DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS POR MICROSCOPIA ELECTRONICA Y EL ENSAYO INMUNOSORBENTE ENZIMA CONJUGADA (ELISA)

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DIAGNOSTICO

DE ROTAVIRUS

POR MICROSCOPIA

ELECTRONICA

Y EL ENSAYO INMUNOSORBENTE

ENZIMA CONJUGADA

(ELISA)

Alberto Simhon,l

Salvador Amato,* Francisco

Hernández,*

Robert H.

Yolken,3 y Leonardo

Mata’

l

Este trabajo tiene por objeto demostrar la efciencia del ensayo inmuno-

sorbente enzima conjugada (ELISA) como método para el diagnóstico de rotavirus. Para ello se analizaron muestras provenientes. de 247 niños con diarrea admitidos en el Hospital Nacional de Niños de Costa

Rica. El método de comparatión utilizadofue el de microscopía ebctró-

nica de transmisión (MET) y la evaluación, que se refiere a la sensibili- dad en el diagnóstico, costo, tiempo y otros o!etulles operativos, demuestra

que el ELISA es el método óptimo para el estudio o!e grandes cantidades de muestras.

Introducción

La enfermedad diarreica persiste como

una de las principales causas de morbilidad

y mortalidad en sociedades tradicionales y

preindustriales (1). Durante tiempo consi-

derable los investigadores se han abocado a explicar la etiología del mayor número de gastroenteritis infantiles en las que no se

lograba demostrar agentes parasitarios o

bacterianos usuales. El hallazgo de entero-

bacteriáceas capaces de producir exotoxi-

nas (2,3) y de agentes víricos de ‘70 nm de diámetro (rotavirus) (4, 5), ha permitido esclarecer la etiología de muchas diarreas antes llamadas “inespecíficas”. Mientras el

diagnóstico de enterobacteriáceas toxigéni-

cas todavía encuentra dificultades metodo-

lógicas, el de los rotavirus ha superado la mayoría de los obstáculos.

Para demostrar la presencia de rotavirus se han empleado diversas técnicas. La mi-

’ Instituto de Investigaciones en Salud (INISA), Universi- dad de Costa Rica y Ministerio de Salud, San José, Costa Frica. ’ Instituto de Investigaciones en Salud (INISA), Universi- dad de Costa Rica, San José, Costa Rica.

3 Laboratory of Infectious Diseases, National Indtute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, E.U.A.

croscopía electrónica (6) es ya clásica, y si bien la visualización de los viriones es relati- vamente exacta y sencilla, el alto costo del equipo y la tecnología que demanda el mé- todo limitan su uso general. Otras técni- cas como la fijación del complemento (7),

la contrainmunoelectroosmoforesis (8), y la

inmunofluorescencia (9), son menos sensi-

bles o presentan dificultades de índole téc-

nica. El radioinmunoensayo en fase sólida

(10) tiene una alta sensibilidad, pero su eje- cución requiere reactivos costosos de una vida media corta y un contador de cente- lleo, que es un aparato costoso y general-

mente no disponible en muchos centros

asistenciales y laboratorios de diagnóstico.

Recientemente se ha desarrollado el en-

sayo inmunosorbente enzima conjugada

(ELISA) (II) para el diagnóstico de rotavi- rus (I2), cuyo fundamento es el siguiente: las proteínas en condiciones apropiadas de pH se adhieren a la superficie de polivinilo. Sobre la proteína adsorbida se lleva a cabo

una reacción antígeno-anticuerpo y a este

complejo se le añade un reactivo consis- tente en un conjugado de inmunoglobuli- nafosfatasa alcalina. El conjugado tiene una

gran afinidad por su antígeno homólogo,

(2)

’ así como una gran actividad enzimática. Una vez que el conjugado ha reaccionado con su antígeno, se adiciona un substrato apropiado cuya hidrólisis por la fosfatasa alcalina genera un color fácil de distinguir

visualmente y cuantificable espectrofomé-

tricamente. La sensibilidad de la técnica es

equivalente a la del radioinmunoensayo y

tiene la ventaja de que no requiere reactivos 0 aparatos costosos para su ejecución.

El propósito de este trabajo es el de eva- luar el ELISA en una investigación epide- miológica en la cual se analizan muestras

fecales. El método de comparación es la

microscopía electrónica, y la evaluación

abarca tanto la sensibilidad en el diagnós- tico del agente vírico, como costo, tiem-

po y otros detalles operativos de ambos

métodos.

