UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS
Producción de
Glucosa Oxidasa
T E S I S
CLAUDIO ENRIQUE VOGET
El p r e s e n t e t r a b a j o de t e s i s p a r a o p t a r al g r a d o de D o c t o r en C i e n c i a s B i o q u í m i c a s f u e r e a l i z a d o en el C e n t r o de I n v e s t i g a c i ó n y D e s a r r o l l o en F e r m e n t a c i o n e s I n d u s t r i a l e s ( C I N D E F l ) , F a c u l t a d de C i e n c i a s E x a c t a s de la U n i v e r s i d a d N a c i o n a l de la P l a t a , b a j o la d i r e c c i ó n del D o c t o r A n t o n i o P. B a l a t t i .
A mí e s p o s a e h i j o s A mis p a d r e s y h e r m a n o
Mi r e c o n o c i m i e n t o Al Dr. A n t o n i o P. B a l a t t i por h a b e r m e b r i n d a d o la o p o r t u n i d a d de r e a l i z a r el p r e s e n t e t r a b a j o en las i n s t a l a c i o n e s del C e n t r o de I n v e s t i g a c i ó n y D e s a r r o l l en F e r m e n t a c i o n e s I n d u s t r i a l e s . A la F a c u l t a d de C i e n c i a s E x a c t a s de la U n i v e r s i d a d N a c i o n a l de La P l a t a , por p e r m i t i r m e el e m p l e o de sus e q u i p o s e i n s t a l a c i o n e s . Al C o n s e j o N a c i o n a l de I n v e s t i g a c i o n e s C i e n t í f i c a s y T é c n i c a s p o r el o t o r g a m i e n t o de s u c e s i v a s b e c a s q u e p e r m i t i e r o n la r e a l i z a c i ó n de e s t o s e s t u d i o s .
Mi a g r a d e c i m i e n t o Al Dr. A n t o n i o P. B a l a t t i p o r su g u í a y e s t í m u l o pe rma n en t es . Al L i c . L u i s B r u n o B l a n c h por la p r e p a r a c i ó n del r e a c t i v o c l o r h i d r a t o de o - d i a n i s i d i n a . A mi m a d r e y a la Sra. D i a n a V e n t u r i n i p o r su i n e s t i m a b l e t r a b a j o d a c t i l o g r a f i c o . Al Sr. J u l i o C. F i g a r i por su i n a p r e c i a b l e a s i s t e n cia t é c n i c a y al r e s t o del p e r s o n a l del C I N D E F I .
I N D I C E Pag . 1. I N T R O D U C C I O N --- --- 1 1.1. La r e a c c i ó n c a t a l í t i c a --- 1 1.2. F u e n t e s de g l u c o s a o x i d a s a ---- --- 3 1.3. E s t r u c t u r a y p r o p i e d a d e s de la g l u c o s a o x i d a s a --- 5 1 . *4. A p l i c a c i o n e s dé la g l u c o s a o x i d a s a --- 9 1.5. V a l o r a c i ó n de la a c t i v i d a d e n z i m á t i c a --- 10 1.6. O b t e n c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a --- 13 1.7. D e s a r r o l l o del t r a b a j o --- 15 2. M A T E R I A L E S Y M E T O D O S --- 17 2.1. M i c r o o r g a n i s m o 2 . 1 . 1 . C e p a e m p l e a d a en los e s t u d i o s --- 17 2 . 1 . 2 . C o n s e r v a c i ó n de la c e p a --- 17 2.2. M e d i o s de c u l t i v o 2 . 2 . 1 . M e d i o de p r o d u c c i ó n de e s p o r o s --- 17 2 . 2 . 2 . M e d i o b a s e de f e r m e n t a c i ó n --- 1 8 2.3* D e t e r m i n a c i o n e s a n a l í t i c a s 2 . 3 . 1 * R e c u e n t o de e s p o r o s --- 18 2 . 3 . 2 . P e s o s e c o --- 18 2 . 3 . 3 . M e d i d a de pH --- ■--- 18 2 . 3 * 4 . M e d i d a de o x í g e n o d i s u e l t o --- 18 2 . 3 . 5 . C o n s u m o de o x í g e n o --- 18 2 . 3 - 6 . M e d i d a del c o n s u m o de s a c a r o s a --- 19 2 . 3 . 7 . M e d i d a del c o n s u m o de n i t r a t o --- 19 2 . 3 . 8 . D e t e r m i n a c i ó n de p r o t e í n a s --- 19 2 . 3 . 9 . M e d i d a de la v e l o c i d a d de a b s o r c i ó n de o x í g e n o ( V A O ) - 19 2 . 3 . 1 0 . C r o m a t o g r a f í a en papel de á c i d o s o r g á n i c o s --- 20 2 . 3 * 1 1 . D e t e r m i n a c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a --- 20 2 . 4. C o n d i c i o n e s de o p e r a c i ó n 2 . 4 . 1 . E n s a y o s en f r a s c o s a g i t a d o s --- 24 2 . 4 . 2 . E n s a y o s en t e r m e n t a d o r e s con a g i t a c i ó n m e c á n i c a --- 24 2 . 4 . 3 * E s t é r i l i z a c i ó n --- 25 2 . 4 . 4 . D e s a r r o l l o del i n o c u l o --- 26 2 . 4 . 5 . P r o c e s a m i e n t o de las m u e s t r a s del c u l t i v o --- 26 2 . 4 . 6 . E x t r a c c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a --- 26
3. R E S U L T A D O S E X P E R I M E N T A L E S Y D I S C U S I O N ... 31 3.1. D e t e r m i n a c i ó n c o l o r ¡ m é t r i c a de g l u c o s a o x i d a s a --- 31 3.2. C o m p a r a c i ó n de d i f e r e n t e s t r a t a m i e n t o s del m i c e l i o en la e x t r a c c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a --- Al 3.3* I n f l u e n c i a de la c o m p o s i c i ó n del m e d i o de c u l t i v o en la p r o d u c c i ó n e n z i m a t i ca 3 . 3 - 1 - P r o d u c c i ó n en el m e d i o b a s e --- A 3 3 - 3 . 2 . I n f l u e n c i a de la f u e n t e de n i t r ó g e n o --- A 3 3 . 3 . 3 . I n f l u e n c i a de la f u e n t e de c a r b o n o --- A6 3 . 3 * A. I n f l u e n c i a de p r o d u c t o s q u e a p o r t a n f a c t o r e s de c r e c i m i e n t o --- A8 3 . 3 . 5 . C o n c e n t r a c i ó n de n i t r a t o de c a l c i o --- 50 3 . 3 . 6 . P r o d u c c i ó n e n z i m á t i c a en el m e d i o m o d i f i c a d o --- 50 3 . 3 . 7 . D i s c u s i ó n de los r e s u l t a d o s en f r a s c o s . 3.A. E s t u d i o con la P r e n s a - X --- 58 3.5. E s t u d i o s en t a n q u e s a g i t a d o s 3 . 5 . 1 . I n o c u l o ---
63
3 . 5 . 2 . I n f l u e n c i a del pH --- 66 3 . 5 . 3 . I n f l u e n c i a de la a e r a c i ó n --- 70 3 . 5 * A. I n f l u e n c i a de la c o n c e n t r a c i ó n de la f u e n t e de c a r b o n o --- 75 3 . 5 . 5 . D i s c u s i ó n de los r e s u l t a d o s en t a n q u e --- 81 A. C O N C L U S I O N E S --- 88 B I BL I O G R A F I A --- 91I N T R O D U C C I O N Los m i c r o o r g a n i s m o s s i n t e t i z a n n u m e r o s a s e n z i m a s q u e c u m p l e n sus f u n c i o n e s en los p r o c e s o s de c r e c i m i e n t o , m e t a b o l i s mo y a u t o l i s i s de la c é l u l a . Un v a r i a d o n ú m e r o de e l l a s , t a n to de n a t u r a l e z a i n t r a c e l u l a r c o m o e x t r a c e l u l a r ha e n c o n t r a d o un i m p o r t a n t e c a m p o de a p l i c a c i ó n en d i v e r s o s p r o c e s o s i n d u s t r i a l e s , en la m e d i c i n a , en la a n a l í t i c a q u í m i c a y en la i n v e s t i g a c i ó n b i o q u í m i c a (5, 32, 33» *+ 2 , 89, 90, 9*0. D e n t r o de e s t e g r u p o h e t e r o g é n e o se e n c u e n t r a la e n z i m a c u y a p r o d u c c i ó n es o b j e t o de e s t u d i o en el p r e s e n t e t r a b a j o y q u e c o m ú n m e n t e se d e n o m i n a g l u c o s a o x i d a s a (GOD). El i n t e r é s por la m i s m a s u r g e f u n d a m e n t a l m e n t e de sus m ú l t i p l e s a p l i c a c i o n e s en la t e c n o l o g í a de a l i m e n t o s , c o m o así t a m b i é n a su d i f u n d i d o e m p l e o c o m o r e a c t i v o e s p e c í f i c o p a r a la d e t e r m i n a c i ó n de gluctD sa, a s p e c t o e s t e de r e l e v a n c i a en el d i a g n ó s t i c o c l í n i c o (7, 25 , 80, 8*+, 85 , 97 , 1 0*») . El m é t o d o de p r o d u c c i ó n de la g l u c o s a o x i d a s a lo constitu^ ye la c l a s i c a f e r m e n t a c i ó n en c u l t i v o s u m e r g i d o y es l l e v a d o a c a b o con el e m p l e o de h o n g o s f i l a m e n t o s o s (7,
