Estructura genética en poblaciones de Symphonia globulifera
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(2) Tabla de Contenido. Resumen Introducción…………………………………………………………………………..1 Estructura genética en especies de árboles tropicales a escala local…………..2 Estructura genética en poblaciones de árboles tropicales a escala regional…...5 Historia filogeográfica de los bosques tropicales……………………………...8 Estudio filogeográfico en la especie Symphonia globulifera…………………12 Marcadores moleculares……………………………………………………...17 Fst y Rst………………………………………………………………………20 Importancia de este estudio…………………………………………………...22 Objetivos……………………………………………………………………...24 Materiales y Métodos………………………………………………………………..24 Especie de estudio…………………………………………………………….24 Recolección de muestras……………………………………………………...26 Extracción de ADN…………………………………………………………...28 Análisis genético……………………………………………………………...29 Análisis estadístico……………………………………………………………31 1) Frecuencias alélicas, heterocigocidad, equilibrio de Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento………………………….....................31 2) Diferenciación entre poblaciones: Fst y Rst……………………...31 3) Distancia genética………………………………………………...31. 2.
(3) 4) Aislamiento por distancia………………………………………...32 5) Construcción de árboles…………………………………………..32. Resultados……………………………………………………………………………33 1) Frecuencias alélicas, heterocigocidad, equilibrio de Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento………………………….....................33 2) Diferenciación entre poblaciones: Fst y Rst……………………...37 3) Aislamiento por distancia………………………………………...40 4) Distancia genética y construcción de árboles…………………….42 Discusión……………………………………………………………………………..44 Bibliografía…………………………………………………………………………..54. 3.
(4) Estructura genética en poblaciones de Symphonia globulifera (Clusiaceae) en Mesoamérica. Resumen La mayoría de poblaciones del mundo presentan cierto grado de estructura genética, causada por procesos ecológicos, históricos y geológicos. En este estudio se examina la estructura genética de 13 poblaciones de Symphonia globulifera, a una escala regional. Los microsatélites fueron los marcadores moleculares elegidos para este estudio gracias a su codominancia y a su alta tasa de mutación, lo que hace que se pueda estudiar la evolución en periodos cortos de tiempo (menos de 1 Ma.). Los valores de las medidas de diferenciación genética (Fst y Rst), indicaron que hay diferencias significativas entre la mayoría de las poblaciones. Según los resultados, las poblaciones de La Selva, La Guyana Francesa y Yasuni, se separaron genéticamente del resto de poblaciones hace mucho tiempo y desde entonces han acumulado mutaciones de forma independiente. Estos resultados coinciden con lo esperado ya que por un lado, los individuos de La Selva son los únicos que se diferencian morfológicamente del resto y por el otro, estudios previos han demostrado que desde el surgimiento de la cordillera de los Andes (>15 Ma.) las poblaciones que quedaron separadas, no han intercambiado material genético, lo cual explicaría la diferenciación entre las poblaciones de la Guyana Francesa y Yasuní y el resto de poblaciones ubicadas al lado oeste de los Andes. No se encontró una correlación linear positiva significativa entre la distancia geográfica y la genética, sin embargo gráficamente parece haber una tendencia al aislamiento por distancia. Se construyeron. 4.
(5) árboles sin raíz con las distancias genéticas de D (Nei) y (δµ ) ² (Goldstein) pero hubo. mucha incongruencia al utilizar diferentes métodos, por lo cual se pudo concluir que en este caso y con sólo 4 loci, esa aproximación no es precisa. Los resultados obtenidos en este estudio pueden estar sesgados como consecuencia de la presencia de alelos nulos y la homoplasia de tamaños, por lo cual se debe aumentar a 10 o más, el número de loci analizados.. Introducción En la introducción a este estudio se va a hablar acerca de los procesos responsables de causar estructura genética en las poblaciones de diferentes especies de árboles, tanto a escala local como regional. Entre estos procesos se encuentran el asilamiento por distancia (Wright 1943) y factores ecológicos como la dispersión de semillas, la polinización, y sistemas de reproducción, entre otros (Loveless & Hamrick 1984). Posteriormente se propone una nueva perspectiva desde la cual se puede abordar el tema de la estructura genética, mediante el análisis de la historia filogeográfica de las especies, la edad de las poblaciones y el momento histórico (geológico) en el que llegaron a sus destinos. Se hace un recuento general de la historia geológica que tuvo impacto en los patrones fitogeográficos y se introduce a un estudio filogeográfico realizado en la especie de estudio; Symphonia globulifera. Posteriormente se explica porque se escogieron los microsatélites como marcadores moleculares y no otros como los AFLP’s. Para terminar, se habla acerca de los objetivos y la aplicabilidad de este estudio.. 5.
(6) Estructura genética en especies de árboles tropicales a escala local Las poblaciones de la mayoría, si no de todas las especies del mundo, presentan cierto grado de estructura genética (Balloux y Lugon-Moulin 2002). Adicionalmente, se ha podido establecer que casi todos los organismos se encuentran distribuidos en parches, lo cual es el resultado de la interacción de varios agentes, que a su vez determinan y moldean la estructura genética de las poblaciones (e.g. Collevatti et al. 2001). Entre estos agentes se encuentran barreras geográficas, heterogeneidad de hábitats, procesos históricos e historias naturales de las especies (sistemas de apareamiento y dispersión de semillas, entre otros) (e.g., Donnelly & Towson 2000; Gerlach & Musolf 2000). Las plantas que se reproducen sexualmente dispersan sus genes de dos maneras (Crawford, 1984). Por un lado, los gametos masculinos se dispersan dos veces, desde el individuo masculino portador del polen al individuo femenino (vía polen), y del individuo femenino como parte del complemento genético del embrión. Por el contrario, los gametos femeninos solo se mueven una vez por medio de las semillas. Potencialmente existe una gran varianza en la distancia de dispersión del polen comparada con la de las semillas, gracias a esto, si se tiene conocimiento del sistema de polinización de una especie, es posible hacer predicciones precisas acerca de la distribución de la diversidad genética dentro de una población y entre diferentes poblaciones de la misma. Un estudio realizado en la especie de árbol tropical Symphonia globulifera (Aldrich and Hamrick 1998), reveló que las poblaciones desarrollan estructura genética cuando la dispersión de semillas interactúa con la estructura demográfica, por ejemplo la densidad de individuos adultos, o cuando interactúa con la estructura del bosque, por ejemplo la existencia de un claro. Hamrick et al. (1993) condujeron un estudio en el cual. 6.
(7) examinaron varias especies de árboles en un bosque continuo, teniendo en cuenta los diferentes estadios (adultos, juveniles, semillas), y determinaron que la densidad de individuos adultos y la estrategia de dispersión de semillas interactúan y determinan los niveles de estructura genética encontrada en la siguiente generación en un área local (e.g. < 50 ha). De su estudio concluyeron que una baja densidad de adultos y dispersión limitada, generan el patrón más fuerte de estructura genética, según lo revelado por el análisis de alozimas. Con ese estudio se pudo establecer también, que las especies que presentan una dispersión limitada (e.g. por medio de la gravedad), tienen mayor heterogeneidad genética entre los parches de los nuevos juveniles, mientras que las especies con una dispersión de semillas más extensa y que alcanza mayores distancias, presentan menos estructura genética espacial (Loveless & Hamrick 1984; Fleming & Heithaus 1981). A pesar de que se tiene una buena idea de cuales son los factores que causan la estructura genética entre las poblaciones, se sabe también que en realidad es algo mucho mas complejo y que requiere de la interacción entre la dispersión de semillas y otros procesos ecológicos y genéticos, como por ejemplo los patrones de deposición de semillas, la dispersión de polen, la densidad de adultos, la selección del micro hábitat y muchos aspectos de la ecología del reclutamiento de semillas (Howe & Smallwood 1982). La magnitud de la heterogeneidad genética espacial relacionada al sistema de dispersión de semillas, depende de varios factores (Hamrick et al, 1993): 1) La proporción de semillas que imigran a una población ya establecida y que. contribuyen con gametos para la siguiente generación (e.g. flujo genético) (Crawford 1984). Además, Slatkin et al. (1989), demostró que hay una diferencia importante entre la colonización de semillas hacia hábitats vacantes y el flujo genético hacia poblaciones 7.
