prueba diagnóstica no invasiva de la deficiencia de este enzima.

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ESPAÑA 21

Número de solicitud:200202372 51

Int. Cl.7:C12Q 1/34 12

SOLICITUD DE PATENTE A1 22

Fecha de presentación:16.10.2002 43

Fecha de publicación de la solicitud:01.06.2004

43

Fecha de publicación del folleto de la solicitud:

01.06.2004

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Solicitante/s:

Consejo Superior de Investaciones Científicas c/ Serrano 117

28006 Madrid, ES

Universidad Autónoma de Madrid

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Inventor/es:Aragón Reyes, Juan José y Fernández Mayoralas, Alfonso

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Agente:No consta

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Título:Empleo de 4-galactosil-xilosa en humanos para la evaluación in vivo de lactasa intestinal como prueba diagnóstica no invasiva de la deficiencia de este enzima.

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Resumen:

Empleo de 4-galactosil-xilosa en humanos para la evalua-ción in vivo de lactasa intestinal como prueba diagnóstica no invasiva de la deficiencia de este enzima.

Utilización en humanos de método basado en la utiliza-ción de 4-galactosilxilosa integrando en este método una técnica alternativa a la determinación de xilosa en orina, consistente en valorar la concentración de xilosa en san-gre tras la administración al paciente de 4-galactosil-xilo-sa, que resulta más conveniente para el caso de su utili-zación en recién nacidos.

Tecnología para la evaluación in vivo de la actividad lacta-sa intestinal, como prueba no invasiva para el diagnóstico de la deficiencia de este enzima, que se basa en la eva-luación directa de la actividad global del enzima en el indi-viduo completo, no en la valoración de las consecuencias de su deficiencia, no requiere de aparataje especializado, no provoca molestias aparentes en los pacientes porta-dores de deficiencia de lactasa y es altamente fiable, su-perando de esta forma los inconvenientes de las pruebas diagnósticas actualmente utilizadas.

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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 DESCRIPCIÓN

Empleo de 4-galactosil-xilosa en humanos para la evaluación in vivo de lactasa intestinal como prueba diagnóstica no invasiva de la deficiencia de este enzi-ma.

Sector de la técnica

La invención se encuadra en el sector farmacéuti-co y es aplicable en el sector médifarmacéuti-co en la evaluación in vivode la actividad lactasa intestinal en humanos como prueba diagnóstica no invasiva de la deficiencia de este enzima, como así mismo en cualquier circuns-tancia normal o patológica en que interese determinar los niveles de este enzima in vivo.

Estado de la técnica

La lactasa intestinal se localiza en la mucosa del intestino delgado con su centro activo expuesto ha-cia la luz del intestino y es el enzima responsable de la hidrólisis de la lactosa, el azúcar de la leche. Este azúcar no se absorbe como tal a nivel intestinal, por lo que es imprescindible la hidrólisis previa a sus com-ponentes galactosa y glucosa, que son los finalmente absorbidos. La deficiencia de lactasa intestinal con-duce a la mala absorción e intolerancia a la lactosa. Debido a la carencia de este enzima, la lactosa no hi-drolizada en el intestino delgado provoca retraso en la velocidad de vaciamiento gástrico y aumento del transito intestinal, incremento de la presión osmótica y retención de fluido en la luz intestinal, dando lugar su fermentación bacteriana en el colon a la produc-ción de gases, como hidrógeno, metano y dióxido de carbono y a la formación de ácidos grasos de cadena corta. Como consecuencia de estos hechos el proce-so de digestión se reduce y disminuye la abproce-sorción de monosacáridos, presentándose dolor y calambres ab-dominales, flatulencia, ruidos intestinales audibles y diarrea. En el adulto este cuadro se conoce como hi-polactasia o intolerancia a la lactosa, que constituye el trastorno genético más frecuente, afectando a alre-dedor a la mitad de la especie humana. En el caso del recién nacido, la deficiencia congénita del enzima im-pide la correcta utilización de la lactosa originándose trastornos severos, como diarrea intensa y deshidra-tación, derivados tanto de la disminución del aporte energético como del acúmulo intestinal del disacárido no hidrolizado, lo que requiere una detección precoz y el cambio alimenticio a una leche carente de lactosa. La deficiencia de lactasa se presenta además de forma secundaria en un número importante de patologías in-testinales que conllevan deterioro en diverso grado de la mucosa intestinal, como la enfermedad celíaca, en-fermedad inflamatoria intestinal crónica (la enferme-dad de Crohn y la colitis ulcerosa), síndrome de co-lon irritable, resecciones intestinales, fibrosis quística, neonatos prematuros, administración de quimiotera-pia, o como trastorno adicional a la ancianidad, entre otras. La valoración de la actividad lactasa es, pues, de particular interés en gastroenterología, pediatría y, en general, en procesos patológicos en los que se precise evaluar la integridad funcional de la mucosa intestinal o realizar el diagnóstico diferencial con la deficiencia de este enzima. Hasta ahora, el diagnóstico de la defi-ciencia de lactasa intestinal se ha basado en:

- Determinación directa del enzima lactasa en una muestra de mucosa de intestino delgado del paciente obtenida por biopsia mediante endo-scopia (1).

- Evaluación de las consecuencias metabólicas derivadas de la deficiencia del enzima tras una prueba de sobrecarga oral de lactosa (1-2 g por Kg de peso corporal), como la aparición de sín-tomas de deficiencia en el sujeto (dolor abdomi-nal, flatulencia, diarrea, etc.), y determinación de glucosa en plasma (2), de galactosa en plas-ma (2) y orina (3) y de carbohidratos en heces (4). Evaluación de gases espirados tras la sobre-carga de lactosa resultantes de la fermentación en el colon de la lactosa no metabolizada, como es la determinación en el aliento de hidrógeno espirado (5), de14CO

2 (6) o 13CO2 (7) tras la

sobrecarga de lactosa conteniendo14C-lactosa

o13C-lactosa, respectivamente, o bien de la

ra-zón13CO

2/H2(8). Determinación en suero de la

razón13C/2H-glucosa (9) tras la sobrecarga con

lactosa conteniendo13C-lactosa y2H-glucosa.

Otros métodos de evaluación de la actividad de la lactasa intestinal se basan en el empleo de determina-dos disacáridetermina-dos que son análogos estructurales de la lactosa y que son por ello susceptibles de funcionar como sustratos de ese enzima, por lo que una vez in-geridos son transformados por la acción de la lactasa intestinal en determinados monosacáridos que son ab-sorbidos por la mucosa del intestino, pudiendo deter-minarse la eliminación de alguno de ellos en la orina. Así, los métodos descritos en las patentes españolas ES-P-478590 y ES-P-482073, se basan en la evalua-ción in vivo mediante la administraevalua-ción oral de 3-O-metil lactosa y la determinación de 3-O- 3-O-metil-D-glu-cosa en orina.