Materiales y métodos

Se estudiaron 247 niños con diarrea

atendidos en los Servicios de “Lactantes 2”, “Lactantes B” y “Emergencias” del Hospital

Nacional de Niños de Costa Rica, entre

enero de 1976 y febrero de 1977. La edad de los niños estuvo comprendida entre 0 y 24 meses. Las características de la población y otros detalles del estudio han sido pre- viamente descritos (13). Con las muestras se

prepararon sendas suspensiones al 20%

en caldo de infusión de cerebro y corazón

adicionado con albúmina sérica bovina al

0.5%, las que fueron almacenadas a -7OOC hasta el momento de su diagnóstico.

Microscopía electrónica. La técnica para la identificación de partículas víricas con mi- croscopio electrónico, descrita por Flewett

et at. (6), fue modificada en nuestro labora- torio (23). Básicamente las suspensiones de heces se trataron con partes iguales de fluo-

rocarbón (Genesolv) y se centrifugaron a

4,000 rpm (2,000 x G) en frío durante 30 minutos. Se separaron los sobrenadantes y

con ellos se impregnaron rejillas de 200

-_

membrana soporte de formvar; las rejillas se tiñeron luego con ácido fosfotúngstico al 2% a pH 5.5. Las preparaciones se exa-

minaron con un microscopio electrónico

de transmisión (Hitachi HU-12A) por un

tiempo promedio de 10 minutos y máximo de 40 minutos. La mayor parte de las mues- tras se habían tratado y examinado con mi- croscopio electrónico con anterioridad a la ejecución del ELISA en el laboratorio. Los

diagnósticos por ambos métodos se hicie-

ron en forma independiente y ciega sin que

el examinador conociera ni el estado de l

salud del niño ni el resultado obtenido con el método de comparación.

ELISA. Se realizó un ELISA de “doble

sandwich” según modificación de uno de

los autores (Yolken); la técnica fue la si- guiente (figura 1):

FIGURA l-Diagrama esquemático del ELISA para la detección de rotavirus.

u

A

LAVADO

LAVADO

(3)

l

Simhon et al. DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS 393

a) En cada una de las 72 cavidades en “U” de bandejas microtiter descartables de polivinilo flexible (cooke), se depositaron 100 ~1 de suero

hiperinmune caprino antirotavirus diluido

1: 100,000 en solución amortiguadora de carbo- nato de pH 9.6. Se incubaron las bandejas a 4OC durante toda la noche. Luego de esta incu- bación y de cada una de las subsiguientes las bandejas se lavaron tres veces con solución amortiguadora de fosfatos a pH 7.4, adiciona- da de 0.5 ml de Tween 20 por litro de solución (PBS-Tween).

b) Seguidamente se añadieron a cada una de las 72 cavidades 50 /*l de PBS-Tween que conte- I, nía suero fetal bovino y suero normal de cabra, ambos al 1% (PBS-Tween-SFB- I%-SNC- 1%) y luego se agregaron por duplicado 50 ~1 de sus- pensiones de heces al 20%. En cada bandeja se colocaron 33 muestras, un testigo positivo, un testigo negativo y un control salino. (Ver anexo). Las bandejas se incubaron a 4OC durante toda la noche.

c) Se adicionaron a cada cavidad 100 ~1 de suero hiperinmune de cobayo antirotavirus para formar así el “primer sandwich”; este suero se diluyó 1:800 en PBS-Tween que contenía suero fetal bovino al 1% y suero normal de cabra al

0.5% (PBS-Tween-SFB-l%-SNC-0.5%). Las

bandejas se incubaron a 37OC durante una hora. ch) Se añadieron a cada cavidad 100 ~1 de suero hiperinmune de cabra anticovayo conju- - gado a fosfatasa alcalina (Sigma) para producir - el “doble sandwich”. El conjugado se diluyó 1:400 en PBS-Tween-SFB-1%~SNC-0.5%. Las bandejas se incubaron a 37OC durante una hora.

d) Por último, se agregaron a cada cavidad 100 ,ul de p-nitrofenil fosfato (Sigma) en solu- ción amortiguadora de dietanolamina a pH 9.8. e) Transcurridos 30 minutos a 37OC se de- tuvo la reacción adicionando 50 ~1 de NaOH 3N a cada cavidad, y se comparó visualmente el co- lor de las cavidades con los controles positivo y negativo. Las muestras rotavirus-positivas pro- dujeron un color amarillo intenso distinguible a simple vista.