(8) ya establecidas. Si por ejemplo, la mayor parte del movimiento de semillas es hacia poblaciones ya establecidas, la estructura genética encontrada será menor a la encontrada si la mayoría de semillas colonizan nuevos hábitats. 2) La densidad de adultos que se reproducen. Si las semillas que colonizan un. nuevo hábitat provienen de adultos diferentes, la estructura genética encontrada es menor a la que se encontraría si provienen de uno o muy pocos adultos. El efecto de la baja densidad de adultos es sobretodo evidente en las especies con dispersión por viento. 3) El forrajeo y comportamiento de deposición del agente dispersor. Por un lado. están los animales que forrajean dentro de la copa de un mismo individuo y posteriormente depositan varias semillas emparentadas en un sitio apropiado para el reclutamiento. De este comportamiento resultará una alta heterogeneidad entre los diferentes sitios de reclutamiento, pero puede ser contrarrestada si ocurren varios eventos independientes de deposición. En el otro extremo están los agentes dispersores que forrajean en la copa de diferentes individuos femeninos y depositan las semillas individualmente a lo largo de la zona. Este patrón de forrajeo y dispersión de semillas debe generar menos estructura genética entre los parches de reclutamiento. Hamrick et al. compararon especies de árboles tropicales con diferentes sistemas de dispersión y diferentes densidades de adultos en la isla de Barro Colorado, y demostraron al final de su estudio que la estructura genética mas fuerte se encontró en los individuos juveniles de la especie Platypodium elegans (Hamrick et al. 1993). Esta especie se encuentra en densidades bajas y su agente dispersor es el viento. Por el contrario, la estructura genética mas leve fue encontrada en la especie Swartzia simplex var. Ochnacea, cuyo agente dispersor son las aves y se encuentra en altas densidades.. 8.
(9) La estructura del bosque, como se menciono anteriormente, también puede ser un factor importante en la generación de estructuras genéticas. Un estudio realizado en la especie pionera Cecropia obtusifolia (Alvarez-Buylla and Garay 1994), reveló que la alta densidad de semillas que se acumula en los claros del bosque, parece ser un factor determinante en el patrón de variación genética encontrado mediante el análisis de alozimas. Otro factor que afecta la variación genética en poblaciones de plantas es su historia reciente (Cwynar and MacDonald 1987, Templeton et al. 1995). Si por ejemplo una población se ha mantenido pequeña por varias generaciones o si recientemente ha pasado por una serie de cuellos de botella, esta debe presentar menos estructura genética que una población que se ha mantenido grande y estable por varias generaciones. Estructura genética en poblaciones de árboles tropicales a escala regional Al hablar de la estructura genética de las poblaciones, se hace referencia a la distribución de la variación genética en cada población y entre diferentes poblaciones, y esta se ve afectada por factores demográficos y genéticos. Entre los factores demográficos se encuentran todos los procesos que determinan la historia natural de la especies, como por ejemplo, las tasas de nacimiento, mortandad y dispersión en los diferentes estadios de los individuos. Por otro lado, los procesos de mutación, deriva genética, recombinación y selección hacen parte de los factores genéticos que afectan la estructura de las poblaciones (Álvarez-Buylla & Garay, 1994). Existen muy pocos estudios que investiguen tanto la estructura genética como la demográfica en poblaciones de especies tropicales (pero ver Eguiarte et al. 1993).. 9.
(10) En todas las poblaciones, incluso en las especies que presentan una distribución espacial continua, el entrecruzamiento esta restringido a distancias cortas debido a que la capacidad de dispersión de cada individuo es limitada y es mucho menor al área ocupada por la población. En este caso las poblaciones se estarían diferenciando como resultado de un proceso conocido como “aislamiento por distancia” (Wright 1943). El reducido flujo genético causaría la diferenciación entre las poblaciones, y dicha diferenciación estaría correlacionada directamente con la distancia geográfica y por lo tanto las poblaciones más cercanas serian genéticamente más parecidas, que aquellas distantes. Los bosques tropicales se han caracterizado por ser comunidades con una alta diversidad, pero sin embargo es muy poco lo que se conoce a nivel de especies sobre la distribución geográfica de la diversidad genética (Aide & Riviera, 1998). Por otra parte, no hay mucha información acerca de la organización espacial de la variabilidad genética, los niveles del flujo genético entre las poblaciones y el efecto de la densidad en la endogamia. Lo anterior es cierto sobretodo a escalas mayores de 50 hectáreas. Sin embargo, últimamente se han realizado estudios a nivel regional en especies de árboles tropicales en los que se emplean marcadores moleculares, como los microsatélites y AFLP, para responder muchas de las incógnitas acerca de la distribución espacial de la diversidad genética y el efecto que la intervención del hombre tiene en dicha diversidad. Los estudios se han hecho sobretodo en especies que están en peligro de extinción y que están siendo amenazadas por la mano del hombre, por ejemplo mediante la deforestación, fragmentación y la tala selectiva del bosque (Hall et al 1994, Dayanandan 1999, Novick et al 2003). La deforestación puede reducir el tamaño de la población o en el peor de los casos puede eliminar por completo una población local. La fragmentación del bosque por su parte, puede hacer que poblaciones que solían ser continuas queden aisladas 10.
(11) genéticamente y por consiguiente pierdan diversidad genética, ya sea a causa de la endogamia o por deriva genética. La tala del bosque puede llevar a la disminución de la densidad poblacional y como resultado, al aumento de la endogamia en dicha población (Knowles et al., 1987; Murawski et al., 1990). Un estudio realizado en la especie Carapa guianensis (Meliaceae) (Dayanandan et al, 1999) en el que se analizaron 4 loci de microsatélites, demostró que la riqueza alélica en las muestras de semillas recolectadas en un fragmento de bosque aislado era menor a la riqueza encontrada en el bosque continuo. Adicionalmente, al calcular los valores de las distancias genéticas D (Nei), (δµ)2 y Rst, se pudo establecer que estos valores eran mas altos en los juveniles que en los adultos, sugiriendo que el flujo genético estaba siendo restringido debido a la deforestación y la fragmentación del hábitat. Otro estudio en el que se usaron 7 loci de microsatélites para examinar la estructura genética espacial en poblaciones Mesoamericanas de la especie Swietenia macrophylla, demostró que existe una mayor estructura filogeográfica en la zona. Mesoamericana que en la región Amazónica. Estos resultados sugieren que existe una compleja historia biogeográfica en la región Mesoamericana, debido probablemente a la presencia de cadenas montañosas en la región, y se predice que este mismo patrón puede ser observado en diferentes especies que tengan la misma distribución. Al realizar estudios en genética de poblaciones a una escala regional, se puede examinar el verdadero efecto de la mano del hombre en la diversidad genética, lo cual es útil para crear estrategias de conservación. Por otro lado, por medio de herramientas moleculares como los microsatélites es posible hacer estudios filogeográficos y examinar el efecto que tiene la historia biogeográfica en la estructura genética de las poblaciones.. 11.
(12) Historia Filogeográfíca de los bósques tropicales En los últimos años se ha incrementado el interés por conocer y estudiar las estructuras genéticas de las especies de árboles neotropicales, especialmente para fines de la conservación (e.g., Aldrich et al., 1998, Dayandan et al, 1999). La estructura genética encontrada mediante el uso de técnicas moleculares, se ha atribuido en la mayoría de los casos a procesos de asilamiento por distancia, a factores ecológicos como la dispersión de semillas y polinización, y a sistemas de reproducción, entre otros (Howe & Smallwood, 1982). Sin embargo, no se ha explorado de igual manera la historia filogeográfica de las especies, la edad de las poblaciones y el momento histórico (geológico) en el que llegaron a sus destinos. La estructura genética puede estar fuertemente relacionada con la presencia de barreras geográficas (cadenas montañosas, zonas áridas) que hayan surgido después del establecimiento de las poblaciones, impidiendo el flujo genético entre ellas. Por otra parte, la edad de las poblaciones y el momento geológico en el que llegaron a su destino, pueden explicar sus actuales distribuciones espaciales. El intercambio de especies de plantas entre el norte y el sur de América, ha sido un factor determinante y que explica en gran medida, los patrones fitogeográficos observados en la actualidad (Gentry, 1982). En primera instancia, es necesario hacer un breve recuento de los eventos geológicos más influyentes en la evolución y distribución de las plantas latinoamericanas. Uno de los eventos mas importantes fue, sin lugar a dudas, la separación entre Sur América y África, proceso que empezó hace 127 millones de años, y que concluyó hace aproximadamente 90 millones de años (Raven & Axelrod, 1974). Durante el primer tercio de la evolución de las angiospermas, tiempo en el cual la gran mayoría de los ordenes y familias de plantas modernas surgieron, sur América hacia. 12.
