DETERMINACIÓN CROMATOGRÁFICA DEL CONTENIDO

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DETERMINACIÓN

CROMATOGRÁFICA

DEL

CONTENIDO

DE

MONOTERPENOIDES DE ACUERDO AL GRADO DE FERTILIZACIÓN,

ESTADO DE MADUREZ Y TIEMPO DE COSECHA PRESENTES EN LA

MANZANILLA (Matricaria recutita L.) EN LAS CONDICIONES DE CULTIVO

DEL JARDÍN BOTÁNICO DR. JORGE PÍÑEROS CORPAS (MUNICIPIO DE

SUBA, SABANA DE BOGOTÁ).

ANTONIO LUIS MEJÍA PIÑEROS, Biólogo, LUIS MIGUEL POMBO OSPINA, Ingeniero Químico,

investigadores de la Fundación Universitaria Juan N. Corpas.

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I. Introducción

La manzanilla (Matricaria recutita L.) se emplea principalmente como antiinflamatoria,

espasmolítica, antiulcerosa, carminativa,

digestiva, bactericida, fungicida y sedante suave (1, 2, 3, 4,5).

Los constituyentes principales de los capítulos florales de la manzanilla son el aceite esencial. La esencia (0,4-1,5%) contiene alrededor de un 50% de los sesquiterpenos (-)-alfa-bisabolol y sus óxidos A y B, óxido de bisabolona, cis- y trans-en-in-dicicloéter (hasta un 25%) y camazuleno (1-15%), el cual se forma a partir de la matricina (lactona sesquiterpénica) durante la destilación. El camazuleno es responsable del intenso color azul de la esencia.

Entre los flavonoides, se han identificado principalmente heterósidos de la apigenina, como la 7-glucosil-apigenina, y de otras flavonas y flavonoles, que constituyen hasta un

8% de la droga.

Otros componentes son: polisacáridos

mucilaginosos (hasta un 10%), cumarinas

(umbeliferona y herniarina), ácidos fenoles y lactonas sesquiterpénicas (matricina) (6,7). La droga consiste en los capítulos florales donde, según las farmacopeas (British Herbal Pharmacopeia, 1996) (8), se encuentran los principios activos de la planta. Sin embargo,

mientras las plantas están en estado

vegetativo producen una serie de

componentes importantes que luego se transportan a la parte reproductiva. Así mismo, el contenido en las diferentes partes de la planta es variable de acuerdo con su estado de madurez, además de otros factores que se mencionan más adelante. En el año 2002 se llevaron a cabo estudios pertinentes con

caléndula bajo condiciones similares

observándose cambios importantes en la presencia de metabolitos secundarios (Mejía y Pombo, 2002) (9).

En el presente estudio se realizó la determinación cromatográfica en capa delgada (CCD) del contenido de monoterpenoides con actividad antiespasmódica. Estos metabolitos se encuentran en las partes aéreas pero

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principalmente en los capítulos florales.

En este estudio se evaluaron metodologías no

convencionales de cultivo tales como

Agricultura de Sol y Malezas (A S y M) y orgánicas.

La A S y M es una metodología desarrollada en 1983 por el ingeniero agrónomo Nasser Youssef en Brasil, cuyas actividades de manejo se orientan hacia la fertilización orgánica presiembra con biofertilizantes que consisten en una mezcla de estiércol de vacuno fresco, minerales y enriquecida con algunos elementos menores y por otra parte, al desarrollo natural de hierbas protectoras (”malezas”) que no compitan con la planta de interés por la luz solar necesaria para su óptimo crecimiento. En este procedimiento no se realiza desyerbe total, ni fertilización con agroquímicos, ni aplicación de herbicidas, ni manejo integrado de plagas, técnicas tales que

no están acordes con los principios

fundamentales de este modelo de agricultura (10,11).

La determinación del estado de desarrollo óptimo de las plantas en cultivo coincidente con el mayor contenido de metabolitos secundarios de interés en el momento de la cosecha, depende de factores inherentes a su constitución genética y medio ambiente por lo que es uno de los parámetros de calidad más importantes para la fabricación de fitoterápicos ya que su producción óptima está sujeta al conocimiento y manejo de dichos factores genéticos, ontogénicos y ambientales (12,13). Por lo tanto, se recomienda este tipo de estudios para lograr la estandarización de los extractos que cumplan con las normas de calidad, seguridad y eficacia necesarias en el comercio de productos de exportación.

El Jardín Botánico Medicinal Dr. Jorge Piñeros Corpas, se constituye para el laboratorio LABFARVE como el único proveedor de manzanilla para la fabricación de fitoterápicos. Por lo tanto, es fundamental para sus propósitos conocer el comportamiento en

cultivo de esta y otras plantas que se

constituyen en parte de los procesos

encaminados a la implementación de las

Buenas Prácticas Agrícolas (BPA). Sin

embargo con este estudio se pretende arrojar información que pueda ser aplicada a otros cultivos dentro de las áreas aledañas y en condiciones similares al caso particular.

