Estandarización de la cuantificación en la biodegradación de BTEX

Universidad de Los Andes

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental

Estandarización de la cuantificación en la biodegradación de BTEX

Dirigido por:

Manuel Salvador Rodríguez Susa

Ph.D. en Ingeniería

Codirigido por:

Juliana Martinez

Raquel Romero Puentes

Jaime Andrés Cárdenas Sánchez

Estandarización de la cuantificación en la biodegradación de BTEX

Jaime Andrés Cárdenas Sánchez

Universidad de los Andes, Departamento de Ingeniería civil y ambiental – Facultad de Ingeniería,

[email protected]

Resumen

Contaminantes tales como el benceno, tolueno, etilbenceno y xileno son de gran interés para los investigadores como para las agencias ambientales debido a los riesgos que representan en la salud pública y alta contaminación que pueden generar en aguas. Recientemente un gran esfuerzo ha sido dedicado para el desarrollo de métodos que sean eficaces y fiables en el tratamiento de estas sustancias tóxicas. La bioremediación aparece como una alternativa altamente rentable y eficiente para eliminar los contaminantes del petróleo y especialmente sus derivados como el benceno, tolueno, etilbenceno y xileno. En esta investigación se propone la microextracción en fase sólida como método para

la estandarización de la cuantificación de BTEX. El experimento contó con el uso de un consorcio compuesto por Enterobacter sp , Serratia

fonticola, Pseudomonas fragi y Bacillus subtilis el cual fue sembrado en el medio Bushnell Hass con una concentración de gasolina de 500 ppm.

Se determinaron las concentraciones de BTEX y parámetros como la temperatura, conductividad, oxígeno disuelto y pH en el consorcio a las 0, 24 y 48 horas para dos ensayos diferentes. Como resultados se obtuvieron réplicas con alta similitud entre sí, aunque los dos ensayos difirieron uno del otro por lo que la heterogeneidad de las muestras sigue siendo el principal problema. Se recomienda para un próximo ensayo el uso de patrones de BTEX como las fuentes de carbono para el medio Bushnell Hass.

Palabras claves:

bioremediación, BTEX, estandarización, microextracción en fase sólida.

Abstract

Pollutants such as benzene, toluene, ethylbenzene and xylene are of great interest to researchers and environmental agencies due to the risks they represent to public health and the high pollution that can generate in waters. Recently, much effort has been devoted to the development of methods that are effective and reliable in the treatment of these toxic substances. Bioremediation appears as a highly profitable and efficient alternative to remove contaminants; particularly petroleum and its derivatives such as benzene, toluene, ethylbenzene and xylene. This research proposes solid phase microextraction as a method for the standardization of the quantification of BTEX. The experiment had the use of a

consortium made of Enterobacter sp, Serratia fonticola, Pseudomonas fragi and Bacillus subtilis that was on growth in Bushnell Hass medium

with a concentration of 500 ppm of gasoline. BTEX concentrations and parameters such as temperature, conductivity, dissolved oxygen and pH were determined in the consortium at 0, 24 and 48 hours for two different tests. As results replicas with high similarity to each other were obtained, although the two trials differed from each other so that the heterogeneity of the samples remains as the main problem. It is recommended for an upcoming test using a BTEX pattern as carbon sources for Bushnell Hass medium.

Key words:

bioremediation, BTEX, standarization, solid phase microextraction

1

Introducción

______________________________________________________

La necesidad de encontrar un desarrollo sostenible trae consigo la búsqueda de alternativas. Alternativas que sean capaces de lidiar con el impacto antropogénico que generan nuestras actividades económicas, he aquí todo el problema con la extracción y manejo de hidrocarburos. Es esta manipulación la responsable de impactos ambientales como la contaminación de aguas y suelos debido a su mal manejo ya sea durante su transporte, un derrame o bien por la fuga de estos en los tanques de almacenamiento de las gasolineras. Esta situación conlleva a un vertimiento diario de trazas de hidrocarburos como: poliaromáticos (PAHs), BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) y fenol principalmente (Jo, Rene, Kim, & Park, 2008).

El benceno, tolueno, etilbenceno y xileno son hidrocarburos monoaromáticos de alta volatilidad y solubilidad en el agua que pueden llegar a representar hasta un 90% de los componentes de la gasolina que se encuentran en la fracción soluble de las fuentes de agua potable. Estas características hacen de estos compuestos un problema de salud pública y representen una amenaza significativa para la salud humana y el medio ambiente debido a sus propiedades tóxicas, mutagénicas y carcinogénicas (Durmusoglu, Taspinar, & Karademir, 2010). La exposición humana a estos compuestos como mezcla puede conducir a daños genéticos, daños en el sistema excretorio, neurológico y respiratorio y otros problemas de salud que van desde la irritación de los ojos, membranas mucosas y la piel hasta el debilitamiento del sistema nervioso, médula ósea y cánceres. Por ello la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos ha clasificado al benceno, tolueno, etilbenceno y xileno como contaminantes prioritarios ya que a pesar de todas sus repercusiones, su uso sigue persistiendo debido al gran

número de aplicaciones que tienen (Morlett-Chávez et al., 2010).