(13) parte del oeste de Gondwana , considerada la cuna de las angiospermas (Raven and Axelrod 1974). Desde la perspectiva de las plantas tropicales, Sur América fue una Isla durante casi todo el terciario y parte del cretácico, y la mayor parte de la evolución de su rica y variada flora se llevó a cabo en aislamiento luego de haberse separado de África (Gentry, 1982). Por lo tanto, muchas de las familias de angiospermas de América tropical, como Bromeliáceae y Cactáceas, han tenido mucho tiempo para evolucionar e irradiarse en Sur América. Por otra parte, todavía no es clara la historia de la separación entre Norte América y Gondwana. Aparentemente, Norte América incluyendo la península Centro Americana, se separó durante el periodo jurásico de Gondwana, mucho antes del surgimiento de las angiospermas (Lillegraven et al ,1979). Evidencias geológicas recientes (Morley 2000) sugieren que en el cretácico tardío se reestableció una conexión entre el Centro y el sur de América, como consecuencia de movimientos hacia el oeste de las dos masas de tierra. Aún no se sabe con certeza que proporción de aquella conexión de origen Cretácico entre Centro y Sur América, tuvo lugar por encima del nivel del mar, aunque se presume que consistió de un arco de Islas interrumpidas. En el terciario tardío, una nueva época de alta actividad volcánica dio lugar al surgimiento de islas en la región entre Sur América y Centro América. Estas islas se transformaron en lo que hoy en día conocemos como la parte baja de Centro América y finalmente en el plioceno, aproximadamente hace 3 millones de años, se formó una conexión terrestre sustancial con el surgimiento del istmo de Panamá (Keigwin, 1978). A pesar de que el cierre del istmo de Panamá fue uno de los procesos mas importantes para la biota latino Americana, no se le puede restar trascendencia a la previa conexión entre el Norte y el Sur, que tomo lugar en el Cretácico tardío. En esa época 13.
(14) muchas de las familias y géneros de plantas ya se habían expandido lo suficiente en la parte oeste de Gondwana y cabe la posibilidad de que hubieran aprovechado las islas para usarlas como puente entre las dos masas de tierra (Gentry 1982). A principios del terciario, la conexión interrumpida entre el Norte y el Sur se rompió debido al movimiento hacia el Norte de las proto-antillas. Este hecho sugiere que sólo aquellos taxa antiguos que ya en el Cretácico se habían expandido, tuvieron la oportunidad de pasar por medio de las Islas a la otra masa terrestre, antes del surgimiento del istmo de Panamá en el Plioceno. El segundo evento geológico con gran importancia fitogeográfica en el Neotrópico, fue el surgimiento de la cordillera de los Andes. La cordillera central es la mas antigua y existe desde el cretácico (Zeil, 1979) pero sin embargo, la mayor parte del surgimiento de la parte norte de los Andes se llevó a cabo hace aproximadamente 5 millones de años, durante el Plioceno y el Pleistoceno (van der Hammen, 1974). El tercer evento de gran importancia fitogeográfica fueron las fluctuaciones en el clima asociadas a el movimiento de los glaciales durante el Pleistoceno tardío (25,000 – 12000 BP) (van der Hammen, 1974; Kershaw, 1978). Durante esa época se restringió la distribución del bosque húmedo tropical debido a una disminución en la temperatura y precipitación. En Centro América, las especies de tierras bajas estuvieron limitadas a hábitats riparios hasta hace aproximadamente 12,000 años, tiempo en el cual hubo un incremento en la temperatura y precipitación de la zona. Este cambio climático dio lugar a una expansión en la distribución de las especies de bosque húmedo tropical y en la actualidad la distribución de muchas de las especies llega hasta el sur de Méjico (Aide & Rivera, 1998).. 14.
(15) La teoría de los refugios en el Pleistoceno, sugiere que las especies de bosques de tierras bajas estuvieron restringidas a unos pocos refugios cerca al Ecuador en donde los cambios climáticos no fueron tan extremos (Haffer, 1969; Prance, 1982), estos sitios se conocen como “source pool”. A pesar de que han habido muchas críticas a esta teoría, hay evidencias que demuestran que durante el último glacial muchos de los bosques de tierras bajas fueron reemplazados por sabanas (Kershaw, 1978). La posible restricción del bosque en el Pleistoceno tardío, debió tener un gran impacto sobre la estructura genética y la distribución de las especies (Whitmore & Prance, 1987). Gentry (1982) propuso que la zona del Chocó en Colombia y Ecuador, debió ser un óptimo “source pool” para la vegetación Centro Americana, gracias a su alta tasa de precipitación y a la gran diversidad de especies que presenta. Sin embargo, se ha demostrado (Gentry, 1986) que la vegetación Centro Americana tiene mayor afinidad con la de la Amazonia y es posible que esta zona sea el “source pool” para la flora de Centro América. El modelo que explica lo que ocurrió durante el Pleistoceno se conoce como “stepping stone model” (Kimura & weiss, 1964) y asume que durante los cambios climáticos, el total de la diversidad genética estuvo restringida al “source pool” y apenas hubo un incremento en la temperatura y en las lluvias, la vegetación se expandió hasta Mesoamérica y se fueron fundando nuevas poblaciones con una muestra de la diversidad genética original. Como las poblaciones siguieron migrando hacia al norte, cada vez se iba perdiendo mayor diversidad genética. Esto resultaría en poca variación entre las diferentes poblaciones y una relación linear negativa entre la diversidad genética y la distancia geográfica desde el “source pool”.. 15.
(16) Si es cierto que los bosques húmedos estuvieron restringidos a la zona del Chocó o a la Amazonia durante el Pleistoceno, entonces las tasa de dispersión de semillas de las especies que llegaron a la zona Mesoamericana tuvo que haber sido lo suficientemente alta para haber llegado a Méjico en tan solo 12,000 años, lo cual es bastante improbable (Aide & Riviera 1998). Por lo tanto, la teoría que más fuerza tiene sugiere que los bosques húmedos de tierras bajas se alojaron en hábitats riparios que estaban ubicados en la costa Caribe de Centro América (Meave et al. 1991). Es más factible que en 12,000 años las especies que hoy en día habitan la parte baja de Mesoamérica hayan migrado desde los hábitats riparios de la costa del Caribe y no desde el Chocó o la Amazonia. Si esta hipótesis es correcta entonces se espera que las poblaciones de las especies Centro Americanas tengan una alta diversidad genética debido al flujo genético que deben estar experimentando. Es posible discernir entre las dos hipótesis propuestas realizando estudios con marcadores moleculares, como los microsatélites o RAPD (Aide & Rivera, 1998). Estudio filogeográfico en Symphonia globulifera La gran distribución que alcanzan especies como S. globulifera, ocupando todo el Neotrópico y traspasando extraordinarias barreras geográficas como la cordillera de los Andes, con gradientes altitudinales de temperatura que imponen dificultades fisiológicas a organismos de tierras bajas (Janzen 1967), puede ser explicada mediante dos escenarios hipotéticos. El primer escenario supone que el establecimiento de las especies se llevo a cabo después del surgimiento de las barreras geográficas y atribuye el éxito de la especie a su gran capacidad de dispersión mientras que el segundo, asume que las especies se establecieron antes del surgimiento de estas barreras (Dick et al. 2003). Raven (1999), le. 16.