Por otra parte, en la patente española ES-P-9001680 se describe la preparación del disacárido 4-O-β-galactopiranosil-D-xilosa de la fórmula

para la evaluación in vivo de la actividad lactasa intes-tinal. Dicho disacárido se administra oralmente, actúa como sustrato de la lactasa intestinal y por tanto se hidroliza, en el tracto intestinal, en xilosa y galacto-sa, ambos son absorbidos y la xilosa es eliminada por la orina donde puede determinarse directamente me-diante un método colorimétrico simple. Las cantida-des de xilosa excretadas en orina están correlaciona-das con los niveles de lactasa intestinal.

La patente española ES-P-9001680 también des-cribe un método de preparación para la 4-O-β-ga-lactopiranosil-D-xilosa, que comprende una síntesis a partir de bencil β-D-xilopiranósido que implica re-acciones de protección selectiva, glicosilación y des-protección.

La patente española ES-P-9502185 describe pro-cedimientos enzimáticos para la preparación de mez-clas de disacáridos galactopiranosil-xilosas que con-tienen 4-O-β-galactopiranosil-D-xilosa y sus regioi-sómeros 2-O-β-galactopiranosil-D-xilosa y 3-O-β-ga-lactopiranosil-D-xilosa. La patente española ES-P-9502185 describe también el empleo de una mezcla de los tres dichos regioisómeros en la evaluación in

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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 vivode la actividad lactasa intestinal de ratas lactan-tes, demostrando que la eliminación de xilosa en orina tras la administración oral de esa mezcla a los anima-les a lo largo de su desarrollo es proporcional a la ac-tividad lactasa intestinal determinada postmortem en mucosa intestinal de los mismos animales.

La patente española ES-P-20010419 describe un procedimiento enzimático para obtener 4-O-β-galac-topiranosil-D-xilosa que implica una reacción enzi-mática entre D-xilosa y un sustrato β-D-xilopiranósi-do y una posterior fase de aislamiento y purificación de 4-O-β-galactopiranosil-D-xilosa. La patente espa-ñola ES-P-20010419 describe también el uso de 4-O-β-galactopiranosil-D-xilosa en la preparación de com-posiciones y disoluciones útiles para la evaluación in vivode lactasa intestinal en humanos.

Es objeto de esta patente describir el empleo de 4-O-β-galactopiranosil-D-xilosa preparada según el procedimiento descrito en la patente española ES-P-20010419 para la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal en hummanos como prueba diagnós-tica no invasiva de la deficiencia de este enzima. Referencias

1. Dahlqvist, A. (1964). Anal. Biochem. 7, 18-25. 2. Newcomer, A.D., McGill, D.B., Thomas, P.J. & Hofmann, A.F. (1975) N. Engl. J. Med. 293, 1232-1236.

3. Goda, T., Bustamante, S., Thornburg, W. & Koldovsky, O. (1984) Biochem. J. 221, 261-263.

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5. Metz, G., Jenkins, D.J., Peters, T.J., Newman, A. & Blendis, L.M. (1975) Lancet 1, 1155-1157.

6. Sasaki, Y., Lio, M., Kameda, H,. Ueda, H. & Aoyagi, T. (1970) J. Lab. Clin. Med. 76, 824-835.

7. Koetse, H.A., Stellaard, F., Bijleveld, C.M., Elzinga, H., Boverhof, R., Van der Meer, R., Vonk, R.J. & Sauer, P.J. (1999) Scand. J. Gastroenterol. 34, 35-40.

8. Koetse, H.A., Vonk, R.J., Pasterkamp, S., Pal, J., de Bruijn, S. & Stellaard, F. (2000) Scand. J. Gas-troenterol. 35,607-611.

9. Vonk, R.J., Stellaard, F., Priebe, M.G., Koet-se, H.A., Hagedoorn, R.E., de Bruijn, S., Elzinga, H., Lenoir-Wijnkoop, I. & Antoine, J.M. (2001) Eur. J. Clin. Invest. 31, 226-233.

Descripción de la invención

Los métodos utilizados hoy para el diagnóstico de la deficiencia de lactasa intestinal, descritos en el apartado anterior, están afectos por una serie de des-ventajas que en líneas generales implican escasa fiabi-lidad y molestias importantes en los pacientes además de la necesidad de aparataje especializado, como se describe a continuación. La determinación directa de la actividad lactasa en una muestra de mucosa de in-testino delgado del paciente obtenida por biopsia me-diante endoscopia, además de ser una prueba cruenta e invasiva y que requiere control radiológico, indica solamente la actividad del enzima en una parte o una zona determinada del intestino, que además no coin-cide generalmente con la de mayor presencia de este enzima (el yeyuno medio), por dificultades de acceso a través de endoscopia, y es además variable de unas tomas a otras, no suministrando pues información so-bre la actividad total del enzima en el individuo. El resto de los métodos son pruebas no invasivas que su-ponen una sobrecarga oral de lactosa (de 25 a 50 g) y posterior evaluación de las consecuencias

metabóli-cas de la deficiencia de lactasa, como es la medición en el aliento de gases procedentes de la metaboliza-ción de la lactosa no hidrolizada por las bacterias que pueblan el intestino grueso; estas pruebas son indi-rectas, puesto que no permiten la medida directa de la actividad del enzima in vivo, y dependen de la ca-pacidad de producción endógena de gases, como H2

o CO2, por el sujeto, lo que además de ser variable

de unos individuos a otros se afecta por factores di-versos, como el hábito de fumar, la dieta, la ingesta de laxantes o la antibioterapia oral, por lo que pre-sentan una importante proporción de falsos positivos y falsos negativos siendo por ello su fiabilidad esca-sa. Por otro lado, las pruebas de sobrecarga de lactosa requieren la ingesta de cantidades de ese azúcar muy superiores a las presentes en una dieta fisiológicamen-te equilibrada, lo que provoca molestias gastroinfisiológicamen-tes- gastrointes-tinales considerables en los sujetos deficientes como dolores abdominales, flatulencia y diarrea. En lactan-tes con presunta deficiencia, la sobrecarga de lactosa puede resultar de hecho peligrosa por la presentación de diarrea importante y deshidratación potencial, lo que obviamente requiere otro tipo de prueba. La apli-cación de las pruebas de sobrecarga de lactosa, en sus diversas modalidades, requieren de equipamiento no rutinario, como es la espirometría para la medida de gases en el aliento, que aunque usual en los medios hospitalarios no lo es en cualquier centro sanitario en general, o del empleo de contadores de centelleo, o aparataje mucho más especializado y restringido co-mo cromatografía de gases y espectrometría de masas para la determinación de14CO

2,13CO2 y13C/2

H-glu-cosa, cuando la sobrecarga implica la utilización de

1-14C-glucosa o13C-lactosa/2H-glucosa. La

administra-ción oral de 3-O-metil lactosa y determinaadministra-ción pos-terior de la 3-O-metil-D-glucosa eliminada en orina, no empleada hasta ahora en la clínica, supone, por un lado, la absorción a sangre de un compuesto no fisio-lógico, como es la 3-O-metil-D-glucosa, y requiere de sistemas de cromatografia de gases o de cromatogra-fía líquida de alta presión para su determinación. Objeto de la invención

Superar los inconvenientes de las pruebas diag-nósticas actualmente utilizadas y descritas en el párra-fo anterior, proporcionando una tecnología para la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal, como prueba no invasiva para el diagnóstico de la de-ficiencia de este enzima, que se basa en la evalua-ción directa de la actividad global del enzima en el individuo completo, no en la valoración de las con-secuencias de su deficiencia, no requiere de aparataje especializado, no provoca molestias aparentes en los pacientes portadores de deficiencia de lactasa y es al-tamente fiable, entre otras ventajas que se describen en el párrafo siguiente.

