Cultivo Por Lote y Alimentado

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LABORATORIO DE BIORREACTORES

5MB1

Práctica: 4

Cultivo por Lote y Lote Alimentado

PROFESORES: Rosa Isela Jiménez Castillo Juan Carlos Rodríguez Sierra

Guillermo Garibay Benítez

Equipo 1 Sección 1

Integrantes:

Lozano Ramírez Yadira Elizabeth Méndez Viramontes Claudia

Marmolejo Pérez Omar Marmolejo Pérez Viridiana Morales Carmona Estefanía

Yáñez Retes Flor Angélica

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Resumen

Introducción

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis es una bacteria gram positiva, estas bacterias producen endosporas las cuales proporcionan mayor resistencia a factores ambientales como por ejemplo la temperatura, esta bacteria puede sobrevivir en un límite de temperaturas de 55°C a 70°C y puede soportar pH hasta de 2 a 3 (Lisboa, 2003).

B. subtilis es una de las 40 especies reconocidas del género Bacillus que tiene la capacidad de moverse. Esta bacteria produce enzimas hidrofílicas extracelulares que degradan polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos, los que utiliza como fuente de energía. (Sierra, 2008).

B subtilis presenta una mayor resistencia al final de la fase exponencial debido a la formación de endosporas, y el grado de resistencia de éstas depende de las condiciones ambientales en las que se encuentre (León, 2001).

Una de las sustancias producidas por las endosporas, es el ácido dipicolínico, el cual se localiza en el núcleo de la endospora, además también de este compuesto también son ricas en iones Ca+ las cuales forman un complejo el cual representa el 10% del peso seco de la endospora (León, 2001).

Cultivo por lote

Un cultivo por lote es un sistema de cultivo cerrado en el que existe una cantidad inicial limitada de nutriente. El inoculo pasa por 4 diferentes fases, la de adaptación o fase lag, una fase de crecimiento exponencial o fase log, otra en la que la velocidad de muerte y la de crecimiento son iguales, fase estacionaria, y una fase de muerte, en la que la velocidad de muerte es mucho mayor que la de crecimiento. La fase exponencial puede describirse por la siguiente ecuación:

𝑑𝑥 𝑑𝑡 = 𝜇𝑥

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Donde:

𝑥 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑏𝑖𝑎𝑙 𝜇 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜

Para determinar la concentración de biomasa en un intervalo específico de tiempo, la ecuación anterior se puede integrar, de tal forma que:

𝑙𝑛𝑥 = 𝑙𝑛𝑥𝑜 + 𝜇𝑡

El incremento o decremento en la velocidad de crecimiento está dado por el agotamiento de la concentración de sustrato, observándose en una gráfica que relacione μ con la concentración de sustrato limitante residual, representado por la siguiente ecuación (Monood):

𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑠 𝐾𝑠 + 𝑠 Donde: 𝜇𝑚𝑎𝑥 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝐾𝑠 = 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑖𝑐𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎 𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑛𝑒𝑐𝑒𝑠𝑎𝑟𝑖𝑜 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑎𝑙𝑐𝑎𝑛𝑧𝑎𝑟 1 2 𝑑𝑒 𝜇𝑚𝑎𝑥 Una manera de determinar estos parámetros cinéticos mediante los datos experimentales de un quimiostato es con la linealización de la ecuación de Monood:

1 𝐷 = 𝑘𝑠 𝜇max (𝑠)+ 1 𝜇𝑚𝑎𝑥

Realizando un análisis similar al de biomasa, es posible expresar el cambio de la concentración del producto microbiano, en función de la concentración de biomasa:

𝑑𝑝

𝑑𝑡 = 𝑞𝑝(𝑥) y 𝑞𝑝 = 𝑌𝑝𝑥(𝜇) + 𝑚𝑝

Donde:

𝑞𝑝 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜

𝑚𝑝 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑑𝑎 𝑎𝑙 𝑚𝑎𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 Los patrones o modelos de flujo de sustrato en células que sintetizan productos dependen de si la formación de producto se encuentra asociada o no al metabolismo energético. En cultivos donde la síntesis del producto está asociado solo de forma indirecta al metabolismo energético, la velocidad de consumo de sustrato es función de 3 factores: la velocidad de crecimiento, la velocidad de formación de producto y la velocidad de consumo de sustrato necesario para el crecimiento y el mantenimiento.

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𝑑𝑠 𝑑𝑡 = − ( 𝜇 𝑌𝑥𝑠+ 𝑞𝑝 𝑌𝑝𝑠+ 𝑚𝑠) 𝑥 Donde: 𝑚𝑠 = 𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜

Cultivo por lote alimentado

La operación por lote alimentado se utiliza con el fin de controlar la concentración de sustrato en el medio, ya sea para mantenerlo bajo si se desea una baja concentración de biomasa o para mantenerlo alto ya que grandes cantidades de sustrato pueden producir vías metabólicas alternas deseadas.