(17) dio soporte al segundo escenario hipotetizando que las 1431 especies (Jorgensen et al. 2002) que comparten el este y oeste de la cordillera de los Andes en Ecuador, evidencian que aproximadamente el 30% de la flora selvática tropical evolucionó antes del surgimiento de los Andes. La reconstrucción filogeográfica de las especies, utilizando fósiles moleculares que permiten estimar el tiempo en el que las poblaciones se establecieron en los diferentes sitios, es una herramienta útil que ofrece un nivel de resolución deseado para discernir entre estas dos alternativas. En el primer estudio filogeográfico de plantas neotropicales, basado en la secuenciación de ADN, se analizaron secuencias del gen nuclear ITS en poblaciones de la especie Symphonia globulifera (Dick et al. 2003). El objetivo del estudio era comparar la diversidad de haplotipos de la especie a lo largo de su distribución (desde Centro América hasta la Amazonia, cubriendo todo el Neotrópico), y a su vez comparar los resultados obtenidos con procesos geológicos y la edad de las poblaciones. Adicionalmente, el estudio pretendía reconstruir la historia filogeográfica de la especie usando la tasa de sustitución de ITS encontrada en diferentes taxa de angiospermas, y también mediante el uso de fósiles del polen de S. globulifera: (Pachydermites diederexi), con el propósito de determinar el momento histórico en el que las poblaciones se establecieron en su actual hábitat y hace cuanto tiempo se separaron. El análisis filogeográfico reveló que existen tres linajes dentro de la especie (Ver Fig.1): (1) trans -andino (Mesoamérica + oeste de Ecuador), (2) cis-andino (Amazonía + Guyana Francesa) y (3) Las Antillas (Dominica). Este mismo patrón de estructura genética en Mesoamérica se ha encontrado en diferentes taxa, por ejemplo en especies de. 17.
(18) árboles (Gillies et al. 1999), peces (Berminghan & Martin 1998), monos aulladores (Cortes-Ortiz et al. 2003) y culebras (Zamudio & Greene 1997). Este estudio reveló que existe un alto contraste de diversidad alélica entre los linajes trans-andino y cis-andino; mientras que el primero presentó una marcada variabilidad haplotípica, el segundo presentó un patrón uniforme (ver Fig. 2). Este hecho sugiere dos posibles explicaciones: (1) la expansión de Symphonia en Mesoamérica es anterior a la expansión de la especie a través de la Amazonia y por lo tanto ha tenido un mayor tiempo para diferenciarse y establecerse. (2) la gran heterogeneidad geográfica característica de Mesoamérica (cadenas montañosas y zonas áridas) ha impedido el flujo genético entre las poblaciones creando esta gran diversidad alélica.. Figura 1. Mapa de distribución de las poblaciones de Symphonia globulifera estudiadas. En los círculos aparecen los tres linajes formados 1) trans-andino, 2) Cis-andino, y 3) Antillas. Mapa tomado de Dick et al.2003.. Las montañas en particular, actúan como potentes barreras físicas para la dispersión y el flujo de genes, y la razón como se mencionó anteriormente, es que con la altitud se genera un gradiente marcado de temperaturas, el cual impone una limitante para. 18.
(19) los organismos de tierras bajas. La cordillera de los Andes en especial, representa una gran barrera biótica para las poblaciones de S. globulifera, pues desde que quedaron separadas por esta, no han intercambio genes de ITS. Probablemente la razón por la cual Los Andes es una barrera de tal magnitud para S. globulifera, es que no existen elevaciones de altitudes intermedias que sirvan como puentes entre las tierras bajas en ninguno de los dos lados de la cordillera. Por otro lado y volviendo a la reconstrucción de la historia y expansión de S. globulifera, existen evidencias genéticas y fósiles que permiten inferir que la migración. de la especie desde África hasta el Neotrópico fue por medio del océano; lo más probable teniendo en cuenta que la semilla no pasa por un estado de latencia y que muere rápidamente con la desecación (Maury-Lechon et al. 1980), es que hubiera cruzado el Atlántico sobre troncos o raíces. Por otro lado la diferenciación regional parece haber estado ligada a la heterogeneidad geográfica (e.g., montañas tropicales) (Dick et al. 2003). La dispersión marítima jugó un papel importante también en la expansión de la especie a lo largo de la región Neotropical. Según lo revelado por los análisis filogenéticos y los tiempos dados por el reloj molecular , los tres clados de S. globulifera en el nuevo mundo compartieron un ancestro común por ultima vez, cuando Mesoamérica y Suramérica se encontraban separados por un canal oceánico, hace más de 3.1 Ma. (Dick et al 2003). La presencia de S .globulifera en las Antillas, parece evidenciar otro escenario de dispersión marítima.. 19.
(20) Symp hon ia verru cosa. Symphonia microp hil a Malagasy congeners. 0.75 80. Symphoni anec ta rifer a. Symp hon ia uro phy lla. 0.81. Korup , Cameroon (N= 2) We st Africa. 61 Cameroon (N= 1) -1. 1.0 #8 Domi nica (N= 2) West Indi es. 100. -5 0. 77 62 0.83 62. 15 Ma no de. French Guiana (N=4) #7 Yasuní, Ecuador (N=15) C is -An des Bolivia (N=2) Manaus, Brazil (N=5) #5 BCI, P anamá (N=18) 1.0 Ft. Sher man , PA (N=1) 100 #4 Camp ana, PA (N= 1) +1. 1.0 100. Symphonia globulifera. 0.65 64. #6 C oastal Ecu ador (N= 10) Tran s-Andes. +1 #1 Beli ze (N=2). 0.27. 0.18. #3 Bocas del To ro, PA (N= 1) Costa Rica (4) #2 Chiriq uí, PA (N= 1). 0. 01 substitu tio ns/site. Figura 2 Filograma de las relaciones filogenéticos entre las poblaciones neotropicales de Symphonia globulifera basado en secuencias del gen nuclear ITS. En la figura se muestran los tres linajes encontrados 1) trans-andino, 2) Cis-andino, y 3) Antillas. Figura de Dick et al. 2003.. Mediante una recopilación de datos moleculares y fósiles, fue posible evidenciar que la especie tuvo su expansión en el Neotrópico en la era Terciaria dando lugar a tres linajes genéticamente divergentes y geográficamente estructurados (Dick et al. 2003). S. globulifera, según lo revelado por el record fósil, habita el nuevo mundo desde el. mioceno temprano (hace 15-18 millones de años), se encuentra ampliamente distribuida y mantiene una uniformidad morfológica a lo largo de su distribución. Esta especie es una. 20.
(21) buena representante de las especies de árboles Neotropicales antiguas con gran distribución y cuyo género esta representado por muy pocas especies e incluso sólo una, como es el caso de S. globulifera (Bermingham & Dick 2001). La riqueza de géneros en las comunidades de árboles de bosques tropicales indica que en la mayoría de los casos la diversidad de plantas es de origen Terciario (Ricklefs & Scluter 1993), y es probable que muchas de las especies con amplia distribución, sean también antiguas. Este estudio filogeográfico de Symphonia globulifera deja abiertas muchas preguntas acerca de los procesos responsables de generar estos patrones de estructura genética en las diferentes poblaciones de especies en Mesoamérica, y adicionalmente le da soporte a la hipótesis de que la historia geológica y la edad de las poblaciones están muy relacionadas con el nivel de estructura genética revelado mediante el uso de técnicas moleculares. Por otra parte, los datos sugieren que existe mayor diversidad alélica entre las poblaciones de Panamá, lo cual puede estar reflejando la compleja historia geológica del puente terrestre (Dick et al 2003). Marcadores moleculares Para poder analizar detalladamente la estructura genética de las poblaciones y tener una mejor idea de lo que ocurre en la zona Mesoamericana, es necesario trabajar con un marcador molecular que ofrezca un nivel de resolución adecuado para este tipo de estudios. En este estudio se trabajará con microsatélites, ya que son marcadores moleculares codominantes (ver después), y por lo tanto ofrecen una ventaja con respecto a otro tipo de herramientas tradicionalmente empleadas, como es el caso de la secuenciación de genes, el análisis de alozimas, los AFLP’s y RFLP’s.. 21.
