Resumen: Los nervios laríngeos recurrentes (NLR) de los ma-míferos son diferentes en longitud entre ambos lados. Esta asimetría implica, a priori, diferentes tiempos de conducción del estímulo a la musculatura laríngea controlada por cada nervio, postulándose diversos modelos para explicar el cierre glótico sincrónico más allá de la citada diferencia. Varios son los estudios publicados en esta materia aunque, no obstante, presentan carencias en datos relevantes. Utilizando dos gru-pos de 10 y 6 ratas, respectivamente, nuestro estudio compara la longitud de los NLR por lado y, mediante microscopía ópti-ca acoplada a un sistema de análisis morfométrico, el número y características de las fibras mielínicas que los componen. Los resultados muestran que el NLR izquierdo (NLRi) es, de promedio, 0,84 cm más largo que el NLR derecho (NLRd). No hay diferencias estadísticamente significativas en el número de fibras por lado pero sí en el grosor de las mismas, mayores en el NLRd. Estos datos se analizan valorando los posibles mecanismos de compensación de la diferencia de longitud de los NLR.
Palabras clave:Nervio laríngeo inferior. Laringe. Fibras mielínicas.
Análisis de imagen.
Morphometry of the recurrent laryngeal nerves of the rat
Abstract:In mammals the recurrent laryngeal nerves are dissimilar in length between both sides. This asymmetry in-volves different time of arrival of the stimulus to the laryn-geal musculature controlled by each nerve. Thus, several explanations have been addressed to elucidate the closest of the glottis at the same time despite the unlike length of the nerves. However, previous works on the topic lack of seve-ral important data. The present study compares, in two
groups of 10 and 6 rats, the length and the composition of myelinated fibers in the recurrent laryngeal nerves of both sides, by means of light microscopy and a computerized morphometric analysis. The results show a mean difference of 0,84 cm longer the left than the right recurrent laryngeal nerve. No statistical differences were observed in the num-ber of myelinated finum-bers between both sides. However, the myelinated fibers of the right side were statistically bigger in diameter than the fibers of the left side. The data are dis-cussed in the context of the mechanisms for the compensa-tion of the dissimilar length of both recurrent laryngeal ner-ves.
Key words: Inferior laryngeal nerve. Larynx. Myelinated fibers.
Image analysis.
INTRODUCCIÓN
Los estudios morfológicos y morfométricos de los ner-vios laríngeos han merecido, desde la mitad del pasado si-glo, la atención de numerosos investigadores. El desarrollo embrionario del sexto arco aórtico, diferente en los lados derecho e izquierdo, genera la desigualdad en longitud que se establece entre los NLR, más largo el NLRi –recurrente en el cayado aórtico– que el NLRd –recurrente en la arteria subclavia derecha1–. Esta asimetría ha llevado a especular
sobre cómo la misma es compensada, morfológica y/o fisio-lógicamente, para que no afecte al mecanismo de produc-ción de la voz: la diferencia en longitud implica, a priori, que el estímulo nervioso conducido por el NLRi llega a la musculatura intrínseca laríngea con un cierto retardo con respecto a lo que acontece con el NLRd.
Se han llevado a cabo estudios sobre esta materia en mamíferos comunes en la experimentación como el conejo, el gato o la rata, y en alguno tan inhabitual como la jirafa2-7.
Varios son los estudios realizados en nervios humanos7-11.
No obstante, la bibliografía consultada muestra que, en mu-chos casos, los autores no hacen mención del lado del que proviene la muestra de NLR analizado2,3,5,8,10,11, de qué nivel
proceden las secciones2,5,8, o incluso, el tamaño muestral de
NLR utilizados en el estudio6. Adicionalmente, el registro
de la forma, la toma de medidas y la cuantificación de las fibras se realizaron manualmente hasta bien entrada la
dé-Morfometría de los nervios laríngeos recurrentes
de la rata
A. Pascual-Font, A. Merchán, E. Maranillo, A. Brillas, J. R. Sañudo, F. J. Valderrama-Canales
Departamento de Anatomía y Embriología Humana I. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.