Utilizar en humanos el método basado en la utili-zación de 4-galactosilxilosa integrando en este méto-do una técnica alternativa a la determinación de xilo-sa en orina, consistente en valorar la concentración de xilosa en sangre tras la administración al paciente de 4-galactosil-xilosa, que resulta más conveniente para el caso de su utilización en recién nacidos.

Breve descripción de la invención

La metodología objeto de la invención se basa en el empleo de 4-galactosil-xilosa (4-0-β-galactopira-nosil-D-xilosa). Este compuesto funciona como un análogo estructural de la lactosa, el substrato fisioló-gico de la lactasa, de manera que tras su

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administra-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ción oral es hidrolizado por el enzima de la mucosa intestinal, pasando los productos de la reacción a la sangre y uno de ellos, la xilosa, aparece en la orina, donde puede ser valorado mediante una simple deter-minación colorimétrica. Alternativamente, en la pre-sente invención se describe la valoración de xilosa en sangre puede determinarse igualmente la presencia de xilosa en sangre, para lo que bastan unas pocas gotas de la misma, dada la elevada sensibilidad del méto-do de valoración de xilosa. En comparación con los métodos utilizados hoy para el diagnóstico de la defi-ciencia de lactasa intestinal ofrece las siguientes ven-tajas:

Alta fiabilidad, ya que esta metodología está ba-sada en la evaluación directa de la actividad del en-zima a través de la determinación de xilosa en orina o plasma, no en la valoración de las consecuencias metabólicas derivadas de su deficiencia, tales como la producción de H2o CO2 resultantes de la

fermen-tación en el colon del disacárido no hidrolizado. En consecuencia, todas aquellas circunstancias descritas en el primer párrafo de este apartado, que afectan a la generación endógena de gases y que reducen por ello marcadamente la fiabilidad de las pruebas de medida de gases en el aliento tras la sobrecarga de lactosa con producción frecuente de falsos positivos y falsos ne-gativos, no ejercen influencia alguna sobre los resul-tados que se obtienen con la invención aquí descrita.

La información que suministra es directamente in-dicativa de la actividad lactasa total in vivo en el indi-viduo.

Elevada sensibilidad: el límite mínimo de detec-ción de xilosa cuando se determina madiante análisis colorimétrico basado en la reacción con floroglucinol es de 0,1 a 0,05 µg.

Sencillez del aparataje requerido, disponible de rutina en cualquier centro sanitario con las mínimas facilidades de laboratorio de bioquímica clínica, ya que la evaluación del enzima in vivo se basa solamen-te en la desolamen-terminación de xilosa, lo que puede hacerse mediante un simple ensayo colorimétrico.

Ausencia de molestias o trastornos gastrointesti-nales adversos en los pacientes portadores de defi-ciencia de lactasa con la realización de la prueba, de-bido a que la dosis oral a que se administra el disa-cárido, 4-galactosil-xilosa, es muy reducida, que en sujetos adultos es de 0,25 g cuando la determinación de xilosa se realiza en orina y 3,0 g cuando la determi-nación de xilosa se lleva a cabo en sangre. Esto hace prever que las dosis a administrar en niños pueden ser aun más inferiores. Lo reducido de la dosis del di-sacárido es consecuencia de la alta sensibilidad de la determinación de xilosa. También es de resaltar que la hidrólisis de 4-galactosil-xilosa por la lactasa intesti-nal origina la aparición de dos productos fisiológicos, galactosa y xilosa, que son los finalmente absorbidos por la mucosa intestinal.

No requiere una participación activa por parte del sujeto, lo que resulta de particular interés en sujetos lactantes.

No hay que administrar compuestos marcados con isótopos radiactivos.

Descripción de las figuras

Figura 1: Eliminación de xilosa en orina tras la administración oral de 4 mg de 4-galactosil-xilosa (círculo negro) y actividad lactasa intestinal (círculo blanco) en ratas lactantes durante el crecimiento.

Figura 2: Niveles de xilosa en plasma tras la

admi-nistración oral de 8 mg de 4- galactosil-xilosa (círculo negro) y actividad lactasa intestinal (círculo blanco) en ratas lactantes durante el crecimiento.

Figura 3: Eliminación de xilosa en orina de un vo-luntario humano adulto con tolerancia a la ingesta lác-tea (sujeto 1, hombre) tras la administración oral de 1 g de 4-galactosil-xilosa.

Figura 4: Eliminación de xilosa en orina de volun-tarios humanos a lo largo del tiempo tras la adminis-tración oral de diferentes dosis de 4-galactosil-xilosa a dos voluntarios humanos adultos con tolerancia a la ingesta láctea (sujeto 1, hombre; sujeto 2, mujer).

Figura 5: Eliminación de xilosa en orina de volun-tarios humanos a lo largo del tiempo tras la adminis-tración oral de 250 mg de 4-galactosil-xilosa a tres hombres [sujetos 1 (círculo negro, círculo blanco), 7 (triángulo negro, triángulo blanco) y 11 (cuadra-do negro, cuadra(cuadra-do blanco)] y cinco mujeres, [sujetos 2 (círculo negro, círculo blanco), 3 (cuadrado negro, cuadrado blanco), 6 (rombo negro, rombo blanco), 8 (triángulo invertido negro, triángulo invertido blanco) y 9 (triángulo negro, triángulo blanco) tolerantes a la ingesta láctea.

Figura 6: Eliminación de xilosa en orina a lo largo del tiempo tras la administración oral de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a tres voluntarios humanos [sujetos 12 (hombre), 5 (mujer) y 10 (mujer)] con intolerancia a la ingestión láctea.

Figura 7: Valoración de xilosa en orina por cro-matrografía de gases en el sujeto 1, tolerante y en el sujeto 12, intolerante a la ingestión láctea tras la in-gestión de 0,28 g de 4-galactosil-xilosa.

Figura 8: Niveles de xilosa en plasma sanguíneo de voluntarios humanos adultos tras la administración oral de 3 g de 4-galactosil-xilosa a los sujetos 1 (círcu-lo blanco) y 2 (círcu(círcu-lo negro) con tolerancia normal a la ingesta láctea y al sujeto 12 hipolactásico (cuadrado negro).

