre una membrana o matriz, que a su vez se fija a la superficie del transductor, es una de las etapas claves en la construcción del biosensor. En el caso específico de los biosensores diseñados el elemento de reconocimiento es una enzima.

3.2 Enzimas.

Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de las reacciones biológicas. Con su acción regulan la velocidad de muchas reacciones químicas requeridas para la actividad normal de las células; que no se producirían con la suficiente rapidez a la temperatura y pH del cuerpo sin la participación de estas

proteínas especializadas.

El término que define la rapidez a la que se produce una reacción química, catalizada o no, es la velocidad. Las enzimas incrementan la velocidad actuando

como catalizadores [21].

La enzima puede unirse temporalmente de forma covalente a la molécula que

se está transformando durante los pasos intermedios de la reacción, pero al final de la misma la enzima se regenera en su forma original al liberarse el producto.

Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas, cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.

Las enzimas se clasifican en varias categorías: hidrolíticas, oxidantes y reductoras, dependiendo del tipo de reacción que controlen. Las enzimas hidrolíticas

aceleran las reacciones en las que una sustancia se rompe en componentes más simples por reacción con moléculas de agua. Las enzimas oxidativas, conocidas como oxidasas, aceleran las reacciones de oxidación, y las reductoras las reacciones de reducción en las que se libera oxigeno; otras enzimas también catalizan otros tipos de reacciones [21].

3.2.1 Tipos de Enzimas:

Según la función que realizan las enzimas, éstas se clasifican en seis grupos: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y lipasas [22].

3.2.1.1 Oxido-Reductasas: Enzimas relacionadas con las oxidaciones y

reducciones biológicas que intervienen de modo fundamental en los procesos de respiración y fermentación.

3.2.1.2 Transferasas: Catalizan el traspaso de grupos químicos, a exclusión

de hidrógeno; entre dos sustratos. Forman parte de este grupo numerosas enzimas que reciben nombres especiales: Transaminasas, Transacetilasas, Quinasas, etc. Tipos: metiltransferasas, aciltransferasas, glucosiltransferasas, enzimas que hacen la transferencia de grupos nitrogenados y enzimas que transportan grupos fosfatos.

3.2.1.3 Hidrolasas: Es un grupo muy numeroso que comprende cerca de 200

enzimas. Poseen en común la capacidad de introducir los elementos del agua (H+ y OH-), en el sustrato atacado produciendo así una hidrólisis. Tipos: Lipasa,

Glucosa-6-fosfatasa, a -amilasa, tripsina, ureasa y carboxipeptiodasa.

3.2.1.4 Liasas: Grupo de enzimas que catalizan la participación reversible de

grupos químicos que son desprendidos de sus sustratos por mecanismos en los que interviene la hidrólisis. Tipos: Pivurato descarboxilasa, aldolasa, enzima condensante sintetizada del citrato, fumarasa, citrato deshidratasa, aconitasa.

3.2.1.5 Isomerasas: Son las enzimas que catalizan diversos tipos de

isomerización, sea óptica, geométrica, funcional, de posición, etc. Tipos: Lactato

racemasa, ribulosa fosfato epimerasa, maleato epimerasa, triosa fosfato isomerasa, glucosa fosfato isomerasa.

Un enlace polipeptídico es un enlace covalente que se establece entre un grupo carboxilo y un grupo amino, dando lugar al desprendimiento de una molécula de agua.

El enlace peptídico tiene un comportamiento similar al de un enlace doble, es decir, presenta una cierta rigidez que inmoviliza en un plano los átomos que lo forman. Todas las proteínas contienen: Carbono, Hidrógeno, Nitrógeno y Oxígeno, mientras que existen otras que contienen elementos adicionales tales como: azufre,

hierro, fósforo y zinc[21].

3.2.2 Propiedades enzimáticas:

Las enzimas son catalizadores típicos capaces de acelerar la velocidad de una reacción sin ser consumidas en el proceso. La cinética de las reacciones enzimáticas difiere de las reacciones inorgánicas simples.

Cada enzima es específica de forma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reacción, y es más eficaz a una temperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede acelerar una reacción, las enzimas son inestables cuando se calientan. La actividad catalítica de una enzima está determinada sobre todo por su secuencia de aminoácidos y por la estructura terciaria, es decir, la estructura de plegamiento tridimensional de la molécula[23].

