Mercodia
MPO ELISA
Instrucciones de uso
10-1176-01
REACTIVOS PARA 96 ANÁLISIS
EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS EMPLEADOS EN LAS ETIQUETAS
Reactivos para 96 análisis
Fecha de caducidad
Consérvese entre 2 y 8 °C.
Núm. de lote
∑ = 96
© Mercodia 2008, 2009, 2011
USO PRETENDIDO
Mercodia MPO ELISA ofrece un método para establecer la cantidad de MPO humana en el plasma EDTA.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
La mieloperoxidasa (MPO), una glicoproteina que contiene hierro, es un complejo tetramétrico de vinculación covalente con un peso molecular de 150 kDa. Está compuesta por dos cadenas alfa glucosiladas de MW 59-64 kDa y dos cadenas beta desglucosiladas de MW 14 kDa. La MPO se encuentra abundantemente en los gránulos azurofílicos primarios de neutrófilos y está presente en los monocitos.
Como respuesta a una invasión microbiana, los gránulos citoplásmicos de neutrófilos liberan la MPO en el espacio fagosómico y extracelular, catalizando la conversión de peróxido de hidróge-no e iones de cloruro (CI-) a ácido hipocloroso, un potente agente oxidante.
La mieloperoxidasa se emplea tradicionalmente como marcador de inflamaciones de las vías respiratorias causadas por asma o irritantes medioambientales. Asimismo, se cree que la MPO participa en las distintas fases de la aterogénesis y que puede influir en la propagación de la aterosclerosis. La relación entre los niveles elevados de MPO en suero y las enfermedades cardiovasculares (CAD) representa un importante papel de la MPO como marcador de inflama-ciones en las CAD, permitiendo la identificación de pacientes con riesgo de padecer accidentes cardíacos a falta de necrosis miocárdica.
PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
Mercodia MPO ELISA es un inmunoensayo enzimático combinado en fase sólida. Se basa en la técnica de sándwich en la que dos anticuerpos monoclonales se contraponen a determinantes antigénicos separados en la molécula de la MPO. Durante la incubación, la MPO de la muestra reacciona con anticuerpos anti-MPO vinculados a los pocillos de microtitración. Tras el lavado, se añade la peroxidasa junto con los anticuerpos anti-MPO y, después de una segunda incubación y un simple lavado que retire el anticuerpo etiquetado como enzima sin vincular, la vinculación se detecta por la reacción a la 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina(TMB). La reacción se detiene aña-diendo ácido para dar un final colorimétrico que se lea espectrofotométricamente.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
• Para uso diagnóstico in vitro.
• En Norteamérica: Para uso exclusivo en investigación. No válido para procedimientos de diagnóstico.
MATERIAL NECESARIO PERO NO INCLUIDO
• Pipetas para 25, 50, 100, 200, 250 y 1000 μL (son preferibles las pipetas de repetición para añadir la solución de la enzyme conjugate 1X, el Substrate TMB y la Stop Solution). • Cubetas y probetas para la preparación de los reactivos
• Agua redestilada
• Lector de microplacas (filtro de 450 nm)
• Agitador de placas (velocidad recomendada de 700-900 ciclos por minuto, movimiento orbital)
• Aparato para lavado de microplacas
REACTIVOS
Cada paquete de MPO ELISA contiene reactivos para 96 pocillos, suficientes para 42 muestras y una curva de calibrado por duplicado. Para series de ensayos más amplias, emplee reactivos combinados de paquetes con números de lote idénticos. La fecha de caducidad del paquete completo se encuentra indicada en la etiqueta exterior. La temperatura de conservación recomendada es de 2-8 ºC.
Coated Plate 1 placa 96 pocillos Lista para usar
Ratón monoclonal anti-MPO 8 bandas de pocillo
Para las bandas de microtitración sin utilizar, cierre la bolsa con una cinta adhesiva, guárdela a 2-8 °C y utilícelas en los 8 meses siguientes.
Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 frascos 1000 μL Liofilizado
Código de color amarillo Añada 1000 μL Concentración indicada en la etiqueta del frasco de agua redestilada Almacenamiento tras restitución: 2-8 °C durante 8 semanas. por frasco Para conservar los Calibrators restituidos durante más de 8 semanas, almacénelos a - 20 °C.
Calibrator 0 1 frasco 1000 μL Listo para usar
Código de color amarillo
Sample Buffer 1 frasco 12 mL Listo para usar
Código de color amarillo
Assay Buffer 1 frasco 12 mL Listo para usar
Código de color rojo
Enzyme Conjugate 11X 1 frasco 1.3 mL Preparación,
Peroxidasa mezclada con ratón monoclonal anti-MPO véase a continuación.
Enzyme Conjugate Buffer 1 frasco 13 mL Listo para usar
Código de color azul.
Wash Buffer 21X 1 botella 50 mL Diluya el contenido Almacenamiento tras la dilución: 2-8 °C durante 8 semanas. con 1000 mL de agua redestila da para
crear la solución de wash buffer 1X.
Substrate TMB 1 botella 22 mL Listo para usar
Solución incolora Nota: Fotosensible.
Stop Solution 1 frasco 7 mL Listo para usar
Preparación de la solución 1X de enzyme conjugate
Prepare la cantidad necesaria de solución 1X de enzyme conjugate diluyendo Enzyme Conjugate 11X (1+10) en el Enzyme Conjugate Buffer o según la tabla siguiente. Mézclela lentamente. Cuando prepare la solución 1X de enzyme conjugate para toda la placa, vierta todo el contenido del Enzyme Conjugate Buffer en el frasco de Enzyme Conjugate 11X. Curva del Muestras por Enzyme Enzyme Número de bandas calibrador por duplicado Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 bandas (una placa) 1 42 1 frasco 1 frasco 8 bandas 1 26 700 μL 7.0 mL 6 bandas 1 18 500 μL 5.0 mL 4 bandas 1 10 350 μL 3.5 mL Almacenamiento tras la dilución: 2-8 °C durante dos semanas.
OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
Un aspecto importante que debe tenerse en cuenta en las condiciones de manipulación previas al análisis es la prevención de la liberación artificial de MPO de neutrófilos en las muestras, lo que podría provocar la obtención de resultados falsamente altos. Se trata de un asunto particularmente importante, puesto que la MPO ha demostrado su potencial como marcador de enfermedades cardiovasculares en las que los informes han vinculado el aumento de las concentraciones de MPO circulatoria a un aumento del riesgo de padecer enfermedades coronarias, un aumento del riesgo en pacientes con síndromes coronarios agudo y la utilidad clínica en la identificación y el pronóstico de los pacientes con insuficiencias cardíacas.Las concentraciones mayores de MPO en plasma con heparina, citrato-plasma y suero se deben a la liberación in vitro de MPO de los neutrófilos, dependiendo dicho aumento de las concentra-ciones del tiempo a temperatura ambiente tras la extracción.
El plasma EDTA está recomendado para medir la MPO porque los valores no se confunden con la liberación ex vivo difícilmente controlable de la MPO de neutrófilos y por lo tanto puede reflejar de una manera más precisa la concentración de MPO en circulación.
Plasma EDTA
El plasma EDTA es el tipo de muestra recomendado para los análisis de MPO. Extraiga la san-gre mediante venipunción en tubos con EDTA como anticoagulante y separe la parte de plas-ma. Las muestras de sangre de plasma EDTA pueden conservase durante 1 hora a temperatura ambiente antes de centrifugarlas a 1500g durante 10 min. A continuación, el plasma separado pasa directamente a ser analizado o se congela hasta que llegue el momento de su análisis.
Suero, plasma con heparina y citrato-plasma
El suero, el plasma con heparina y el citrato-plasma pueden utilizarse en el ensayo. El suero o la presencia de anticoagulante de heparina o citrato no afectarán a la medición del propio analito. Sin embargo, al valorar los resultados deberán tenerse en cuenta los posibles efectos derivados de la manipulación previa al análisis.