8 5
). C o m o t o d o p r o c e s o de i n t e r é s c o m e r c i a l su t e c n o l o g í a de o b t e n c i ó n se e n c u e n t r a p a t e n t a d a o b i e n es un s e c r e t o de las f i r m a s pro d u c t o r a s ( 3 ** , 35, 50, 62, 75). E s t o m o t i v a q u e la i n f o r m a c i ó n b i b l i o g r á f i c a a c c e s i b l e , si b i e n or i e n t a t i v a , s o l o p e r m i t e d i s p o n e r de un c o n o c i m i e n t o p a r c i a l s o b r e la e l a b o r a c i ó n del p r e p a r a d o e n z i m á t i c o . T e n i e n d o en c u e n t a e s t e c o n t e x t o y la f a l t a de a n t e c e d e n t e s s o b r e el t e m a en n u e s t r o p a í s , se c o n s i d e r ó de i n t e r é s la r e a l i z a c i ó n del p r e s e n t e t r a b a j o c u y a f i n a l i d a d es c o n t r i b u i r al c o n o c i m i e n t o del p r o c e s o f e r m e n t a t i v o c o m o un a p o r t e p a r a el d e s a r r o l l o de una t e c n o l o g í a n a c i o n a l de p r o d u c c i ó n de la e n z i m a . 1.1. La r e a c c i ó n c a t a l í t i c a La g l u c o s a s i f i c a d a s c o m o o x i d a s a p e r t e n e c e a la c l a s e de e n z i m a s c l a - ó x i d o r e d u c t a s a s (E.C. 1.1.3.**) y su n o m b r e s i £t e m á t i c o es p - D - g l u c o s a - l - o x í g e n o - o x i d o r e d u c t a s a (22), La e n z i m a c a t a l i z a la o x i d a c i ó n de l a ^ - D - g l u c o p i r a n o s a a D - g 1 u_ c o n o - f i - l a c t o n a f o r m a n d o en p r e s e n c i a de o x í g e n o una c a n t i d a d e q u i v a l e n t e de p e r ó x i d o d e h i d r ó g e n o (8, 18, 30). E s t o lo d i f e r e n c i a de o t r a s d e s h i d r o g e n a s a s q u e a c t ú a n s o b r e la g l u c o sa p e r o q u e no p u e d e n u t i l i z a r el o x í g e n o c o m o a c e p t o r de hi d r ó g e n o (8, 60). C o m o c o e n z i m a u t i l i z a f l a v i n a d e n i n di n ú c l e o t i d o (FAD) t r a n s c u r r i e n d o la r e a c c i ó n en dos e t a p a s . La p r i m e r a de e l l a s c o n s i s t e en la r e m o c i ó n de dos á t o m o s de h i d r ó g e n o de la m o l é c u l a de g l u c o s a con la c o n s i g u i e n t e r e d u c c i ó n del FAD y la f o r m a c i ó n de la l a c t o n a . En la s e g u n d a e t a p a los á t o m o s de h i d r ó g e n o son t r a n s f e r i d o s al o x í g e n o m o l e c u l a r , p r o d u c i e n d o p e r ó x i d o de h i d r ó g e n o y la s i m u l t á n e a o x i d a c i ó n de la c o e n z i m a . Un e s q u e m a de e s t a s e c u e n c i a de r e a c c i o n e s se r e p r e s e n t a n en la f i g u r a 1 1 E - F A D + 02 --- > E - F A D + H 20 z F i g u r a 1 : O x i d a c i ó n de 1 a Dg 1 u c o s a en p r e s e n c i a de g l u -c o s a o x i d asa E - F A D y E - F A D H ^ : g l u c o s a o x i d a s a en e s t a d o o x i d a d o y r e d u c i d o r e s p e c t i v a m e n t e . 2
-En una e t a p a p o s t e r i o r la g 1 u c o n o 1a c t o n a se h í d r o l l z a a á c i d o g l u c ó n i c o d a n d o c o m o r e s u l t a d o el s i g u i e n t e b a l a n c e C6H12°6 + 02 + H2°
GOD
+
C
6H 1207+
H
2°2 ^ 6 ^ 1 2 ^ 6 : P - D - g l u c o s aC 6 Hi 2
07 : a c i d o g l u c ó n i c o
N o r m a l m e n t e la a c t i v i d a d de la g l u c o s a o x i d a s a es c o m p l e m e n t a d a por la a c c i ó n de la c a t a l a s a ; (E.C. 1.11. 1.6) q u e des c o m p o n e el p e r ó x i d o de h i d r ó g e n o en o x í g e n o y a g u a (13, 52)2 H 2 0 2 - ca-ta l.asa > 2 H 20 + 0 2
Si c o n s i d e r a m o s e n t o n c e s un s i s t e m a c o m b i n a d o de g l u c o s a ox i d a s a - c a t a l a s a y la h i d r ó l i s i s de la g l u c o n o l a c t o n a t e ñ e mos f i n a l m e n t e la s i g u i e n t e e s t e q u i omet ría :
GOD C A H 1 9 ° ¿ + 1/2 0 9 --- ► C . H 1 9 0 7 6 12 6 2 c a t a l a s a 6 1 2 / De a c u e r d o a e s t a s r e a c c i o n e s la o x i d a c i ó n de un mi c r o m o l de g l u c o s a por la a c c i ó n e n z i m á t i c a i m p l i c a la f o r m a c i ó n de una c a n t i d a d e q u i v a l e n t e de á c i d o g l u c ó n i c o o p e r ó x i d o de h i d r ó g e n o y un c o n s u m o de
2 2 . k
j j]
de0 ^
(CNTP). En p r e s e n c i a de c a t a l a s a la m i t a d del o x í g e n o es r e c i c l a d o de m a n e r a q u e la o x i d a c i ó n de un m i c r o m o l de g l u c o s a c o r r e s p o n d e en e s t e c a s o a un c o n s u m o de 1 1.2 0^ (CNTP). E s t a s c o n s i d e r a c i o nes son de s u m a i m p o r t a n c i a en p a r t i c u l a r c u a n d o la a c t i v i dad e n z i m á t i c a es d e t e r m i n a d a m e d i a n t e m é t o d o s b a s a d o s en m e d i d a s de c o n s u m o de o x í g e n o (7^, 110). 1.2. F u e n t e s de g l u c o s a o x i d a s a La e n z i m a se e n c u e n t r a p r e s e n t e en d i f e r e n t e s m i c r o o r g a n i s m o s p r i n c i p a l m e n t e h o n g o s f i l a m e n t o s o s del g é n e r o A s pe r - g i 1 1 u s y P e n i c i 1 1u m q u e son la f u e n t e de su p r o d u c c i ó n i n d u s trial (8 5
). Se ha d e t e c t a d o t a m b i é n su p r e s e n c i a en S p o r o t r i - c h u m p u 1 v e r u 1e n t u m d o n d e i n t e g r a un c o m p l e j o s i s t e m a e n z i m á - t i c o r e s p o n s a b l e de la d e g r a d a c i ó n de m a t e r i a l l i g n o c e l u l ó s i - co (23) y en C a 1 da r i o m y c e s f u m a g o d o n d e p a r t i c i p a de m e c a n i s m o s de c l o r a c i ó n b i o l ó g i c a v i n c u l a d o s a la s í n t e s i s de c a l d a - ri omi c i ñ a (79)- Es p r o d u c i d a a d e m á s p o r a l g u n a s b a c t e r i a s c a t a 1 a s aa c é t i c a s c o m o A c e t o b a c t e r s u b o x y d a n s ( s i n ó n i m o : G 1 u c o n o b a c te r s u b o x y da n s ) y s a l v o u n a s p o c a s e x c e p c i o n e s no fue e n c o n t r a d a en c é l u l a s de v e g e t a l e s o a n i m a l e s s u p e r i o r e s (7 , 12).