II.Objetivos

1. Determinar, mediante la técnica de cromatografía en capa delgada y por comparación cualitativa, la presencia o ausencia de monoterpenoides en la manzanilla bajo diferentes condiciones de cultivo y cosecha, de acuerdo con los

factores climáticos y edáficos

preponderantes en el municipio de Suba, Sabana de Bogotá.

2. Encontrar el momento propicio en el cual está presente el más alto contenido de metabolitos secundarios de interés de acuerdo a la fertilización, hora del día y tiempo de cosecha o estado de madurez de las plantas de manzanilla.

3. Observar los resultados del tratamiento con metodologías propias de la Agricultura de Sol y Malezas sobre la producción de dichos metabolitos.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Para el presente estudio se escogió un área de terreno de 28.8 m2 dentro del Jardín Medicinal

en la cual se establecieron las condiciones climáticas y de suelo previas a la siembra y cosecha de las plantas de manzanilla. En seguida se seleccionaron 3 parcelas de 1.2 x 6.0 m cada una, en las cuales se sembraron 100 plántulas colocadas a distancia de 25 cm entre plantas y 25 cm entre surcos. Las plántulas provinieron de semillero en bolsas de papel periódico colocadas en un sustrato consistente en una mezcla de arcilla, arena y

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abono orgánico en proporción 6:1:1, las cuales, antes de plantar, fueron sometidas durante 4 días a estrés hídrico, de acuerdo con la A S y M.

Las correspondientes parcelas fueron

designadas como unidades experimentales en las que se programó un plan aleatorio de

fertilización y recolección que permitió

comparar el efecto de los diferentes

tratamientos.

Una de las unidades experimentales (Unidad 1) fue fertilizada con abono orgánico, otra (Unidad 2) aislada de las demás por una barrera donde no se aplicó abono, se dejó crecer malezas a su alrededor según las recomendaciones de la A S y M, y otra (Unidad 3) fue dejada sin fertilizar.

En el presente estudio se nominó como fase I, al momento en el que usualmente se lleva a cabo la cosecha de los capítulos florales de manzanilla los cuales contienen los principios activos de interés para la elaboración de fitoterapéuticos, es decir mes y medio después del transplante; y como fase II el periodo en el cual la manzanilla culmina su ciclo de vida (3-4 meses).

Tabla 1. Diseño experimental

Unidad experimental Metodología de cultivo Fases Horas de cosecha 1 Fertilización I y II 9 am-12 m-4 pm* 2 Sol y Malezas I y II 9 am-12 m-4 pm* 3 Sin fertilización I y II 9 am-12 m-4 pm*

* Esta hora solo para la fase I

Para el desarrollo cromatográfico se tuvieron en cuenta las siguientes condiciones (14):

 Extracción: 1 g de los capítulos secos fueron extraídos por agitación, con 15 mL de Diclorometano durante 15 minutos.

 Fase estacionaria: Sílica Gel 60 F 254

 Fase móvil: Tolueno-Acetato de Etilo

(93:7).

 Detección: Las placas cromatográficas

fueron evaluadas sin tratamiento químico a la luz ultravioleta de 254 y 365 nm.

 Patrón cromatográfico: Cineol (1:30) en

Tolueno.

IV. Resultados

Realizando un análisis comparativo de las tres unidades experimentales de manera general en la fase I, se observa una marcada diferencia en la concentración y contenido de monoterpenoides presentes en la unidad 2 en la que se empleó la metodología de cultivo de A S y M (Figura 1B).

Por otra parte, se observa una alta

concentración de la mayoría de los

compuestos de la unidad 2, específicamente en el periodo comprendido entre las 12.00 M y las 4:00 pm.

La unidad 3 muestra diferencias en

concentración y contenido con respecto a la unidad 1 en la fase I de experimentación (Figura 1C).

Con respecto al principal metabolito con

actividad antiespasmódica, bisabolol, se

observa una mayor concentración de este en la unidad 2 en el periodo comprendido entre las 12:00 M y las 4.00 pm.

En relación con el farneseno, azuleno y los óxidos de bisabolol, no se observan diferencias

apreciables al comparar los perfiles

cromatográficos de las tres unidades

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De acuerdo a los resultados cromatográficos, que se observan en la figura 2 para la fase II, la unidad 3 muestra una mayor concentración y cantidad de monoterpenoides respecto a las otras dos unidades. Así mismo, en esta unidad se evidencia mayor contenido a las 12:00 M. Cabe anotar que para esta fase de experimentación no se pudo realizar la recolección a las 4:00 pm por motivos climatológicos.

Evidentemente se observa una marcada diferencia en la concentración y cantidad de monoterpenoides presentes en las unidades experimentales que fueron muestreadas en la fase I con relación a la fase II.