Descripción detallada de la invención

La metodología consiste en la administración por vía oral de una disolución acuosa de 4-galactosil-xilo-sa a sujetos humanos tras ayuno de al menos 8 horas, determinándose la cantidad de xilosa presente en la orina excretada a partir de entonces tras un periodo de tiempo determinado. La metodología puede llevarse a cabo igualmente determinando la aparición de xilosa en sangre valorándola en plasma, o suero sanguíneo, preparado a partir de una muestra de sangre extraída pasado un periodo de tiempo tras la ingesta del di-sacárido. La determinación de xilosa puede llevarse a cabo mediante análisis colorimétrico basado en la reacción con floroglucinol y usándose como blanco, bien la orina basal o bien el plasma o el suero sanguí-neo basal, según la metodología que se emplee. La 4-galactosil-xilosa ingerida es hidrolizada por la lactasa intestinal, de manera que los productos de esta reac-ción enzimática, galactosa y xilosa, son absorbidos a la sangre a través de la mucosa intestinal, siendo luego excretada la xilosa en la orina, por lo que la cantidad de xilosa que a parece tanto en sangre como en ori-na tras ingerir el disacárido es expresión directa de la actividad del enzima in vivo.

La 4-galactosil-xilosa utilizada para la realización de esta invención fue preparada según el procedimien-to descriprocedimien-to en la patente española ES-P-20010419.

Tanto la eliminación de xilosa en orina, como la aparición de xilosa en sangre, tras la administración oral de 4-galactosil-xilosa se correlacionan

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estrecha-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 mente con la actividad lactasa intestinal, según se ha examinado en ratas lactantes, se representa en las Figs. 1 y 2 y se describe en los Ejemplos 1 y 2.

La ingestión de 4-galactosil-xilosa por sujetos vo-luntarios humanos adultos con capacidad normal de digestión de lactosa o tolerantes a la lactosa, esto es, que poseen niveles normales de actividad lactasa in-testinal, juzgado en base a que no refirieron el pade-cimiento de ningún tipo de molestia o trastorno gas-trointestinal adverso tras la toma de leche o cualquier alimento lácteo, dio lugar a la excreción paulatina de xilosa en orina a lo largo de un periodo de 8 horas a partir de la administración del disacárido, como con-secuencia de su hidrólisis por la lactasa intestinal. Es-to demuestra que la 4-galacEs-tosil-xilosa es substraEs-to in vivode la lactasa intestinal de humanos, según se re-presenta en las Figs. 3, 4 y 5 y se describe en los Ejem-plos 3 al 11.

La excreción de xilosa en orina por voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa aumentó con la cantidad de 4-galactosil-xilosa ingerida, cuando és-ta se empleó a dosis de 0,25 g, 0,5 g, 1 g y 3 g. La ingestión de 4-galactosil-xilosa no provocó molestias ni trastorno gastrointestinal alguno en los sujetos es-tudiados. Esto demuestra que la eliminación de xilosa por sujetos humanos es dependiente de la dosis que se administre de 4-galactosil-xilosa, siendo suficiente una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa para detec-tar con fiabilidad xilosa en orina tras la ingesta de este compuesto, según se representa en la Fig. 4 y se des-cribe en los Ejemplos 4 y 5.

La proporción de xilosa excretada en orina por vo-luntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa es-tuvo dentro del mismo rango cuando se administró la misma cantidad de 4-galactosil-xilosa a individuos del mismo sexo. Esto demuestra que los resultados obtenidos con esta metodología se reproducen con fi-delidad de unos individuos normales a otros, según se representa en la Fig. 5 y se describe en los Ejemplos 4 al 11.

La administración de 0,25 g de 4-galactosil-xilo-sa a voluntarios humanos adultos con intolerancia a la lactosa, portadores de una deficiencia de lactasa in-testinal, da lugar a una disminución marcada en la eli-minación de xilosa en orina respecto a los valore me-dios observados en voluntarios tolerantes, en función del grado de deficiencia del enzima. Esto se observó en dos sujetos estudiados que eran intolerantes a la lactosa, uno de ello diagnosticado previamente como hipolactásico intenso y otro que refirió presentar in-tolerancia a la lactosa desde el nacimiento, según se representa en las Figs. 6A y 6B, respectivamente, y se describe en los Ejemplos 12 y 13, respectivamente. La ingestión de 4-galactosil-xilosa por estos dos su-jetos intolerantes no les provocó molestias ni trastor-nos gastrointestinales de ningún tipo. Esto demuestra que la metodología que se presenta permite la eva-luación in vivo de la actividad lactasa intestinal y es una prueba válida para el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos, no provoca molestias aparentes en los sujetos portadores de una deficiencia y basta solamente una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa para detectar con fiabilidad defi-ciencias intensas del enzima.

La administración oral de 4-galactosil-xilosa y la posterior determinación de la xilosa resultante en ori-na permite diferenciar entre pacientes intolerantes a la lactosa que son portadores de una deficiencia de

lactasa intestinal y pacientes intolerantes a la lactosa que lo son por presentar un cuadro de alergia a com-ponentes de la leche pero que no son portadores de una deficiencia del enzima, puesto que en estos últi-mos la eliminación urinaria de xilosa está dentro de los límites normales. Esto se demuestra en la Fig. 6C y se describe en el Ejemplo 14; en esta Figura 6C se muestra que la eliminación urinaria de xilosa tras la ingestión de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa por una vo-luntaria adulta intolerante a la lactosa, que refirió pa-decer desde la niñez reacciones alérgicas cutáneas tras la toma de leche o alimentos lácteos, no fue signifi-cativamente diferente del comportamiento observado por la media de los voluntarios tolerantes mujeres es-tudiados. La ingestión de 4-galactosil-xilosa por esta voluntaria adulta alérgica intolerante a la lactosa no le ocasionó reacción alérgica alguna ni ningún tipo de trastorno gastrointestinal.

La eliminación de xilosa en orina tras la adminis-tración de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a sujetos tole-rantes a la lactosa, y su disminución en sujetos into-lerantes a la lactosa hipolactásicos, se muestra adicio-nalmente por una técnica de valoración de xilosa di-ferente de la reacción colorimétrica con floroglucinol, como es la cromatografía de gases. Esto se presenta en la Fig. 7 y se describe en el Ejemplo 15, en que se demuestra igualmente que la eliminación de xilosa en orina se reduce marcadamente cuando se administra 4-galactosil-xilosa a un sujeto intolerante a la lactosa hipolactásico en comparación un sujeto tolerante a la lactosa.

La administración oral de 3 g de 4-galactosil-xilo-sa a voluntarios humanos adultos tolerantes a la lacto-sa dio lugar a la aparición gradual de xilolacto-sa en plasma sanguíneo determinada colorimétricamente con floro-glucinol, que alcanzó un máximo alrededor de las 2 horas tras la ingesta del disacárido. La administra-ción oral de la misma cantidad de 4-galactosil-xilosa a un voluntario humano adulto intolerante a la lactosa diagnosticado como hipolactásico originó una dismi-nución marcada en la cantidad de xilosa determinada en plasma sanguíneo de este sujeto tras 2 horas de in-gerir el disacárido; no dando lugar esta prueba a mo-lestia o trastorno gastrointestinal alguno en este sujeto intolerante a la lactosa. Esto se muestra en la Fig. 8, describe en el Ejemplo 16 y demuestra que la determi-nación de xilosa en sangre tras la administración oral de 4-galactosil-xilosa permite la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal y es una prueba válida para el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos.