Almacenamiento
Las muestras de sangre de plasma EDTA pueden conservarse durante 1 hora a temperatura ambiente antes de centrifugarlas a 1500g durante 10 min. A continuación, el plasma separado pasa directamente a ser analizado o se congela a temperaturas inferiores a los -20 °C hasta que llegue el momento de su análisis.
DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
Normalmente las muestras deberían diluirse 1:5 (50 μL de muestra + 200 μL de Sample Buffer) antes de someterlas a análisis.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Todos los reactivos y las muestras deben llevarse a temperatura ambiente antes de su uso. Prepare una curva de calibrado para cada turno de ensayo.
1. Recomponga el Calibrator 1-5 con 1000 μL de agua redestilada para cada frasco 2. Prepare la solución 1X de enzyme conjugate, la solución 1X de wash buffer y las
muestras.
3. Prepare pocillos de microplacas suficientes para incorporar los Calibrators y las muestras por duplicado.
4. Utilice la pipeta de 25 μL y pase dicha cantidad de cada Calibrator y de las muestras a los pocillos correspondientes.
5. Añada 100 μL del Buffer Assay a cada pocillo.
6. Incube en un agitador de placas (700-900 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente (18-25 °C).
7. Lave 6 veces con 700 μL de solución 1x de wash buffer por pocillo usando un lavador de placas automático en la función de lavado con agua abundante. Tras realizar el
último lavado, vuelque la placa y golpéela con firmeza sobre el papel absorbente. No incluya el paso de impregnación en el proceso de lavado.
O de forma manual,
Descarte el volumen de la reacción volcando la microplaca en una pileta. Añada a cada pocillo 350 μL de solución 1X de wash buffer. Deseche la solución de lavado, golpee con
firmeza varias veces.
sobre el papel absorbente para eliminar el exceso de líquido. Repita esta acción 5 veces. Evite la impregnación prolongada durante el lavado.
8. Añada a cada pocillo 100 μL de solución 1X de enzyme conjugate.
9. Incube en un agitador de placas (700-900 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente (18-25 °C).
10. Lave siguiendo las indicaciones anteriores. 11. Añada a cada pocillo 200 μL de Substrate TMB.
12. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C). 13. Añada a cada pocillo 50 μL de Stop Solution.
Coloque la placa sobre un agitador durante unos 5 segundos para asegurarse de que se mezcla bien.
14. Lea la densidad óptica a 450 nm y calcule los resultados. Haga una lectura cuando hayan transcurrido 30 minutos.
Nota: Para evitar la contaminación entre la mezcla y el sustrato, se recomienda usar pipetas distintas.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO
Los grupos de suero internos con concentraciones de MPO baja, media y alta deberán probarse de forma rutinaria como muestras y sus resultados se registrarán día tras día. Es conveniente que el laboratorio emplee se acostumbre a registrar los datos siguientes de cada prueba: Número de lote del paquete, fechas de dilución y/o restitución de los componentes del paquete, valores DO para los Calibrators y controles.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Nota: El Calibrator 0 (vacío) no debe emplearse para calcular la curva de calibrado.
Cálculo informatizado
L
a concentración de MPO en muestras desconocidas deberá calcularse, en la medida de las posibilidades, empleando una reducción de los datos informatizados. Utilice las absorbencias obtenidas frente a las concentraciones conocidas de los Calibrators 1-5 y el análisis de regresión spline cúbica para construir la curva de calibrado. Multiplique las concentraciones de MPO que se han calculado por el factor de dilución (p. ej., x5)Cálculo manual
1. Divida los valores de absorbencia obtenidos para los Calibrators 1-5, compárelos con la concentración de MPO en un papel cuadriculado y dibuje a mano la curva de calibrado. 2. Lea la concentración de las muestras en la curva de calibrado.