(22) La secuenciación de ADN por su parte, es un buen marcador molecular para caracterizar la diferenciación entre poblaciones de plantas, cuando estas divergieron hace millones de años. La desventaja de este tipo de análisis es que la variabilidad es muy baja, y por lo tanto este marcador no es óptimo para muchos tipos de análisis en genética de poblaciones. Los AFLP’s (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amlificados) consiste en fragmentos de ADN genómico escogidos al azar, que se marcan con primers fluorescentes y se corren en una secuenciadora de ADN. Las ventajas de los AFLP’s son las siguientes: 1) los fragmentos se escogen aleatoriamente dentro del genoma, 2) el número de marcadores polimórficos es muy alto, 3) es una técnica reproducible, 4) puede aplicarse sin conocimiento previo del genoma de la especie. La desventaja de este marcador molecular es que es dominante, es decir, no detecta los dos alelos por lo cual no se puede emplear en análisis de paternidad o de endogamia. Para hacer RFLP’s (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción), es necesario aislar el ADN del cloroplasto, ya que en las angiospermas este organelo se transmite por vía materna. Este tipo de marcador es útil para hacer comparaciones con datos provenientes de marcadores nucleares (microsatélites, AFLP’s) y poder inferir la importancia relativa de la dispersión de polen y de semillas. Los microsatélites fueron los marcadores moleculares escogidos ya que poseen la mayoría de las propiedades deseables para realizar investigaciones en genética de poblaciones. Los microsatélites son secuencias compuestas de repeticiones de di o trinucleótidos cuya función dentro del genoma es desconocida. Aparentemente, la polimerasa se equivoca durante el proceso de replicación de estas secuencias, resultando en altas tasas de mutación por adición o sustracción de unidades repetitivas. Los microsatélites son marcadores moleculares codominantes, por lo tanto permiten 22.
(23) diferenciar entre el alelo proveniente del padre y el de la madre, y entre un heterocigoto y un homocigoto. Gracias a esto, son ideales para obtener medidas directas de dispersión y variabilidad genética. Estos marcadores son útiles para estudios de genética de poblaciones y estructuras genéticas espaciales, ya que proveen un estimativo directo de las frecuencias alélicas en las poblaciones y permiten medir relaciones de parentesco. El factor limitante para la aplicación de los microsatélites es que son costosos y deben ser encontrados dentro del genoma de cada especie por medio de la creación de una biblioteca geonómica. El primer paso para crear una biblioteca geonómica, es cortar el ADN con enzimas de restricción, posteriormente los fragmentos que resultan deben ser clonados usando plasmidos y bacterias como vectores y finalmente se detectan las secuencias con microsatélites [(e.g. (TA) N)] por medio de una sonda conocida. El siguiente paso es secuenciar los fragmentos de ADN obtenidos y si las regiones flanqueadoras son lo suficientemente largas, se desarrollan primers marcados con fluorescencias. De esta manera es posible amplificar los diferentes loci encontrados dentro del genoma de la especie, y los productos de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) pueden ser corridos en una secuenciadora de ADN, junto con un marcador de peso molecular conocido. El polimorfismo de los microsatélites se representa como diferencias entre los tamaños de los alelos. Todavía no es muy claro cual es el mecanismo que usan los microsatélites para mutar, sin embargo se han propuesto dos modelos: 1) entrecruzamiento desigual durante la meiosis (este modelo explica cambios más drásticos en el número de repeticiones) y 2) la polimerasa se “resbala” durante la replicación de una nueva cadena. Cuando el ADN se replica la polimerasa pierde la pista de su posición y puede dejar unidades repetitivas sin replicar o en el otro extremo, puede adicionar más unidades de las que debería. El 23.
(24) resultado es que la nueva cadena va a tener más o menos unidades repetitivas que la cadena madre. Se ha estimado que estos marcadores moleculares mutan de 100 a 10,000 veces más rápido que la sustitución de pares de bases, lo cual hace que los microsatélites sean óptimos para estudiar la evolución en periodos cortos de tiempo (cientos o miles de años). Fst y Rst En la mayoría de estudios en genética de poblaciones se usan los métodos estadísticos Fst diseñado por Wright (1951) y/o su modificación, el Rst diseñado por Stalkin (1995) para estimar la conectividad y flujo genético entre diferentes poblaciones. Estos dos métodos, tienen sus ventajas y desventajas al ser empleados para el análisis de datos obtenidos mediante el uso de microsatélites. Para comprender la diferencia entre Fst y Rst es necesario tener en cuenta los modelos de mutación que cada uno asume. Fst por su parte, asume el modelo de alelos infinitos (IAM) (Kimura & Crow 1964), el cual propone que cada mutación genera un nuevo alelo, y no considera la homoplasia, como es el caso de las alozimas. Por otra parte, Rst asume el modelo de mutación por pasos o stepwise mutation model (SMM; Kimura & Otha 1978), el cual propone que cada mutación genera un nuevo alelo variando sólo en el número de bases, ya sea mediante la adición o sustracción de una simple unidad repetitiva del microsatélite, teniendo la misma probabilidad µ/2 en ambas direcciones. Se supone que los alelos de tamaños muy diferentes están menos relacionados que aquellos de tamaños similares, y por lo tanto este modelo asume que existe una “memoria” en el tamaño alélico. Los microsatélites se ajustan de mejor manera al modelo SMM.. 24.
(25) En una población ideal (modelo de Isla para la migración; Wright 1931), y asumiendo que la mutación sigue el modelo de alelos infinitos, el Fst es una función decreciente de N(m + µ), es decir, del producto del tamaño poblacional local (N) y la suma de la mutación (m) y la migración (µ) (e.g. Hartl & Clark 1997). El Fst se vuelve una simple función de la tasa de migración cuando la mutación no es significativa, lo cual no es el caso de los microsatélites que presentan una alta tasa de mutación, del orden de 10^-3 mutaciones por gameto. Existe una desventaja adicional al usar Fst para el análisis de datos obtenidos mediante microsatélites, y es que el modelo de mutación al que se ajustan no es el de alelos infinitos, sino mas bien uno que genere homoplasia, como lo es el modelo de mutación por pasos (SMM). Por otra parte, el valor de Rst es independiente de la tasa de mutación bajo el modelo SMM (Kimmel et al.1996), pero su mayor desventaja es que es muy sensible al tamaño de la muestra y presenta una alta varianza en comparación con la obtenida con Fst.. A pesar de que los dos métodos tienen sus ventajas y desventajas, resulta interesante realizar comparaciones entre los dos ya que estas pueden tener un significado biológico importante. La hipótesis general al comparar los valores de Fst y Rst, es que si estos dos valores son iguales, la acumulación de mutaciones no es la causa de la diferenciación entre las diferentes poblaciones. En otras palabras, las mutaciones no son significativamente mayores a la deriva genética. Por otra parte, si el valor de Rst es significativamente mayor al de Fst, es probable que las poblaciones se hayan separado hace mucho tiempo y desde entonces hayan acumulado las mutaciones responsables de. 25.
(26) crear la diferenciación. Si por el contrario el valor de Fst resulta ser menor al de Rst es posible que exista homoplasia de tamaños entre los microsatélites. Existen ciertos errores de diseño experimental que pueden afectar los valores de Fst y Rst. Dentro de los factores que producen sesgos en dichos valores, se encuentran la. escala espacial y temporal a la cual se realiza el muestreo. Una de las grandes debilidades de la genética de poblaciones tradicional, es que la población global de la especie estudiada, debe ser dividida a priori en pequeñas entidades llamadas subpoblaciones. En el caso ideal, cada muestra debería representar una población diferente. Esta clasificación puede ser relativamente fácil en especies distribuidas de forma discreta, en donde la subpoblación generalmente corresponde a una estructura física, como una isla. Sin embargo, en especies con una distribución más continua, esta clasificación es arbitraria y subjetiva. Por lo tanto, realizar una subdivisión a priori puede tener importantes consecuencias en la estimación de la estructura genética de las poblaciones (Balloux et al. 2002). De hecho, cuando una muestra (considerada una población) consiste realmente de varias poblaciones diferentes, la estructura estará subestimada. Contrario a lo anterior, cuando varias muestras pertenecen a la misma población, no es posible detectar estructura genética dentro de las muestras. Importancia de este estudio Para los conservacionistas y ecólogos tropicales, es de suma utilidad e interés conocer el grado del flujo genético, la endogamia y la diferenciación genética que existe en las poblaciones de árboles tropicales. Los modelos de evolución que explican la riqueza de especies en los bósques tropicales, se basan en diferentes percepciones acerca de la cantidad de endogamia y la diferenciación genética (Federov 1966). Para la. 26.