Teniendo en cuenta el patrón que sigue la apari-ción de xilosa en sangre y orina a lo largo del tiem-po tras la administración oral de 4-galactosil-xilosa a voluntarios humanos tolerantes e intolerantes a la lactosa y la alta sensibilidad del método empleado de valoración colorimétrica de xilosa con floroglucinol, las muestras de fluidos corporales a utilizar con esta metodología en sujetos adultos pueden ser orina basal previa a la ingesta de 4-galactosil-xilosa y orina total de 3 o 4 horas tras la ingesta de ese compuesto, o bien una muestra de sangre basal previa a la ingesta de 4-galactosil-xilosa y otra muestra de sangre extraída tras 2 horas de la administración de ese compuesto, sien-do suficiente un volumen de 0,3 a 0,5 ml de sangre en cada muestra.

Esta prueba es igualmente aplicable en niños y en lactantes, tanto determinando xilosa en orina como en

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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 sangre, pudiéndose disminuir a la mitad la dosis a ad-ministrar oralmente de 4-galactosil-xilosa y pudiendo ser también suficiente la utilización de muestras de sangre de 0,15 a 0,3 ml, como una primera aproxima-ción.

Ejemplos de realización de la invención Ejemplo 1

Correlación entre la eliminación de xilosa en ori-na y de la aparición de xilosa en sangre tras la admi-nistración oral de 4-galactosil-xilosa con la actividad lactasa intestinal. Esto se ha demostrado en ratas lac-tantes comparando a lo largo del desarrollo de estos animales la eliminación de xilosa en orina tras admi-nistrarles oralmente 4-galactosil-xilosa con la activi-dad lactasa determinada postmortem en mucosa intes-tinal, que como es conocido declina fisiológicamente durante el crecimiento. Para ello, un grupo constitui-do por 20 ratas lactantes pertenecientes a constitui-dos camada y con 12 días de edad, se mantuvo en ayuno durante 6 horas separadas de la madre. Transcurrido ese tiem-po, se recogió orina basal de cada animal mediante presión vesical transabdominal e inmediatamente se administraron a cada uno 4 mg de 4-galactosil-xilosa diluida en 0,3 ml de agua destilada utilizando una son-da intraesofágica. A partir de ese momento se recogió orina durante las 6 horas siguientes, determinándose en la misma la xilosa eliminada mediante análisis co-lorimétrico basado en la reacción con floroglucinol y usándose la orina basal como blanco. Inmediatamente tras la recogida de orina, se sacrificaron cuatro de los animales en los que se determinó directamente la ac-tividad lactasa en la mucosa intestinal. Para ello se re-secó un trozo de intestino delgado, se lavó, se recogió la mucosa mediante raspado con vidrio y se homoge-neizó ésta; midiéndose la actividad lactasa espectrofo-tométricamente en el homogeneizado. Los animales restantes fueron devueltos a la madre y con ellos se repitió el experimento en condiciones similares a los 15, 18, 21, 26 y 35 días de edad en que quedó extin-guida la población inicial de animales. Los resultados de esta experiencia aparecen recopilados en la Fig. 1. En la que se aprecia: 1) Que se detecta la presencia de xilosa en orina procedente de la hidrólisis de la 4-galactosil-xilosa administrada por la acción de la lac-tasa intestinal; 2) Que el curso de la eliminación de xilosa en orina, originada por la administración oral de 4-galactosil-xilosa a lo largo del crecimiento de los animales, corre paralelo con la conocida modificación fisiológica de la actividad lactasa intestina que declina a lo largo del desarrollo, correlacionándose estrecha-mente la eliminación de xilosa en orina con la acti-vidad lactasa intestinal como lo indica el coeficiente de correlación lineal (r) de 0,96 obtenido entre am-bos parámetros, según se representa en el inserto de la Fig. 1. Previamente a esta experiencia se encontró que la eliminación de xilosa en orina aumenta con el incremento de la cantidad de 4-galactosil-xilosa que se administre oralmente a los animales al margen de la edad de los animales, variando las dosis de este di-sacárido de 2 a 32 mg diluidas en 0,3 ml de agua. Esta experiencia demuestra que la metodología que se pre-senta es útil para la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal, siendo el procedimiento empleable para la evaluación no invasiva de esta actividad de ma-nera incruenta con fines diagnósticos.

Ejemplo 2

Correlación entre la eliminación de xilosa en ori-na y de la aparición de xilosa en sangre tras la

ad-ministración oral de 4-galactosil-xilosa con la activi-dad lactasa intestinal. Esto se ha demostrado en ra-tas lactantes comparando a lo largo del desarrollo de estos animales la cantidad de xilosa en plasma anali-zada tras administrarles oralmente 4-galactosil-xilosa con la actividad lactasa determinada postmortem en mucosa intestinal. Para ello, un grupo constituido por 60 ratas lactantes pertenecientes a dos camadas y con 12 días de edad, se mantuvo en ayuno durante 6 ho-ras separadas de la madre. Transcurrido ese tiempo, se extrajo sangre basal de cada animal mediante pun-ción cardíaca e inmediatamente se administraron a ca-da uno 8 mg de 4-galactosil-xilosa diluica-da en 0,3 ml de agua destilada utilizando una sonda intraesofágica. Pasadas 3 horas de la administración del disacárido se extrajo de nuevo una muestra de sangre, obteniéndose el plasma sanguíneo o fracción sobrenadante por cen-trifugación de esa muestra determinándose xilosa en el mismo mediante análisis colorimétrico con floro-glucinol y usándose el plasma de la sangre basal como blanco. Inmediatamente tras la extracción de sangre, se sacrificaron cuatro de los animales en los que se determinó directamente la actividad lactasa en la mu-cosa intestinal de la misma manera que lo descrito en el Ejemplo 1. Los animales restantes fueron devuel-tos a la madre y con ellos se repitió el experimento en condiciones similares a los 15, 18, 21, 26 y 35 días de edad en que quedó extinguida la población inicial de animales. Los resultados de esta experiencia apa-recen recopilados en la Fig. 2. En la que se aprecia: 1) Que se detecta la aparición de xilosa en plasma sanguíneo procedente de la hidrólisis de la 4-galac-tosil-xilosa administrada por la acción de la lactasa intestinal; 2) Que el curso de la aparición de xilosa en plasma sanguíneo, originada por la administración oral de 4-galactosil-xilosa a lo largo del crecimien-to de los animales, corre igualmente paralelo con el declive fisiológico de la actividad lactasa intestina a lo largo del desarrollo, correlacionándose de manera muy estrecha la aparición de xilosa en plasma sanguí-neo con la actividad lactasa intestinal como lo indica el coeficiente de correlación lineal (r) de 0,98 obteni-do entre ambos parámetros, según se representa en el inserto de la Fig. 2. Previamente a esta experiencia se encontró que la aparición de xilosa en plasma sanguí-neo alcanza su máximo nivel en torno a 3 horas tras la administración oral de 4-galactosil-xilosa, que la can-tidad de xilosa en plasma aumenta con el incremento de la cantidad de 4-galactosil-xilosa que se adminis-tre oralmente a los animales al margen de la edad de los animales cuando la dosis de este disacárido va-rió de 4 a 16 mg diluida en 0,3 ml de agua y que las cantidades de xilosa en suero sanguíneo obtenido tras dejar reposar las muestras de sangre durante 20 minu-tos a temperatura ambiente y centrifugación posterior fueron similares a las determinadas en plasma. Esta experiencia demuestra que la determinación de xilosa en plasma o suero sanguíneo tras las administración oral de 4-galactosil-xilosa es igualmente útil para la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal, siendo el procedimiento empleable para la evaluación no invasiva de esta actividad de con fines diagnósti-cos.