Realizando el análisis comparativo, tomando como parámetro las fotografías de las placas cromatográficas de la planta estudiada (14), se determinaron los grupos de compuestos

químicos específicos, observándose la

presencia de los siguientes: farneseno, azuleno, poliinos, bisabolol, espatulenol y óxidos de bisabolol. Los poliinos son los

compuestos que aparecen en mayor

concentración en la unidad 2, durante el periodo comprendido entre las 12.00 M y las 4:00 pm, al comparar los resultados con las otras dos unidades.

En la unidad 2 de la fase II la concentración de

bisabolol disminuye considerablemente

respecto a la misma unidad en la fase I.

Los datos climáticos de temperatura

superficial, precipitación media y radiación media, para los meses de julio y septiembre, fueron obtenidos del resumen mensual de la estación de monitoreo ambiental del DAMA ubicada en la Fundación Universitaria Juan N. Corpas y se muestran en la tabla 2 y la gráfica 1 (15).

Tabla 2. Datos meteorológicos para los meses

de julio y septiembre de 2004 Julio Septiembre Temperatura superficial (°C) 12.3 15.9 Precipitación media (mm) 30.7 40.4 Radiación media acumulada (W-h/m2) 5131 5012

Gráfica 1. Promedio de radiación solar en los

meses de julio y septiembre de 2004

Promedios de radiación solar

0 100 200 300 400 500 600 700 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hora R a d ia c n (W -h /m 2 ) Julio Septiembre V. Discusión

Los resultados obtenidos en la unidad 2 (A S y M) muestran que este tipo de agricultura se adapta mejor a las condiciones de crecimiento silvestre que es común a la naturaleza de la

manzanilla. Por consiguiente, dichos

resultados sugieren que esta planta no necesita de manejos agrícolas especiales para la obtención de metabolitos secundarios de interés en las concentraciones y cantidades requeridas. Este hecho se corrobora en la unidad 3, donde no se realizó fertilización, sin embargo los resultados de la unidad 2 son evidentemente superiores.

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El estado de madurez de la manzanilla, cuyo ciclo de vida es corto (3-4 meses), influye notablemente en la concentración y contenido de los metabolitos, como se observa en los resultados de la fase I con respecto a los de la fase II, ya que se presenta un mayor contenido de los componentes analizados en las muestras tomadas en la fase intermedia de crecimiento y desarrollo correspondiente a la fase I. Este comportamiento se explica por los diferentes estados fisiológicas propios de la manzanilla, debido a que en el estado de madurez inicial los metabolitos secundarios cumplen funciones de defensa y de atracción para la polinización por lo tanto se concentran, pero en las fases tardías de crecimiento y desarrollo, en donde al parecer, no cumplen

una función específica, disminuyen

considerablemente.

De acuerdo con los perfiles cromatográficos de todas las unidades experimentales, tanto en la fase I como en la fase II, se observa una

mayor concentración y cantidad de

monoterpenoides en el periodo comprendido entre las 12:00 M y las 4.00 pm. En concordancia con las necesidades climáticas que influyen en la variación de la composición química de la manzanilla, las 12:00 M corresponde al mayor valor de radiación solar y temperatura. Estos factores son esenciales en la mayor producción de metabolitos secundarios.

La precipitación no es un factor climático determinante en la variación del contenido de principios activos de la manzanilla bajo las condiciones de cultivo empleadas en este estudio, en donde se mantuvo un programa continuo de riego durante todo el periodo de crecimiento de las plantas.

VI. Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos el estado ideal de madurez para obtener la mayor concentración y cantidad de principios activos corresponde a aquel en el cual la planta ha

desarrollado completamente sus estructuras florales (mes y medio después del proceso de transplante).

Definitivamente la hora del día en la que se debe realizar la recolección de capítulos florales para obtener la mayor cantidad posible de compuestos de interés, está comprendida entre las 12:00 M y las 4:00 pm y se relaciona directamente con la intensidad de radiación solar.

La agricultura de sol y malezas (A S y M) influye de manera importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas de manzanilla, lo cual se ve reflejado en la proporción de monoterpenoides y compuestos contenidos en los aceites esenciales, debido probablemente, a que este modelo de agricultura se aproxima mucho a las condiciones naturales de crecimiento de la manzanilla.

VII. Recomendaciones

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente estudio cabe establecer para

subsiguientes trabajos una metodología

similar, que permita determinar, con alguna certeza, los momentos propicios para la obtención de las cantidades adecuadas de

principios activos, que lleven a la

estandarización para el aseguramiento de la calidad de los fitomedicamentos.

Por otra parte, sería interesante para

posteriores estudios aplicar un diseño

experimental que tenga en cuenta la obtención de datos referentes a la proporción de nutrientes mayores y menores presentes en el suelo, y permita evaluar la influencia de estos sobre el crecimiento y desarrollo vegetal, así como en la cantidad y calidad de los compuestos de interés.

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