Los tratamientos físicos convencionales, tales como la absorción, la adsorción, la combustión y la condensación poseen varios inconvenientes como los altos costos de operación y mantenimiento además de la producción de subproductos tóxicos. Recientemente, los procesos de tratamiento biológico conocido como bioremediación que utilizan la capacidad natural de los microorganismos para degradar contaminantes a productos menos nocivos aparecen como una limpia y prometedora alternativa. Las numerosas ventajas de los métodos biológicos incluyen la degradación directa, impidiendo así el aumento de la contaminación del medio ambiente; el hecho de ser su propia fuente de energía para la descomposición de los contaminantes; el bajo costo de operación y mantenimiento y finalmente su gran eficacia para el tratamiento de los contaminantes a bajas concentraciones (Mazzeo, Levy, de Angelis, & Marin-Morales, 2010).

La biodegradación de BTEX se da tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Bajo condiciones aeróbicas, las bacterias utilizan el oxígeno para la activación y rompimiento del anillo. El proceso inicial consta de una oxidación directa del anillo aromático a través de una mono-oxigenasa, un ataque dioxigenasa o la oxidación del lado alquilo. Todas estas vías convergen en la formación de catecoles intermediarios que a su vez son degradados en piruvatos finalmente, el cual es de fácil asimilación por el ciclo de krebs (Andreoni & Gianfreda, 2007).

En ausencia de oxigeno la biodegradación de BTEX sigue siendo factible como se había mencionado anteriormente por lo que es de gran uso, ya que es normal que se formen zonas anaerobias en los suelos durante la compactación, así como en los suelos y aguas subterráneas contaminadas con hidrocarburos debido a la reducción del oxígeno disuelto resultado de procesos biológicos. La biodegradación anaeróbica del tolueno ha sido la más investigada; se puede degradar bajo muchas condiciones reductoras. El primer paso en el metabolismo anaerobio del tolueno y xileno esta mediado por una reacción enzimática que adiciona fumarato a su grupo metilo para formar BBS (benzyl.succinate synthase) como intermediario. La degradación anaerobia del benceno puede incluir una carboxilación inicial, hidroxilación, metilación o la reducción del anillo aromático para formar benzoyl-CoA como intermediario (Andreoni & Gianfreda, 2007).

A partir de lo dicho anteriormente y de la investigación realizada por Raquel Romero en donde se investigó la remoción de hidrocarburos en aguas residuales mediante humedales construidos de flujo subsuperficial plantados con

Canna sp y Juncus effusus; los cuales obtuvieron como resultados remociones de 93% para benceno, tolueno, etilbenceno y xileno (Romero & Rodríguez, 2013). Se

pretende como objetivo inicial utilizar diferentes organismos encontrados en estos humedales para ver su efectividad en la biodegradación de BTEX y así mismo verificar si es más eficiente un consorcio de estos microorganismos.

2

Materiales y métodos

____________________________________________  

La metodología tuvo como base la cromatografía de gases y está compuesta por dos grandes partes: el método de purga y trampa y la microextracción en fase sólida. Esto fue consecuencia de los diferentes problemas (los cuales se explicaran detalladamente más adelante) que se presentaron con los resultados obtenidos inicialmente.

La cromatografía de gases es en pocas palabras es una técnica de separación que entre las técnicas cromatográficas utilizadas con fines analíticos es de las únicas que puede llegar a ofrecer tan altas capacidades de separación o sensibilidad a la hora de analizar compuestos volátiles, a pesar de tener como limitación la estabilidad térmica de sus compuestos (McNair & Miller, 1998).

Para poder realizar una separación mediante cromatografía de gases, se inyecta una pequeña cantidad de la muestra a separar en una corriente de un gas inerte a elevada temperatura, e nuestro caso 250 °C; esta corriente de gas atraviesa una columna cromatográfica que separa los componentes de la mezcla por medio de un mecanismo de partición que se encuentra a una temperatura de 40 °C por lo que los compuestos se “condensan” y a través de diferentes cambios de temperatura cada uno de estos son capturados. Los componentes separados, salen de la columna a intervalos diferentes y pasarán a través de un sistema de detección que en nuestro caso es el selectivo de masas (McNair & Miller, 1998).

Ahora bien, antes de pasar a describir cada una de las dos metodologías empleadas para el análisis de las muestras hubo varios procedimientos realizados a priori que se explicarán a continuación.

Lo primero y he aquí la importancia de la tesis realizada por Raquel Romero fue la descongelación de los siguientes microorganismos aislados de los humedales artificiales

usados: Enterobacter sp, Aeromonas hydrophila,

Brevundimonas sp, Cupriavidus sp, Serratia fonticola, Bacillus subtilis, Pseudomonas fragi, Rodhococcus erythropolis, Bacillus lichenformi y Microbacterium sp.

De todos estos microorganismos se seleccionaron los

siguientes cuatro: Enterobacter sp, Serratia fonticola,

Psuedomonas fragi y Bacillus subtilis. Esta selección fue realizada de acuerdo a revisiones bibliográficas anteriores en donde se encontraron cada uno de estos organismos

asociados con procesos efectivos de degradación de BTEX. A continuación se muestran cada uno de ellos.

Imagen 1. Enterobacter sp y Serratia fonticola.

Imagen 2. Pseudomonas fragi y Bacillus subtilis.