3.2.3 Estructura y funcionamiento de las enzimas

Las enzimas son grandes proteínas que aceleran las reacciones químicas. En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reacción. Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud. Este hecho asegura que la enzima no participe e reacciones equivocadas. La enzima misma no se ve afectada por la reacción. Cuando los productos se liberan, la enzima vuelve a unirse con un nuevo sustrato

3.2.3.1 Desnaturalización de las enzimas

La desnaturalización de las enzimas implica modificaciones en la estructura

de la proteína que traen como resultado una alteración o desaparición de sus funciones. Este fenómeno puede producirse por una diversidad de factores, ya sean fisicos cómo: el calor, las radiaciones ultravioleta, las altas presiones; o químicos cómo: ácidos, bases, sustancias con actividad detergente. Este fenómeno genera la ruptura de los enlaces di sulfuro y los puentes de hidro geno [21].

Cuando la proteína es desnaturalizada pierde sus funciones cómo: viscosidad, velocidad de difusión y la facilidad con que se cristalizan. Pero la consecuencia más significativa de la desnaturalización es que las proteínas pierden su actividad biológica característica. La reversibilidad de la desnaturalización, depende que tan

fuertes sean los agentes que desnaturalizaron la proteína[21].

3.2.4 Glucosa oxidasa (GOD) [21, 22,24].

La glucosa oxidasa (GOD) es una enzima oxido reductasa que cataliza la reacción de la glucosa (sustrato) y el oxigeno es el cofactor o ce-sustrato. La reacción ocurre de la siguiente manera:

EC.(3)

H 202 + 4 a min o.antipirina- fenol POD ) Compuesto coloreado (i min oquinona) + H 20

La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la reacción de la glucosa en presencia de oxigeno a acido glucónico y peroxido de hidrogeno, y la peroxidasa (POD) reacciona con el peroxido de hidrogeno en presencia de un cromógeno generando agua y un compuesto coloreado.

Si se prepara una solución con una concentración de glucosa conocida se llevan a cabo las Ec.3 donde la absorbancia, medida por un método

enzimático-espectrofotométrico, es proporcional a dicha concentración.

La glucosa oxidasa (P-O-glucosa, oxigeno 1 oxido reductasa, GOD, D-glucosa-1-oxidasa) descubierta en 1928 por Muller en aspergillus níger y penicillium glaucum, cataliza la oxidación de P-D-glucosa a 8-D-gluconolactona en la presencia de oxigeno molecular:

P -

a -

enzima -FADH ₂ + 0₂ ~ enzima -FAD + H₂0₂ Ec.(4)

a -

La glucosa oxidasa posee un grupo prostético ligado a la parte proteíca y el mismo corresponde a la Flavina Adenina dinucléotido abreviada como FAD. Los flavin-nucleótidos actúan como grupos prostéticos de las flavoenzimas o flavoproteínas las cuales son enzimas de oxido reducción.

3.2.4.1 Características de la Glucosa oxidasa (GOD) [15].

Peso molecular: 160.000 daltons.

pH óptimo: 5.5 con un rango amplio de 4-7

Punto isoeléctrico: pH 4,6.

Temperatura óptima: 35-50 °C.

Estabilidad: es estable por 12 meses a 2-8°C.

Especificidad: posee alta especificidad para con la P-D-glucosa. No actúa sobre la u-D-glucosa, 2-deoxi-u-D-glucosa, D-manosa y O-galactosa.

Inhibidores: p-cloromercuribenzoato, hidroxilamina, hidracina, bisulfito de sodio.

Estructura: Es una enzima dimérica que consiste de dos polipéptidos idénticos de aproximadamente 80KD unidos por enlaces disulfuro. Cada subunidad contiene 1

mol de FAD.

La glucosa oxidasa no cataliza la reacción completa bajo condiciones anaeróbicas y la velocidad de reacciona es dependiente de la concentración de oxigeno.

G L

-1-

t

[

EFAD-G] EFAD

EFADH₂.L

Donde:

G: beta-D-glucosa

EFADH₂

L: delta-D-gluconolactona

[

EFADH2

.0

EFAD EFAD.H202

Ec. (5)

La forma oxidada de la enzima, EFAD, funciona como una dehidrogenasa para extraer 2 hidrógenos de la P-D-glucosa para formar la enzima reducida,

EF ADH2, y 8-D-gluconolactona. En una etapa subsecuente, la 8-D-gluconolactona se

3.3 Inmovilización de enzimas

Inmovilizar una enzima, consiste en convertirla en sitios activos de una matriz a través de diferentes métodos. Dicha matriz es llamada soporte, y permite que una pequeña cantidad de enzima sea utilizada para grandes cantidades de sustrato, a través de procesos continuos [25].