INVESTIGACIÓN BÁSICA
Correspondencia: Francisco J. Valderrama-Canales. Departamento de Anatomía y Embriología Humana I. Facultad de Medicina, Universidad Complutense Madrid. 28040 Madrid.
E-mail: fvalde@med.ucm.es Fecha de recepción: 1-8-2006 Fecha de aceptación: 30-9-2006
cada de los años setenta4. Todos estos inconvenientes del
planteamiento experimental, o de índole técnica, generan resultados dispares y, en muchos casos, contradictorios, lo que representa una severa limitación para el análisis de los datos globales y la interpretación biológica del modelo7.
El presente estudio pretende ampliar el conocimiento sobre la morfología macroscópica y la composición de las fi-bras mielínicas de los NLR. Los resultados que se obtengan del mismo servirán como patrón de normalidad en un mo-delo experimental de los procesos de degeneración-regene-ración de los nervios laríngeos. El animal empleado es la ra-ta, por su facilidad de obtención, mantenimiento y manipulación. Este modelo ya se ha utilizado en alguno de los artículos revisados, lo que nos ha permitido realizar una comparación directa de los resultados5,6. Al mismo tiempo,
el conocimiento de estas estructuras en los mamíferos po-dría servir de aproximación en la búsqueda de un horizonte terapéutico para diversas afecciones laríngeas en el ser hu-mano.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales y procesamiento de los nervios
Para la realización del estudio se utilizaron dos series de ratas Sprague-Dawley, hembras, de edad comprendida entre las 6 y las 8 semanas (con pesos comprendidos entre los 200 y los 250 g). En todo momento se siguió escrupulo-samente la normativa vigente respecto a la estabulación, cuidado y sacrificio de los animales de experimentación.
La primera serie, 10 animales, se utilizó para la medi-ción de las longitudes de los NLR y el estudio de su morfo-logía macroscópica mediante microdisección de los mismos. Las ratas fueron eutanasiadas (pentobarbital, 12 mg/Kg i. p.) y fijadas por perfusión intracardiaca de paraformaldehí-do al 4% en tampón fosfato salino con heparina monosódi-ca. Se inyectó látex coloreado de rojo desde el cayado aórti-co, para destacar los troncos arteriales y facilitar la identificación de las estructuras nerviosas, y se procedió a la microdisección de éstas ayudándose de un microscopio quirúrgico Zeiss-OPM1. Los NLR de ambos lados fueron medidos in situ –para evitar la retracción de los mismos y alterar la medida real–, desde su origen en el nervio vago hasta su entrada a la laringe, por detrás de la articulación cricotiroidea (Fig. 1).
La segunda serie, 6 animales, se utilizó para el estudio morfométrico de los NLR. Los animales fueron anestesiados y perfundidos por el procedimiento anteriormente descrito, empleándose en este caso una solución de glutaraldehído al 3% y paraformaldehído al 3% en tampón cacodilato (0,1 M, pH 7,4). Utilizando el microscopio de disección, ambos NLR fueron resecados justo desde el polo inferior de la glándula tiroides hasta la articulación cricotiroidea. El segmento fue inmediatamente postfijado por inmersión, durante dos ho-ras, en el mismo fijador. A continuación, y mediante las téc-nicas histológicas habituales, los nervios fueron lavados en tampón, deshidratados en una serie creciente de alcoholes y contrastados con acetato de uranilo para ser, finalmente, in-cluidos en epon. Tras la polimerización de la resina en la es-tufa, se procedió a la obtención de secciones semifinas –0,5 µm– por medio de un ultramicrotomo (LKB III). Las seccio-nes, una vez depositadas sobre los portaobjetos, fueron teñi-das con azul de toluidina para su ulterior examen a micros-copía óptica.