Su d e s c u b r i m i e n t o p u e d e s e r a t r i b u i d o a M á x i m o v , q u i e n en 190*4 o b t u v o p o r p r e c i p i t a c i ó n con a c e t o n a un p r e p a r a d o c e l u lar de A s p e r g í llus n iger en el cual la c a p a c i d a d de c o n s u m o de o x í g e n o r e s u l t a b a mas p e r d u r a b l e q u e la c o r r e s p o n d i e n t e p r o d u c c i ó n de CO^. P u d o o b s e r v a r a d e m á s q u e la a d i c i ó n de g l u c o s a e s t i m u l a b a el c o n s u m o de 0^ y qje d i c h o e f e c t o no era p r o m o v i d o p o r o t r a s s u s t a n c i a s c o m o el g l i c e r o l . C o n c l u y ó de e s t a m a n e r a q u e d i c h o p r e p a r a d o c o n t e n í a una " o x i d a s a " q u e a c t u a b a en for-1 ma i n d e p e n d i e n t e del m e t a b o l i s m o r e s p i r a t o r i o ( a c t i v i d a d z i m a - s ica) y q u e la m i s m a era a c t i v a d a por g l u c o s a (2*0. T r a n s c u r r i e ron sin e m b a r g o más de 20 a ñ o s , h a s t a 1926, p a r a q u e M u l l e r r e a l i z a r a la m i s m a o b s e r v a c i ó n en e x t r a c t o s c e l u l a r e s de A s p e r g í - 1 1u s n i g e r y Pen i c i 1 1um g 1a u c u m y a i s l a r a la e n z i m a r e s p o n s a b l e de d i c h a p r o p i e d a d a la cual d e n o m i n ó g l u c o s a o x i d a s a (G 0 D ) . P u d o c o n s t a t a r a d e m á s q u e u n o de los p r o d u c t o s de la r e a c c i ó n e n z i m á t i c a era el á c i d o g l u c ó n i c o e s t a b l e c i e n d o de e s t a m a n e r a las b a s e s b i o q u í m i c a s de la f e r m e n t a c i ó n g l u c ó n i c a d e s c u b i e r t a en 1922 por el m i c r o b i ó l o g o f r a n c é s M o l l i a r d (
2
*4
). En e s t u d i o s p o s t e r i o r e s r e a l i z a d o s por d i v e r s o s i n v e s t i g a d o r e s la e n z i m a p r o v e n i e n t e de A s p e r g í llus n iger fue e s t u d i a d a en d e t a l l e , e l u c i d á n d o s e su e s t r u c t u r a , p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s y los m e c a n i s m o s de la r e a c c i ó n c a t a l í t i c a (2, 18, 30, 52,7 2
, 73, 95, 101) En la d é c a d a del*40
y en r e l a c i ó n con el d e s c u b r i m i e n t o y la i n v e s t i g a c i ó n s o b r e la p e n i c i l i n a se a i s l a r o n de los c u l t i v o s de P e n i c i l l u m n o t a t u m s u s t a n c i a s q u e en p r e s e n c i a de o x í g e n o y g l u c o s a e r a n m u y b a c t e r i o s t á t i c a s y se d e s c r i b i e r o n con el n o m b r e de N o t a t i n a , P e n i c i l i n a B y P e n a t i n a (8, 2*4, 102). Su f o r m a de p r e p a r a c i ó n fué i n c l u s o p a t e n t a d a por d i v e r s a s f i r m a s c o m e r c i a les (15, 93). P o s t e r i o r m e n t e se d e m o s t r ó q u e t o d o s e s t o s c o m p u e s t o s e r a n i d é n t i c o s a la g l u c o s a o x i d a s a , y q u e el p e r ó x i d o de h i d r ó g e n o f o r m a d o e n z i m á t i c a m e n t e era el r e s p o n s a b l e de la a c c i ó n b a c t e r i c i d a . R e s u l t a e v i d e n t e q u e la c e p a u t i l i z a d a o b i e n las c o n d i c i o n e s del c u l t i v o p r o m o v í a n la f o r m a c i ó n de la e n z i m a con una m í n i m a o n u l a p r e s e n c i a de c a t a l a s a , p e r m i t i e n do de e s t a m a n e r a la a c u m u l a c i ó n del H2
02
. Al igual q u e la e n z i m a p r o v e n i e n t e de A s p e r g í l l u s n í g e r , se real i z a r o n i n t e n sas i n v e s t i g a c i o n e s p a r a e s t a b l e c e r el c o m p o r t a m i e n t o y p r o-p i e d a d e s de los -p r e -p a r a d o s o b t e n i d o s del P e n i c i l l u m n o t a t u m 8, 12, *45). La e n z i m a ha s i d o t a m b i é n a i s l a d a en f o r m a c r i s t a
lina de los m e d i o s de c u l t i v o de P e n i c i l l u m a m a g a s a k i e n s e (*49). El p r i m e r p r e p a r a d o e n z i m á t i c o o f r e c i d o c o m e r c i a l m e n t e d a t a de 1952 (102), p e r s i s t i e n d o en la a c t u a l i d a d su p r o d u c c i ó n i n d u s trial la cual es r e a l i z a d a p r e f e r e n t e m e n t e con c e p a s de As pe rgi - 11 us n iger (3*4, 35, 50), P e n i c i 1 1 um a m a g a s a k i e n s e y P e n i c i l l u m v í t a l e (75,
8 5
). O t r a s e s p e c i e s de P e n i c i l l u m ( e j . p u r p u r o g e n u m ) han s i d o t a m b i é n a i s l a d a s e v i d e n c i a n d o a l t o s r e n d i m i e n t o s en g l u c o s a ox i d a s a (6 5
). 1 . 3 . E s t r u c t u r a y p r o p i e d a d e s de la g l u c o s a ox i d a s a . D e t a l l a d o s e s t u d i o s c o m p a r a t i v o s r e a l i z a d o s con la e n z i m a o b t e n i d a de A s p e r g í l l u s n i g e r , P e n i c i l l u m n o t a t u m y P e n i c i l l u m a m a g a s a k i e n s e , m u e s t r a n q u e a d e m á s de la r e a c c i ó n c a t a l í t i c a , e x i s t e una g r a n s e m e j a n z a en m u c h a s de sus p r o p i e d a d e s (8 5
). T e n i e n d o en c u e n t a e s t e a s p e c t o y el h e c h o de e m p l e a r en n u e s tros e s t u d i o s una c e p a de A s p e r g í l l u s n i g e r , la s i g u i e n t e d e s c r i p c i ó n e s t a r á r e f e r i d a a la e n z i m a p r o v e n i e n t e de d i c h o mi- c r o o r g a n i smo. La e n z i m a es una g 1 i c o p r o t e i na de p e s o m o l e c u l a r 1 6 0 . 0 0 0 c o n s t i t u i d a por dos s u b u n i d a d e s i d é n t i c a s (PM 7 9 , 0 0 0 ) u n i d a s c o v a 1 e n t e m e n t e p o r p u e n t e s d i s u l f u r o (101). El a n á l i s i s de su c o m p o s i c i ó n r e v e l a un1 k%
de p r o t e i na, 2 6 .bZ
de a z ú c a r e s n e u t ros,2 . bZ
de a m i n o a z u c a r e s y dos m o l e s de FAD ( f l a v i n , a de- nin, d i n u c l e ó t i d o ) por mol de e n z i m a (73, 101). En su c a d e n a p o 1 i p e p t í d i c a e x i s t e un m a r c a d o p r e d o m i n i o de á c i d o a s p á r t i c o y á c i d o g l u t á m i c o c o m o así t a m b i é n de g l i c i n a , a 1an i na y l e a c i - na q u e c o m p r e n d e n en c o n j u n t o elbbZ
del total de a m i n o á c i d o s p r e s e n t e s en la m o l é c u l a . Los c a r b o h i d r a t o s e s t á n c o n s t i t u i d o s p r i n c i p a l m e n t e por m a ñ o s a y en m u c h a m e n o r p r o p o r c i ó n g a l a c t o s a y ga 1 a c t o s a m i n a . La u n i ó n de e s t o s a z ú c a r e s a la c a d e n a p o l i - p e p t í d i c a se h a r í a p r o b a b l e m e n t e por e n l a c e s a m i n o g l i c o s í d i c o s e n t r e el c a r b o h i d r a t o y el g r u p o a m i d o de la a s p a rag i na (73)- Se ha p o d i d o o b s e r v a r q u e la r e m o c i ó n de unbOZ
de los c a r b o h i d r a t o s por t r a t a m i e n t o con p e r i o d a t o no a l t e r a s i g n i f i c a t i v a m e n t e las p r o p i e d a d e s c a t a l í t i c a s de la e n z i m a p e r o sí a f e c t a sus r e s i s t e n c i a t é r m i c a , s u g i r i e n d o de e s t a m a n e r a q u e los m i s mos no p a r t i c i p a n en la c o n f o r m a c i ó n del c e n t r o a c t i v o p e r o le c o n f i e r e n e s t a b i l i d a d a la e s t r u c t u r a m o l e c u l a r (63)*La g l u c o s a o x i d a s a m a n i f i e s t a una a l t a e s p e c i f i c i d a d por su s u s t r a t o . En el C u a d r o 1 se p u e d e o b s e r v a r las v e l o c i d a d e s de r e a c c i ó n r e l a t i v a s a la | J - D - g 1 u c o s a p a r a d i f e r e n t e s c o m p u e s t o s . C U A D R O 1 E s p e c i f i c i d a d de s u s t r a t o p a r a la g l u c o s a o x i d a s a Pos i c ión mod i f i cada n°de carbono
Compues to Cambios con respecto a 1 a ^-D-gl ucosa
Ve 1oc i dad relativa
- - D-g 1 ucosa - 100
1 Q ^ - D - g 1ucosa Configuración del OH 0.6A
1.5 anh i dro-D- g 1uc i tol
Reemplazo del OH por H 0
2 2-Deoxy-D-
g 1ucosa
Reemplazo del OH por H 3.3