Lo segundo es la determinación del medio más propicio para hacer crecer nuestros microorganismos y que tenga como fuente de carbono la gasolina que después determinemos como la indicada para poder ver su degradación. Teniendo esto en cuenta y después de una revisión bibliográfica se encontraron en varios artículos el uso del medio Bushnell Hass. Este medio está compuesto por sulfato de magnesio, cloruro de calcio, fosfato de monopotasio, nitrato de amonio, cloruro férrico y difosfato de potasio(Chen, Barker, & Gui, 2008).

Lo tercero y último es la determinación de la concentración de gasolina a usar en cada uno de los ensayos. Esta determinación se hizo a partir de los datos tomados en la tesis de Raquel Romero en donde se hicieron promedios de las concentraciones a las entradas y salidas de las gasolinerías y a partir de una revisión bibliográfica se determinó una concentración de 500 ppm.

2.1

Purga y trampa

El método de purga y trampa sirve para separar analitos volátiles de líquidos o sólidos, concentrarlos e introducirlos en un cromatógrafo de gases. El objetivo de este método es aislar el 100% del analito de la muestra. Este funciona a través de un automuestrador que requiere 25 ml como volumen mínimo, los cuales se hacen pasar por un gas de purga (en nuestro caso helio) a través de una disolución por un tiempo definido con el fin de purificar la muestra. El gas de purga que sale del vial es después recogido y concentrado en un tubo o trampa durante unos 10 minutos. Después de

los 10 minutos se eleva la temperatura de la trampa a unos 200 °C y se vuelven a volatilizar los compuestos haciéndolos entrar a la columna del cromatógrafo, donde se concentran en una trampa fría. Una vez se ha completado este proceso se calienta la columna cromatográfica para así dar inicio a la separación. En esta técnica los compuestos no se recuperan en su totalidad, por lo que se deben hacer estudios de recuperación, para los diferentes compuestos involucrados. La recuperación del analito está afectada por la concentración del analito, por la matriz de la muestra y por el tiempo de purga (Quirós, s. f.). Además a priori a todo lo mencionada anteriormente se debe de realizar una curva de calibración, que en nuestro caso se hace con un patrón de BTEX para que así el cromatógrafo pueda correr de manera adecuada cada una de las muestras.

Entonces con el fin de cumplir el objetivo inicial de ver la efectividad de los microorganismos en la biodegradación de BTEX y así mismo verificar si son más eficientes en un consorcio se realizó lo siguiente:

Primero se debe dejar creciendo durante un día en una incubadora a 37 °C cada uno de los microorganismos en tubos de 10 ml con caldo BHI (brain heart infusión), el cual es un medio nutritivo que promueve este crecimiento. Después del paso de las 24 horas se puede pasar al montaje experimental que compuso cada uno de los ensayos. Estos ensayos se componen de la muestra problema individual de cada uno de los microorganismos que contiene 360 ml de medio BH, 40 ml de cada microorganismo y 0,2 ml de gasolina con su respectiva replica con el fin de poder validar los resultados obtenidos; de un control grupal que contiene 360 ml de medio BH y 0,18 ml de gasolina; de un sacrificio individual con 180 ml de medio BH, 0,1 ml de gasolina y 20 ml de cada microorganismo con el fin de poder medir parámetros como pH, conductividad, oxígeno disuelto y temperatura que puedan dar conocimiento de las condiciones en las cuales se encuentra cada uno de los ensayos; y de tres cajas de Petri por microorganismo con medio TSA (medio nutritivo) que permitan comprobar que en ninguno de los ensayos hubo contaminación por otro microorganismo que pueda afectar la degradación de la gasolina.

Estos fueron después puestos en un shaker durante 48 horas en las que en el tiempo cero, a las 24 horas y en el tiempo final se tomaron muestras de 100 ml. A estas muestras de 100 ml se les debía realizar un proceso de filtración (imagen 3) debido a las características del método de purga y trampa y finalmente fueron después pasadas a frascos ámbar para ser llevadas al cromatógrafo.

Imagen 3. Equipo de filtración.

2.2

Microextracción en fase sólida

El método de microextracción en fase sólida es usado para extraer compuestos químicos que requieran una posterior identificación de una muestra. Esta es una técnica mucho más simple que el de purga y trampa y posee la ventaja de ejercer una menor manipulación de la muestra. Consta de una fibra cubierta por una fase que sirve como medio para la extracción, esta fibra suele estar hecha de materiales como el carbón activado que son de gran desempeño para la adsorción de compuestos volátiles o no volátiles y que se encuentren tanto en una fase líquida como una fase gaseosa.

El método se constituye por procesos de muestreo y desorpción. En el muestreo se calienta la muestra y algunas veces también se agita con el fin de acelerar el proceso y así volatilizar todos los compuestos que se encuentran en la muestra y estos sean adsorbidos por la fibra (imagen 4). En el proceso de desorpción lo que se hace es transferir la fibra al puerto de inyección del instrumento de separación, que en nuestro caso es un cromatógrafo de gases. La cantidad de moléculas que puede extraer la fibra depende de la concentración de la muestra por lo que posee la desventaja que la fibra se sature cuando existan altas concentraciones (Pawliszyn, 1997).

Imagen 4. Montaje para microextracción en fase sólida

A diferencia del anterior método, la microextracción en fase sólida se hizo con el objetivo de poder estandarizar la cuantificación de BTEX en muestras de gasolina.