Evaluación morfométrica
La evaluación morfométrica se llevó a cabo, desde la captura de las imágenes a la cuantificación de los paráme-tros deseados y la obtención de los datos numéricos resul-tantes, mediante un programa específico para tal propósito Figura 1. Imagen de una microdisección del cuello y el tórax de una rata. Se
observa la disposición anatómica normal de los nervios vagos, recurrentes y de los elementos vasculares. acc: arteria carótida común; ao: arco aórtico; cc: cartílago cricoides; gt: glándula tiroides; nlrd: nervio laríngeo recurrente derecho; nlri: nervio laríngeo recurrente izquierdo; trq: tráquea; X: nervios vagos derecho e izquierdo.
denominado “Visilog®” (www.imagesp.es). El proceso se
desarrolla, principalmente, según la siguiente secuencia. Una vez seleccionado al microscopio, a bajo y medio aumento, uno de los cortes semifinos del nervio, la sección era obser-vada en campo claro con un objetivo de inmersión 100x y, mediante una cámara digital acoplada al microscopio, la imagen del mismo se enviaba a un PC, dónde era capturada (Fig. 2 A). La imagen se fotografiaba fraccionada en varios sectores, entre 4 y 9, puesto que, al aumento al que se reali-zaba la captación de la imagen, el área completa de la mis-ma era superior a la del campo registrado por la cámis-mara. El conjunto de imágenes era guardado por el software en una carpeta específica desde la que, posteriormente, se componía el mosaico íntegro de la sección estudiada, es decir, se re-componía la sección del nervio. Sobre la imagen completa se definía, mediante el programa, un umbral que permitiría en los sucesivos procesos la identificación de las partículas a cuantificar –en este caso las fibras mielínicas del nervio– (Fig. 2 B), así como realizar la cuantificación de los paráme-tros que, previamente, habían sido definidos en el programa. El programa informático permite al investigador, de modo manual, seleccionar, modificar o eliminar las fibras registra-das, para poder corregir cualquier reconocimiento anómalo o exclusión de alguna fibra producidos por el proceso infor-matizado. Los ítems que se cuantificaron para cada fibra mielínica fueron: el área exterior, correspondiente al área de la sección de la fibra mielínica; el área interior, que corres-ponde al área de la sección del axón; el perímetro exterior, que corresponde al de la fibra; el perímetro interior, corres-pondiente al del axón; los diámetros equivalentes exterior e interior (exterior: de la fibra completa; interior: del axón); el grosor de la vaina de mielina, calculado como la diferencia entre el diámetro equivalente exterior menos el diámetro equivalente interior y todo ello dividido entre dos; y, final-mente, el factor G, calculado como el cociente entre el perí-metro interior y el períperí-metro exterior12-17.
Los datos numéricos obtenidos fueron exportados al programa estadístico SPSS 13.0 para su ulterior análisis. Pa-ra valoPa-rar la significación estadística de los datos, las me-dias se compararon mediante la realización del test de la T de Student. Las gráficas se realizaron mediante el programa Excel.
RESULTADOS
Longitud de los NLR
La longitud promedio de los NLR, desde el origen en el vago hasta la entrada a la laringe, fue de 2,79 cm para el NLRd y de 3,63 cm para el NLRi (Tabla I). Los NLR de la rata se originan del nervio vago, el NLRi debajo del cayado aórtico y el NLRd inferiormente a la arteria subclavia (Fig. 1). En ambos casos, cada NLR rodea la cara inferior del va-so con el que se relaciona, se dispone en el surco traqueoe-sofágico y sigue un recorrido craneal hasta la laringe (Fig. 1).
Morfometría de los NLR
Durante el procesado histológico de los NLR dos muestras quedaron inutilizadas, por lo que de los 6 pares iniciales la muestra finalmente analizada quedó reducida a 10 nervios (Fig. 3). De ellos, se conservaron los NLR de am-bos lados del mismo animal en cuatro casos, por lo tanto dos nervios quedaron “desapareados” (Fig. 3). Para cada NLR se cuantificó el número de fibras mielínicas y para ca-da una de ellas los parámetros estudiados fueron: el área exterior, el perímetro exterior, el diámetro equivalente exte-rior, área inteexte-rior, el perímetro inteexte-rior, el diámetro equiva-lente interior, el grosor de la vaina de mielina y el factor G (Fig. 4).