D-manosa Configuración del OH 0.98
2-o-met i 1 -D— g 1ucosa Sustitución del H en el OH por met i 1 o 0 3 3"Deoxy-D- g 1ucosa
Reemplazo del OH porH 1
k
D-galactosa Configuración del OH 0.5k -
Deoxy-D- g 1ucosaReemplazo del OH por H 2
5 5-Deoxy-D- Reemplazo del OH por H 0.05
g 1ucosa (no se forma anillo piranos ico)
L- g1ucosa Configuración del OH 0
6 6-Deoxy-D-1
g 1ucosa
Reemplazo del OH por H 10
X y 1 osa Reemplazo del C^ por H 0.98
-O b s e r v a m o s q u e la o x i d a c i ó n de 1 a ( 5 - D - g l u c o s a es 160 v e c e s m a s r á p i d a q u e la de su a n ó m e r o ^ ( a l f a ) , a u n q u e e s t e a s p e c t o es de p o c a i m p o r t a n c i a en sus a p l i c a c i o n e s i n d u s t r i a l e s , ya q u e los p r e p a r a d o s c o m e r c i a l e s c o n t i e n e n en g e n e r a l m u t a r o t a s a . En c o n d i c i o n e s a n a e r ó b i cas p u e d e u t i l i z a r c o m o a c e p t o r e s de h i d r ó g e n o a c i e r t o s c o l o r a n t e s c o m o azul de m e t i l e n o , t i o n i n a , e t c . , p e r o la r e a c c i ó n t r a n s c u r r e m u c h o m á s l e n t a en c o m p a r a c i ó n con el o x í g e n o . Esta p r o p i e d a d ha m o t i v a d o q u e la e n z i m a sea c a r a c t e r i z a d a c o m o una d e s h i d r o g e n a s a más q u e c o m o una o x i d a s a s u g i r i é n d o s e q u e su n o m b r e más c o r r e c t o sea el de g l u c o s a a e r o d e s h i d r o g e n a s a . Sin e m b a r g o por su d i f u s i ó n el t é r m i n o g l u c o s a o x i d a sa s i g u e v i g e n t e en la a c t u a l i d a d . A l t e r n a t i v a m e n t e el FAD redu ci do p u e d e ser r e g e n e r a d o e l e c t r o q u í m i c a m e n t e m e d i a n t e un poten_ c i a 1 de + 2 0 0 mV (59) . La e n z i m a es a c t i v a en un a m p l i o r a n g o de pH. La v e l o c i d a d de r e a c c i ó n es m á x i m a e n t r e
k
y 6 . 5 con un l i g e r o p i c o en 5.5* A pH a l c a l i n o es i n e s t a b l e p e r d i e n d o p o r e j e m p l o un30%
de a c t _i_ v i d a d si se la m a n t i e n e d u r a n t e 10 m i n u t o s a pH 8.1 (85, 102). En r e l a c i ó n a la t e m p e r a t u r a d e b e m o s c o n s i d e r a r q u e los c a m b i o s en e s t e p a r á m e t r o i m p l i c a t a m b i é n v a r i a c i o n e s en la c o n c e n t r a c i ó n de u n o de los r e a c t i v o s , el o x í g e n o . La s o l u b i l i d a d del m i s m o d i s m i n u y e con el a u m e n t o de la t e m p e r a t u r a y c o m p e n s a de e s t a m a n e r a los b e n e f i c i o s q u e d e s d e el p u n t o de v i s t a t e r m o d i - n a m i c o i m p l i c a un i n c r e m e n t o de la t e m p e r a t u r a . La v e l o c i d a d de r e a c c i ó n es p r á c t i c a m e n t e c o n s t a n t e en el r a n g o de 3 0 ° a 6 0 ° C (33, 85). La e s t a b i l i d a d t é r m i c a es una p r o p i e d a d i m p o r t a n t e a c o n s i d e r a r s o b r e t o d o en la t e c n o l o g í a de a l i m e n t o s d o n d e r a d i ca su p r i n c i p a l a p l i c a c i ó n i n d u s t r i a l , ya q u e los p r o d u c t o s a 1 m e n t i c i o s son h a b i t u a l m e n t e s o m e t i d o s a d i f e r e n t e s t r a t a m i e n t o s t é r m i c o s c o m o p a s t e u r i z a c i ó n , etc. En e s t e s e n t i d o d e b e m o s m e n c i o n a r q u e la e n z i m a es e s t a b l e d u r a n t e 6 h o r a s a A 0 ° C en un r a n g o de pH deb
.5 a 6.0, m i e n t r a s q u e a 5 0 ° C la a c t i v i d a d d i ^ m i n u y e en el m i s m o l a p s o en un 10%. A t e m p e r a t u r a s de 6 0 ° C y s u p e r i o r e s la i n a c t i v a c i ó n o c u r r e con m a y o r v e l o c i d a d d e p e n d i e n d o del pH. En el C u a d r o 2 se p r e s e n t a n a l g u n o s d a t o s s o b r e la e s t a b i l i d a d de la g l u c o s a o x i d a s a a d i f e r e n t e s v a l o r e s de pH y a t e m p e r a t u r a s s u p e r i o r e s a 6 0 °C. La p r e s e n c i a de g l u c o s a , su s u s t r a t o , e j e r c e un c i e r t o e f e c t o p r o t e c t o r a u m e n t a n d o su e s t a b i l i d a d en m e d i o s a l c a l i n o s y la r e s i s t e n c i a t é r m i c a (33)* E s tas p r o p i e d a d e s q u e se r e f i e r e n al c o m p o r t a m i e n t o de la e n z i m a« n s o l u c i ó n p u e d e n ser m o d i f i c a d a s f a v o r a b l e m e n t e si la m i s m a se i n m o v i l i z a en s o p o r t e s a d e c u a d o s (4, 99, 103)* De e s t a f o £ ma se ha p o d i d o a m p l i a r el r a n g o de pH en el cual la e n z i m a es a c t i v a , a u m e n t a r su t e r m o e s t a b i 1 i d a d y f a v o r e c e r la cinétj_ ca de la r e a c c i ó n c a t a l í t i c a (6, 11, 44, 82, 103).
C U A D R O
2
T i e m p o (en m i n u t o s ) r e q u e r i d o p a r a i n a c t i v a r el 9 0 % de la a c t i v i d a d e n z i m á t i c a b a j o d i f e r e n t e s c o n d i c i o n e s de pH y t e m p e r a t u r a PH T e m p e r a t u r a 65° 70° 75° 80° 4.5 - 1 1 3 1 . 1 5 . 0 1 06 23 7 1 .5 5.5 90 16 6 2.0 6 . 0 - 1 2 4 1 .3 En r e l a c i ó n a la c i n é t i c a de la r e a c c i ó n e n z i m á t i c a la cons_ t a n t e de M i c h a e l i s (Km) p a r a g l u c o s a se ha d e t e r m i n a d o en 0 . 1 1 -0 . 1 2 M. Para el o x í g e n o el Km es f u n c i ó n de la t e m p e r a t u r a con v a l o r e s c o m p r e n d i d o s e n t r e 0.21 mM (0°C) y 0 . 8 3 mM (3 8 ° C ) (30,64, La e n z i m a es i n h i b i d a p o r iones m e t á l i c o s c o m o A g + , C u + + y H g ++ y en f o r m a c o m p e t i t i v a por a r a b i n o s a y 2 - d e o x y - g l u c o s a . Los p r o d u c t o s de r e a c c i ó n g l u c o n o l a c t o n a y ^ ^ 0 ^ m u e s t r a n t a m b i é n un e f e c t o i n h i b i t o r i o s o b r e la a c t i v i d a d de la e n z i m a (30, 33). 8-La g l u c o s a o x í d a s a de A s p e r g í l l u s n í g e r no ha s i d o aún c r i s t a l i z a d a p e r o sí p r o c e s a d a h a s t a un a l t o g r a d o de p u r e z a m e d i a n te p r e c i p i t a c i ó n con s u l f a t o de a m o n i o , c r o m a t o g r a f í a de i n t e r c a m b i o i ó n i c o ( D E A E - c e l u l o s a ) ( p u n t o i s o e l é c t r i c o : A . 21) y c r o m a t o g r a f í a por t a m i z m o l e c u l a r ( S e p h a d e x G - 2 0 0 ) . La a c t i v i d a d e s p e c í f i c a del p r e p a r a d o p u r i f i c a d o d e t e r m i n a d o a 3 0°C y pH 5*6 en p r e s e n c i a de un e x c e s o de c a t a l a s a r e s u l t ó de 172 u m o l e s C
>2
c o n s u m i d o s / m i n / m g de p r o t e í n a ( 1 0 1 ) . 1 . A . A p l i c a c i o n e s de la g l u c o s a o x í d a s a Las v a r i a d a s a p l i c a c i o n e s q u e la e n z i m a ha e n c o n t r a d o f u n d a m e n t a l m e n t e en la i n d u s t r i a a l i m e n t a r i a han s i d o a m p l i a m e n t e d e s c r i p t a s y a n a l i z a d a s por S c o t t (8 A ) y S c h m i d t (86). En la a c t u a l i d a d n u e v a s e l a b o r a c i o n e s t e c n o l ó g i c a s c o n t i n ú a n en d e s a r r o l l o r e f l e j á n d o s e e s t e a s p e c t o en la a p a r i c i ó n de n u e v a s p a t e n t e s . B á s i c a m e n t e la r e a c c i ó n e n z i m á t i c a es u t i l i z a d a con los s i g u i e n t e s p r o p ó s i t o s : r e m o v e r g l u c o s a en p r e s e n c i a de un e x c e s o de o x í g e n o , r e m o v e r o x í g e n o en p r e s e n c i a de un e x c e s o de g l u c o s a , p r o d u c i r á c i d o g l u c ó n i c o y f o r m a r p e r ó x i d o de h i d r ó g e n o . Con r e l a c i ó n a la r e m o c i ó n de g l u c o s a , su p r i n c i p a l a p l i c a c i ó n e s t á d i r i g i d a a p r e v e n i r la r e a c c i ó n de M a i l l a r d d u r a n t e la e l a b o r a c i ó n de p r o d u c t o s d e s e c a d o s c o m o h u e v o s , p a p a s y c a r n e , y a la p r e p a r a c i ó n de b e b i d a s d i e t é t i c a s c o m o j u g o s de f r u t a , v i n o s y c e r v e z a . Por su p a r t e , la e l i m i n a c i ó n de o x í g e n o p a r a p r e s e r v a r p r o d u c t o s s e n s i b l e s ha d a d o l u g a r al m a y o r n ú m e r o de p a t e n t e s y p u b l i c a c i o n e s s o b r e el e m p l e o de la e n z i m a (en c o n j u n t o con c a t a l a s a ) en la t e c n o l o g í a de a l i m e n t o s . E n t r e las m á s i m p o r t a n t e s d e b e m o s m e n c i o n a r la p r e v e n c i ó n de r a n c i d e z en m a n t e c a s , a c e i t e s y m a y o n e s a ; e s t a b i l i z a c i ó n de b e b i d a s c í t r i c a s , v i n o sy
