Efecto biocida de Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutante sobre larvas III de Aedes aegypti bajo condiciones de laboratorio

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REBIOL 2017; 37(2): 14 - 21, Julio - Diciembre Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas.

Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú. ISSN: 2313-3171 (En Línea)

Artículo Original

Efecto biocida de

Bacillus thuringiensis

H-14 var.

israelensis mutante sobre larvas III de

Aedes

aegypti

bajo condiciones de laboratorio

Biocidal effect of

Bacillus thuringiensis

H-14 var. israelensis mutant

on larvae III of

Aedes aegypti

under laboratory conditions

Willian Blas-Cerdán

1

, Gina Zavaleta-Espejo

1

, José Saldaña-Jiménez

1

,

Willian Blas-Roeder

2

y Deyvi Meléndez-Rodríguez

1

1Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú. 2Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional de Trujillo.

RESUMEN

Se evaluó el efecto biocida de Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutante sobre larvas III de Aedes aegypti bajo condiciones de laboratorio. Para ello se utilizó una formulación comercial como testigo (2000 ppm) y tres formulaciones de Bti mutante a tres concentraciones (3000, 4000 y 5000 ppm) y larvas de A. aegypti

obtenidas a partir de huevo bajo un sistema de iluminación constante, temperatura de 26 ±1°C y pH de 7.0. La aplicación de las formulaciones se realizó en vasos descartables conteniendo 100 mL de agua destilada con 25 larvas para cada una de las concentraciones consideradas. Las evaluaciones de mortalidad larvaria se hicieron a partir de las 40 horas después de la aplicación, ocurriendo el mayor efecto larvicida con la formulación del Bti mutante 2 a 4000 ppm, la misma que presenta diferencias significativas (p<0,05)con respecto a las otras formulaciones utilizadas. Se determinó que no existe relación directa entre la producción del bioinsecticida Bti mutante y la actividad biocida sobre las larvas III de A. aegypti.

Palabras clave: Bacillus thuringiensis, Aedes aegypti, mutante, bioinsecticida, formulación

ABSTRACT

Biocidal effect of Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutant strain on larvae III of Aedes aegypti

under laboratory conditions was examined. For this, a commercial formulation was used as control (2000 ppm) and three formulations of mutant Bti (3000, 4000 and 5000 ppm) and A. aegypti larvae, which were obtained from eggs under a constant lighting system, at a temperature of 26 ± 1 ° C and a pH of 7.0. The application of the formulations was carried out in disposable cups containing 100 mL of distilled water with 25 larvae for each of the concentrations considered. The evaluations of larval mortality were made from 40 hours after the application, with the highest larvicidal effect with the mutant Bti 2 (4000 ppm formulation), which presents significant differences (p<0,05) with respect to the other formulations used. It was determined that there is no direct relationship between the production of the Bti mutant bioinsecticide and the biocidal activity on larvae III of A. aegypti.

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INTRODUCCIÓN

Aedes aegypti, es el vector del virus que ocasiona el Dengue, una enfermedad muy frecuente en el hombre, constituyéndose en un severo problema de salud pública, especialmente en países tropicales donde las condiciones ambientales favorecen su desarrollo y proliferación. Se estima que anualmente se presentan 50 millones de casos en el mundo1. Así mismo en el Perú el primer caso de Dengue se registró en 1852, en 1990 en Iquitos y Tarapoto se reportó una epidemia de 150000 personas infectadas, y en Trujillo se diagnosticaron 7000 casos de Dengue clásico durante el año 2000 2.

El Dengue se transmite por la hembra A. aegypti cuyo hábito alimenticio, hematófaga, favorece la propagación de la virosis. Su ciclo biológico presenta dos etapas bien diferenciadas, la fase acuática de huevo, larva y pupa; y la fase aérea de adulto o imago. El periodo larval comprende cuatro estadios: I, II, III y IV, siendo los tres primeros los más voraces, obteniendo su alimento del agua que se encuentra en recipientes naturales o artificiales. El periodo larval transcurre entre 5 a 7 días en condiciones favorables de alimentación y a 27° C de temperatura; el ciclo completo puede durar entre 10 a 15 días, dependiendo de las condiciones ambientales 3.