Figura 2. A. Imagen de una sección semifina (0,5 µm) de un nervio recurrente observada a 100x con un objetivo de inmersión. Desde este tipo de imágenes se inicia todo el proceso de captura y procesado informatizado para el posterior análisis morfométrico. El recuadro se muestra procesado y aumentado en la figura 2 B. B. La fotografía muestra la imagen obtenida tras el procesado de la imagen microscópica mediante el software “Visilog”. La numeración es la asignada automáticamente a cada partícula a analizar; en este caso las fibras mielínicas. La imagen original corresponde al recuadro de la figura 2 A.
El total de fibras mielínicas de los diez nervios estudia-dos fue de 1895; 1.020 correspondientes a los 5 NLRi y las 875 restantes a los 5 NLRd, lo que arroja una media de 204 fibras por NLRi y 175 fibras por NLRd (Fig. 3). Sólo en uno de los casos en los que se contaba con los dos NLR del mis-mo animal, el NLRd presentaba más fibras mielínicas que el NLRi –animal Cnr5– (Fig. 3). No obstante, para valorar ade-cuadamente estos resultados, ha de tenerse en cuenta que la diferencia entre la media de fibras de ambos lados no resul-tó estadísticamente significativa (Fig. 3).
Los resultados obtenidos para los parámetros analiza-dos en cada fibra se muestran en las figuras 4 y 5. Excepto para el factor G todos los parámetros analizados (área exte-rior, área inteexte-rior, perímetro exteexte-rior, perímetro inteexte-rior, diá-metro exterior equivalente, diádiá-metro interior equivalente, grosor de la mielina) resultaron significativamente mayores para el conjunto de las fibras mielínicas del lado derecho (Fig. 4). La figura 5 muestra la distribución de las fibras de ambos nervios en función del área de las mismas. A tenor de los datos ya comentados, la gráfica muestra como la
cur-va correspondiente al NLRd está desplazada hacia la dere-cha con respecto a la curva del NLRi, evidenciando nueva-mente que el área (y por lo tanto el diámetro) de las fibras del NLRd es mayor que el de las fibras del NLRi.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Los datos del presente estudio muestran que, en la ra-ta, la longitud media del NLRd es de 2,79 cm, mientras que para el NLRi es de 3,63 cm. Así, la diferencia en longitud entre los NLR de ambos lados es de unos 0,84 cm, lo que representa un 24%. Estos datos son similares a los obteni-dos, también en la rata, por otros autores6. Comparando
nuestros datos con otros estudios en diversas especies de mamíferos, incluyendo el hombre, nuestros resultados son Tabla 1: Se recogen en la tabla las longitudes de los NLR
medidas en los animales utilizados, indicando la media resultante para los NLRd y los NLRi
Animal Sexo Longitud (cm)
NLRdNLRi L1 H 3,2 3,9 L2 H 2,9 3,7 L3 H 2,9 3,7 L4 H 3 3,6 L5 H 2,7 3,6 L6 H 2,7 3,5 L7 H 2,6 3,7 L8 H 2,7 3,5 L9 H 2,6 3,6 L10 H 2,6 3,5 Longitud media 2,79 3,63
Figura 3. Diagrama de barras que muestra el número de fibras mielínicas por nervio y lado y la media de dichas fibras por lado. La diferencia entre las medias no es significativa p=0,37.