(27) conservación de recursos genéticos, es importante tener información acerca de la organización espacial de la variabilidad genética y el tamaño efectivo de la población. El intercambio de genes entre diferentes poblaciones, homogeniza las frecuencias alélicas y determina los efectos de selección natural y deriva genética. Un alto grado de flujo genético impide la adaptación local, ya que evita la fijación de alelos favorables para la población bajo ciertas condiciones específicas, y adicionalmente impide el proceso de especiación (Barton &Hewitt 1985). Por otra parte, el flujo genético genera nuevos polimorfismos en las poblaciones e incrementa el tamaño efectivo local de la población, es decir, la capacidad de resistir a cambios azarosos en las frecuencias alélicas. Con un incremento de este tipo, es posible generar una oposición a la deriva genética azarosa, creando nuevas combinaciones alélicas sobre las que selección natural pueda potencialmente actuar (Balloux et al. 2002). Determinar cual es el grado de diferenciación entre poblaciones de una especie es un tema central en la biología de la conservación. Por ejemplo, poblaciones pequeñas y aisladas están expuestas a la deriva genética, lo cual puede afectar su potencial evolutivo mediante la fijación de mutaciones deletéreas (Wright 1977; Madsen et al.1996; Higgins & Lynch 2001). En el caso de la tala de árboles y la fragmentación del bosque, la reducción en la densidad de árboles puede alterar los patrones de reproducción y aumentar la probabilidad de endogamia (Murawski et al. 1994). La composición genética de cada individuo, refleja el número de alelos que se están intercambiando entre las diferentes poblaciones. Por lo tanto, entender el flujo genético y sus efectos, es indispensable para estudios en genética de poblaciones, ecología, conservación y epidemiología (Balloux et al.2002). Por otra parte, el conocimiento de la estructura genética de las poblaciones puede brindar una guía valiosa 27.
(28) para la creación de estrategias y manejos para la conservación (e.g. Rossiter et al.200; Eizirik et al. 2001) Finalmente, mediante estudios detallados de la estructura genética de las poblaciones, es posible que seamos testigos de uno de los pasos hacia la especiación, y que podamos entender una de las razones por las cuales existen tantas especies en el mundo. Objetivos 1. Examinar detalladamente la estructura genética poblacional de la especie Symphonia globulifera en poblaciones de Mesoamérica (Costa Rica y Panamá), el. oeste y este de Ecuador y la Guyana Francesa. 2. Caracterizar mediante el uso de microsatélites, la diversidad genética y el grado de flujo genético en un grupo de poblaciones que en teoría debe estar intercambiando genes. 3. Extrapolar la información micro-evolutiva obtenida, para realizar comparaciones con los patrones de divergencia revelados con el análisis del gen nuclear ITS. 4. Relacionar los resultados obtenidos con el surgimiento del Istmo de Panamá como un puente terrestre que conecta el norte y el sur, permitiendo el intercambio y movimiento de especies.. Materiales y Métodos Especie de estudio: Symphonia globulifera (Clusiaceae) conocida comúnmente como Barillo, Cerillo,. Cero, se encuentra distribuida desde África tropical hasta los Neotrópicos, incluyendo a 28.
(29) las Antillas. Se caracteriza morfológicamente por sus flores globulares y rojizas y por sus raíces aéreas. En la mayoría de los sitios donde habita se presenta como un árbol de dosel, su tronco mide alrededor de 50cm de diámetro y alcanza en promedio una altura de 30 metros. Sin embargo en Costa Rica, aparece como un árbol del sotobosque con un tronco más delgado.. Figura 3 Fotografías de Symphonia globulifera en Panamá; 1) a la izquierda se muestra el árbol de dosel en donde se puede apreciar el diámetro del tronco; 2) Derecha; arriba: fotografía de la flor de coloración rojiza y 3) Derecha; abajo: semilla de S.globulifera en donde se puede apreciar su tamaño (aproximadamente 5 cm).. Figura 4 Fotografía de un individuo de Symphonia globulifera en La Selva, Costa Rica. En la fotografía se muestra el tamaño de la fruta en comparación con el tronco.. 29.
(30) Los individuos de esta especie se encuentran tanto en tierra firme como en ríos. Symphonia globulifera es hermafrodita y produce un fruto de aproximadamente 3cm el. cual es consumido por rumiantes, aves de gran tamaño, primates y murciélagos. Sus flores son visitadas principalmente por colibríes y aves nectarinas. De lo anterior se puede concluir que la especie tiene una capacidad de dispersión limitada y abarca distancias relativamente cortas, si se compara con especies que usan el viento como dispersor. En esta especie se presentan flores durante todo el año pero hay un pico entre los meses de Junio y Agosto. Cada individuo dura aproximadamente 2 meses con inflorescencias y debido a que los frutos necesitan 1 ó 2 meses para madurar, es común ver árboles que presenten frutos y al mismo tiempo flores (Croat 1978). Los individuos de esta especie tienen preferencia por sitios húmedos y crecen de forma abundante en sitios cercanos a cuerpos de agua. Sus semillas carecen de un estadio de dormancia y no son resistentes a la desecación, por lo cual es difícil entender como pudo la especie cruzar el Atlántico. S. globulifera es una especie común en bosques viejos. Todavía no es claro cual es el origen. del género pero se presume que es Madagascar, ya que allí es donde se encuentra la mayor diversidad de especies. Recolección de muestras: En este estudio se pretende analizar la variación genética en 4 loci de microsatélites. Las muestras provienen de 13 poblaciones de Symphonia globulifera (Tabla 1) colectadas en Costa Rica, Panamá, el oeste y este de Ecuador y la Guyana Francesa (Fig.3). La mayoría de las muestras fueron colectadas en la parte baja de Mesoamérica (Costa Rica y Panamá), ya que estas áreas concentran la mayor diversidad de haplotipos de ITS (ver figura 2) y por lo tanto, se espera que los niveles de. 30.
(31) diferenciación genética entre las poblaciones de la zona, sean altos. Las muestras tomadas en el Ecuador y en la Guyana Francesa, son útiles para realizar comparaciones con la zona mesoamericana y analizar el efecto de la cordillera de los Andes en la diferenciación. Por otro lado, las muestras suramericanas sirven para realizar comparaciones con los datos obtenidos mediante la secuenciación del gen nuclear ITS (Dick et al. 2003). Cada 10 metros se colectaron hojas de árboles adultos que tuvieran más de 10 cm. de diámetro a la altura del pecho, por un transecto determinado. Si se encontraban juveniles, se colectaba solo la hoja de uno de ellos para evitar tener muestras de individuos con el mismo parentesco.. Tabla 1. Tabla resumiendo los datos de recolección de las muestras para este estudio. Population Chilimati La S elva Veraguas El Cope Cerro Campana S anta Rita Isla de Barro Colorado Pipeline Road Fort S herman Cerro Jefe Esmeraldas Paracou Yasuni. Pais Costa Rica Costa Rica Panama Panama Panama Panama Panama Panama Panama Panama Ecuador Guyana Francesa Ecuador. latitud 10,433 10,417 8,533 8,567 8,667 9,250 9,167 9,133 9,350 9,250 0,600 5,300 -0,917. longitud -85,050 -84,000 -81,083 -80,583 -79,917 -79,617 -79,833 -79,683 -79,950 -79,383 -80,017 -52,883 -75,400. altitud 266 m 54 m 832 m 220 m 800 m 200 m 26 m 100 m 8m 520 m 1m 18 m 194 m. tamaño de muestra (n) 30 30 30 30 33 35 149 26 31 31 24 96 44. En promedio se tomó una muestra de 30 individuos por población con las excepciones de la Isla de Barro Colorado, donde se colecto la totalidad de individuos en. 31.
(32) el “Forest Dynamics Plot” de 50 ha, (n = 196), y La Guyana Francesa, en donde se colectaron aleatoriamente 96 individuos.. Figura 3 Mapa de distribución de las poblaciones estudiadas en la parte baja de Centro América: Costa Rica y Panamá. Extracción de ADN Cada hoja colectada fue marcada y posteriormente llevada al laboratorio en donde se almacenaron a -20° C, para posteriormente realizar las extracciones de ADN usando el Kit de Dneasy (Quiagen Incorporated, Valencia, California). El proceso de extracción de ADN comienza cortando las hojas en pequeños discos y pesando aproximadamente 50mg de tejido. Posteriormente se coloca el tejido en un tubo con 600 µl de solución de extracción (buffer AP1+1.5µl 100mg/ml RNasa + reactivo DX) y se introducen dos perlas cilíndricas. Con el fin de macerar el tejido, la mezcla se centrífuga por 45 segundos a 4.5 m/s. El siguiente paso es incubar los tubos por 10 minutos a una temperatura de 65° C, mezclando cada 3 minutos. Luego se agregan 200µl 32.