0 produjeron Bloqueo del ELISA. un color intermedio Algunas muestras que entre los controles positivo y negativo se clasificaron

como dudosas y requirieron una prueba de

bloqueo para su diagnóstico definitivo. El bloqueo se hizo tratando tales muestras con a) suero convaleciente de ternero experi-

mentalmente infectado con rotavirus hu-

mano y b) suero fetal bovino. Si la muestra fuese rotavirus-positiva los anticuerpos an-

tirrotavirus del suero convaleciente se liga- rían al antígeno y la reacción de color en el ELISA quedaría bloqueada. Por otro lado, el suero fetal bovino, por estar exento de

concentraciones medibles de anticuerpos,

no tendría efecto sobre la muestra positiva y al final de la reacción se generaría el color amarillo (no hay bloqueo).

Por el contrario, si la muestra fuese

rotavirus-negativa, ni el suero convale-

ciente ni el suero fetal bovino tendrían efecto alguno, y en ninguno de los dos casos se produciría color. Otra posibilidad es que una muestra desarrolle color luego de ser tratada con ambos sueros, lo que podría deberse a una alta concentración de partí- culas víricas que no fueren neutralizadas

por anticuerpos antirrotavirus del suero

convaleciente. Diluciones apropiadas de di-

cha muestra confirmarían el hecho. En el

cuadro 1 se ilustran las tres posibilidades.

CUADRO l-Prueba de bloqueo del ELISA en muestras dudosas por rotavirus en niños con dia- rrea del Hospital Nacional de Niños de Costa Rica, 1976-1977.

Prueba de bloqueo

ELISA Suero Suero ELISA

(preli- fetal convafe- (detini-

Muestra No. minar) bovino ciente tivo)

090 9 -a - 271 f += - + 413 + - 565 c + - + 576 + - 622 -c + - + 643 c - - 657 f + - + 659 -c + - + 662 c + - + 541b - 653 (20%)’ + + + + 653 (2%)’ + + + 653 (0.2%)d - - - -

; + = positivo; f = dudoso; - = negativo.

Testigo negativo; esta y todas las muestras precedentes, concentración al 20%.

i Testigo positivo; concentración entre paréntesis. El mismo testigo anterior, pero diluido 10 veces.

(4)

Los siguientes fueron los pasos seguidos en la prueba de bloqueo:

a) Ciento veinticinco microlitros de la mues- tra dudosa se depositaron en cada uno de dos tubos que contenían, el primero 125 ~1 de suero convaleciente, y el segundo, 125 ~1 de suero fetal bovino, ambos diluidos 1:5 en PBS-Tween- SFB- 1%~SNC- 1%.

b) Después de dos horas de incubación a 3T0G, se transfirieron de cada tubo 100 ~1 por duplicado en cavidades de bandejas microtiter previamente recubiertas con anticuerpo caprino antirrotavirus. A partir de este paso se continuó el ELISA como ya se describió.

Resultados

De 247 muestras de niños con diarrea, 59

fueron positivas por rotavirus según el

ELISA y 10 resultaron dudosas. A estas se

les hizo la prueba de bloqueo y resultaron seis positivas y cuatro negativas.

El cuadro 2 compara los resultados obte- nidos por microscopía electrónica y ELISA. Por microscopía electrónica, el 20.6% de los casos fue rotavirus-positivo y por ELISA, el

26.3%. Así, en 14 de 247 casos (5.7%) no se detectaron rotavirus por microscopía elec-

trónica. Los extractos fecales de una sub- muestra de estos 14 casos se sometieron a

ultracentrifugación a 39,000 x G durante

30 minutos volviendo a suspenderse el ma- terial centrifugado en 100 ,ul de PBS para

CUADRO 2-Diagnóstico de rotavirus en niños con diarrea según Microscopia Electrónica (ME) y ELISA.

ME ME

positiva negativa Total

No. % No. % No. % ELISA positivo 5 1 20.6 14 5.7 65 26.3 ELISA negativo 0 0 182 73.7 182 73.7 Total 51 20.6 196 79.4 247 100.0 x2 = 179.9; p < 0.001

FIGURA 2-Prevalencia bimestral de rotavirus según microscopia electrónica y ELISA, 1976-1977.

1976 1977

observar con microscopio electrónico. En

ninguna preparación se visualizaron rota-

virus. Paralelamente, a las 14 muestras se

les practicó la prueba de bloqueo del

ELISA, y todas ellas se confirmaron como

rotavirus-positivas.