Entonces con el fin de cumplir con dicho objetivo se diseñó el siguiente montaje experimental que mantuvo la misma concentración de gasolina y el mismo medio BH para las muestras, pero difirió del anterior al realizar el mismo procedimiento en dos momentos diferentes. Además el control contenía 500 ml de medio BH y 250 uL de gasolina; una muestra con 450 ml de medio BH con 250 uL de gasolina y 50 ml de los microorganismos en consorcio con su respectiva réplica; y una muestra de sacrificio con las mismas cantidades de la primer muestra. Así mismo como en la metodología de purga y trampa, las muestras se dejaron en agitación durante 48 horas, por lo que hubo muestras en el tiempo cero, al otro día y al tercer día. En el momento de tomar los 100 ml que se requerían para la cuantificación de BTEX, a diferencia de la metodología de purga y trampa, se decidió realizar una agitación estandarizada a cada ensayo con el fin de tratar de obtener una muestra homogénea. Finalmente para esta metodología se decidió sembrar para cada tiempo muestras de 100 uL en medios selectivos para cada uno de los microorganismos con el fin de poder atribuirle la degradación de BTEX a este consorcio. Los medios selectivos fueron VRB para

Enterobacter sp y Serratia fonticola; cetrimida para

Pseudomonas fragi y el medio bacillus cereus para Bacillus subtilis.

3

Resultados y discusión

____________________________________________  

Los resultados así como la metodología también se encuentran divididos en dos partes que corresponden a cada una de las técnicas usadas. En términos generales la obtención de estos resultados fue diseñada en un principio para poder observar los cambios de las concentraciones del benceno, tolueno, etilbenceno y xileno en determinados periodos de tiempo que fueron establecidos anteriormente con respecto a lo que se encontró como más apropiado en la respectiva literatura. A continuación se muestra lo obtenido para cada una de las metodologías.

3.1

Purga y trampa

Con respecto a lo obtenido en el método de purga y trampa se debe aclarar que los resultados para los frascos de sacrificio no se tuvieron en cuenta, debido a problemas con las cantidades que estos tuvieron lo que hacía que estos no fueran semejantes a las muestras con los microorganismos medio BH y gasolina. Teniendo en cuenta lo dicho anteriormente se mostrará a continuación lo obtenido con el uso de esta técnica.

Imagen 5. Pseudomonas fragi en TSA.

Imagen 6. Bacillus subtilis en TSA

Con respecto a la siembra en TSA se muestra como ejemplo

lo obtenido para Pseudomonas fragi y Bacillus subtilis en

dos tiempos diferentes demostrando así que no hubo contaminación en las muestras y de que hubo un crecimiento apropiado de los microorganismos en estas.

Las tablas a continuación muestran las diferencias porcentuales que hubo entre las concentraciones de cada uno de los compuestos de los BTEX en los tres tiempos medidos para cada uno de los microorganismos y control, mientras que las figuras muestran la concentración de cada compuesto a lo largo de los tres tiempos medidos en cada microorganismo y control con sus respectivas réplicas.

Tabla 1.Diferencia porcentual de la concentración para BTEX en el control.

Figura 1.

Del control se puede observar claramente la disminución proporcional de cada uno de los compuestos a lo largo de los tiempos medidos, que en el caso del benceno esta disminución llegó a obtener diferencias de un 85% entre el tiempo cero y las 48 horas. Este resultado puede implicar que durante el proceso de obtención de muestras esta

manipulación debió de traer consigo una volatilización de los compuestos. Lo cual correspondería con las características de estos compuestos (Durmusoglu et al., 2010) y esto sin tener en cuenta la manipulación que

implica el proceso de filtración.

BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO

0-­‐48 85,0% 75,9% 77,4% 68,5% 62,4%

0-­‐24 66,8% 56,0% 51,5% 44,0% 44,8%

24-­‐48 54,7% 45,1% 53,5% 43,7% 31,8%

Cambio  Concentración  CONTROL  (%)

Lapso   tiempo

0" 200" 400" 600" 800" 1000" 1200" 1400" 1600" 1800"

0" 24" 48"

Co

ncen

tra

ci

on

*(µg/

l)*

Tiempo*(h)*

Control*

BENCENO" TOLUENO" ETILBENCENO" MP"XILENO" O"XILENO"

Tabla 2.

Figura 2.

Al analizar los resultados para Enterobacter sp se pueden

observar varios comportamientos incoherentes. Lo primero es el hecho de que las réplicas no coinciden entre sí como se puede observar en la Figura 2 en donde por ejemplo, la concentración inicial del tolueno en la gráfica microorganismo 1A corresponde a 900 ug/L mientras que en microorganismo 1B esta concentración cambia a 500 ug/L. Esto puede ser resultado de una clara heterogeneidad de la muestra en donde es muy difícil asegurar que en cada réplica

se esté tomando la misma concentración. También se puede

observar que para la muestra B de Enterobacter sp hay un

aumento de la concentración para todos los compuestos entre el tiempo cero y las 24 horas, en donde se obtuvieron valores de más del 100%. Este resultado puede confirmar lo dicho anteriormente sobre la heterogeneidad de la muestra que hace complicada la toma de estos volúmenes dando así una gran incertidumbre de los datos obtenidos

.