c e r v e z a ; ;en la p r e v e n c i ó n del e m p a r d e a m i e n t o de p r o d u c t o s c o n g e l a d o s c o m o c e r e z a s , d u r a z n o s y m a r i s c o s y en la c o e s t a b i l i z a c i ó n de á c i d o a s c ó r b i c o y c i a n o c o b a 1 a m i n a . Con r e l a c i ó n a la p r o d u c c i ó n de á c i d o g l u c ó n i c o , la e n z i m a se ha i n m o v i l i z a d o en una g r a n v a r i e d a d de s o p o r t e s con el fin de p r o d u c i r s o l u c i o n e s de e s t e á c i d o o sus s a l e s con un a l t o g r a d o de p u r e z a (l, AA, A8, 97). Se ha m e n c i o n a d o t a m b i é n la p o s i b i l i d a d de d e s a r r o l l a r n u e v o s p r o d u c t o s l á c t e o s a c t u a n d o en c o m b i n a c i ó n con la ^ - g a l a c t o s i d a s a(77)- D e n t r o del c a m p o a n a l í t i c o la c i n é t i c a de f o r m a c i ó n de g l u c ó n i c o ha s e r v i d o c o m o b a s e p a r a c a l c u l a r la v e l o c i d a d de
t r a n s f e r e n c i a de o x í g e n o en s i s t e m a s g a s - l í q u i d o (100). F i n a l m e n t e , y con r e l a c i ó n a la ú l t i m a a p l i c a c i ó n m e n c i o n a d a , d e b e m o s d e c i r q u e la c a p a c i d a d de la r e a c c i ó n e n z i m á t i c a de f o r m a r ha s i d o u t i l i z a d a c o m o b a s e p a r a el d e s a r r o l l o de u n a g r a n v a r i e d a d de t é c n i c a s d e s t i n a d a s a la d e t e r m i n a c i ó n c u a n t i t a t i v a de g l u c o s a . Las mas d i f u n d i d a s c o n s i s t e n en d e t e r m i n a r el p r o d u c i d o con un s i s t e m a e n z i m á t i c o i n d i c a d o r q u e c o n t i e n e p e r o x i d a s a ( E . C . 1 . 1 1 . 1 . 7 ) y s u s t a n c i a s o x i d a b l e s c r o m o g é n i c a s o f l u o r e s c e n t e s (25, 57, 80, 76, 88). A l t e r n a t i v a m e n t e el p u e d e ser v a l o r a d o a m p e r o m é t r i c a m e n t e (105). Una v a r i e d a d i n t e r e s a n t e de e s t a a p l i c a c i ó n es el d e s a r r o l l o de e l e c t r o d o s o s e n s o r e s e s p e c f i eos para g l u c o s a q u e c o n t i e n e n a la e n z i m a (31)- La a p l i c a c i ó n de e s t e m é t o d o e n z i m á t i c o en el d i a g n ó s t i c o c l í n i c o y p a r a la d e t e r m i n a c i ó n de g l u c o s a en una g r a n v a r i e d a d de f l u i d o s b i o l ó g i c o s , es en la a c t u a l i d a d de a m p l i a d i f u s i ó n . O t r a s a p l i c a c i o n e s p r o p u e s t a s son la p r o d u c c i ó n de o x í g e n o en p r e s e n cia de c a t a l a s a p a r a s a t i s f a c e r los r e q u e r i m i e n t o s de e n z i m a s i n m o v i l i z a d a s q u e c o n s u m a n 0^ (51) y c o m o a g e n t e b a c t e r i ó s t a t i c o en p a s t a s d e n t í f r i c a s (86). 1.5- V a l o r a c i ó n de la a c t i v i d a d e n z i m á t i c a Un a s p e c t o de f u n d a m e n t a l i m p o r t a n c i a en el e s t u d i o e n z i m o - l ó g i c o es c o n t a r con m é t o d o s a n a l í t i c o s a d e c u a d o s p a r a d e t e r m i n a r la a c t i v i d a d de las e n z i m a s . En el c a s o p a r t i c u l a r de la g l u c o s a o x i d a s a la m e d i d a de a c t i v i d a d p u e d e ser e f e c t u a d a por d i v e r s o s m é t o d o s , los c u a l e s i n c l u y e n m e d i d a s de c o n s u m o de o x í g e no, de p r o d u c c i ó n de á c i d o g l u c ó n i c o y de f o r m a c i ó n de p e r ó x i d o de h i d r ó g e n o . A c o n t i n u a c i ó n se r e a l i z a un b r e v e a n á l i s i s de las d i s t i n t a s p o s i b i l i d a d e s p r o p u e s t a s . - M e d i d a s de c o n s u m o de o x í g e n o . La v e l o c i d a d de c o n s u m o de 0 ^ p u e d e ser d e t e r m i n a d a e m p l e a n d o t é c n i c a s m a n o m é t r i c a s con r esp i rómet ros c o n v e n c i o n a l e s (9, 7 ,
8 5
) o b i e n con el u s o de e l e c t r o d o s de o x í g e n o (52, 101). En la r e a l i z a c i ó n de e s t e tipo de m e d i d a s es f u n d a m e n t a l c o n o c e r el d e s t i n o final del p r o d u c i d o ya q u e el m i s m o d e t e r m i n a r á en ú l t i m a i n s t a n c i a el c o n s u m o n e t o de o x í g e n o de la r e a c c i ó n e n z i m á t i c a . T e n i e n d o en c u e n t a q u e aún b a j o las c o n d i c i o n e s más f a v o r a b l e s p a r t e del H ^ O ^ g e n e r a d o se d e s c o m p o n e y q u e a d e m á s 1 0-los p r e p a r a d o s de g l u c o s a o x í d a s a c o n t i e n e n n o r m a l m e n t e c a t a l a sa, es r e c o m e n d a b l e q u e las m e d i d a s se e f e c t ú e n en p r e s e n c i a de un e x c e s o de e s t a e n z i m a p a r a a s e g u r a r n o s la total y r á p i d a d e s c o m p o s i c i ó n del ^
2^2
a m e d i d a q u e se p r o d u c e . B a j o e s t a s c o n d i c i o n e s y p a r a el c á l c u l o de la a c t i v i d a d es n e c e s a r i o c o n s i d e r a r q u e la c a t a l a s a r e c i c l a la m i t a d del0 ^
c o n s u m i d o en la r e a c c i ó n por lo cual la o x i d a c i ó n de un m i c r o m o l de g l u c o s a i m p l i c a el c o n s u m o de 0 , 5 mi c r o m o l e s de 0^ o sea 11,2p
1 de 0^ en CNTP. Por o t r a p a r t e es c o n o c i d o q u e la c a t a l a s a en p r e s e n c i a de ^ 2 ^ 2 y s u s t a n c i a s o x i d a b l e s c o m o c i e r t o s a l c o h o l e s p u e d e a c t u a r c o m o una p e r o x i d a s a o x i d a n d o el a l c o h o l a a l d e h i d o (43)- Esta r e a c c i ó n p u e d e r e p r e s e n t a r s e de la s i g u i e n t e m a n e r a : R - CH OH + H o cat_aj_asa_- R_ _ CH0
+2
H 2 0 La d e t e r m i n a c i ó n de g l u c o s a o x í d a s a p u e d e t a m b i é n ser r e a l i z a d a en p r e s e n c i a de c a t a l a s a y a l c o h o l ( g e n e r a l m e n t e e t a n o l ) p e r o en e s t e c a s o la o x i d a c i ó n de un m i c r o m o l de g l u c o s a da l u g a r a un c o n s u m o de 2 2 . 4 j j]
de 0^ (CNTP) d e b i d o al e m p l e o del *-*2^2
en e s t a r e a c c i ó n a c o p l a d a de o x i d a c i ó n (9, 43, 85) En el s i g u i e n t e e s q u e m a de r e a c c i o n e s se r e s u m e n las tres s i t u a c i o n e s p o s i b l e s b a j o las c u a l e s p u e d e n r e a l i z a r s e las d e t e r m i n a c i o n e s : O x i d a c i ó n de la g l u c o s a en p r e s e n c i a de g l u c o s a o x í d a s a : C 6 H 1 2 ° 6 + H 2° + °2 C6H 1207 + H2°2 O x i d a c i ó n de la g l u c o s a en p r e s e n c i a de g l u c o s a o x í d a s a y c a t a l a s a : C 6 H 1 2 0 6 + ,/2 °2 --- C 6 H 1 2 ° 7 O x i d a c i ó n de la g l u c o s a en p r e s e n c i a de g l u c o s a o x í d a s a , c a t a l a s a y e t a n o l : C 6 H 12°6 + °2 + c h3 C H 2 0H --- C 6 H 1 2 0 7 + C H 3 CH0 + H 2° ^6
^12^6
’ D - g l u c o s a , : á c i d o g l u c ó n i c o C C Hg 0 H :e t a n o 1 , C H I C H O : a c e t a l d e h i d oDe a c u e r d o a lo m e n c i o n a d o s u r g e la n e c e s i d a d de e s t a b l e c e r con e x a c t i t u d b a j o q u é c o n d i c i o n e s se r e a l i z a la m e d i d a , a fin de a s e g u r a r n o s q u e los v a l o r e s de c o n s u m o 0^ s e a n e s t e - quí o m é t r i c o s con la c a n t i d a d de s u s t r a t o ( g l u c o s a ) t r a n s f o r m a d o .