A continuación se describe una serie de ejemplos de realización de la invención llevados a cabo con di-versos voluntarios humanos adultos, todos ellos fue-ron informados por escrito del estudio a realizar y die-ron su consentimiento escrito de participación

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volun-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 taria en el mismo. Ejemplo 3

La 4-galactosil-xilosa es substrato in vivo de la lactasa intestinal de humanos. Esto se ha demostra-do en primer lugar administrandemostra-do oralmente 1 g de 4-galactosil-xilosa disuelto en 50 ml de agua a un vo-luntario adulto hombre (sujeto 1) ayunado 8 horas y con tolerancia normal a la ingesta de leche y produc-tos lácteos, o sea tolerante a la lacproduc-tosa. A este sujeto se le tomó una muestra de orina basal inmediatamen-te aninmediatamen-tes de ingerir el disacárido 4-galactosil-xilosa y se volvió a recoger su orina tras la ingesta del mismo cada hora durante 8 horas, constituyendo cada mues-tra la totalidad de la orina excretada en cada perio-do de tiempo. Se determinó xilosa en todas las mues-tras mediante análisis colorimétrico basado en la reac-ción con floroglucinol y usándose la orina basal como blanco. La ingestión de 4-galactosil-xilosa no provo-có molestias ni trastorno gastrointestinal alguno a este sujeto. Los resultados de esta experiencia aparecen re-copilados en la Fig. 3, donde se representa la cantidad de xilosa determinada en cada muestra (con símbo-lo) y la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo (con símbolo) calcula-da adicionando a la canticalcula-dad de xilosa determinacalcula-da en cada muestra las cantidades determinadas en todas las muestras precedentes. En esta Fig. 1 se aprecia: 1) Que se excreta xilosa en la orina de este sujeto tras la administración oral de 4-galactosil-xilosa; 2) Que la eliminación de xilosa en orina fue máxima a las 2 horas y se acumuló progresivamente en la misma tras la administración de este compuesto. Esta experien-cia demuestra que la 4-galactosil-xilosa es substrato in vivo de la lactasa intestinal de humanos y que la determinación de xilosa en orina oral de 4-galactosil-xilosa es útil para la evaluación in vivo de la actividad lactasa intestinal en humanos, siendo el procedimien-to empleable para la evaluación no invasiva de esta actividad de con fines diagnósticos.

Ejemplos 4 y 5

La eliminación de xilosa en orina por voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa varia con la cantidad de 4-galactosil-xilosa ingerida. Esto se ha demostrado administrando 0,25 g, 0,5 g y 3 g de 4-ga-lactosil-xilosa a un voluntario adulto hombre toleran-te a la lactosa (sujeto 1, Ejemplo 4) y a un voluntario adulto mujer tolerante a la lactosa (sujeto 2, Ejemplo 5) en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 1 y determinando igualmente xilosa colori-métricamente con floroglucinol en la orina excretada por ambos a lo largo del tiempo tras la ingesta del di-sacárido. Se dejó un periodo libre de entorno a una semana entre cada toma de 4-galactosil-xilosa por el mismo individuo. La ingestión de 4-galactosil-xilosa a las dosis utilizadas no provocó molestias ni trastorno gastrointestinal alguno a ninguno de estos dos sujetos. Los resultados de estas experiencias aparecen recopi-lados en la Fig. 4 panel A (para el sujeto 1 y Ejemplo 4) y en la Fig. 4 panel B (para el sujeto 2 y Ejemplo 5), donde se representa la cantidad de xilosa acumulada en la orina tras la ingesta de 4-galactosil-xilosa para cada dosis administrada. En la Fig. 4A se incluyen los datos obtenidos con el mismo sujeto 1 tras ingerir 1 g del disacárido procedentes de la Fig. 3 para que pue-da compararse con el resto de las dosis administrapue-das. En estas Figuras 4A y 4B se aprecia: 1) Que la elimi-nación de xilosa en orina a lo largo del tiempo tras la ingesta de 4-galactosil-xilosa aumentó al

incremen-tarse la cantidad administrada tanto al sujeto 1 (Fig. 4A), como al sujeto 2 (Fig. 4B); 2) Que una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa permitió detectar con fa-cilidad la aparición de xilosa en orina de cualquiera de estos dos sujetos. Estas experiencias demuestran: 1) Que la excreción de xilosa en orina por voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa aumentó con la cantidad de xilosa ingerida cuando ésta se adminis-tró oralmente a dosis de 0,25 g, 0,5 g, 1 g y 3 g, sin que ninguna de las dosis utilizadas provoque moles-tias ni trastorno gastrointestinal alguno derivados de la realización de la prueba y 2) Que una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa es suficiente como para deter-minar xilosa en orina con alta fiabilidad tras la ingesta de este disacárido.

Ejemplos 6 al 11

La proporción de xilosa excretada en orina por vo-luntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa esta dentro del mismo rango cuando se administra la mis-ma cantidad de 4-galactosil-xilosa a individuos del mismo sexo. Esto se ha demostrado administrando 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a 8 voluntarios adultos tolerantes a la lactosa, 3 hombres (sujeto 1, Ejemplo 4; sujeto 7, Ejemplo 6; sujeto 11, Ejemplo 7) y 5 mu-jeres (sujeto 2, Ejemplo 5; sujeto 3, Ejemplo 8; sujeto 6, Ejemplo 9; sujeto 8, Ejemplo l0; sujeto 9, Ejemplo 11) en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 1 y determinando igualmente xilosa colori-métricamente con floroglucinol en la orina excretada por los sujetos a lo largo del tiempo tras la ingesta del disacárido. La ingestión de 4-galactosil-xilosa a las dosis utilizadas no provocó molestias ni trastor-no gastrointestinal algutrastor-no a ningutrastor-no de estos sujetos. Los resultados de estas experiencias aparecen recopi-lados en la Fig. 5 que comprende los paneles A, B, C y D, donde se representa la cantidad de xilosa deter-minada en cada muestra (con símbolos blancos) y la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo (con símbolo negros) calcula-da adicionando a la canticalcula-dad de xilosa determinacalcula-da en cada muestra las cantidades determinadas en todas las muestras precedentes. En el panel A se represen-tan los valores individuales obtenidos con cada uno de los sujetos hombres (sujetos 1, 3 y 6). En el panel B representan los valores individuales obtenidos con cada uno de los sujetos mujeres (sujetos 2, 3, 6, 8 y 9). En los paneles C y D se representan los valores medios ± el error estándar de la media calculados pa-ra los valores correspondientes a los sujetos hombres y mujeres estudiados, respectivamente. En la Fig. 5A se incluyen los datos obtenidos con el sujeto 1 tras in-gerir 0,25 g de 4-galactosil-xilosa procedentes de la Fig. 4A y en la Fig. 5B se incluyen los datos obteni-dos con el sujeto 2 tras ingerir 0,25 g de 4-galactosil-xilosa procedentes de la Fig. 4B, con objeto de que puedan compararse con el resto sujetos estudiados en las mismas condiciones. En esta Fig 5 se aprecia: 1) Que el acúmulo de xilosa eliminada en orina estuvo dentro del mismo rango, no excediendo el error es-tándar del 37% sobre la media en los hombres y del 8% en las mujeres y 2) Que la máxima eliminación de xilosa estuvo entre 2 y 3 horas tras la ingesta del disa-cárido. Estas experiencias demuestran que los resul-tados obtenidos con esta metodología se reproducen con fidelidad de unos individuos a otros.