Tabla 3.

BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO 0-­‐48 87,9% 79,5% 86,0% -­‐1,4% 75,5% -­‐39,4% -­‐51,3% -­‐125,9% -­‐102,8% -­‐79,4%

0-­‐24 32,2% 16,8% 23,5% -­‐286,3% 5,5% -­‐75,1% -­‐81,5% -­‐147,8% -­‐156,6% -­‐114,9%

24-­‐48 82,2% 75,4% 81,7% 73,8% 74,1% 20,4% 16,7% 8,8% 21,0% 16,5%

Lapso   tiempo

Cambio  Concentración  MUESTRA  1B  (%) Cambio  Concentración  MUESTRA  1A  (%)

0" 100" 200" 300" 400" 500" 600" 700" 800" 900" 1000"

0" 24" 48"

Co

ncen

tra

ci

ón

+(µg/

l)+

Tiempo+(h)+ Microorganismo+19A+

BENCENO" TOLUENO" ETILBENCENO" MP"XILENO" O"XILENO"

0" 100" 200" 300" 400" 500" 600" 700" 800" 900" 1000"

0" 10" 20" 30" 40" 50" 60"

Co

ncen

tra

ci

ón

+(µg/

l)++

+

Tiempo+(h)+ Microorganismo+19B+

BENCENO" TOLUENO" ETILBENCENO" MP"XILENO" O"XILENO"

BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO

0-­‐48 81,7% 74,6% 84,7% 74,5% 69,3% 80,2% 74,2% 60,7% 59,7% 54,4%

0-­‐24 64,2% 49,0% 48,4% 39,2% 43,3% 24,3% 2,7% -­‐53,5% -­‐42,4% -­‐26,0%

24-­‐48 49,0% 50,3% 70,3% 58,1% 45,9% 73,9% 73,5% 74,4% 71,7% 63,8%

Cambio  Concentración  MUESTRA  3B  (%) Cambio  Concentración  MUESTRA  3A  (%)

Lapso   tiempo

Figura 3.

Los datos de Serratia fonticola demuestran mejorías con

respecto a Enterobacter sp pero siguen presentando errores

parecidos como las mismas diferencias en las concentraciones de compuestos como el tolueno en el

tiempo inicial como lo ocurrido con. Además Serratia

fonticola también obtuvo aumentos en las concentraciones entre el tiempo cero y las 24 horas, aunque esta vez los

valores no fueron tan grandes como en Enterobacter sp y el

mayor correspondió a 53,5%.

Tabla 4.

Figura 4.

0.0000# 50.0000# 100.0000# 150.0000# 200.0000# 250.0000# 300.0000# 350.0000# 400.0000#

0# 10# 20# 30# 40# 50# 60#

Co ncen tra ci ón +(u g/ L) + Tiempo+(horas)+ Microorganismo+3A+ 3A#BENCENO# 3A#TOLUENO# 3A#ETILBENCENO# 3A#MP#XILENO# 3A#O#XILENO# 0.000# 100.000# 200.000# 300.000# 400.000# 500.000# 600.000# 700.000# 800.000# 900.000# 1000.000#

0# 10# 20# 30# 40# 50# 60#

Co ncen tra ci ón +(u g/ L) + Tiempo+(horas)+ Microorganismo+3B+ 3B#ETILBENCENO# 3B#MP#XILENO# 3B#O#XILENO# 3B#O#XILENO# 3B#O#XILENO#

BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO

0-­‐48 53,3% 41,3% 33,1% 68,5% 62,4% 73,2% 59,8% 46,7% 44,2% 47,8%

0-­‐24 -­‐8,1% 2,4% 9,0% 44,0% 44,8% 24,5% -­‐1,4% -­‐48,1% -­‐44,0% -­‐33,5%

24-­‐48 58,7% 39,9% 26,4% 43,7% 31,8% 64,5% 60,4% 64,0% 61,3% 60,9%

Cambio  Concentración  MUESTRA  9B  (%)

Lapso   tiempo

Cambio  Concentración  MUESTRA  9A  (%)

0" 50" 100" 150" 200" 250" 300" 350" 400"

0" 24" 48"

Co ncen tra ci ón ++( µg/ L) + Tiempo+(h)+ Microorganismo+99A+ BENCENO" TOLUENO" ETILBENCENO" MP"XILENO" O"XILENO" 0" 100" 200" 300" 400" 500" 600" 700" 800" 900"

0" 24" 48"

Co ncen tra ci ón +(µg/ L) + Tiempo+(h)+ Microoganismo+99B+ BENCENO" TOLUENO" ETILBENCENO" MP"XILENO" O"XILENO"

Pseudomonas fragi fue el microorganismo que obtuvo los peores resultados ya que en ellos se pueden observar todos los errores mencionados en los microorganismos anteriores. Se puede ver que hay aumentos de las concentraciones entre el tiempo cero y las 24 horas como por ejemplo, el etilbenceno que llega a tener un aumento en su

concentración del 48,1%. También se puede observar diferencias en concentraciones para un mismo compuesto en su tiempo cero en las réplicas, como el caso del benceno que posee concentraciones de 200 ug/L y 600 g/L lo que invalida completamente los datos.

Tabla 5.

Figura 5.