Hasta el momento el uso del larvicida temephos y cipermetrinas para adultos de A. aegypti han tenido buenos resultados, sin embargo se ha informado casos de resistencia. Ante ello, una posible alternativa para solucionar el problema de resistencia es el control biológico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente cuyos productos reducen sus efectos. Así mismo se ha reportado la existencia de más de 1500 especies de microorganismos entomopatógenos, entre los cuales las bacterias son de mayor importancia, constituyendo los bioinsecticidas 4,5.

Bacillus thuringiensis (Bt), es una bacteria que se encuentra en la flora natural del suelo, de forma bacilar, Gram positiva, anaeróbica facultativa y formadora de esporas; esta bacteria produce toxinas altamente específicas contra insectos 6, cuya producción comercial se realiza por fermentación en grandes biorreactores. Primero se propaga en una fase vegetativa y exponencial; cuando un compuesto nutritivo del medio se agota, la bacteria entra en fase de esporulación sintetizando las proteínas toxigénicas en forma de cristales. Después de terminada la esporulación, las células se lisan por completo liberándose la espora y los cristales paraesporales; luego de la citólisis, la masa de la espora es aproximadamente 15% de la célula vegetativa y el cristal es del orden del 12% al 17% de la misma 7,8. Durante muchos años se pensó que Bt era un patógeno exclusivo de lepidópteros, porque solo se aislaron cepas activas de este grupo de insectos. Sin embargo, en 1978 De Barjac describió la variedad israelensis, que actúa en forma muy específica contra mosquitos de los géneros Cúlex, Anópheles y Aedes 9.

Los cristales son protoxinas formados por la glucoproteína  - endotoxina, de elevado peso molecular (130 a 140 Kda), las que se presentan en forma bipiramidal, cuboide, esférica o compuesta 10, 11,12. La - endotoxina es efectiva solamente cuando es ingerida por insectos que tienen en las membranas de sus células epiteliales del intestino medio, receptores específicos para ligar dicha toxina 13,14.

Determinados agentes ambientales, físicos o químicos pueden alterar la estructura molecular del ADN, provocando una mayor frecuencia de mutaciones, a los mismos que se les denomina mutágenos o agentes mutagénicos. Dentro de los mutagénicos químicos se encuentran el 5-Bromouracilo, etil metano sulfonato (EMS), ácido nitroso, cloruro de hidroxilamina, naranja de acridina, entre otros, pudiéndose agruparse en varias categorías como: análogo de bases, hidroxílantes, desaminantes, alquilantes e intercalares 15. El naranja de acridina, es un colorante catiónico selectivo de los ácidos nucleicos y se encuentra dentro de los agentes mutagénicos intercalares, integrándose entre las bases nitrogenadas del ADN16.

Se han reportado trabajos en Escherichia coli, Rhizobium sp. y Drosophila melanogaster, donde se confirma su actividad mutagénica en concentraciones que van de 10 a 100 g/mL. Los mutantes

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obtenidos de E. coli tratados con naranja de acridina resultaron con una mayor actividad de la enzima penicilina G-acylicasa, en tanto se sugiere que se podría utilizar para la producción de otros metabolitos secundarios en otros organismos 17, 18.

En la actualidad Bt, es el producto comercial de mayor difusión y uso a nivel internacional por su alta especificidad, inocuidad para el hombre, animales y plantas, al no dejar residuos tóxicos en el ambiente 19. Debido a la importancia de Bti en la producción de bioinsecticida, cuyos genes se encuentran muy emparentados entre sí, se ha creído conveniente desarrollar una nueva estrategia que permita incrementar el control de larvas de A. aegypti utilizando Bti mutante inducido con naranja de acridina.