Las m e d i d a s de c o n s u m o de
0 ^
son p r e c i s a s y de g r a n sens_|_ b i l i d a d (0,02 a 0,5 U . l . * ) p e r o son d e s v e n t a j o s a s en el sent_i_ do de q u e i n s u m e n t i e m p o y son t e d i o s a s c u a n d o es n e c e s a r i o p r o c e s a r un g r a n n ú m e r o de m u e s t r a s . - M e d i d a de la p r o d u c c i ó n de á c i d o g l u c ó n i c o . El m é t o d o p r o p u e s t o por U n d e r k o f l e r (102) se b a s a s i m p l e m e n t e en t i t u l a r el á c i d o g l u c ó n i c o p r o d u c i d o l u e g o de un d e t e r m i n a d o t i e m p o de r e a c c i ó n . El p r o c e d i m i e n t o es s i m p l e y p r á c t i c o p e r o p o c o s e n s i b l e (5 a 25 U . l . * ) y a d i f e r e n c i a del m é t o d o m a n o m é t r i c o no es n e c e s a r i o c o n s i d e r a r la p r e s e n c i a de c a t a l a s a . Se ha m e n c i o n a d o c o m o una p o s i b l e f u e n t e de e r r o r en la d e t e r m i n a c i ó n , la c i n é t i c a de h i d r ó l i s i s de la g l u c o n o - 1 a c t o n a . - M e d i d a de la f o r m a c i ó n de p e r ó x i d o de h i d r ó g e n o . Las d i s t i n t a s a l t e r n a t i v a s p r o p u e s t a s p a r a m e d i r la v e l o c i d a d de f o r m a c i ó n de ^ 2 ^ 2 SOn ^ a s s ' 9 u 'e n t e s ; 1. D e t e r m i n a c i ó n a m p e r o m é t r i ca del\ ^
f o r m a d o por la a c c i ó n del ^ ^ 0 ^ s o b r e el i o d u r o (70).2
3k
D e t e r m i n a c i ó n p o t e n c i o m é t r i c a de la d i s m i n u c i ó n de SC>2
p r o d u c i d o por la a c c i ó n D e t e r m i n a c i ó n f l u o r i m é t r i c a d a s a y s u s t a n c i a s o x i d a b l e s D e t e r m i n a c i ó n c o l o r imét r ica d a s a y s u s t a n c i a s o x i d a b l e s del^ 2 ^ 2
s o ^ re S O ^ H (3) en p r e s e n c i a de p e r o x i - f l u o r e s c e n t e s (76,' 81). en p r e s e n c i a de p e r o x i - c r o m o g é n i c a s (5^, 60, 98)-La s e n s i b i l i d a d de e s t a s t é c n i c a s es c o m p a r a b l e a las m e d i d a s de c o n s u m o de 0^ p e r o p r e s e n t a n la v e n t a j a de una m a y o r r a p i d e z en a d e t e r m i n a c i ó n . Ul : U n i d a d e s I n t e r n a c i o n a l e s * 1 2-1 . 6 O b t e n c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a El m é t o d o de p r o d u c c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a lo c o n s t i t u y e la c l a s i c a f e r m e n t a c i ó n en c u l t i v o s u m e r g i d o . De a c u e r d o a la b i b l i o g r a f í a el s i s t e m a de c u l t i v o e m p l e a d o casi con e x c l u s i v i d a d es el " b a t c h " y a e x c e p c i ó n del t r a b a j o de N o v a k (66) su p r o d u - c i ó n en s i s t e m a c o n t i n u o no ha s i d o m e n c i o n a d a . En A s p e r g i l l u s y en Pe n i c i 1 1 um la e n z i m a es de c a r á c t e r i n d u c i b l e y su f o r m a c i ó n p o r el h o n g o es m a r c a d a m e n t e d e p e n d i e n t e de la c o m p o s i c i ó n del m e d i o de c u l t i v o s i e n d o de p a r t i c u l a r i m p o r t a n c i a la i n f l u e n c i a de las f u e n t e s de c a r b o n o y n i t r ó g e n o (26, 27» 28, 29). Al igual q u e en o t r o s p r o c e s o s f e r m e n t a t i v o s la c o m p o s i c i ó n del m e d i o de c u l t i v o y las c o n d i c i o n e s de o p e r a c i ó n ó p t i m a s p a r a su p r o d u c c i ó n d e p e n d e n de los r e q u e r i m i e n t o s p a r t i c u l a r e s de c a d a c e p a (27, 28, 65, 69). La e n z i m a es de n a t u r a l e z a i n t r a c e l u l a r p e r o un a s p e c t o i m p o r t a n t e d i s t i n g u e la f e r m e n t a c i ó n con a m b o s g é n e r o s de h o n g o s . En As pe rg i 1 1 us la m i s m a es e x t r a í d a del m i c e l i o g e n e r a l m e n t e con el e m p l e o de m é t o d o s f í s i c o s o m e c á n i c o s de r u p t u r a c e l u l a r e n t r e los q u e se d e s t a c a por su e f i c i e n c i a la a g i t a c i ó n con a b r a s i v o s (55, 107, 109). En c a m b i o con P e n i c i 1 1u m la p r o g r e s i v a a u t o l i s i s q u e s u f r e el m i c r o o r g a n i s m o en el t r a n s c u r s o del p r o c e s o h a c e q u e su r e c u p e r a c i ó n sea f i n a l m e n t e e f e c t u a d a a p a r t i r del m e d i o de c u l t i v o , a s e m e j á n d o s e en e s t e a s p e c t o a la p r o d u c c i ó n de e n z i m a s e x t r a c e l u l a r e s (85). E s t a s d i f e r e n c i a s t i e n e n su i n c i d e n c i a en los t i e m p o s de p r o c e so q u e n e c e s i t a n e s t a s c e p a s p a r a a l c a n z a r sus m á x i m o s r e n d i m i e n t o s . Las f e r m e n t a c i o n e s con As pe rg i 1 1 us o s c i l a n e n t r e 16 y
2b
h o r a s , en c a m b i o con Pe n i c i 1 1 um los p e r í o d o s son m á s p r o l o n g a d o s , a l r e d e d o r de 60 h s . (55, 65, 1 08). Los m e c a n i s m o s b i o q u í m i c o s q u e r e g u l a n la s í n t e s i s de g l u c o s a o x i d a s a en e s t o s h o n g o s f i l a m e n t o s o s no han s i d o e l u c i d a dos en su t o t a l i d a d . A l g u n a s a p r e c i a c i o n e s han s i d o r e a l i z a d a s a p a r t i r del c o m p o r t a m i e n t o o b s e r v a d o en la f e r m e n t a c i ó n g 1ucó_ n i c a p a r t i c u l a r m e n t e con As pe rg i 1 1us N i ge r . Se c o n s i d e r a q u e la p r o d u c c i ó n de á c i d o g l u o ó n i c o es la e x p r e s i ó n f e n o t í p i c a de lo q u e se ha d e n o m i n a d o m e t a b o l i s m o por s o b r e f l u j o ( o v e r f l o w m e t a b o l i sm) de los c a r b o h i d r a t o s (17, 2*0. El c o n c e p t o suyacen_ te en e s t a d e f i n i c i ó n es el s i g u i e n t e : b a j o d e t e r m i n a d a s cond_[_ c i o n e s de c u l t i v o el h o n g o r e c i b e un a p o r t e de c a r b o h i d r a t o q u es u p e r a su c a p a c i d a d de u t i l i z a r l o c o m o f u e n t e de e n e r g í a y b i o - m a s a , d e r i v a n d o de e s t a m a n e r a una f r a c c i ó n del m i s m o h a c i a la f o r m a c i ó n de g l u c ó n i c o el cual es s e g r e g a d o al e x t e r i o r y a c u m u l ado en el m e d i o de c u l t i v o . La i m p o s i c i ó n de e s t e s o b r e f l u j o p u e d e ser l o g r a d o m e d i a n t e el m a n e j o c o n v e n i e n t e de n u m e r o s o s f a c t o r e s c o m o la c o n c e n t r a c i ó n de la f u e n t e de c a r b o n o , el pH, etc. A m o d o dé e j e m p l o p o d e m o s m e n c i o n a r q u e c u a n d o el h o n g o se c u l t i v a en un m e d i o con a d e c u a d o b a l a n c e de m i n e r a l e s y f u e n t e de n i t r ó g e n o , e n p r e s e n c i a de b a j a s c o n c e n t r a c i o n e s de f u e n t e de c a r b o n o c o m o p u e d e n ser 0 , 5 % ó 1%, el m i s m o c r e c e r á s i n t e t i z a n ^ do m a t e r i a l c e l u l a r con una n u l a o í n f i m a f o r m a c i ó n de á c i d o oj^ g á n i c o . P e r o al i n c r e m e n t a r la c o n c e n t r a c i ó n de a z ú c a r al 5% ó 10%, una i m p o r t a n t e f r a c c i ó n de la m i s m a a p a r e c e r á c o m o á c i d o o r g á n i c o en el m e d i o de c u l t i v o . De igual m a n e r a si en el p r i m e ro de los c a s o s el c r e c i m i e n t o es i m p e d i d o o s e r i a m e n t e l i m i t a d o por a u s e n c i a o d é f i c i t de a l g ú n c o m p o n e n t e del m e d i o , la f u e n t e de c a r b o n o s e r á c o n v e r t i d a en á c i d o o r g á n i c o en una a l t a p r o p o r c i ó n . Un c o m p o r t a m i e n t o s i m i l a r es o b s e r v a d o en r e l a c i ó n a la f o r m a c i ó n de o t r o s á c i d o s o r g á n i c o s c o m o son c í t r i c o , o x á l i c o , f u m á r i c o , e t c . (24, 96). De e s t a m a n e r a y con un c o r r e c t o m a n e j o del m e d i o de c u l t i v o y de las c o n d i c i o n e s de o p e r a c i ó n se han a l c a n z a d o c o n v e r s i o n e s de h a s t a un 9 0 % y 1 0 0 % a p a r t i r de s o l u c i o n e s c o n t e n i e n d o e n t r e 15% y
30