En este tipo de operación se comienza con un volumen bajo de medio inoculado, en el que el sustrato es alimentado y no existe corriente de producto. Por esta razón el volumen dentro del tanque no es constante y es función del tiempo.

𝑑𝑉 𝑑𝑡 = 𝐹

Entonces la masa de células en el reactor es igual V*(x) y la variación con respecto al tiempo considerando una muerte celular despreciable, es igual a:

𝑑(𝑥𝑉)

𝑑𝑡 = 𝐹𝑥𝑜 + 𝜇𝑥𝑉

Integrando y dividiendo entre el volumen, V, toda la expresión se obtiene: 𝑑𝑥

𝑑𝑡 = 𝑥(𝜇 − 𝐷) Donde:

𝐷 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝐹 𝑉)

La velocidad de consumo de sustrato en un cultivo por lote alimentado depende además de las variables ya mencionadas en el cultivo por lote, del factor de dilución:

𝑑𝑠 𝑑𝑡 = 𝐷(𝑠𝑜 − 𝑠) − ( 𝜇 𝑌𝑥𝑠+ 𝑞𝑝 𝑌𝑝𝑠+ 𝑚𝑠) 𝑥

Pirt (1979) ha expresado el cambio de la concentración de producto en un reactor con volumen variable igual que para un reactor en cultivo continuo como se muestra a continuación:

𝑑𝑝

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Entonces, la concentración de producto cambia de acuerdo a la relación entre la velocidad de producción y la de dilución.

OBJETIVO GENERAL

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MATERIAL Y EQUIPO

Material Equipo

Matraz Erlenmeyer de 250 mL (2) Autoclave

Micropipeta de 1000 µL (2) Biorreactor Tanque agitado Puntas para micropipeta de 1000 µL (1 caja) EZ-Control

Probeta 1000 mL (1) Potenciómetro Tubos eppendorf (40) Parrillas eléctricas

Micropipeta de 100 a 1000 µL (1) Incubadora rotatoria de temperatura controlada Frasco de taparrosca de 1 L (1) Bombas peristáltica (0 a 2 L/h)

Manguera de silicón (varias) Balanza analítica

Torundas de algodón-alcohol Electrodos de pH, temperatura y oxígeno disuelto. Celdas de 1 µL (18) Espectrofotómetro

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Preparación de Medio inicial e inóculo 2L

Reactivo Cantidad (g) Extracto de Levadura 40.0096 Glucosa 10.0093 Sulfato de Magnesio 1.0025 Cloruro de Calcio 0.0208

*Se tomaron 200 ml de ésta solución como medio de inóculo de B. subtillis (2 μl) y se llevó a un pH 7.

Preparación de Medio para lote alimentado 2.85L

Reactivo Cantidad (g) Extracto de Levadura 57

Sacarosa 14.5 Sulfato de Magnesio 1.425 Cloruro de Calcio 0.0285

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Metodología

Preparación de medios de cultivo (Día 1)

Cultivo por Lote (Día 2)

Preparación de 1.8 L de medio de cultivo (glucosa) inicial y 0.2 L para inocular Esterilizar los 200 ml de medio en autoclave (15 min, 121°C y 15 psi) Dejar enfriar e inocular en campana con 2 µL de Bacillus Subtillis Dejar incubar el medio inoculado por 10 h aprox. A 37°C y 200 rpm Guardar los 1.8 L de medio glucosa en refrigeración hasta el día siguiente Preparar 2.85 L de medio de cultivo (sacarosa) Dejar en refrigeración hasta el día siguiente

Sellar Biorreactor con mangueras e introducir los

sensores de pH y oxígeno dejando un escape para la

presión.

Esterilizar Biorreactor con medio inicial en autoclave

(15 min, 121°C y 15 libras)

Dejar enfriar en Campana

Vaciar el medio inoculado en Campana cuidando las

condiciones estériles

Conectar Biorreactor a EZ-Control

Monitorear condiciones de medio y establecer una

agitación de 100 rpm

Tomar muestra inicial para medir densidad

celular en espectrofotómetro a 600 nm Realizar DNS y Bradford leyendo espectrofotómetro a 540 y 595 nm respectivamente

Tomar muestra cada hora y realizar Bradford, DNS y densidad celular a cada

muestra

Realizar curva de proteínas, azúcares reductores y densidad

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Resultados

Se realizaron toma de muestras cada hora, y a cada una de las muestras se le hicieron mediciones de biomas, azucares reductores y proteína total, los datos obtenidos se muestran en la tabla 1.