Por lo antes expuesto se pretende conocer el efecto biocida de Bti mutante sobre larvas III de A. aegypti bajo condiciones de laboratorio; esperando que a mayor concentración de Bti mutante mayor será la mortalidad de larvas III de A. aegypti. Por otro lado la presente investigación tiene como finalidad determinar las diferentes concentraciones de Bti mutante con mayor actividad larvicida, así como establecer la relación entre la producción de Bti mutante y su acción biocida.

MATERIAL Y MÉTODOS Material biológico

Se usaron larvas de A. aegypti obtenidas de huevos de la cepa Rockefeller, proporcionado por el Laboratorio de Protozoología de la Facultad de Ciencias Biológicas; Bioinsecticidas: una formulación comercial de Bti “Lepibac” P.M. y formulaciones de Bti mutante inducidas con naranja de acridina 20; conservadas a -4°C.

Obtención de larvas III de Aedes aegypti en condiciones de laboratorio.

Los huevos de A. aegypti se colocaron en fuentes de plástico de 20 por 30 cm. con agua destilada hasta su eclosión. Las larvas emergieron en un lapso de 2 a 3 días, y se alimentaron con “conejina”, previamente triturada y esterilizada a 80 °C por 30 minutos. El agua se recicló diariamente para evitar el desarrollo de patógenos hasta alcanzar el estadio de larvas III, cinco días después de la eclosión 21. Todo el proceso se desarrolló utilizando un sistema de iluminación constante, con focos de 50 watts, para mantener una temperatura a ± 26°C, utilizando un termo hidrómetro y a un pH de 7,0.

Tamaño y representatividad de la muestra

Se utilizó 2500 huevos de A. aegyti, de los cuales emergieron aproximadamente 1800 larvas y para el desarrollo de la investigación se tomaron al azar 1200 de ellas.

Producción de Bti mutante

En un medio de cultivo Nysma conteniendo 80, 160 y 200 ppm del mutageno naranja de acridina, se realizó la siembra de Bti, y luego de 48 horas se detectaron colonias mutantes: M1, M2 y M3, y se seleccionaron por sus características fenotípicas. Luego de un proceso de fermentación por 50 horas, en biorreactores tipo tanque cilíndrico aireado y agitado, para cada concentración se obtuvo la biomasa de Bti mutante. Posteriormente se centrifugó, deshidrató y trituró la biomasa, cuantificándose en gramos de peso seco por litro, con un contenido de esporas, cristales proteicos y residuos celulares; el mismo que se considera como una formulación 20.

Determinación de la dosis letal media de la formulación comercial.

Se pesaron 50, 80, 125, 250 y 500 mg de la formulación; y se diluyeron en 100 mL de agua destilada, contenidos en placas petri de 19 cm de diámetro más un control, posteriormente se colocaron 25 larvas III de A. aegypti para cada concentración. La dosis letal media se determinó por el recuento de larvas muertas en tres repeticiones.

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Se eligieron cuatro tratamientos de tres formulaciones de Bti mutante y una de la formulación comercial “testigo”: 0, 2000, 3000, 4000 y 5000 ppm; se utilizó 20 vasos descartables conteniendo 25 larvas y 100 mL de agua destilada en cada repetición, el ensayo se realizó por triplicado. Los datos se tomaron a partir de las 40 horas después de la aplicación, siguiendo un diseño experimental en bloques completos al azar, donde cada tratamiento son las formulaciones y cada bloque las concentraciones22.

Análisis Estadístico

Con los datos obtenidos en la experiencia, se realizaron los cálculos para estimar la línea de regresión, y determinar la dosis letal media y dosis letal máxima, así como el Análisis de varianza y la comparación de medias por el método de Duncan, para establecer la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos, con una PEI=0,05 22.