% de c a r b o h i d r a t o (16, 42, 96). C a b e m e n c i o n a r q u e en g e n e r a l la p r o d u c c i ó n de un á c i d o o r g á n i co por e s t a s c e p a s de A s p e r g i l l u s N i g e r no es e x c l u y e n t e de la f o r m a c i ó n de o t r o . D e p e n d i e n d o de las c o n d i c i o n e s de c u l t i v o y de la e s p e c i f i c i d a d de la c e p a , es c o m ú n o b s e r v a r la a c u m u l a c i ó n de g l u c ó n i c o , c í t r i c o u o x á l i c o (24). E s t e c o m p o r t a m i e n t o d e m u e s t r a la v e r s a t i i l i d a d del m e t a b o l i s m o de los h o n g o s y la n e c e s i d a d de e s t a b l e c e r con l í m i t e s p r e c i s o s las c o n d i c i o n e s ó p t i m a s de p r o c e s o s e g ú n sea el p r o d u c t o de n u e s t r o i n t e r é s . El á c i d o g l u c ó n i c o una vez p r e s e n t e en el m e d i o de c u l t i v opue_
de ser u t i l i z a d o por el m i c r o o r g a n i s m o c o m o f u e n t e de c a r b o n o lo cual g e n e r a l m e n t e o c u r r e c u a n d o la f u e n t e o r i g i n a l se ha c o n s u m i d o en su m a y o r p a r t e ( 5 3 ) * A l g u n o s e s t u d i o s b i o q u í m i c o s han d e m o s t r a d o q u e la d e g r a d a c i ó n del g 1 ucona.to p u e d e ser r e a l i z a d a por d i v e r s o s c a m i n o s m e t á b o l i c o s q u e c o n d u c e n a i n t e r m e d i a r i o s de la vía g 1 ¡ e o l í t i c a (21, 40). P o d e m o s d e c i r e n t o n c e s q u e la c a p a c i d a d g e n é t i c a de s i n t e t i z a r g l u c o s a o x i d a s a por
e s t o s h o n g o s es un r e c u r s o del cual d i s p o n e n c u a n d o por d i v e r sas c a u s a s se e n c u e n t r a n en un m e d i o d e s b a l a n c e a d o q u e no les p e r m i t e a p r o v e c h a r con total e f i c i e n c i a la f u e n t e de c a r b o n o , o b l i g á n d o s e a d e r i v a r la m i s m a h a c i a la f o r m a c i ó n de g l u c ó n i - co. Por lo t a n t o se p u e d e e s t a b l e c e r en p r i n c i p i o c i e r t a s a n a l o g í a s e n t r e la f e r m e n t a c i ó n g l u c ó n i c a y el p r o c e s o de o b t e n c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a ya q u e e v i d e n t e m e n t e la p r i m e r a de e l l a s r e q u i e r e la p r e s e n c i a a c t i v a de la e n z i m a en las c é l u l a s del h o n g o . Sin e m b a r g o c a b e h a c e r la s i g u i e n t e c o n s i d e r a c i ó n ; en la p r o d u c c i ó n de g l u c ó n i c o el o b j e t i v o es o b t e n e r la m a y o r c o n v e r s i ó n p o s i b l e de la f u e n t e de c a r b o n o en á c i d o o r g á n i c o lo cual c o n d u c e n e c e s a r i a m e n t e a una r e d u c i d a f o r m a c i ó n de bio^ m a s a . En c a m b i o c u a n d o e l p r o c e s o es e n f o c a d o h a c i a la p r o d u c c i ó n de e n z i m a c o n s i d e r a n d o e s t a c o m o un p r o d u c t o i n t r a c e l u l a r c o m o en el c a s o de la f e r m e n t a c i ó n con A s p e r g i l l u s N i g e r , es n e c e s a r i o t e n e r - e n c u e n t a q u e los r e n d i m i e n t o s s e r á n f u n c i ó n no s ó l o del c o n t e n i d o de g l u c o s a o x i d a s a de la b i o m a s a s i n o t a m b i é n de la c o n c e n t r a c i ó n de d i c h a b i o m a s a en el m e d i o de c u l t i v o . En e s t a s i t u a c i ó n se d e b e b u s c a r un c o m p r o m i s o e n t r e a m b o s p a r á m e t r o s p a r a q u e el p r o c e s o no sea a n t i e c o n ó m i c o y es por e l l o q u e las c o n d i c i o n e s q u e r e s u l t e n m á s f a v o r a b l e s para
la p r o d u c c i ó n de la e n z i m a no d e b e n ser n e c e s a r i a m e n t e las m i s_ mas q u e las e s t a b l e c i d a s p a r a una ó p t i m a f e r m e n t a c i ó n g l u c ó n i c a
1.7 D e s a r r o l l o del t r a b a j o
P a r a r e a l i z a r el p r e s e n t e t r a b a j o se e m p l e o la c e p a de A s p e r g i l l u s n i g e r N R R L 3 p r o d u c t o r a de á c i d o g l u c ó n i c o y p o r lo
t a n t o f u e n t e p o t e n c i a l de g l u c o s a o x i d a s a (16). En la p r i m e r a p a r t e se e s t u d i ó un m é t o d o c o 1or i m é t r i co p a r a la d e t e r m i n a c i ó n de la a c t i v i d a d e n z i m á t i c a el cual por su fácil r e a l i z a c i ó n y s i m p l i c i d a d r e s u l t ó s u m a m e n t e a d e c u a d o c o m o t é c n i c a de r u t i n a Las e x p e r i e n c i a s del p r o c e s o f e r m e n t a t i v o se i n i c i a r o n con la s e l e c c i ó n de un m é t o d o de e x t r a c c i ó n de la e n z i m a y con los en_ s a y o s en f r a s c o s a g i t a d o s d o n d e se i n v e s t i g ó la i n f 1 li e n c í a de
la c o m p o s i c i ó n del m e d i o de c u l t i v o s o b r e la p r o d u c c i ó n e n z i m á tica. F i n a l i z a d o s e s t o s ensaye.s se e s t u d i ó la o p e r a c i ó n de e x t r a c c i ó n a e f e c t o s de e s t a b l e c e r las c o n d i c i o n e s ó p t i m a s de
p r o c e s a m i e n t o de las c é l u l a s del h o n g o . Por u l t i m o se u t i l i z a ron f e r m e n t a d o r e s con a g i t a c i ó n m e c á n i c a en u n a e s c a l a de c u a tro l i t r o s d o n d e se a n a l i z ó la i n f l u e n c i a de d i v e r s a s v a r i a b l e s de o p e r a c i ó n en los r e n d i m i e n t o s de la f e r m e n t a c i ó n .
-2. M A T E R I A L E S Y M E T O D O S
2. 1 M í c roo rgan ísmo
2 . 1 . 1 . C e p a e m p l e a d a en los e s t u d i o s Se e m p l e ó c o m o m i c r o o r g a n i s m o p r o d u c t o r de e n z i m a la cepa de A s p e r g í l l u s n i g e r N R R L 3 p r o v i s t a por el N o r t h e r n R e g i o n a l R e s e a r c h C e n t e r ( U . S . D e p a r t m e n t of A g r i c u l t u r e ) . 2 . 1 . 2 . C o n s e r v a c i ó n de la c e p a La c e p a se r e c i b i ó c o m o e s p o r o s 1 i o f i 1 i z a d o s , los c u a l e s se r e s u s p e n d i e r o n en s o l u c i ó n f i s i o l ó g i c a y se s e m b r a r o n en el m e d i o 1 . L u e g o de i n c u b a r a 3 0 ° C d u r a n t e 6 d í a s la n u e v a g e n e r a c i ó n de e s p o r o s se r e c o l e c t ó de los d e s a r r o l l o s con s o l u c i ó n f i s i o l ó g i c a c o n t e n i e n d o 0 . 0 1 % de T w e e n 80. Una f r a c c i ó n de la s u s p e n s i ó n o b t e n i d a se la l i o f i l i z ó en s u e r o de c o n e j o o s u e r o de e q u i n o p a r a el m a n t e n i m i e n t o de los e s p o r o s por p e r í o d o s p r £ l o n g a d o s de t i e m p o (36, 68). O t r a f r a c c i ó n se la l l e v ó a una c o n c e n t r a c i ó n de g l i c e r o l del 15% v / v y se la c o n g e l ó e n . p e q u e ñas a m p o l l a s a la t e m p e r a t u r a de - 2 0 ° C e m p l e á n d o s e e s t o s e s p o
ros p a r a la p r e p a r a c i ó n de los c u l t i v o s de t r a b a j o por un t i ern po m á x i m o de 6 m e s e s . T r a n s c u r r i d o d i c h o p e r í o d o se t o m ó un 1 i o_ f i 1 i z a d o y se r e p i t i ó el p r o c e d i m i e n t o , es d e c i r , se o b t u v i e r o n n u e v o s e s p o r o s s e m b r a n d o el m e d i o 1 con los c u a l e s se p r e p a r ó una n u e v a s e r i e en g l i c e r o l . E s t e p r o c e d i m i e n t o p e r m i t i ó un c o r r e c t o m a n e j o de la c e p a p r e s e r v a n d o de e s t a m a n e r a su c a p a c i dad f e r m e n t a t i v a . 2.2. M e d i o s de c u l t i v o 2 . 2 . 1 . M e d i o de p r o d u c c i ó n de e s p o r o s ( m e d i o N ° 1) k h2p o/4 ---M g S O ^ . 7 H 2 0 C a C 0 ^ ---A g a r ---A g u a d e s t i l a d a c . s . p . G l u c o s a P e p t o n a N H , NO _ H 3 3.0 g 0 . 0 2 5 g 0 . 0 2 5 g 0 . 0 1 2 g 0 . 0 1 0 g 0. A g 2 . 5 g 100 mi El pH del m e d i o es de 6 . ^ 0 h i d r o l i z a d o p e p s í n i c o de h í g a d o de c e r d o
2 . 2 . 2 . M e d i o b a s e de f e r m e n t a c i ó n ( m e d i o N°2) C o m o m e d i o b a s e p a r a el d e s a r r o l l o del p r o c e s o f e r m e n t a t i v o se e m p l e o una m o d i f i c a c i ó n del m e d i o de M u l l e r (27) c u y a c o m p o s i c i ó n es la s i g u i e n t e : S a c a r o s a --- 5 . 0 g C a ( N
0 3
)2
.**H2 0
---0 . 2
g K H2
P O¿4
---0 . 0 2 5