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Ejemplo de ficha
Pocillos Identidad A450 Conc. μg/L**
1A-B Calibrator 0 0.066/0.062 2C-D Calibrator 1* 0.101/0.108 3E-F Calibrator 2* 0.195/0.193 4G-H Calibrator 3* 0.453/0.468 2A-B Calibrator 4* 1.479/1.422 2C-D Calibrator 5* 2.471/2.476 2E-F Muestra 1 0.265/0.260 76 2G-H Muestra 2 0.817/0.821 272 3A-B Muestra 3 1.582/1.591 548
*Concentración indicada en la etiqueta del frasco **Resultado multiplicado por el factor de dilución (x5)
Curva de calibrado
Aquí se muestra una curva de calibrado típica. No utilice esta curva para calcular los resulta-dos de la prueba real.
RESTRICCIONES DEL PROCEDIMIENTO
Como sucede con las pruebas de diagnóstico, un diagnóstico definitivo no debería basarse en los resultados de una única prueba, sino que correspondería al médico realizarlo tras haber valorado todos los resultados clínicos.
Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolizadas no interfieren en el ensayo.
VALORES ESPERADOS
La práctica correcta dicta que cada laboratorio establezca su propio rango de valores.
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
Límite de detección
El límite de detección se define como la Capacidad de Detección según la norma ISO11843-Parte 1. La Capacidad de Detección deberá considerarse parte de la validación de un método en lugar de tomar la concentración más baja que pueda medirse.
El límite de detección es más bajo que la concentración del Calibrator 1 establecida con la metodología descrita en la norma ISO1183- Parte 4. La concentración para las muestras con una absorbencia por debajo del Calibrator 1 no debería calcularse. En su lugar, se expresarán como menos que o igual a (≤) la concentración indicada en el frasco para el Calibrator 1.
Efecto gancho
Las muestras con concentraciones de hasta 30 000 μg/L han sido analizadas sin reflejar resul-tados altamente bajos.
Recuperación
La recuperación tras la incorporación es del 85-96% (89% de media). La recuperación tras la dilución es del 97-108% (101% de media).
Precisión
Cada muestra fue analizada en 4 réplicas en 33 ocasiones diferentes.
Muestra Valor de media
(μg/L) en % de ensayos
Coeficiente de variación
entre % de ensayos % total de ensayos
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CALIBRADO
El paquete MPO ELISA ha sido calibrado en contraposición con un preparado comercial de MPO, altamente purificado y plenamente validado. La concentración de mieloperoxidasa se expresa en μg/L.
GARANTÍA
Los datos sobre el rendimiento presentados fueron obtenidos con el procedimiento indicado. Todo cambio o modificación en el procedimiento no recomendado por Mercodia AB podría in-fluir en los resultados, en cuyo caso Mercodia AB declina todas las garantías expresas, implícitas o legales, incluida la garantía implícita sobre comerciabilidad e idoneidad de uso. En tal caso, Mercodia AB y sus distribuidores autorizados no se responsabilizarán de los daños y perjuicios indirectos o resultantes.
Especificidad
Se han hallado las siguientes reacciones cruzadas:
TPO ≤ 0.01% CRP ≤ 0.01% EPO 3.53% Lisozima 0.03% Elastasa 0.12% Alfa-1-antitripsina ≤ 0.01%
REFERENCIAS
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Nambi V. (2005) The Use of Myeloperoxidase As a Risk marker for Atherosclerosis. Current Atherosclerosis Reports 7:127-131
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RESUMEN DE LA HOJA DE PROTOCOLO
Añada los Calibrators y las muestras 25 μL Añada el Assay Buffer 100 μL
Incube 1 hora a 18-25 ºC en un agitador de placas
Lave la placa con la solución 1X de wash buffer
6 veces Añada la solución 1X de enzyme conjugate 100 μL
Incube 1 hora a 18-25 ºC en un agitador de placas
Lave la placa con la solución 1X de wash buffer
6 veces Añada Substrate TMB 200 μL
Incube 15 minutos
Añada la Stop Solution 50 μL
Agite durante 5 segundos para que se mezcle.
Mida A450 Valore los resultados.