Figura 4. A. Diagrama de barras que muestra el valor por cada lado de los parámetros: Diámetro exterior equivalente (µm), diámetro interior equivalente (µm), grosor de la mielina (µm) y factor G (adimensional). Excepto para el factor G, las diferencias por lado para cada uno de ellos es significativa (* p< 0,0001). B. Diagrama de barras que muestra el valor por cada lado de los parámetros: Área exterior (µm2), área interior (µm2), perímetro exterior (µm) y
perímetro interior (µm). Las diferencias por lado para cada uno de ellos es significativa (* p< 0,0001).
concordantes con los datos obtenidos en ellos. Así, en los nervios humanos la diferencia se cifra en una media de 11 cm –24%–, en perros es de unos 13 cm –36%– y, casi como curiosidad, en las jirafas de unos 30 cm –17%7, 18, 19–. Es
pro-bable que esta homogeneidad en la diferencia de longitud entre los NLR de los mamíferos estudiados responda al me-canismo ontogénico que genera la recurrencia de ambos nervios, obviamente común a todos ellos desde el punto de vista del desarrollo embrionario del sexto arco aórtico, asi-métrico entre ambos lados1.
Nuestro estudio ha analizado 1895 fibras mielínicas, mostrando una media de 204 para el NLRi y de 175 para el NLRd, no obstante, esta diferencia no resulta estadística-mente significativa y la variabilidad entre los individuos es alta. Incluso en uno de los animales estudiados el número de fibras era mayor en el NLRd que en el NLRi. Estos datos apuntan a un equilibrio en el número de fibras que contiene cada uno de los NLR, así como a una notoria variabilidad
interindividual, lo que corroboraría los análisis de otros tra-bajos4,6,7. Las diferencias numéricas entre nuestro estudio y
uno previo, también en rata, realizado por Dahlquist y cols. (1982), pueden explicarse tomando en consideración la ubi-cación próximo-distal de la que se tomó la muestra de ner-vio en cada caso, pues a medida que el NLR se aproxima hacia la laringe disminuye el número de fibras mielínicas que contiene6,7. En otro estudio, que analiza los NLR del
ga-to, se muestra que el NLRd contiene más fibras mielínicas que el NLRi, aunque no se habla de la significación estadís-tica de esos datos4. De confirmarse esta discrepancia podría
interpretarse como una diferencia entre especies, en este ca-so un roedor y un carnívoro.
También el análisis del diámetro de las fibras que com-ponen los NLR arroja resultados dispares según el modelo animal estudiado. Tanto en el perro como en el hombre se ha sugerido que el diámetro promedio de las fibras del NLR izquierdo es mayor que el de las fibras del NLR dere-cho, basándose únicamente en la comparación de las me-dias obtenidas o en la observación de los diagramas de dis-tribución por diámetros de las fibras, no realizándose en ninguno de los trabajos un análisis estadístico de los resul-tados9,18,20. No obstante, en nuestro estudio el diámetro de las
fibras del NLRd es estadísticamente mayor que el diámetro de las fibras del NLRi. Estas discrepancias pueden deberse a que nuestros resultados han sido analizados estadística-mente y los de otros autores han sido interpretados sin un estudio estadístico. No obstante, no es descartable, nueva-mente, que estas discordancias se deban a variaciones entre diferentes especies.
La distribución de las fibras en función del área o del diámetro de las mismas no presenta, para la muestra que hemos analizado, ninguna distribución especial. La curva correspondiente a las fibras del NLRd está desplazada a la derecha con respecto a la curva correspondiente a las fibras del NLRi, indicando de manera coherente con los datos ya discutidos que las fibras mielínicas del NLRd son mayores que las del NLRi. Otros autores, en otras especies de mamí-feros, han obtenido de igual manera distribuciones unimo-dales en los estudios de las fibras de los NLR3,7. No
obstan-te, también se han descrito distribuciones bimodales, relacionándose la existencia de grupos de tamaño con el ti-po funcional de las fibras (motoras extrafusales, intrafusa-les, sensitivas)6,9,18. Así en la rata, se ha descrito una
distribu-ción bimodal con un pico entre 2 y 3 µm y otro, menos pronunciado, entre 4,5 y 7 µm6. Pese a que en nuestro
estu-dio la distribución de las fibras por diámetro no sigue una distribución bimodal, sin embargo la mayoría de las fibras se distribuyen en el intervalo comprendido entre ambos pi-cos.