RESULTADOS

En la Fig. 1, se muestra el efecto biocida de Bti sobre larvas III de A. aegypti a través de la línea de regresión, donde la dosis letal media se encuentra entre 1250 y 2500 partes por millón; y la dosis letal máxima ocurre a partir de 5000 ppm de la formulación comercial, a partir de las 40 horas de aplicación.

El número promedio de larvas III muertas de A. aegypti producidas por las diferentes formulaciones a distintas concentraciones de Bti, obtuvieron sus valores máximos a 4000 ppm en cada uno de los tratamientos (M1: 11,76; M2: 13,10; M3: 11,38) excepto en el testigo, después de las 40 horas de aplicación, como se observa en la Tabla 1.

En la Tabla 2, se presenta el análisis de varianza para el promedio de larvas III muertas de A. aegypti

por cada formulación de Bti mutante, incluido el testigo, a diferentes concentraciones (ppm) a partir de las 40 horas de aplicación.

La prueba de comparación de media de Duncan, confirma la existencia de diferencias significativas entre la formulación comercial, M1 y M3 con respecto al M2 de Bti, en relación al número promedio de larvas III muertas de A. aegypti, como se indica en la Tabla 3.

Tabla 1. Número promedio de larvas III muertas de Aedes aegypti producidas por cada formulación de Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutante incluso la formulación comercial diferentes concentraciones (ppm) a

partir de las 40 horas después de la aplicación.

BLOQUES TRATAMIENTOS T1 (F.C) T 2 (M1) T 3 (M2) T 4 (M3) 2000 ppm 13,42 9,77 9,86 9,83 3000 ppm 10,25 9,78 13,20 10,70 4000 ppm 10,23 14,80 15,70 14,60 5000 ppm 10,10 12,70 13,62 10,40 Promedio 11,00 11,76 13,10 11,38

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0 5 10 15 20 25 30 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 N º d e lar vas m u e rtas

Concentración de la formulación comercial (ppm)

Fig 1. Línea de regresión para determinar la Dosis Letal Media (DL50) y Dosis Letal Máxima (DL100) de las diferentes concentraciones (ppm) de una formulación comercial de Bti “Lepibac” sobre larvas III de Aedes

aegypti a partir de las 40 horas después de la aplicación.

Tabla 2. Análisis de varianza para el promedio de larvas III muertas de Aedes aegypti para cada formulación de

Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutante, incluido la formulación comercial a diferentes concentraciones (ppm) a partir de las 40 horas después de la aplicación.

Fuente de

Variación Grados de Libertad

Suma de

Cuadrados Cuadrado Medio calculadoF- tabuladoF- Entre tratamientos 3 9,97 3,32 7,72 3,86* Entre bloques 3 24,00 8,00 18,60 3,86 * Error 9 3,90 0,43 Total 15 37,87

P.E.I.: 0,05, * Presentan diferencias significativas DL50

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Tabla 3. Prueba de comparación de medias de Duncan de larvas III muertas de Aedes aegypti para cada formulación de Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutante, incluido la formulación comercial a

diferentes concentraciones (ppm) a partir de las 40 horas después de la aplicación. Tratamientos Promedio de

larvas muertas Grupos Homogéneos

T1 (F.C) 11,00 X T2 (M1) 11,76 X T3 (M2) 13,10 XX T4 (M3) 11,38 X P.E.I.: 0,05 DISCUSIÓN

En todo trabajo de investigación, que implica comprobar la actividad de una sustancia determinada sobre algún sistema biológico, se hace necesario conocer la dosis letal media y la dosis letal máxima; porque a partir de ellas podemos elegir las concentraciones adecuadas para la consecución de un objetivo establecido23. En tal sentido, se utilizó la línea de regresión para determinar la dosis letal media de las larvas III de A. aegypti, la que se encuentra entre 1250 y 2500 ppm; la dosis letal máxima ocurre a partir de las 5000 ppm de la formulación comercial utilizada como testigo respecto a las formulaciones de Bti mutante (Figura 1).