En la figura 2 se ha dibujado la prevalen- cia bimestral de rotavirus según microsco- pía electrónica y ELISA. Puede apreciarse

que la demostración de los virus por eI

ELISA fue mayor que por la microscopía

electrónica tanto en los meses endémicos

como en los epidémicos. Si se le asigna a la

microscopía electrónica una sensibilidad

igual a la unidad, el ELISA demuestra te- ner una sensibilidad de 1.27.

Conclusiones

En esta investigación el ELISA detectó 14 li (5.7%) infecciones por rotavirus que no se diagnosticaron por la microscopía electró- nica, aún después de concentración ulterior por ultracentrifugación. Para visualizar los

viriones con el microscopio electrónico se

requiere una concentración de partículas

del orden de 10’ o más por gramo de he- ces, que deben estar relativamente intactas

(5)

l

Simhon et al. DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS 395

para que sean reconocibles. Por el contra- rio, en una reacción antígeno-anticuerpo, el número mínimo de rotavirus requerido

para evidenciar el agente parece ser me-

nor; aparentemente la inmunoglobulina

específica puede reaccionar con fragmen-

tos o componentes antigénicos, además de

partículas completas. La diferencia apun-

tada probablemente explique la mayor sen-

sibilidad del ELISA frente a la microscopía electrónica para detectar rotavirus.

0 Otras ventajas del ELISA son los bajos

costos de operación, ya que se calculó que

cada muestra por duplicado costaba apro-

ximadamente EUA$O.SO en 1977. A los

sueros antirrotavirus que todavía no exis- ten en forma comercial se les asignó un

olor nominal de EUA$40.00 por ml. Por

el contrario, la inversión económica en

equipo para la microscopía electrónica y

para el radioinmunoensayo es muy alta.

El tiempo de ejecución favorece clara- mente al ELISA ya que el. estudio de 250

muestras requirib aproximadamente 40

horas de trabajo de un técnico de laborato- rio subprofesional supervisado por un pro- I fesional universitario, esto es, 10 minutos

por muestra. Por el contrario, cada suspen- sión de heces al 20%, requirió que se clarifi- cara, se colocara sobre una rejilla recubierta de formvar y se tiñera para finalmente, ob- szrvarla al microscopio electrónico por un período promedio de 10 minutos. Así, pro- cesar 250 muestras ocupó 125 horas de tra- bajo de dos técnicos subprofesionales y de

un profesional universitario. El tiempo

promedio por muestra fue de 30 minutos.

Cabe hacer notar que experiencias poste-

* riores han demostrado que es posible au-

mentar la eficiencia en el tiempo de ejecu- ción del ELISA. Así, se ha comprobado que se pueden procesar alrededor de mil mues-

tras por semana, disminuyendo aún más los

costos del método.

La microscopía electrónica era hasta hace poco el único medio diagnóstico de rota- virus y se utilizó como método de referen- cia en la evaluación de opciones. El uso

del microscopio electrónico queda limitado

a laboratorios especializados, mientras que

el radioinmunoensayo, importante por su

alta sensibilidad y posibilidad de masifica- ción, tiene un alto costo y es relativamente lento. El ELISA está destinado a desplazar

totalmente al radioinmunoensayo en el es-

tudio de rotavirus y otros agentes infeccio- sos, así como de sus anticuerpos. Para el

ELISA no se requieren aparatos costosos

y se evitan los inconvenientes de trabajar

con material radioactivo. La sensibilidad

del ELISA (equivalente a la del radioinmu- noensayo) y su sencillez de ejecucibn lo ha- cen el método de elección para estudios epidemiológicos en el momento actual. Así, la técnica es ideal para determinar la corre- lación que guardan los rotavirus con otros agentes bacterianos y parasitarios y su pa- pel relativo en la etiología de la diarrea.

.

Resumen

Se estudiaron muestras de heces de 247

niños con diarrea admitidos en el Hospi- tal Nacional de Niños de Costa Rica. Se

investigó la presencia de rotavirus por

medio de microscopía electrónica de trans- misión (MET) y del ensayo inmunosorben-

te enzima-conjugada (ELISA). La sensi-

bilidad al ELISA fue mayor que MET

(X2= 179.9, p < 0.00 1); en 5.7% de los casos se encontró antígeno de rotavirus sin que se visualizaran partículas víricas por MET. El ELISA es de ejecución más simple y más barato que MET, por lo que parece ser el método óptimo para el estudio de grandes cantidades de muestras. 0

Ayradecimiento

I

Esta investigación se financió en parte con fondos de la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica y del Consejo Nacio- nalde Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT). Los autores agradecen la coopera-

(6)

ción de los Dres. Edgar Mohs y Cecilia Lizano y su reconocimiento a los Sres. Francisco Gamboa de la enfermera Julieta León, del Hospital Na- y Roberto Padilla, del INISA, Universidad de cional de Niños, Costa Rica. Asimismo expresan Costa Rica.