En la bibliografía sobre el tema, se ha interpretado ha-bitualmente que un mayor grosor de las fibras mielínicas del NLRi, o un mayor número de ellas, respecto del otro la-do, son la base morfológica que permitiría al impulso ner-vioso viajar más rápido por este nervio y ser, de este modo, simultáneo al del NLRd, compensando así la diferencia en longitud entre ambos nervios7,9,18-20. Sin embargo, los
resulta-Figura 5. A. Histograma que muestra la distribución de las fibras del NLRd y del NLRi en función del área seccional de las mismas (µm2). Las curvas
presentan una distribución unimodal. Observe como para el NLRd hay un mayor porcentaje de fibras de mayor calibre cuando se compara con el mismo valor del NLRi. B. Histograma acumulado del área seccional de las fibras mielínicas de los NLR (µm2). Observe el desplazamiento de la curva del NLRd
hacia la derecha, lo que indica que el grosor de las fibras de este nervio es mayor que el de las fibras del NLRi.
dos obtenidos en relación al número de fibras mielínicas y el grosor de las mismas según el lado de procedencia del NLR no son homogéneos. Entre los estudios de electrofisio-logía, tampoco hay acuerdo en los resultados sobre la velo-cidad de conducción de los nervios3,6,9,18. Así, uno de estos
estudios sobre la velocidad de conducción del impulso ner-vioso determinó una mayor velocidad de conducción para el NLRi18. Sin embargo, otros autores encontraron que la
ve-locidad de conducción era igual para ambos NLR21e incluso
se han registrado para el mismo NLR velocidades de con-ducción más lentas en las porciones distales y más rápidas en las porciones proximales19. La explicación a todas las
di-ferencias observadas en los tiempos de conducción entre los NLR, según Atkins (1973), podría fundamentarse en que para el mismo nervio, la velocidad de conducción cambia a lo largo de su longitud, siendo ésta mayor cuanto más pro-ximal. Por lo tanto, la estimulación y registro de la veloci-dad en distintos puntos del nervio arroja valores diferen-tes19.
Como análisis final, observamos una gran heteroge-neidad en los datos recogidos en la literatura consultada junto con importantes discrepancias en su interpretación. Nos lleva esta situación a abordar el asunto desde el punto de vista de la relevancia fisiológica de la disimetría de los NLR. Si aceptamos una velocidad media de conducción en los NLR de 60-70 ms–17,21, el cálculo de la diferencia en el
tiempo de conducción entre los NLR de la rata se estimaría en unos 0,13 ms. Los datos experimentales sobre la veloci-dad de contracción de los músculos intrínsecos laríngeos de diversos mamíferos, indican que los músculos más rápi-dos, como el vocal y el cricoaritenoideo lateral, se contraen en tiempos que oscilan entre los 11 y los 22 ms, mientras que el músculo cricoaritenoideo posterior, el más lento, tar-da entre 28 y 50 ms en contraerse (para una revisión de es-tos daes-tos véase la referencia 22). Comparando estas cifras, el retardo de 0,13 ms en la conducción del NLRi frente al NLRd representa tan solo la centésima parte de la veloci-dad con la que se contraen los músculos más rápidos en la laringe. La consideración de estos datos de la fisiología neuromuscular, juntos con los datos morfológicos obteni-dos en este estudio, nos lleva a plantearnos abiertamente si la diferencia de longitud entre los NLR necesita de una compensación morfofisiológica para conseguir una perfecta sincronía durante la función laríngea. Nuestros datos apun-tan a que, al menos en la rata, nervios con una diferencia en longitud de hasta el 24% no presentan caracteres morfo-lógicos que justifiquen una velocidad de conducción mayor en el NLR más largo, ya sea mediante un mayor número de fibras mielínicas o mediante un aumento del grosor de la vaina de mielina.
En conclusión, los NLR de la rata presentan diferencias en longitud en función del lado, pero no en el número o grosor de las fibras mielínicas que los componen.
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