Ejemplos 12 y 13

La administración de 4-galactosil-xilosa a volun-tarios humanos intolerantes a la lactosa y posterior

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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 determinación de xilosa en orina permite detectar la deficiencia de lactasa intestinal. Esto se ha demostra-do administrandemostra-do 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a demostra-dos sujetos voluntarios con sintomatología de intolerancia a la lactosa y determinando xilosa colorimétricamen-te con floroglucinol en la orina excretada por ambos a lo largo del tiempo tras la ingesta del disacárido. Uno de ellos (sujeto 12, Ejemplo 12), era un varón de 64 años de edad con intolerancia severa a la in-gesta láctea desde los 8 años, diagnosticado previa-mente como hipolactásico tanto por biopsia intestinal como por pruebas de sobrecarga de lactosa, portando por tanto una deficiencia intensa de lactasa intestinal. El otro, (sujeto 5, Ejemplo 13) era una mujer de 30 años de edad que refirió padecer sintomatología de intolerancia a la lactosa desde el nacimiento, que pre-cisó entonces el abandono de la lactancia materna y el cambio a una leche sin lactosa, portando presunta-mente una deficiencia congénita de lactasa intestinal. La ingestión de 4-galactosil-xilosa a las dosis utiliza-das no provocó molestias ni trastorno gastrointestinal alguno a ninguno de estos dos sujetos. Los resultados de estas experiencias aparecen recopilados en la Fig. 6 panel A (sujeto 12, Ejemplo 12) y panel B (sujeto 5, Ejemplo 13), donde se representa la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo en ambos sujetos (con símbolos negros), incluyendo en cada caso la curva que representa los valores me-dios de los voluntarios tolerante a lactosa correspon-dientes a su sexo y tomadas de las Figs. 5C y 5D, para facilitar la comparación. En esta Fig. 6 se aprecia: 1) Que la eliminación de xilosa en orina por el sujeto 12 fue muy inferior a los valores medios de eliminación de xilosa en voluntarios tolerantes a la lactosa, excre-tando este sujeto 1,33 mg totales de xilosa en orina de 8 horas tras la ingestión del disacárido, que frente al valor medio encontrado en los voluntarios toleran-tes hombres estudiados de 35,7 ± 2,0 mg tras el mis-mo periodo de tiempo representó una disminución del 96%, lo que esta de acuerdo con su diagnóstico pre-vio de deficiencia intensa de lactasa intestinal; 2) Que la eliminación de xilosa en orina por el sujeto 5 fue muy inferior a los valores medios de eliminación de xilosa en voluntarios tolerantes a la lactosa, excretan-do este sujeto 4,08 mg totales de xilosa en orina de 8 horas tras la ingestión del disacárido, que frente al valor medio encontrado en los voluntarios tolerantes mujeres estudiados de 23,5 ± 2,0 mg tras el mismo pe-riodo de tiempo representó una disminución del 83%, lo que indica que se este sujeto porta una deficiencia también intensa de lactasa intestinal de carácter con-génito, ya que presentó intolerancia a la lactosa des-de el nacimiento. Estas experiencias des-demuestran que la metodología que se presenta permite la evaluación in vivode la actividad lactasa intestinal y el diagnós-tico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos, no provoca molestias aparentes en los su-jetos portadores de una deficiencia y basta solamente una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa para detec-tar con fiabilidad deficiencias intensas del enzima en sujetos adultos.

Ejemplo 14

La administración de 4-galactosil-xilosa a volun-tarios humanos intolerantes a la lactosa y posterior determinación de xilosa en orina, permite diferenciar entre pacientes intolerantes a la lactosa que portan una deficiencia de lactasa intestinal y pacientes intoleran-tes a la lactosa que lo son por presentar un cuadro

de alergia a componentes de la leche, pero que no son portadores de una deficiencia del enzima. Esto se ha demostrado con la administración de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa y determinación posterior de xilosa colorimétricamente con floroglucinol en la orina ex-cretada a lo largo del tiempo por un sujeto voluntario (sujeto 13), mujer de 25 años de edad, que presen-tó sintomatología de intolerancia a la lactosa a partir de los 12 años y que también refirió padecer alergia cutánea aguda tras la ingesta de leche. La ingestión de 4-galactosil-xilosa a la dosis utilizada no provocó molestias ni trastorno gastrointestinal alguno en este sujeto. Los resultados de esta experiencias aparecen recopilados en la Fig. 6 panel C, donde se representa la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo en este sujeto (con símbolos ne-gros), incluyendo también la curva que representa los valores medios de los voluntarios tolerante a lactosa correspondientes a su sexo y tomada de la Fig. 5D pa-ra facilitar la compapa-ración. En esta Fig. 6C se aprecia que este sujeto presentó un patrón de eliminación de xilosa prácticamente normal, excretando a las 8 horas la misma cantidad total que la media de las mujeres tolerantes, no tratándose entonces de una deficiencia del enzima, sino de un caso de alergia a algún compo-nente de la leche a la vista de los datos clínicos refe-ridos por el paciente. Esta experiencia demuestra que la metodología que se presenta permite diferenciar en-tre pacientes intolerantes a la lactosa que portan una deficiencia de lactasa intestinal y pacientes intoleran-tes a la lactosa que lo son por presentar un cuadro de alergia a componentes de la leche, pero que no son portadores de una deficiencia real del enzima. Ejemplos 15 y 16