El número promedio de larvas III muertas de A. aegypti alcanzó su valor más alto a una concentración de 4000 ppm en todos los tratamientos con Bti mutante, a excepción del testigo, que lo hizo a 2000 ppm. Esta actividad lenta se debería a las diferentes concentraciones del naranja de acridina del cual se originaron, ocasionando cambios en su actividad; la mortalidad larvaria máxima ocurrió cuando se utilizó la formulación M2 de Bti a 4000 ppm, después de las 40 horas de aplicación (Tabla 1); coincidiendo con los resultados obtenidos por Couch y Ross 24 quienes señalan que el mayor efecto biocida en larvas de A. aegypti se produce entre las 24 y 48 horas después de la aplicación con

Bti. Sin embargo, Zavaleta 21 reporta una mortalidad del 100% a las 24 horas, lo que concuerda con Montero 25, quienes trabajaron en la susceptibilidad de A. aegyipti frente a Bti.

La máxima producción de Bti se logró a 200 ppm del agente mutagénico, con un peso seco promedio de 2,78 gr/L; pero el mayor efecto biocida sobre las lavas III de A. aegypti ocurre con Bti mutante, utilizando 160 ppm del mutágeno; evidenciando que no existe una relación directa entre la producción del bioincecticida mutante y su capacidad larvicida, más aún cuando ocurre asincronía en el proceso 20. Los resultados distintos de la capacidad biocida de Bti mutante y la formulación comercial, sobre larvas III de A. aegypti, indicados con sus promedios fueron confirmados por el análisis de varianza (Tabla 2); para identificar la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos, no obstante a pesar de ser un método riguroso es muy genérico y sensible a las diferencias que puedan presentar por lo menos un par de tratamientos; ante ello se hizo necesario un método más específico como es la prueba de comparación de medias de Duncan (Tabla 3), para determinar entre que tratamientos existen tales diferencias 22.

La producción de Bti mutante en la presente investigación se encuentra sobre las halladas en otras investigaciones, pero esto no demuestra una mayor capacidad biocida, dado a su origen. Sin embargo es necesario señalar que se trabajó solo con el 16% del principio activo, a diferencia de la formulación comercial que presenta el 32% del mismo. Por otro lado las formulaciones de Bti mutante son poco estables y los resultados hallados no aseguran su reproducibilidad, por lo tanto lograr la estabilidad del mutante es una finalidad a cumplir 20.

Se hace necesario ampliar las investigaciones relacionadas a los resultados del presente ensayo, con la finalidad de aprovechar mejor los genes de B. thuringiensis H-14 var. israelensisen la consecución de bioinsecticidas, tratando de hacer combinaciones de los mismos para mejorar el rango de acción de

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las proteínas biocidas contra distintos organismos plaga, que constituyen una amenaza para la salud y calidad de vida del hombre; utilizando técnicas inducidas de mutación al azar.

Es factible iniciar en el Perú y sobre todo en nuestra región, otros trabajos con diferentes agentes mutagénicos químicos, para obtener mutantes más eficientes e incrementar la producción del bioinsecticida Bti y lograr curvas de rendimiento más elevadas, así como disminuir las poblaciones de insectos vectores de enfermedades como el dengue, malaria, entre otras.

Se debe potenciar y masificar la utilización del bioinsecticida Bti, dentro del marco del desarrollo sustentable por ser biodegradable, efectivo, seguro y sin llegar a producir impactos ambientales; para lo cual se debe iniciar algunas estrategias que permitan implementar normas y políticas para su uso. En conclusión: (i) las formulaciones de Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis (Bti) mutante tuvieron efecto biocida sobre las larvas III de Aedes aegypti bajo condiciones de laboratorio, (ii) el mayor efecto larvicida se logró con la formulación de Bti M2 a una concentración de 4000 ppm. Y (iii) no existe relación directa entre la producción del bioinsecticida Bti mutante y la actividad biocida sobre las larvas de A. aegypti.

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