(33) de un buffer que precipita las proteínas (AP2). Después de incubar los tubos en hielo por 5 min. se centrífugan por 10 min. más. Posteriormente se extraen 400 µl del sobrenadante de cada tubo, se pasan a un plato de 96 pozos y se añaden 600µl del buffer AP3. De nuevo se centrífuga por 5 min. a 5600 rpm. Se añaden 800µl de la solución AW y se centrífuga de nuevo por 15 min. a 5600 rpm con el fin de eliminar el EtOH. Finalmente se eluye dos veces con 100µl de buffer AE precalentado a 70° C, y cada vez se centrífuga durante 2 min. a 5600 rpm. Las extracciones se pueden almacenar a 4° C si es por poco de tiempo, o a –20° C si se quiere almacenar por un periodo largo de tiempo. Los detalles de este protocolo de extracción de ADN de plantas, puede encontrarse en el website de Quiagen Incorporated. La calidad del ADN es mucho mejor si se extrae de hojas frescas y por esta razón se uso ese tipo de material para realizar todas las extracciones, con la excepción de la población de Esmeraldas. En este caso el material de extracción fueron hojas secas, y como era de esperarse la calidad del ADN y las amplificaciones no fueron tan buenas como las de las otras poblaciones. Análisis genético Para realizar el genotipaje de todos los individuos colectados, se usaron 4 loci de microsatélites previamente desarrollados y optimizados para S. globulifera (tabla 2). Los 4 loci se desarrollaron a partir de una biblioteca geonómica enriquecida para los dinucleotidos poly AG /poly TC. Detalles del desarrollo, optimización y caracterización de los loci SGC4 y SG19, pueden encontrarse en Aldrich et al. 1998. Los loci SG03 y SG92 fueron desarrollados por Henri Caron (INRA, Bordeaux, Francia), pero aún no han sido publicados.. 33.
(34) Para realizar el genotipaje de los individuos, se uso el ADN extraído como templado y los primers marcados con fluorescencia para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para cada locus. El volumen total de la reacción de PCR fue de 10 µl [5.14µl de agua sigma; 1.0µl de buffer 10X; 1.0µl de DNTP's; 0.8µl de MgCl2; 0.5µl. de cada primer, 0.0625µl de Quiagen taq polimerasa y 1µl de ADN templado]. Las condiciones térmicas de la PCR fueron las siguientes; 96° C por 5min; 25 ciclos de 96° C por 45seg; 55° C por 1 min; 72° C por 30 seg. Finalmente se lleva a cabo una extensión a 72° C por 15 min. El genotipaje se realizó en la secuenciadora MJ (MJ Research automated sequencer) en los laboratorios de biología molecular del Smithsonian Tropical Research Institute (Naos, Panamá). Los loci SGC4 y SG19 estaban marcados con el mismo color (HEX = amarillo) y adicionalmente tenían el mismo rango de número de pares de bases (162-192) y (158-182), respectivamente (tabla 2); por lo anterior estos dos loci fueron corridos en geles diferentes. Por otra parte, los loci SG92 y SG03, se cargaron en el mismo pozo ya que los fragmentos de ADN estaban marcados con diferentes colores (FAM y HEX, respectivamente) y no tenían el mismo tamaño por lo cual no se sobreponían (tabla 2). Adicionalmente, se cargo en cada pozo un marcador de peso molecular estándar (ROX 400HD). Para la colección y análisis de los datos se uso el programa Cartographer (MJ Research). Este programa permite detectar los alelos presentes en las muestras corridas en la secuenciadora MJ y calcula los tamaños de cada fragmento de ADN. Los alelos deben estar marcados con uno de los siguientes cuatro colores fluorescentes: FAM (azul), TET (Verde), HEX (amarillo) y ROX (Rojo).. 34.
(35) Los genotipos que no se podían analizar claramente se volvían a correr, y los geles fueron analizados dos veces para revisar que no hubiera errores en al lectura de los datos.. Análisis estadístico 1) Heterocigocidad, Equilibrio de Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento Las frecuencias alélicas y la heterocigocidad promedio observada y esperada, fueron estimadas con el programa GENEPOP 3.2a (Raymond & Rousset 1995). Para todos los pares de loci se estimó el desequilibrio de ligamiento y equilibrio de HardyWeinberg, usando la prueba estadística de Fisher y los valores de P se estimaron por medio de 1000 permutaciones de la cadena de Monte Carlo Markov. 2) Diferenciación entre poblaciones: Fst y Rst Para este estudio se obtuvo el valor tanto de Fst como de Rst con el fin de determinar los niveles de diferenciación genética entre las poblaciones, usando el programa SPAGeDi (Spatial Pattern Analysis of Genetic Diversity) (Hardy,O. J.& X. Vekemans, 2002). Adicionalmente se calculó la probabilidad (P) para probar la hipótesis de que el valor de Rst se debe a la acumulación de mutaciones de tipo SMM. Finalmente se calcularon los valores de Fis para determinar el grado de endogamia de las poblaciones estudiadas. 3) Distancia genética Se estimaron las distancias genéticas entre todos los pares de poblaciones. El valor de (δµ ) ² basado en el modelo de mutación a pasos (SMM) (Goldsetin et al. 1995) y la. 35.
(36) distancia estándar D de Nei (Nei 1987) basada en el modelo de mutación de alelos infinitos (IAM), se estimaron usando el programa SPAGeDi. Se han hecho simulaciones que muestran que es más probable que el valor de D Nei produzca la topología correcta cuando las poblaciones se divergieron recientemente (Takezaki & Nei 1996). Goldstein et al. (1995) mostraron que la distancia de Nei no es linear al aplicarse a datos de microsatélites, cuando los periodos de tiempo son largos. A diferencia de otras medidas de distancia, las diferencias en los tamaños de muestra entre las diferentes poblaciones, no afecta la varianza de Nei (D) ni la de Goldstein (δµ ) ².. 4) Aislamiento por distancia Se calculó la distancia geográfica entre todos los pares de poblaciones y usando el programa GENEPOP, se probó la hipótesis de que la distancia genética entre las poblaciones es una función de la distancia geográfica. Se estimó la correlación entre la distancia geográfica y los valores de Fst y Rst, y la significancia fue determinada mediante una prueba de Mantel (Mantel 1967) con 1000 permutaciones. 5) Construcción de árboles Se reconstruyeron árboles filogenéticos mediante dos métodos; UPGMA (Sneath y Sokal 1973) y (Nj) neighbor-joining (Saitou y Nei 1987), implementados en el programa Phylip 3.573c (Felstein 1993). UPGMA es un algoritmo relativamente útil para datos de frecuencias alélicas cuando la tasa de evolución es la misma en todas las poblaciones (Takezaki & Nei, 1996). Por otro lado, se ha documentado que el método de Nj es útil en una gran variedad de situaciones (Nei, 1991).Una de las grandes diferencias. 36.
(37) entre los dos métodos, es que UPGMA produce un árbol enraizado mientras que Nj genera árboles filogenéticos sin raíz. Para el análisis se usaron las dos medidas de distancia genética: Nei (D) y Goldsetein (δµ ) ². La significancia de la mejor topología se estimo con 1000 replicas de bootstrap y finalmente se construyeron árboles consenso.. En estos momentos se esta debatiendo cual es la verdadera utilidad de construir árboles filogenéticos con datos de genética de poblaciones. En este estudio se usará la construcción de árboles como un elemento gráfico y visual que ayude al entendimiento de los datos de distancias genéticas.. Resultados Frecuencias alélicas, heterocigocidad, equilibrio de Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento Se analizaron 570 individuos representantes de 13 poblaciones de Symphonia globulifera usando 4 loci de microsatélites, y se observó un promedio de 9.4 alelos por. población incluyendo los 4 loci. La población que más alelos presenta es la Guyana Francesa con 17.25 alelos en promedio, y es también una las poblaciones con mayor número de individuos analizados, (n=96). La población con mayor tamaño de muestra es Barro Colorado (n=149), sin embargo, no presenta el mayor numero de alelos (x = 13.25). Esmeraldas es la población con menor número de alelos en promedio (4.66), y es la única que no tiene datos para uno de los locus (SG03) (Tabla 3). La razón de esto puede ser que. 37.
