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Orquídeas el Azafrán (Cultivo in vitro de semillas)

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Orquídeas el Azafrán (Cultivo in vitro de semillas)

CULTIVO IN VITRO ORQUÍDEAS

ÍNDICE PÁGINA

Polinización 1

Tiempos de maduración de semillas 3

Material 4

Preparación del medio de cultivo 5

Esterilización de la capsula y semillas y siembra en medio de cultivo

6

Siembra en medio de cultivo 6

Cultivo 7

Resiembra 7

Siembra en macetas comunitarias 7

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POLINIZACIÓN

La polinización se puede realizar con un palito de bamboo, palillo, lápiz etc. Se coloca el palillo debajo de la columna dorsal jalando la antera hacia uno para obtener las polinias. Las polinias se colocan en el estigma de la misma flor o de otra flor con la que se quiera hacer la cruza. Al retirar el lápiz las polinias quedaran adheridas al estigma. Solo queda esperar a que se forme la capsula al comenzar el desarrollo de las semillas en el ovario subfloral.

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Fig. 2. Partes detalladas de la flor de las orquídeas. Es importante identificarlas con claridad para

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TIEMPOS DE MADURACIÓN DE SEMILLAS

Tabla 1. Ejemplos de los tiempos de maduración de algunos géneros y especies de

orquídeas.Tomado de www.lamolina.edu.pe/agronomia/dhorticultura/html.../cuya.doc. Calanthe 4 meses Cattleya 11 meses Coelogyne 13 meses Dendrobium 12 meses Epidendrum 4 meses Miltonia 9 meses. Odontoglossum 7 meses Phalaenopsisi 6 meses.

Para tener más detalles consulta el archivo de tiempos de maduración de semillas donde encontraras un archivo más amplio con una mayor cantidad de especies descritas.

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MATERIAL

Agar agar Agua destilada Algodón estéril

Atomizador con solución cloro 1 Cl: 4 (H2O) Autoclave u olla de presión

Bolsas de basura

Botes de polipropileno con tapa Cámara estéril

Cepillo de dientes estéril o desinfectado Cinta Micropore 3M

Cinta testigo Cloro comercial Detergente liquido

Frascos con agua destilada estéril Frascos gerber

Frascos polipropileno de 500 ml Guantes

Hoja de papel

Jeringa de 10 ml con tapón Jeringa de 60 ml sin aguja Masking tape

Medio de mantenimiento Phytamax Orchid Maintenance Medium (Sigma)

Medio de siembra Phytamax orchid Medium with Charcoal and Banana powder (Sigma) Microondas

Olla y cuchara Palillos largos Papel aluminio Papel china blanco

Parafilm o plástico adherente Pinzas largas y cortas estériles Probeta 1L

Solución cloro 1 Cl: 4 (H2O), 1 Cl: 9 (H2O) Tapas o tapones de goma

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PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO

Para preparar el medio en frascos de polipropileno (PP), disolver la cantidad de medio Phytamax de acuerdo a las indicaciones del fabricante en agua destilada. Agregar 8 gr de agar agar para cada litro de medio preparado. Calentar hasta dar el primer hervor dejar cocer unos segundos, es importante disolver correctamente por lo que debe de moverse constantemente hasta hervir. Se deja enfriar un poco y se agregan 60 ml del medio en cada frasco, se coloca la tapa únicamente apretando está en una parte del frasco y este se coloca en microondas por 3 minutos para esterilizar el medio y el interior del frasco. Previamente se debe tener preparada una bolsa en la cual con ayuda de un atomizador se desinfecta con solución de cloro 1 Cl: 4 (H2O), se vuelve desinfectar el interior de la bolsa rociándola con la solución cada vez que se mete un frasco dentro de esta. Los frascos deben de colocarse sin taparse totalmente para evitar una condensación elevada. Una vez enfriados estos se cierran dentro de la bolsa. Los frascos están listos para sembrar.

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Page 6 of 9 Para preparar el medio en frascos de vidrio, existen dos maneras de hacer: la primera, se puede preparar el medio y esterilizarlo en olla exprés o autoclave junto con los frascos vacios y posteriormente en la cámara estéril verter el medio en los frascos. La segunda, se puede preparar el medio disolverlo correctamente por medio de calor y agitación y colocarlo en los frascos y luego estos con el medio esterilizarlos, de esta forma tenemos los frascos listos para sembrar.

Se recomienda dejar frascos tanto de PP como de vidrio unos días a temperatura ambiente antes de sembrar para observar cualquier indicio de contaminación de esta forma se evita desperdiciar semillas o que la contaminación provenga desde antes de la siembra de las semillas.

ESTERILIZACIÓN DE LA CAPSULA Y SEMILLAS Y SIEMBRA EN MEDIO DE CULTIVO

Cuando se hace el corte de la capsula antes de que esta se abra y libere las semillas debe de colocarse dentro de la cámara estéril en un recipiente con solución de cloro 1 Cl: 9 (H2O) por 5-10 min, durante este tiempo cepillas con cepillo de dientes estéril la superficie de la capsula, también se puede agregar a la solución una gotita de detergente liquido o reactivo TWEEN 20, con la finalidad de romper la membrana celular de los microorganismos. Transcurrido el tiempo enjuagar en agua destilada estéril. Otra forma de desinfección es sumergir la capsula en alcohol isopropílico sacarla y flamear el alcohol que quedo sobre la cápsula sin exponer la capsula a exceso de calor.