El comportamiento de los datos experimentales con respecto al tiempo, y modo de operación se muestran en la figura 1.

Figura 1.- Cambio de concentración de biomas, azucares reductores y proteína total con el tiempo Azucares reductores A= 540nm Proteina A= 595nm Biomasa A= 660 nm Azucares reductores (μg/mL) Proteina (μg/mL) Biomasa (Células/mL) 1 2 0.157 0.197 0.047 24.40 107.89 9907 3 0.208 0.16 0.073 24.40 87.33 10928 4 0.268 0.213 0.15 8.71 116.78 13951 5 0.742 0.267 0.203 6.68 146.78 16031 6 0.138 0.266 0.408 2.96 146.22 24080 7 0.126 0.232 0.267 2.49 127.33 18544 8 -0.053 0.127 0.215 2.43 69.00 16503 9 3 0.208 0.205 2.09 114.00 16110 10 0.201 0.213 0.217 1.94 116.78 16581 11 0.047 0.243 0.012 1.93 133.44 8533 12 3 0.312 0.028 1.85 171.78 9161 13 0.137 0.46 0.159 1.23 254.00 14304 14 1 0.733 0.523 0.44 405.67 28595

Cultivo por Lote Alimentado

Tabla 1.- Datos experimentales de absorbancia y concentración para cultivo por lote y lote alimentado de B.

Absorbancia Concentracion

Tiempo (h) Configuración

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Por definición la constante Ks es numéricamente igual a la concentración de sustrato necesaria para llegar a ½ de μmax, entonces se graficaron las μ con respecto a la concentración de sustrato consumido y se ajustó un modelo para determinarla.

Sustituyendo el valor de la

μ

max/2 en el modelo y despejando x se obtuvo Ks. 𝑘𝑠 = 6.026 𝜇𝑔/𝑚𝐿

Figura 2.- Determinación gráfica de parámetros cinéticos A) determinación de la velocidad especifica de crecimiento μ. B) Determinación de la velocidad máxima de crecimiento μmax.

y = 0.0638x R² = 0.9379 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 2 4 6 8 Ln (X/Xo ) Tiempo (h)

Determinación de μ

0.0746 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0 2 4 6 8 μ (h -1) Tiempo (h)

μ max (h-1)

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Mediante los parámetros cinéticos obtenidos con los datos experimentales, se realizó una simulación del lote alimentado y se calculó el % de error absoluto para cada una de las mediciones tal como se muestra en la tabla siguiente:

Posteriormente se graficaron estos datos y se observó el comportamiento de la concentración de los compuestos

2 2.089 2.009 4.0 114.00 114 0.0 16109.9 16109.90 0.0 2.194 1.940 1.666 16.4 116.78 138.44 15.6 16581.02 19907.82 16.7 2.372 1.932 1.356 42.5 133.44 165.48 19.4 8532.72 24144.87 64.7 2.538 1.845 1.122 64.5 171.78 195.33 12.1 9160.88 28848.10 68.2 2.693 1.225 0.939 30.5 254.00 228.22 11.3 14303.94 34044.90 58.0 2.84 0.440 0.795 44.6 405.67 304.08 33.4 28594.58 39763.00 28.1 Cultivo por Lote Alimentado Simulación %Error Configura ción Factor de dilución D

(h-1) Simulación %Error Simulación %Error

Azucares reductores (μg/mL) Proteina (μg/mL) Biomasa (Células/mL)

Experimento

Experimento Experimento

Tabla 2.- Datos experimentales y simulados de concentración de biomasa, proteína y azucares reductores durante la alimentación.

0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 7 8 9 10 11 12 13 14 Co n ce n tr a ció n d e p ro te ín a to ta l μ g /m L Co n ce n tr a ció n d e a u ca re s re d u cto re s μ g /m L Tiempo (h)

Datos experimentales vs Simulación Lote alimentado

Azucares reductores Azucares reductores simulación Proteína Proteina simulacion

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Discusión

Conclusión

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 7 8 9 10 11 12 13 14 C o n ce n tr ac n d e b io masa C é lul as /mL Tiempo (h)

Datos experimentales y simulación Lote alimentado

Biomasa Biomasa (simulación)

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CUESTIONARIO.

1. Investigue y explique algunas alternativas para controlar el pH, que no sean las mencionadas durante la práctica (p.e. sales amortiguadoras, producción de metabolitos secundarios, etc.).

2. Realiza un diagrama de flujo para obtener ron con el uso de un biorreactor empleando un sustrato seleccionado por usted.

3. Menciona 5 modificaciones que le realizarías al biorreactor para mejorar el proceso.

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