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células,

etc. por su unión a un soporte [6].

Los reactores donde se llevan a cabo reacciones controladas por enzimas se les llama bio-reactores y constan de un lecho ( soporte + enzima inmovilizada ), a través del cual pasa un flujo de sustrato continuamente; durante el tiempo de residencia del sustrato en el bioreactor, ocurre la reacción, obteniendo el o los productos deseados a

la salida del mismo [25].

Las ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas son: El aumento de la estabilidad de la enzima; La posible reutilización del derivado lo que implica la disminución de los costos del proceso y la posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enztma inmovilizada.

Estos reactores con enztmas inmovilizadas emplean cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza [6].

Entre las desventajas del proceso de inmovilización están: La alteración de la

conformación de la enzima respecto de su estado nativo, la gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte, siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización y el biocatalizador es

más caro que la enzima nativa [ 6].

3.3.1 Métodos de inmovilización enzimática

En general, los métodos de inmovilización se clasifican en dos categorías:

retención flsica y unión química:

3.3.1.1Métodos de inmovilización de enzimas por retención fisica

Entre los métodos de inmovilización por retención fisica están: atrapamiento y

la inclusión de membranas.

El Atrapamiento consiste en la retención flsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros

fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo

mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un

reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de

un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, es de gran sencillez desde el punto de vista experimental puesto que requiere poca cantidad de enzima para obtener

derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza

química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína [ 6) .

Entre los métodos por inclusión en membranas están la microencapsulación y los reactores de membrana:

En la técnica de microencapsulación las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas

por surfactantes, también llamadas "micelas reversas"). Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas

reacciones que suceden en múltiples pasos[25]

El desarrollo de los reactores de membrana o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor [258].

3.3.1.2 Métodos de inmovilización de enzimas por unión química.

Entre los métodos de inmovilización por unión química están la unión a soportes y el reticulado.

Los métodos de unión a soportes son los métodos de inmovilización más utilizados. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de

pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han

utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y

más corrientemente en forma de esferas. Entre los soportes empleados están los soportes inorgánicos que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.), también se encuentran los soportes orgánicos como los Polímeros naturales: a su vez

divididos en: polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc). Proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc) ; y

Polímeros sintéticos: divididos en: poliolefinas (como el poliestireno ), polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) otros tipos (alcohol

polivinílico, poliamidas, etc). Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorción o por unión covalente. [26].

En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno. Los principales factores que influyen en la adsorción, son [26]:

l. El pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la proteína y del sólido;

2. La fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción de la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la proteína;

3. El diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor

de la enzima;

4. La presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimática del derivado.

Como principales ventajas de este método destacan: su preparación sencilla, su bajo costo, no hay cambios de especificidad enzimática y los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorción son principalmente la optimización de las variables que controlan la adsorción, los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecánico y la unión al soporte es débil.

Una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear resinas

de intercambio iónico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.

3.3.1.2.1 Unión covalente

La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas[27].

De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son

principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el

exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unión covalente. (23].

Este método presenta las siguientes ventajas:

l. La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;

2. La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización;

3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.

4. Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.

En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de inconvenientes:

l. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya

que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.

2. El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.

3. La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.

3.3.1.2.2 Reticulado

También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas. El método del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones

intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se

pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e,

incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son

enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones

extremas de pH y temperatura[28].

El co-reticulado, permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática

debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una

proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la

albúmina bovina).

Un procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en

inmovilizar la enzima por adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un

soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y

posteriormente añadir el reactivo bifuncional. [28]. .

Recientemente se ha estudiado un método de cross-linking que consiste en la

cristalización de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído (Cross-Linked

Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un

entramado cristalino, donde las moléculas de enzima están rodeadas exclusivamente

por otras moléculas de proteína. De esta manera la propia enzima actúa como soporte,

y su estructura terciaria está estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares.

La estructura cristalina posee canales microscópicos (20-SOÁ) que permiten el paso

de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reacción. Estos

cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, así como la acción de

las proteasas. Esta tecnología se ha aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se

han utilizado en la obtención de compuestos enatioméricamente puros y en la síntesis