(38) la calidad de la extracción de ADN no fue muy buena debido a que el material de extracción fueron hojas secas. Tabla 2 Tabla resumiendo la información de los 4 loci estudiados.Tp : tamaño promedio de alelos en el locus, en paréntesis la varianza; A: numero de alelos; He: heterocigocidad esperada Locus marcador color Tamaño fragmento (bp) SGC4 HEX amarillo (162-192) SG19 HEX amarillo (158-182) SG92 FAM azul (164-196) SG03 HEX amarillo (292-322). Tp 173.2 (49.6) 172.2 (85.6) 178.9 (31.6) 318 (120.6). A 28 24 19 30. He 0,9225 0,8945 0,8758 0,8377. Se observó un promedio de 25.2 alelos por locus, siendo SG92 el locus con menos alelos (19) y SG03 el que presentó un mayor número de alelos (30).. Tabla 3 Información general para cada uno de los 4 loci; AT: número total de alelos; X (rango): promedio de alelos, en paréntesis el rango; A: número de alelos por locus en cada población; He y Ho: Heterocigocidad observada y esperada.. Poblacion P.Road St. Rita C.Campana F. Sherman C. Jefe Veraguas El Cope Esmeraldas B.Colorado Chilimati G. Francesa Yasuni La Selva. n 26 35 33 31 31 30 30 24 149 30 96 44 30. AT 26 40 28 29 36 35 41 14 54 40 69 45 35. X(rango) 6.5 (4--8) 10 (7--14) 7 (3--11) 7.25 (5--11) 9 (7--11) 8.75 (5--11) 10.25 (5--13) 4.66 (4--5) 13.25 (10--15) 10 (4--17) 17.25(14--23) 11.25 (8--15) 8.75 (5--14). A 8 7 6 5 9 8 11 5 14 9 17 13 5. S G19 He 0,811 0,742 0,770 0,636 0,785 0,746 0,764 0,609 0,833 0,620 0,678 0,724 0,400. Ho 0,885 0,771 0,576 0,742 0,806 0,800 0,833 0,458 0,745 0,733 0,615 0,705 0,300. A 6 14 8 8 11 11 13 4 15 10 23 15 11. S GC4 He 0,719 0,742 0,641 0,640 0,581 0,867 0,842 0,621 0,850 0,473 0,756 0,682 0,724. Ho 0,769 0,800 0,667 0,581 0,581 0,800 0,800 0,542 0,886 0,500 0,792 0,727 0,733. A 8 12 11 11 9 11 12 5 15 4 14 8 5. SG92 He 0,847 0,743 0,801 0,671 0,776 0,661 0,873 0,650 0,792 0,574 0,717 0,594 0,503. Ho 0,769 0,771 0,697 0,710 0,806 0,600 0,900 0,500 0,678 0,667 0,573 0,455 0,567. A 4 7 3 5 7 5 5 * 10 17 15 9 14. S G03 He 0,608 0,653 0,581 0,350 0,408 0,339 0,719 * 0,668 0,277 0,657 0,470 0,714. Ho 0,346 0,457 0,455 0,258 0,226 0,267 0,233 * 0,396 0,267 0,490 0,432 0,567. La distribución de los alelos en los loci SGC4 y SG92 es totalmente continua y es casi continua en los loci SG19 y SG03, lo cual sugiere que los microsatélites si se ajustan al modelo de sustitución por pasos (SMM) (Figura 6).. 38.
(39) Locus SG03. Locus SG92. 5. 2,5. 4. 2. 3. 1,5. 2. 1. 1. 0,5. 0. 0 1. 3. 5. 7. 9. 11 13. 15. 17 19. 21 23 25 27 29. 1 2. 3 4 5 6. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19. Ale los. A l e l os. Locus SGC4. Locus SG19 3. 2,5. 2,5 2. 2 1,5. 1,5 1. 1 0,5. 0,5 0. 0 1. 3. 5. 7. 9. 11. 13. 15. 17. 19. 21. 23. 1. 3. A l e l os. 5. 7. 9. 11. 13. 15. 17. 19. 21 23 25 27. A l e l os. Figura 6 Histogramas de las frecuencias alélicas en cada uno de los 4 loci estudiados. En el eje Y se representan las frecuencias alélicas en todas las poblaciones estudiadas y en el eje X los diferentes alelos encontrados para cada locus.. La prueba de desequilibrio de ligamiento demostró que bajo la hipótesis nula: Ho= “Los genotipos de un locus son independientes de los genotipos de otro locus”, los loci SG19 y SG92 están en desequilibrio de ligamiento, al igual que los loci SGC4 y SG03, con un 95% de confianza (tabla 4). Tabla 4 Prueba de desequilibrio de ligamiento para los 4 loci analizados. Los valores de p* son significativos con un 95% de confianza. Pares de locus SG19 Vs SGC4 SG19 Vs SG92 SGC4 Vs SG92 SG19 Vs SG03 SGC4 Vs SG03 SG92 Vs SG03. valor de P 0,242 0.021 * 0,108 0,746 0.03* 0,288. 39.
(40) En cuanto a la prueba del equilibrio de Hardy-Weinberg, y bajo la hipótesis nula; Ho= “no hay déficit de heterocigotos”, se encontró que los valores de P para los loci SG19, SG92 SG03, son significativos y sugieren que hay déficit de heterocigotos con un 95% de confianza (tabla 5). Estos datos concuerdan con los valores de Fis (coeficiente de endogamia) para los 4 loci estudiados, ya que los valores de SG19, SG92 y SG03 son mayores que cero, mientras que el valor de SGC4 es negativo (Tabla 7).. Tabla 5 Valores de P para la prueba de déficit de heterocigotos. Locus SG19 SGC4 SG92 SG03. P 0.0001*** 0.7601 0*** 0***. La misma prueba de déficit de heretocigotos realizada en las 13 poblaciones, sugiere que hay déficit de heterocigotos en 7 de ellas: Cerro Campana, Veraguas, El Copé, Esmeraldas, Barro Colorado, Guyana Francesa y Yasuní, con un 95% de confianza (Tabla 6). Todos los valores de Fis fueron mayores que cero con la excepción de Chilimati. Los valores más altos de Fis corresponden a las siguientes poblaciones: Cerro Campana, El Copé, Esmeraldas, Barro Colorado y Guyana Francesa. Estas poblaciones también tuvieron un valor de P significativo en la prueba de déficit de heterocigotos.. 40.
(41) Tabla 6. La tabla muestra los valores de P para la prueba de déficit de heterocigotos en las 13 poblaciones estudiadas ,se muestran los valores de Fis y las heterocigocidades esperadas y observadas. Poblacion P.Road St. Rita C.Campana F. Sherman C. Jefe Veraguas El Cope Esmeraldas B.Colorado Chilimati G. Francesa Yasuni La Selva. P 0,2124 0,0566 0.0004 *** 0,0839 0,0612 0.0119 ** 0.0056 *** 0.0039 *** 0*** 0,9637 0*** 0.0006 *** 0,1337. He Ho Fis 0,760 0,721 0,072 0,777 0,766 0,030 0,714 0,624 0,141 0,779 0,772 0,035 0,673 0,648 0,055 0,685 0,654 0,064 0,826 0,725 0,140 0,659 0,538 0,206 0,816 0,702 0,143 0,744 0,831 -0,084 0,869 0,768 0,122 0,762 0,730 0,056 0,725 0,682 0,082. 2) Diferenciación entre poblaciones: Fst y Rst Los valores de las dos medidas de diferenciación genética Fst y Rst fueron mayores que cero al comparar todas las poblaciones analizando cada locus por separado (Tabla 7). De igual manera al considerar los 4 loci analizados y realizar comparaciones entre pares de poblaciones, se observó que los valores de Fst y Rst fueron también mayores a cero en todos los casos (Tabla 8). El valor mas bajo de Fst y Rst fue entre las poblaciones de Barro Colorado y Fort Sherman (0.054 y 0.006, respectivamente). El valor mas alto es entre las poblaciones de Esmeraldas y La Selva, Fst= 0.279 y Rst =0.641.. Tabla 7 Valores de Fst, Rst, Ris y Fis para los 4 loci estudiados Locus SG19 SGC4 SG92 SG03. Fis 0,0457 -0,0197 0,0934 0,3285. Fst 0,1065 0,0933 0,1278 0,1548. Ris 0,1189 0,0469 0,0716 0,6149. Rst 0,3203 0,1693 0,2015 0,3149. 41.
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