De todos los resultados estos pareciesen ser los más acertados al compáralos con los demás porque por lo menos se obtuvo un comportamiento de disminución progresiva de los compuestos a lo largo de los tres diferentes tiempos medidos, pero aun así presenta errores observados en los

otros microorganismos. Para Bacillus subtilis también

ocurrieron problemas con las réplicas ya que tanto el tolueno como el benceno poseen diferentes concentraciones en el tiempo cero, además el mp xileno obtuvo el mismo problema del aumento de su concentración pero esta vez fue entre las 24 horas y las 48 horas y fue de 16,9%.

Al analizar los resultados obtenidos para el método de purga y trampa se proponen varias hipótesis que pueden llegar a explicar lo sucedido con su uso. Lo primero es el alto grado de manipulación que pueden llegar a tener las muestras durante el proceso de filtrado ya que debido al alto grado de crecimiento que hubo en ciertos microorganismos, como lo

es el caso de Serratia fonticola, se tuvieron que hacer varios

cambios del papel de filtración por lo que existe una alta probabilidad de volatilización de BTEX . Siguiendo con el proceso de filtración, este requería de vacío para pasar las muestras por el papel de filtración por lo que esto también ayudaría con la volatilización de los compuestos.

BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO BENCENO TOLUENO ETILBENCENOMP  XILENO O  XILENO

0-­‐48 31,5% 34,6% 2,0% 31,8% 1,8% 20,6% 13,9% 9,2% 8,1% 18,3%

0-­‐24 30,0% 5,4% 26,3% -­‐16,9% 22,4% 69,6% 68,6% 72,7% 62,7% 68,8%

24-­‐48 52,0% 38,1% 27,8% 20,2% 23,8% 75,9% 73,0% 75,2% 65,7% 74,5%

Cambio  Concentración  MUESTRA  18B  (%) Cambio  Concentración  MUESTRA  18A  (%)

Lapso   tiempo

0" 200" 400" 600" 800" 1000" 1200" 1400" 1600" 1800"

0" 24" 48"

Co

ncen

tra

ci

ón

+(u

g/

L)

+

Tiempo+(horas)+

Microorganismo+18:A+

BENCENO" TOLUENO" ETILBENCENO" MP"XILENO" O"XILENO"

0" 200" 400" 600" 800" 1000" 1200" 1400"

0" 24" 48"

Co

ncen

tra

ci

ón

+(u

g/

L)

+

Tiempo+(horas)+ Microorganismo+18:B+

BENCENO" TOLUENO" ETILBENCENO" MP"XILENO" O"XILENO"

Por otro lado está el hecho de que al adicionar gasolina a las muestras, estas dejan de ser homogéneas ya que la gasolina es insoluble en el agua y nuestro medio esta hecho a base de esta. Esto puede traer consigo muchos errores y puede llegar a ser la causa de la invalidez de las réplicas porqué en el momento de extraer los 100 ml para filtrar nunca se puede estar seguro de que se esté tomando la misma concentración en su réplica. Así mismo esto podría explicar el por qué habían tan diferentes concentraciones de algunos compuestos en sus tiempos iniciales.

Otra hipótesis sugerida es que al asumir que cada microorganismo está degradando la gasolina, los BTEX deberían de estar adheridos a la biomasa entonces en el momento de realizar el proceso de filtración puede que estos compuestos no se logren filtrar trayendo consigo un gran error a la medición.

Ahora para poder explicar el explicar los aumentos de concentraciones se planteó la hipótesis de que de pronto las rutas metabólicas de los microorganismos al degradar un compuesto estuvieran generando como metabolitos otro que se estuviera analizando. Pero se logró descartar por el hecho de que la degradación de BTEX genera como productos intermediarios catecoles que son después pasados a piruvatos para la posterior asimilación por los microorganismos, entonces no deberían afectar los resultados (Andreoni & Gianfreda, 2007; Jindrova, Chocova, Demnerova, & Brenner, 2002).

Finalmente teniendo en cuenta que la Federación Nacional de Biocombustible de Colombia estableció un 10% de etanol en la gasolina («Federación Nacional de Biocombustibles de Colombia», s. f.) Lo más probable es que los microorganismos prefieran degradar primero el etanol que los BTEX debido a que posee una estructura mucho más simple entonces es más fácil de metabolizar. Esto trae consigo una disminución en la degradación de los BTEX por parte de los microorganismos seleccionados que afecta de manera importante los resultados esperados (Corseuil, Hunt,

Ferreira dos Santos, & Alvarez, 1998)

.

3.2

Microextracción en fase sólida

Debido a lo mencionado anteriormente se decidió cambiar el objetivo de la tesis y enfocarlo ahora hacia la estandarización de un método que pueda proveer datos más confiables y válidos al momento de analizar la presencia de BTEX en muestras con gasolina porqué el manejo de la gasolina presenta muchas dificultades al no ser soluble en agua y requiere de una técnica que pueda lidiar con las características de sus compuestos a la hora de analizarlos.

Por eso al hacer una revisión bibliográfica se decidió emplear ahora el método de microextracción en fase sólida puesto que la extracción se realiza de una manera rápida sin utilizar solventes y existe una menor manipulación de las muestras por lo que estas pueden ser almacenadas y aun así no se tendrán pérdidas significativas de los compuestos (Pawliszyn, 1997).