g M g S O ^ . 7 H 0. --- 0 . 0 2 5 g KC 1 --- 0 . 0 2 5 g A c i d o c í t r i c o m o n o h i d r a t o --- 0 . 0 7 5 g Fe C 1 .6
H 0 --- 0 . 0 0 2 g M a c e r a d o de m a í z ( s ó l i d o ) --- 1.0 g A g u a d e s t i l a d a c . s . p . --- 100 mi El pH del m e d i o se a j u s t a al v a l o r *4.50. 2.3 D e t e r m i n a c i o n e s anal í t i c a s 2 . 3 - 1- R e c u e n t o de e s p o r o sSe real izó en una c á m a r a de r e c u e n t o c e l u l a r del t i p o N e u b a u e r 2 . 3 - 2. P e s o s e c o El c o n t e n i d o de m a t e r i a s e c a del m i c e l i o o de un v o l u m e n d e t e r m i n a d o de la s u s p e n s i ó n de c é l u l a s d e s i n t e g r a d a s se d e t e r m i n ó en e s t u f a a 1 0 5 ° C h a s t a p e s a d a c o n s t a n t e . 2 . 3 - 3- M e d i d a de pH La m i s m a fue e f e c t u a d a u t i l i z a n d o un p e a c h í m e t r o M e t r o h m E 396 2 . 3 • *+ • M e d i d a del o x í g e n o di s u e l t o Se r e a l i z ó por m e d i o de un e l e c t r o d o g a l v á n i c o m a r c a B i o t e e . Se e x p r e s a en f o r m a r e l a t i v a c o m o p o r c e n t a j e del v a l o r inicial p r e s e n t e en el c u l t i v o q u e se toma c o m o 100% de s a t u r a c i ó n . 2 . 3 - 5- C o n s u m o de o x í g e n o en el f e r m e n t a d o r Se e s t i m ó por un b a l a n c e de m a t e r i a c o n s i d e r a n d o el p o r c e n t a je de 0 2 en los g a s e s de e n t r a d a y s a l i d a del f e r m e n t a d o r . Se e m p l e ó la s i g u i e n t e f ó r m u l a . veo = £ (0 - 0 ) x 6 0 0 V e s 1 8
-V C O : -V e l o c i d a d de c o n s u m o de 0 o ( ^2 )
1
1 x h F : C a u d a l de a i r e s u m i n i s t r a d o al c u l t i v o (■'- . -a-' r e ) m i n u t o V : V o l u m e n de c u l t i v o (l)0
^ ^ ^ s : ^o r c e n t a J e de^2
en ^ ° s9
a s e s9
ue e n t r a n y s a l e n del f e r m e n t a d o r r e s p e c t i v a m e n t e Los p o r c e n t a j e s de 0^ se m i d i e r o n en un a n a l i z a d o r B e c k m a n m o d e l o 0 M - 1k
2 . 3 * 6 . M e d i d a del c o n s u m o de s a c a r o s a Se e f e c t u ó en el f i l t r a d o del c u l t i v o e m p l e a n d o el m é t o d o de H y v a r i n e n y N i k k i l a (39) p r e v i a h i d r ó l i s i s en HCL 1 , 2 5 % ( c o n c e n t r a c i ó n f i n a l ) en b a ñ o m a r t a d u r a n t e 15 m i n u t o s . 2 . 3 * 7 * M e d i d a del c o n s u m o de n i t r a t o Se e f e c t u ó en el f i l t r a d o del c u l t i v o e m p l e a n d o el m é t o d o c o 1 o r i m é t r i c o de Lees y Q u a s t e l (66). 2 . 3 * 8 * D e t e r m i n a c i ó n de p r o t e í n a s La c o n c e n t r a c i ó n de p r o t e í n a s o l u b l e en los e x t r a c t o s celj¿ l a r e s se d e t e r m i n ó por el m i c r o m é t o d o de B i u r e t en el u 1 t rav i o leta s e g ú n I t z h a k i R. (Al). C u a n d o la d e t e r m i n a c i ó n se r e a l i z ó s o b r e la s u s p e n s i ó n c e l u l a r , la m i s m a fue p r e v i a m e n t e d i l u i d a a una c o n c e n t r a c i ó n a p r o x i m a d a de 1 m g / m l de m a t e r i a s e c a y t r a t a d a con N a O H 1 N ( c o n c e n t r a c i ó n f i n a l ) a 1 0 0 ° C d u r a n t e 5 m i n u tos para su d i g e s t i ó n (37). L u e g o se p r o c e d i ó a c e n t r i f u g a r y d e t e r m i n a r en el s o b r e n a d a n t e la c o n c e n t r a c i ó n de p r o t e í n a por el m é t o d o m e n c i o n a d o . 2 . 3 * 9 * M e d i d a de la v e l o c i d a d de a b s o r c i ó n de o x í g e n o (VAO)El v a l o r de VAO en los t e r m e n t a d o r e s con a g i t a c i ó n m e c á n i c a y del s i s t e m a de f r a s c o s a g i t a d o s se c a l c u l ó en b a s e al m é t o d o de C o o p e r . ( 1 ^4) .
2 . 3 . 1 0 » C r o m a t o g r a f í a en pape) de á c i d o s o r g á n i c o s
Se l l e v o a c a b o por la t é c n i c a d e s c e n d e n t e con papel W h a t m a n N°3 y e m p l e a n d o c o m o s o l v e n t e de d e s a r r o l l o n - B u t a n o l , a c i d o f ó r m i c o y a g u a en r e l a c i ó n 1 0 : 7 : 1 0 (53). C o m o r e v e l a d o r se u t i l i z ó una s o l u c i ó n de e t a n o l (50%) c o n t e n i e n d o
5%
de x i l o s a y 5 % de a n i l i n a (92). La c r o m a t o g r a f í a de las m u e s t r a s del c u l t i v o f u e r o n r e a l i z a d a s en el f i l t r a d o , el cual p r e v i a m e n t e se a c i d i f i c ó con HC1 p a r a d e s o l v e r los c r i s t a l e s f o r m a d o s d u r a n t e la f e r m e n t a c i ó n y c e n t r i f u g ó para e l i m i n a r t o d o r e s t o de s e d i m e n t o . Del s o b r e n a d a n t e se s e m b r a r o n d i r e c t a m e n t e 5 yj 1 s o b r e el papel y se r e a l i z ó la c o r r i d a d u r a n t ea k
h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e . En f o r m a p a r a l e l a se c o r r i e r o n los á c i d o s p a t r o n e s (100j j g )
c o m o ser g l u c ó n i c o , c í t r i c o y o x á l i c o . La l o c a l i z a c i ó n de los á c i d o s se r e a l i zó i m p r e g n a n d o el papel con la s o l u c i ó n r e v e l a d o r a y c a l e n t a n d o b r e v e m e n t e a 1 0 5 ° C (92). 2 . 3 * 1l
. D e t e r m i n a c i ó n de g l u c o s a o x i d a s a L u e g o de a n a l i z a r las d i s t i n t a s a l t e r n a t i v a s p r o p u e s t a s p ara v a l o r a r la a c t i v i d a d e n z i m á t i c a ( í t e m 1:5) se c o n s i d e r ó i n t e r e s a n t e u t i l i z a r el m é t o d o c o l o r i m é t r i c o q u e c o n s i s t e en m e d i r la v e l o c i d a d de f o r m a c i ó n de^
2^ 2
con p e r o x i d a s a y una s u s t a n c i a o x i d a b l e c r o m o g é n i c a . En su e l e c c i ó n se t o m ó en c u e n t a q u e la b i b l i o g r a f í a m e n c i o n a su a p l i c a c i ó n a la d e t e r m i n a c i ó n de la e n z i m a en e x t r a c t o s c e l u l a r e s de A s p e r g í l u s n iger ( 6 0 , 9 8 ) c o m o a la c o n v e n i e n c i a de no r e q u e r i r e q u i p o s e s p e c i a l e s p a r a su r e a l i z a ción y a la s e n s i b i l i d a d y s e n c i l l e z de p r o c e d i m i e n t o q u e i m p l i ca e s t e t i p o de m é t o d o . Sin e m b a r g o y d e b i d o a q u e los a u t o r e s e m p l e a n e s t a d e t e r m i n a c i ó n b a j o c o n d i c i o n e s de e n s a y o m u y d i f e r e n t e s y se l i m i t a n a dar una d e s c r i p c i ó n p a r c i a l del d e s a r r o llo de la t é c n i c a , r e s u l t ó n e c e s a r i o e s t u d i a r con m a y o r d e t a l l e el m é t o d o c o l o r i m é t r i c o a fin de e s t a b l e c e r una m e t o d o l o g í a c o n f i a b l e y p r e c i s a p a r a su u t i l i z a c i ó n . Las e x p e r i e n c i a s q u e se r e a l i z a r o n con tal fin se i n c l u y e n en r e s u l t a d o s e x p e r i m e n t a l e s
( í t e m 3-1) d e s c r i b i é n d o s e en la p r e s e n t e s e c c i ó n el f u n d a m e n t o del m é t o d o y las c o n d i c i o n e s f i n a l e s e s t a b l e c i d a s p a r a la r e a l i z a c i ó n de la m e d i d a . F u n d a m e n t o de la d e t e r m i n a c i ó n . Se m e n c i o n ó a n t e r i o r m e n t e q u e el
^
2® 2
^0
r m a ^ o P or Ia a c c i ó n de la g l u c o s a o x i d a s a es d e t e r m i n a d o c o l o r i m é t r i c a m e n t e m e d i a n t e 2 0-el e m p l e o de un s i s t e m a e n z i m á t i c o a c o p l a d o q u e c o n t i e n e peroxj_ d a s a y una s u s t a n c i a o x i d a b l e c r o m o g é n í ca . Por lo t a n t o el prlncj_ p í o en qu e se f u n d a m e n t a la m e d i d a es el m i s m o q u e el e m p l e a d o p a r a la d e t e r m i n a c i ó n c u a n t i t a t i v a de g l u c o s a con r e a c t i v o s s i m i l a r e s (25, ^7, 57)* La d i f e r e n c i a r e s i d e en q u e las c o n d i c i o nes del e n s a y o se a d a p t a n p ara q u e la v e l o c i d a d de la r e a c c i ó n c o l o r ¡ m é t r i c a sea f u n c i ó n de la a c t i v i d a d de g l u c o s a o x i d a s a . La s e c u e n c i a de r e a c c i o n e s es la s i g u i e n t e : R e a c c i ó n p r i n c i p a l ( g l u c o s a o x i d a s a ) C 6 H 1 2 0 6 + °2 + H 2° C 6 H 1 2 0 7 + H 2°2 R e a c c i ó n i n d i c a d o r a ( p e r o x i d a s a , d o n o r ) :