Inmunofenotipo en Leucemias Agudas

Contribución y avances del laboratorio en el

diagnóstico y seguimiento de Leucemias Agudas

Inmunofenotipo en Leucemias Agudas

Dra. Evangelina Agriello

MÉDULA ÓSEA NORMAL

MÉDULA ÓSEA NORMAL

PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS

CD34+

CD45-PERCP

PRECURSORES HEMATOPOYÉTICOS CD34+

COMPROMISO HACIA LOS DISTINTOS LINAJES

CELULARES

HSC

Estrategia de procesamiento de muestras

para diagnóstico hematológico

Punción Aspiración con Aguja Fina

médula ósea sangre periférica LCR

HEPARINA

EDTA

EDTA TRANSFIX

entidades clínico biológicas

THE UPDATED WHO CLASSIFICATION OF HEMATOLOGICAL MALIGNANCIES

The 2016 revision to the World Health Organization

classification of myeloid neoplasms and acute leukemia

Daniel A. Arber,1 Attilio Orazi,2 Robert Hasserjian,3 J¨urgen Thiele,4 Michael J. Borowitz,5

Michelle M. Le Beau,6Clara D. Bloomfield,7 Mario Cazzola,8 and James W. Vardiman9

CITOMETRIA DE

FLUJO

PANEL DE SCREENING PANEL AMPLIADO DE IDENTIFICACION

ESTUDIO

CITOGENÉTICO

CELULAS LISADAS FIJADAS

CELULAS DEL CITOGENETICO

BIOLOGIA

MOLECULAR

ARN TRIZOL(alto costo)

ADN

Punción Aspiración con Aguja Fina

médula ósea sangre periférica LCR

HEPARINA

EDTA TRANSFIX

EDTA

FISH

SIEMPRE!!!

20 METAFASES!!

CITOMETRIA DE FLUJO

PANEL DE SCREENING

PANEL AMPLIADO

DE IDENTIFICACION

ESTUDIO CITOGENÉTICO

FISH

BIOLOGIA MOLECULAR

p190,p210

FLT3

NPM1

cKit

CEBPA

PML RAR

t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1 t(v;11q23.3);KMT2A t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1 t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1 t(8;21)(q22;q22.1);RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22);CBFB-MYH11 PML-RARA t(9;11)(p21.3;q23.3);MLLT3-KMT2A t(6;9)(p23;q34.1);DEK-NUP214 inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM hyperdiploidy hypodiploidy Punción Aspiración con Aguja Fina

médula ósea sangre periférica LCR

HEPARINA

EDTA

EDTA TRANSFIX

ANTICOAGULANTE CITOMETRIA DE

FLUJO

FISH

CITOGENETICO

BIOLOGIA

MOLECULAR

HEPARINA

X

X

X

EDTA

X

X

X

Anticoagulantes para el procesamiento

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, NOS

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1 B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1 B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hyperdiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hypodiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1 Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, BCR-ABL1–like Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with iAMP21

T-lymphoblastic leukemia/lymphoma

Provisional entity: Early T-cell precursor lymphoblastic leukemia

Provisional entity: Natural killer (NK) cell lymphoblastic leukemia/lymphoma

Acute leukemias of ambiguous lineage Acute undifferentiated leukemia

Mixed phenotype acute leukemia (MPAL) with t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1 MPAL with t(v;11q23.3); KMT2A rearranged

MPAL, B/myeloid, NOS MPAL, T/myeloid, NOS

2016

R

E

V

I

S

I

O

N

WHO

ESTRATEGIA DE SCREENING

4 colores

Panel de anticuerpos para la LLA

de células Precursoras B

Panel de anticuerpos para la LLA

de células Precursoras B

t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

t(12;21) ETV6-RUNX1

DNA

Index

t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

t(9;22);BCR-ABL1

t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1

t(1;19);TCF3-PBX1

hyperdiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, NOS

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hyperdiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hypodiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1 Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, BCR-ABL1–like Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with iAMP21

T-lymphoblastic leukemia/lymphoma

Provisional entity: Early T-cell precursor lymphoblastic leukemia

Provisional entity: Natural killer (NK) cell lymphoblastic leukemia/lymphoma

Acute leukemias of ambiguous lineage Acute undifferentiated leukemia

Mixed phenotype acute leukemia (MPAL) with t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1 MPAL with t(v;11q23.3); KMT2A rearranged

MPAL, B/myeloid, NOS MPAL, T/myeloid, NOS

2016

R

E

V

I

S

I

O

N

WHO

V450 V500 FITC PE PerCPC5.5 PECy7 APC APC H7

cyCD3 CD45 nuTdT CD99 CD5 CD10 CD1a smCD3 cyCD3 CD45 CD2 CD117 CD4 CD8 CD7 smCD3 cyCD3 CD45 TcRɣδ TcRαβ CD33 CD56 cyTcRβ smCD3 cyCD3 CD45 CD44 CD13 HLA DR CD45RA CD123 smCD3

Enfermedad Mínima Residual

EMR

La enfermedad mínima residual (

EMR

) es la

persistencia de una cantidad pequeña de células

malignas durante o al finalizar el tratamiento en

cantidades

indetectables

por

microscopia

Acute myeloid leukemia (AML) and related neoplasms AML with recurrent genetic abnormalities

AML with t(8;21)(q22;q22.1);RUNX1-RUNX1T1

AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22);CBFB-MYH11 APL with PML-RARA

AML with t(9;11)(p21.3;q23.3);MLLT3-KMT2A AML with t(6;9)(p23;q34.1);DEK-NUP214

AML with inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM AML (megakaryoblastic) with t(1;22)(p13.3;q13.3);RBM15-MKL1 Provisional entity: AML with BCR-ABL1