A continuación se muestran los resultados obtenidos por dicho método siguiendo el procedimiento explicado anteriormente en la sección de materiales y métodos.

Imagen 7. Agar cetrimida y bacillus cereus

Imagen 8. Agar TSA y VRBA

Con respecto a la siembra en medios selectivos y TSA se puede observar que cada uno de los microorganismos evaluados crecieron en el consorcio, entonces cualquier posible degradación puede ser retribuida a estos. Sin embargo el crecimiento si se vio seriamente afectado puesto que en comparación al crecimiento obtenido al tener muestras con cada microorganismo por aparte este fue mucho más lento y se debió dejar unos días más en la incubadora. Esto puede deberse a que no se encontraron estudios de consorcios con exactamente los mismos microorganismos y al tener que competir entre ellos pudo haber existido algún tipo de inhibición unos a otros.

Las gráficas que se muestran a continuación corresponden a cada uno de los compuestos analizados en los dos momentos diferentes que se hicieron para el consorcio, el control, sus respectivas réplicas y los resultados de los sacrificios en los que se midieron la temperatura, pH, oxígeno disuelto y conductividad.

Figura 6. Concentración del benceno y tolueno para los dos momentos.

Los resultados con respecto al benceno y tolueno presentan mejorías pero no lograron corregir todos los errores que se obtuvieron en la técnica de purga y trampa. A diferencia de purga y trampa en estos resultados la mayoría de las réplicas si coinciden entre si lo cual si justifica el uso de este método con respecto al anterior. Pero siguen ocurriendo esos

aumentos de concentración entre los tiempos iniciales y las 24 y 48 horas. Por otro lado parece no haber una degradación relevante en ninguno de los dos momentos por lo que si puede estar ocurriendo esa inhibición por competición entre los microorganismos mencionada anteriormente al obtener poco crecimiento de estos.

Figura 7. Concentración del etilbenceno y o xileno para los dos momentos.

Con respecto al etilbenceno y o xileno no se presentaron diferencias a lo obtenido con el benceno y el tolueno, excepto por el hecho de que los controles siguen mostrando disminución en sus concentraciones por lo que se puede

decir que todavía sigue existiendo volatilización de los compuestos durante la manipulación de las muestras (Durmusoglu et al., 2010).

0,0   200,0   400,0   600,0   800,0   1000,0   1200,0   1400,0  

0   24   48  

Co ncen tra ci ón  (p pm)  

Tiempo(horas)  

Benceno  

M1  

M1R  

C1  

C1R  

M2  

M2R  

C2  

C2R  

0   500   1000   1500   2000   2500   3000   3500   4000  

0   24   48  

Co ncen tra ci ón (p pm)  

Tiempo(horas)  

Tolueno  

M1  

M1R  

C1  

C1R  

M2  

M2R  

C2  

C2R  

0   100   200   300   400   500   600   700  

0   24   48  

Co ncen tra ci ón  (p pm)  

Tiempo(horas)  

E7lbenceno  

M1  

M1R  

C1  

C1R  

M2  

M2R  

C2  

C2R  

0   200   400   600   800   1000   1200  

0   24   48  

 Co ncen traci ón (p pm)  

Tiempo(horas)  

O-­‐Xileno  

M1  

M1R  

C1  

C1R  

M2  

M2R  

C2  

Figura 8. Concentración del mp xileno para los dos momentos.

El mp xileno no es excepción de los otros compuestos y presenta tanto las mismas virtudes como los mismos errores presentes en el benceno, tolueno, o xileno y etilbenceno. En el mp xileno se siguen observando aumentos en las concentraciones entre los tiempos iniciales, las 24 y 48 horas, así como que en los controles existe disminución de las concentraciones y que no hay una degradación significativa por parte del consorcio.

Lo más importante que se obtuvo de estos resultados es que el primer momento nunca es igual segundo. Este comportamiento se mantuvo para todos los compuestos y es de suma importancia porqué confirma la heterogeneidad de las muestras. Aun así empleando una mecánica para la mezcla de estas no se puede asegurar que exista una homogenización exitosa.

Figura 9. Conductividad para el primer y segundo momento.

Lo que nos confirma estos valores de conductividad es que efectivamente hubo actividad microbiológica en el consorcio, ya que esta varía entre el control y el consorcio en ambos momentos. A pesar de esto la diferencia no es lo suficiente como para atribuirle un gran desempeño al

consorcio en la degradación del BTEX. Por otro lado se sigue observando que el primer y segundo momento poseen valores completamente diferentes e irreproducibles confirmando la heterogeneidad de las muestras.

0   500   1000   1500   2000   2500   3000  

0   24   48  

Co

ncen

tra

ci

ón

 (p

pm)

Tiempo(horas)  

Mp-­‐Xileno  

M1  

M1R  

C1  

C1R  

M2  

M2R  

C2  

C2R  

0   2   4   6  

To   6h   22:30  h   29  h     47h  

Conduc7vidad  (ms/cm)  

Control    

M1  

0   2   4  

To   18h   23:30h   43  h   48h  

Conduc7vidad    

(ms/cm)  

Control    

Figura 10. Oxígeno para el primer y segundo momento.