Abrir la capsula con navaja estéril, sacar las semillas con pinzas estériles y colocarlas en los medios de cultivo. También pueden transferirse las semillas a un frasco con agua estéril y utilizar una pipeta para colocar las semillas en el medio de cultivo. Esto ayuda a remover el algodoncillo que rodea las semillas evitando el traspaso de estos residuos a los frascos de cultivo.

Para el caso de que la cápsula se abra y se liberen las semillas estas deben de recolectarse en una hoja de papel el cual se dobla por la mitad, de esta manera utilizando el papel como un embudo se colocan las semillas en una jeringa con tapón (sin aguja). Una vez las semillas dentro se coloca el embolo hasta la parte superior sin presionar las semillas. En la punta de la jeringa se coloca el tapón, al cual previamente se le hacen dos hoyos en la punta con una aguja caliente y se le coloca una cuadrado pequeño de papel sanita o papel servilleta para evitar que se salgan las semillas durante el lavado. Una vez montada la jeringa esta se sumerge en solución de cloro 1 Cl: 4 (H2O) para desinfectarla. Posteriormente se absorbe el volumen de la jeringa de solución de cloro 1 Cl: 9 (H2O), se agita constantemente por 10 minutos y se deja que las semillas se precipiten. Si quedan semillas sin precipitar se quita el tapón y se elimina un poco de liquido para eliminar esta semillas debido a que en ellas no ha penetrado el cloro y por lo tanto no se encuentran desinfectadas. Una vez hecho esto se coloca el tapón y se elimina la solución de cloro. Posteriormente se absorbe agua destilada estéril y se agita vigorosamente la jeringa para enjuagar las semillas, se deja de agitar y se observa que las semillas comienzan a precipitarse. Este procedimiento de enjuagado se repite 2 veces completando 3 enjuagadas. De la ultima enjuagas no se elimina totalmente el agua con la finalidad de agregar a los medios de cultivo aproximadamente 1 ml del agua con semillas

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Page 7 of 9 para hacer la siembra. Los frascos deben ser sellados para evitar que se contaminen, y deben ser marcados como referencia.

CULTIVO

Los frascos deben de colocarse bajo luces fluorescentes por 8 horas diarias, aproximadamente 40 cm por debajo de la fuente de luz. Una vez hecha la siembra, la germinación de las semillas puede tomar de 1 a 9 meses.

RESIEMBRA

Aproximadamente a los 30 o 60 días después de la germinación será necesario transferir las plántulas a medio de cultivo nuevo para promover un mejor crecimiento. Para el trasplante debe de colocarse el frasco madre y el frasco con el medio nuevo dentro de la cámara de siembra y trabajar bajo condiciones de asepsia. Se debe colocar un frasco con solución de cloro 1 Cl: 4 (H2O) para sumergir los utensilios y enjuagarlos en agua destilada estéril entre siembras. Se toman los plántula con las pinzas desinfectadas esparciéndolas en el medio de cultivo nuevo teniendo cuidado de dejar espacio entre ellas para evitar la competencia. Es importante limpiar los utensilios para tomar otras plántulas y trasplantarlas. Una vez trasplantada se tapan los botes, en este caso la tapa del bote necesita tener un pequeño agujero cubierto con cinta Micropore 3M (resistente a la autoclave) para permitir el intercambio gaseoso pero no la entrada de microorganismos. Los frascos se colocan nuevamente bajo luz fluorescente por 8 horas diarias.

SIEMBRA EN MACETAS COMUNITARIAS

Cuando las plantas han crecido a un tamaño de 5-6 cm y tienen de 3 a más raíces, ya pueden ser sacadas del frasco. Es importante abrir el frasco y permitir que se aclimaten las plantas por 24 horas antes de sacarlas. Se puede romper el frasco o colocar un poco de agua tibia para deshacer el agar. Es importante limpiar el exceso de agar en las plantas para evitar la formación de microorganismos que pudieran dañarlas. Se colocan las plantas en una mezcla de musgo y perlite, una mezcla que permita buena aireación y que absorba humedad. Rociar con fungicida/bactericida como Physan 20 o RD-20. La siembra funciona mejor si se colocan las plantas juntas, colocando de 5 a 3 plantas en macetas de 3”.

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CUIDADOS

Las plantas de deben de colocarse en un lugar con poca luz, sin luz directa, y con humedad y temperatura constantes. Es importante no fertilizar las plantas por ahora, se puede agregar algo de fertilizante a las 3 o 4 semanas de la siembra. Le tomara aproximadamente de 3 a 5 años a las plantas nuevas en producir la primera floración. Repetir la aplicación del fungicida/bactericida cada 3 a 4 semanas. Conforme las plantas se aclimatan y desarrollan se pueden pasar a un lugar con mayor luz y con periodos entre riegos mas extendidos.

Tomado y modificado de: Home Flasking by Sam Fifer,

Referencias

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