La eliminación de xilosa en orina tras la adminis-tración de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a sujetos tole-rantes a la lactosa, y su disminución en sujetos into-lerantes a la lactosa hipolactásicos, se observa igual-mente por una técnica de valoración de xilosa diferen-te de la reacción colorimétrica con floroglucinol. Esto se ha demostrado administrando 0,25 g de 4-galacto-sil-xilosa a un sujeto voluntario tolerante a la lactosa [sujeto 1 (estudiado también en el Ejemplo 3), Ejem-plo 15] por un lado, y por otro a un sujeto voluntario intolerante a la lactosa portador de una deficiencia in-tensa de lactasa intestinal [sujeto 12 (estudiado tam-bién en el Ejemplo 12), Ejemplo 16], y determinan-do xilosa por cromatografía de gases en la orina total recogida tras 3 horas de ingerir el disacárido con un cromatógrafo equipado con detector de ionización de llama y columna espiral de vidrio de 12 m de longi-tud, 0,2 mm de diámetro interno y 0,3 gm de espe-sor. La presencia de xilosa en la orina se detectó en forma de su trimetilsililderivado. Para ello la muestra de orina se liofilizó y se disolvió en 20 µl de piridi-na conteniendo 1 mM de bencil (3-D-xilopiranósido como referencia interna. A continuación se añadieron otros 20 µl de N-trimetilsililimidazol como agente si-lilante, se sonicó la mezcla durante un minuto y se calentó a 60◦

C durante 30 minutos, inyectándose lue-go 1-2 µl de muestra en el cromatógrafo de gases. La temperatura del inyector y del detector empleada fue de 250◦

C, y el gradiente de temperatura en la columna fue el siguiente: 2 minutos a 180◦

C y un incremento de 5◦C por minuto hasta llegar a 250C,

mantenién-dose esa temperatura durante 15 minutos. La concen-tración de xilosa en cada muestra se calculó a par-tir de las áreas de los picos correspondientes en los

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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 cromatogramas. Los resultados de esta experiencias aparecen recopilados en la Fig. 7, donde se muestran los cromatogramas correspondientes a las muestras de orina basal y de orina de 3 horas pertenecientes al su-jeto tolerante y al susu-jeto intolerante, indicándose los tiempos de retención en minutos de los picos asigna-dos a xilosa y al patrón interno en cada caso. En esta Fig. 7 se aprecia que la xilosa excretada en orina de 3 horas tras la ingesta de 4-galactosil-xilosa por el su-jeto 12 hipolactásico fue igualmente muy inferior a la que excretó el sujeto 1 tolerante a la lactosa, según se aprecia por al área de los picos correspondientes a xilosa en los cromatogramas, determinándose con este procedimiento una cantidad de 2,1 mg totales de xilosa en orina de 3 horas del sujeto 12 intolerante hi-polactásico frente a 25,2 mg totales de xilosa en orina de 3 horas del sujeto 1 tolerante a la lactosa, lo que representó una disminución del 92% que esta en con-cordancia con la intensa deficiencia de lactasa intesti-nal que padece este sujeto hipolactásico y es similar al grado de la disminución de xilosa determinada colori-métricamente tras el mismo periodo de tiempo en este mismo sujeto que se aprecia en la Fig. 6A. Esta expe-riencia demuestra que la metodología que se presenta permite el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de lactasa intestinal en humanos independientemente del método de medida que se emplee para la determina-ción de la xilosa eliminada.

Ejemplos 17 al 19

La determinación de xilosa en sangre tras la admi-nistración oral de 4-galactosil-xilosa permite el diág-nóstico no invasivo de la deficiencia de lactasa intes-tinal. Esto se ha demostrado administrando 3 g de 4-galactosil- xilosa a dos sujeto voluntarios tolerantes a la lactosa [sujeto 1, Ejemplo 17 y sujeto 2, Ejem-plo 18 (estos sujetos fueron estudiados también en los Ejemplos 3 al 6)] y al sujeto 12 intolerante a la lacto-sa hipolactásico [Ejemplo 19 (este sujeto fue

estudia-do también en los ejemplos 12 y 15]) y determinan-do xilosa colorimétricamente con floroglucinol en el plasma sanguíneo de muestras de sangre obtenidas de estos sujetos previamente a la ingesta del disacárido y tras la ingesta del mismo a intervalos de aproxima-damente 1 hora durante 6 horas; en el sujeto hipo-lactásico se tomó una muestra de sangre basal y otra muestra de sangre tras 2 horas de ingerir el disacárido 4-galactosil-xilosa. La ingesta de los 3 g de 4-galac-tosil-xilosa no dio lugar a molestia o trastorno gas-trointestinal alguno en este sujeto 12 intolerante a la lactosa ni en los dos sujetos tolerantes. Los resultados de esta experiencias aparecen recopilados en la Fig. 8, donde se aprecia: 1) Que aparece xilosa en el plasma sanguíneo tras la administración oral de 4-galactosil-xilosa a los sujetos 1 y 2 tolerantes a la lactosa, como consecuencia de la hidrólisis de este disacárido por la lactasa intestinal; 2) Que la aparición de xilosa en el plasma sanguíneo de esto dos sujetos alcanzó un má-ximo alrededor de las 2 horas de ingerir 4-galactosil-xilosa para luego disminuir hasta ser indetectable a las 6 horas, como consecuencia del paso de xilosa a la orina; 3) Que en el sujeto 12 intolerante a la lactosa se detectó xilosa en plasma sanguíneo procedente de la muestra de sangre tomada tras 2 horas de la ingesta de 4-galactosil-xilosa en una cantidad de 0,48 µg/100 µl de plasma, que frente a la cantidad detectada a un intervalo de tiempo parecido en el sujeto 1, de 1,72 µg/100 ml de plasma y en el sujeto 2, de 1,95 µg/100 ml de plasma, representó una disminución de xilosa en el plasma del sujeto intolerante hipolactásico del 72% y del 75%, respectivamente. Estas experiencias demuestran que la determinación de xilosa en sangre tras la administración oral de 4-galactosil-xilosa per-mite la evaluación in vivo de la actividad lactasa in-testinal y es una prueba válida para el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos.

(10)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 REIVINDICACIONES

1. Uso de 4-galactosil-xilosa para la elaboración

de composiciones farmacéuticas para la determina-ción de xilosa en sangre en humanos.

(11)
(12)
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(15)
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(18)
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ESPAÑA

21

Nº de solicitud:200202372

22

Fecha de presentación de la solicitud:16.10.2002

32

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA

51

Int. Cl.7: C12Q 1/34

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría Documentos citados Reividicaciones

afectadas

Categoría de los documentos citados

X: de particular relevancia

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría

A: refleja el estado de la técnica

O: referido a divulgación no escrita

P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud

E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado



5 para todas las reivindicaciones



para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe Examinador Página

03.05.2004 A. Maquedano Herrero 1/1

X ES 2023556 A6 (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) 1 16.01.1992, resumen; página 2, líneas 48-61; página 3,

líneas 36-62; página 4, líneas 1-4.

X ES 2100131 A1 (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) 1 01.06.1997, resumen; página 2, líneas 30-38.

X RIVERA-SAGREDO, A. et al.: "4-O-Beta-D-Galactopyranosyl-D-xylose: 1 A new synthesis and application to the evaluation of intestinal

lactase", Carbohydrate Res., (1992), Vol. 228, páginas 129-135, resumen; página 131, 2º párrafo; página 132, 1er párrafo.

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