AML with mutated NPM1

AML with biallelic mutations of CEBPA

Provisional entity: AML with mutated RUNX1

AML with myelodysplasia-related changes

Therapy-related myeloid neoplasms

AML, NOS

AML with minimal differentiation AML without maturation

AML with maturation

Acute myelomonocytic leukemia

Acute monoblastic/monocytic leukemia Pure erythroid leukemia

Acute megakaryoblastic leukemia Acute basophilic leukemia

Acute panmyelosis with myelofibrosis

Myeloid sarcoma

Myeloid proliferations related to Down syndrome

Transient abnormal myelopoiesis (TAM)

Myeloid leukemia associated with Down syndrome

2016

R

E

V

I

S

I

O

N

WHO

Anomalías Inmunofenotípicas por

citometría de flujo

Bloqueos de maduración

Expresión antigénica aumentada/disminuida

Infidelidad de linaje

Asincronismo madurativo

LMA/SMD PANEL

OBJETIVOS GENERALES

IDENTIFICAR

Marcadores pan-presentadores de Ag: HLADR Marcadores células inmaduras: CD34 y CD117 Marcadores poblaciones hematopoyéticas: CD45

Marcadores de las características físicas de las células: FSS/SSC CUANTIFICAR

Tamaño o grado de infiltración al diagnóstico. Evaluación del tratamiento: EMR

CARACTERIZAR

Marcadores relevantes para establecer PATRONES DE MADURACIÓN: Granulocítica: CD11b-CD13, CD10-CD16,

monocitica:CD14, CD300e, Eritoride:CD36, CD71, CD105

Marcadores relacionados con INFIDELIDAD DE LINEA:CD19,CD7,CD56,CD22

11b/13/DRAQ5.105 DRAQ5 -> 0 256 512 768 1024 11b/13/DRAQ5.105 DRAQ5 -> 0 256 512 768 1024 11b/13/DRAQ5.105 DRAQ5 -> 0 256 512 768 1024

24%

11b/13/DRAQ5.105 DRAQ5 -> 0 256 512 768 1024

25%

NEUTRÓFILO EM BASTÃO e MADURO MIELOBLASTO PROMIELÓCITO MIELÓCITO e METAMIELÓCITO

Combinaciones de tubos múltiples para clasificación de

SMD/LMA según Euroflow

L

M

A

/

S

M

D

L

M

A

M

7

LINEA NEUTROFILICA

LINEA MONOCITICA

LINEA ERITROIDE

MEGACARIOCITO

EXP ABERRANTE LINFOIDE

103 102 101 BAND/ NEUTROPHIL METAMYELOCYT MYELOCYTE PROMYELOCYTE MYELOBLAST CD34 HLA-DR CD117 CD13 CD33 CD11b CD64 CD65 CD54 CD10 CD35 CD13 MPO CD15 CD16

Cambios fenotípicos durante la diferenciación

neutrofílica normal de la médula ósea

Maduración de neutrófilos en N dimensiones en MO normal

APS

It is an independent scientific consortium that

aims at innovation and standardization of

flow cytometric immunophenotyping to

further improve and progress diagnostic

patient care

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

Citometría de Flujo Multicolor (8 colores) con

Estandarización técnica completa



Seteo del instrumento



Protocolos de Inmunofenotipage (SOPs)



Precise diagnostic panels definition

Desarrollo de Nuevo software:



Combinación de multiples tubos: cálculo y vista APS



Mapeo de muestras de leucemias de diagnóstico y follow-up contra

templados de “normal/control” muestras

Desarrollo de protocolos Development of 8-color antibody

diagnosis, classification and monitoring of hematological

malignancies



Paneles diseñados para contester una pregunta clínica específica

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

Logros del Consorcio

EuroFlow

Our data

Results of the Euroflow QA programme

6th round, on May 2015

CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell CD5 CD19

CD19 CD56

Varón de17 años

Muestra remitida: médula ósea heparina (mejor muestra!!!) + EDTA

Leucemia

Mieloblástica

Aguda

MARCADORES ABERRANTES ASOCIADOS A LMA CON t(8;21)

Leucemia Mieloblástica Aguda

. . . con expresión de CD19 y CD56

Análisis citogenético

Software Applied Spectral Imaging

46,XY,add(2)(q37)[3],add(7)(q36)[6],t(8;21)(q22;q22)[6],

t(9;22)(q34;q11.2)[6],add(12)(p13)[3] [cp 6]

RQ-PCR (sonda Taqman) Según protocolo Leukemia 2003: Gabert, J et al.

Gen control ABL

BCRABL p190

BCRABL p210

FISH y RQ PCR:

Día 33: Enfermedad Mínima Residual

Muestra analizada : médula ósea

Detección molecular de BCR ABL p190 en Tiempo Real

Método: RQ PCR System (sonda Taqman)

Applied Biosystems

%BCR ABL:

1,77%

Copias de BCRABL p 190: 198 copias

Copias de gen control ABL:

11.167 copias

Detección de EMR por CFM:

panel a 8 colores según EUROFLOW

Se detecta 0.2% de células patológicas.

En resumen

Al diagnóstico, considerar todas las herramientas técnicas

para la mejor caracterización clínico biológica

Importante

:

dialogo!!!! datos clínicos

anticoagulantes

interpretación de resultados en conjunto

Contextualizar las muestras!!

mo

≠

sp,

diagnóstico

≠

seguimiento

EDTA

≠

heparina

emr? B o T o M?