REFERENCIAS (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

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(7)

l

Simhon et al. DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS 397

ANEXO 1

Conjugado de inmunoglobulina-fosfatasa alcalina, sueros, controles y otros reactivos

l Conjugado innrunoglobulina-fosfatasa alcalina: Su preparación se basó esencialmente en el mé- todo de Voller et al. (14).

l Suero fetal bovino (SFB): Rehatuin, Reheis Chem. Co., Kankakee, Illinois.

l Suero de cabra anti-cobayo: Antibodies, Inc., Davis, California.

l Suero de.cabra antirrotawirus y suero de cobayo

antirrotavirus: Preparado por R.H. Yolken,

l NIADID, NIH, Bethesda, Maryland, E.U.A.

l Testigo positivo: “Pool” de 15 extractos feca- les rotavirus-positivo por microscopía electró- nica y ELISA. Se determinó una dilución de trabajo apropiada diluyendo al 2% en caldo in- fusión cerebro y corazón adicionado con albú-

mina bovina al 0.5%.

l Testigo negativo: “Pool” de 15 extractos feca- les negativos tanto por ELISA como por micros- copía electrónica. Se hizo una dilución en igual forma que para el control positivo.

l Solución amortiguadora de carbonato, pH 9.6: Disolver 1.59 g de NazCOs, 2.93 g de NaHCOr y 0.2 g de azida sódica; ajustar a pH 9.6 y llevar a un litro con agua destilada.

l Solución amortiguadora de dietanolamina al 10%, pH 9.8: Mezclar 97 mI de dietanolamina, 100 mg de MgC12.6H20 y 0.2 g de azida sódica; ajustar pH a 9.8 y llevar a un litro con agua destilada. La solución debe estar a temperatura ambiente para ser utilizada.

Diagnosis of rotavirus by electronic microscopy and by enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA) (Summary)

A study was made made of feces of 247 that of TEM (X2 = 179.9, p. < 0.001); in 5.7% children with diarrhea admitted to the National of the cases rotavirus antigen was found where Children’s Hospital of Costa Rica. Tests were TEM had not shown any visible vira1 particles. made to determine the presente of rotavirus ELISA is far simpler to perform and cheaper using transmission electronic microscopy (TEM) than TEM, and would therefore appear to be and the enzyme-linked immuno-sorbent assay the best method for the study of large numbers - (ELISA). Sensitivity of ELISA was greater than of samples. ff 3

Diagnóstico de rotavírus por microscopia electr6nica e o ensaio imunosotvente enzima-conjugada (ELISA) (Resumo)

Estudaram-se amostras de fezes de 247 crian- superior à MET (X2 = 179.9, p< 0.001); en- cas com diarréia que tinham sido baixadas ao controu-se em 5,7% dos casos antígeno de rota- “Hospital Nacional de Niños” na Costa Rica. vírus mesmo sem que se visualizassem partículas Pesquisou-se a presenta de rotavírus através da víricas pela MET. 0 ELISA é de execucão mais microscopia electrônica de transmissáo (MET) simples e é mais barato que a MET, razões pelas

e tambén do ensaio imunosorvente enzima-con- quais parece ser o método ótimo para o estudo

jugada (ELISA). A sensibilidade ao ELISA foi de urna grande quantidade de amostras.

Diagnostic de rotavirus par microscopie électronique et le titrage avec immuno-adsorbant lié à une enzime (ELISA) (Résumé)

On a étudié des échantillons de matières féca- supérieure à MET (X2 = 179.9, p < 0.001); les de 247 enfants atteints de diarrhée et admis

à l’Hopita1 National Infantil de Costa-Rica. On

dans 5,7% des cas on a trouvé l’antigène de rotavirus sans avoir vu de particules virales par a recherché la présence de rotavirus par mi-

croscopie électronique de transmission (MET) MET. Avec ELISA l’utilisation est plus simple et par titrage avec immuno-adsorbant lié à une et meilleur marché et c’est purquoi elle semble enzime (ELISA). La sensibilité à ELISA a été être la méthode optimum pour l’étude de gran- des quantités de prélèvements.

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