Al analizar los resultados del oxígeno disuelto se puede llegar a decir que la mayoría de degradación del BTEX ocurrió en condiciones anaerobias. Probablemente debido a esto es que la degradación fue tan poca ya que los procesos anaerobios son mucho menos eficientes y los

microorganismos siempre van a preferir una degradación aerobia porque además de ser más rápida les va a proveer una mayor cantidad de energía (El-Naas, Acio, & El Telib, 2014).

Figura 11. pH para el primer y segundo momento.

Los microorganismos siempre requieren de un rango de pH para poder sobrevivir y en lo que conviene con biodegradación se puede decir que los microorganismos en ambos momentos se encontraron bajo las condiciones ideales para la degradación del BTEX ya que estos rangos

se encuentran entre 5 y 8. Esto se debe a que la mayoría de las bacterias son neutrófilas entonces condiciones como estas son las más recomendables (Chungsying Lu, Lin, &

Chu, 2002).

Figura 12. Temperatura para el primer y segundo momento.

La temperatura es de gran importancia para los procesos biológicos ya que esta es capaz de determinar el tipo de

metabolismo, las velocidades de difusión, biodisponibilidad y solubilidad. Esto quiere decir que la tasa de degradación

0   2   4   6   8  

To   6h   22:30  

h   29  h     47h  

OD(mg/l)  

Control    

M1  

0   2   4   6   8  

To   18h   23:30h   43  h   48h  

OD(mg/l)  

Control    

M2  

0   5   10  

To   6h   22:30  

h   29  h     47h  

pH  

Control    

M1  

0   2   4   6   8  

To   18h   23:30h   43  h   48h  

pH  

Control    

M2  

-­‐5   5   15   25  

To   6h   22:30  

h   29  h     47h  

T(C)  

Control    

M1  

0   10   20   30  

To   18h   23:30h   43  h   48h  

T(C)  

Control    

de BTEX a diferentes temperaturas puede afectar el crecimiento de las bacterias, la inactivación de enzimas y las concentraciones del sustrato (El-Naas et al., 2014). Estudios en degradación de BTEX han demostrado que esta aumenta cuando se encuentra en rangos entre los 15 - 30 ° C y disminuyen en rangos entre los 30 – 50 ° C (C. Lu, Lin, & Chu, 1999) por lo que nuestro consorcio se encontró en condiciones apropiadas en ambos momentos para la degradación de BTEX.

En resumidas cuentas el método de microextracción en fase sólida demostró ser más adecuado para la cuantificación de

BTEX que purga y trampa puesto que esta vez las réplicas estuvieron mucho más acertadas. Por otro lado esta técnica no fue capaz de lidiar con la heterogeneidad de nuestras muestras como se pudo observar en los diferentes resultados entre los dos momentos. Además para una nueva aproximación se recomienda verificar esporulación por

microscopia para Bacillus subtilis ya que este

microorganismos por medio de la percepción del quórum puede cambiar su comportamiento y comenzar un proceso de esporulación en condiciones de falta de nutrientes por ejemplo (Gollakota & Halvorson, 1960); hecho que puede afectar de manera importante nuestros resultados.

4

Conclusiones

____________________________________________  

El método de microextracción en fase sólida demostró ser más apto para la cuantificación de BTEX que el de purga y trampa, en donde hubo una mayor coincidencia entre cada una de las réplicas. Sin embargo no logró lidiar con la heterogeneidad de las muestras por lo que una posible solución es utilizar un patrón de BTEX que elimine los otros elementos de la gasolina como el etanol que puede afectar la degradación biológica (Corseuil et al., 1998), así mismo como aumentar la solubilidad del agua lo que permitirá tener muestras más homogéneas que provean de resultados más acertados con respecto a la biodegradación de BTEX y eliminen errores como concentraciones iniciales variables e irreproducibles. Además puede que el uso de un patrón de BTEX no sea suficiente y se deba de evaluar cada uno de sus compuestos independientemente porqué se ha demostrado que existe una inhibición de la degradación del benceno en presencia de tolueno y etilbenceno así mismo como se ha encontrado un aumento en la degradación del benceno en presencia de o xileno y la de tolueno en presencia de benceno (Littlejohns & Daugulis, 2008).

Se recomienda para un próximo ensayo evitar altas concentraciones de gasolina porque estas pueden llegar a afectar las estructuras de las comunidades microbianas como fue demostrado a concentraciones de 120 mg/L de BTEX por Lin, Wu, Tang, & Chang, 2012. También es recomendable que antes de los ensayos se realice un proceso de adaptación microbiológica ya que la importancia de esta es tal, que un microorganismo adaptado a benceno puede tener mayores degradaciones del benceno y tolueno que uno adaptado a tolueno (Yeom, Yoo, & Lee, 1997). Además se está asegurando la selección de los microorganismos más aptos por el hecho de generar esa presión de selección sobre estos.

Por otro lado el uso del medio BH para el crecimiento de microorganismos con propósitos de cuantificar la degradación de hidrocarburos demostró ser efectivo. Este medio obtuvo un alto crecimiento bacteriano y no obtuvo problemas con algún microorganismo en específico.

Finalmente con el propósito de descartar errores de mediciones se debe de consultar un laboratorio externo certificado que analice las mismas muestras. Esto puede llegar a ser determinante cuando se estén analizando muestras con bajas concentraciones de BTEX.

5

Referencias

____________________________________________  

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