UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. ESCUELA DE POSTGRADO. Sección: Farmacia y Bioquímica. Mención Productos Naturales

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Texto completo

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Sección: Farmacia y Bioquímica.

Mención Productos Naturales

Determinación de la actividad antibacteriana, in vitro de los extractos de

hoja de Piper aduncum sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus

pyogenes

.

TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE:

Maestro en Farmacia y Bioquímica

MENCIÓN

Productos Naturales Terapéuticos

Autor: Br. Roger Antonio Rengifo Penadillos.

Asesor: Dr. Mario Alva Astudillo

Trujillo –Perú

2009

Nº de registro:

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y seas valiente, no temas, ni desmayes

porque tu DIOS estará contigo donde

quiera que vayas.

Al Señor Jesucristo,

por ser la luz que ilumina

mi entendimiento.

A la Inmaculada

Virgen María, por ser la que

guía mis pasos en cada una de

las acciones de mi vida.

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AGRADECIMIENTO

Al Dr. Mario Alva Astudillo por su orientación durante el desarrollo del

presente trabajo de investigación.

A la Profesora Dra. Pilar Puebla de la Facultad de Farmacia, Universidad

de Salamanca, España; por el registro de los cromatogramas de gases y los

espectros de masas.

Al Mg. Segundo Manuel Miranda Leyva por los registros de los espectros

Uv-vis.

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Página

DEDICATORIA i

AGRADECIMIENTO ii

INDICE GENERAL iii

RESUMEN v

ABSTRACT vi

I. INTRODUCCIÓN 1

II. MATERIALES Y MÉTODOS 5

2.1. MATERIALES 5 2.1.1. Material botánico 5 2.1.2. Cepas bacterianas 6 2.1.3. Medios de cultivo 6 2.1.4. Reactivos 6 2.1.5. Reveladores 7 2.1.6. Material de vidrio 7 2.1.7. Material cromatográfico 7 2.1.8. Equipos 7 2.2. MÉTODOS 8 2.2.1. Preparación de la muestra 8 2.2.2. Marcha fitoquímica 8

2.2.3. Obtención del extracto 9

2.2.4. Hidrólisis del extracto 9

2.2.5. Métodos cromatográficos 9

2.2.6. Caracterización espectroscópica y cromatográfica

de las fracciones. 10

2.2.7. Ensayo de la actividad antibacteriana 11

2.2.8. Evaluación estadística 11 III. RESULTADOS 12 3.1. Marcha fitoquímica 12

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POSGRADO

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3.3. Cromatografía en capa delgada 13

3.4. Cromatografía flash. 14

3.5 Caracterización espectroscópica UV-VIS de los metabolitos

secundarios de las fracciones A y B. 16

3.6. Caracterización espectroscópica IR de los metabolitos

secundarios de las fracciones A y B 17

3.7. Caracterización de los metabolitos secundarios de la fraccion A

mediante GC/MS y1H-RMN. 19

3.8. Caracterización de los metabolitos secundarios de la fraccion B

mediante GC/MS y1H-RMN. 22

3.9. Ensayo de la actividad antibacteriana. 26

IV. DISCUSIÓN 28

4.1. Marcha fitoquímica 28

4.2. Obtención del extracto 28

4.3. Cromatografía en capa delgada 29

4.4. Cromatografía flash. 30

4.5 Caracterización espectroscópica UV-VIS de los metabolitos

secundarios de las fracciones A y B. 30

4.6. Caracterización espectroscópica IR de los metabolitos

secundarios de las fracciones A y B 31

4.7. Caracterización de los metabolitos secundarios de la fracción A

mediante GC/MS y1H-RMN. 32

4.8. Caracterización de los metabolitos secundarios de la fracción B

mediante GC/MS y1H-RMN. 33

4.9. Ensayo de la actividad antibacteriana. 34

CONCLUSIONES 36 RECOMENDACIONES 38 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39

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DE

POSGRADO

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El propósito del presente trabajo es la determinación de la actividad antibacteriana in

vitro de los extractos de hoja de Piper aduncum, sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.

Se obtuvieron extractos acuoso, metanólico, clorofórmico y diclorometánico. En el extracto acuoso se evidenció flavonoides y saponinas; en el extracto metanólico alcaloides y flavonoides; en el extracto clorofórmico triterpenoides y en el extracto diclorometanico se detectó alcaloides y triterpenoides.

El extracto acuoso fue fraccionado mediante cromatografía flash. Las fracciones fueron caracterizadas por espectroscopía UV-VIS, IR y1H-NMR y mediante métodos GC/MS, mostrando la presencia de flavonoides.

Se realizaron ensayos de la actividad antibacteriana de los diferentes extractos y de las fracciones del extracto acuoso frente a cultivos de Staphylococcus aureus y

Streptococcus pyogenes. El extracto acuoso presentó la mayor actividad; el extracto

metanólico presenta actividad moderada, mientras que los extractos diclorometánico y clorofórmico son muy poco activos. En cuanto a las fracciones del extracto acuoso, la fracción B demostró ser más activa que la fracción A.

Palabra Clave: Piper aduncum, favonoides, actividad antibacteriana.

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The purpose of this study is to determinate the antibacterial activity in vitro of the Piper

aduncum leave extracts, against Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.

Aqueous, methanol, chloroform and dichloromethane extracts were obtained. Flavonoids and saponines were detected in the aqueous extract; alkaloids and flavonoids in the methanol extract; triterpenoids in the chloroform extract and alkaloids and triterpenoids in the dichloromethane extract.

The aqueous extract was fractioned by flash chromatography. The fractions were characterized by UV-VIS, IR and 1H-NMR spectroscopy and by GC/MS methods, showing the presence of flavonoids.

Antibacterial activity essays against Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes were carried out with the extracts and aqueous extract fractions. The aqueous extract showed the highest activity; the methanol extract rendered moderate activity, whereas the chloroform and dichloromethane extracts showed only minimal activity. Regarding the aqueous extract fractions, the B fraction showed a higher activity than fraction A.

Key words: Piper aduncum, flavonoids, antibacterial activity.

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I. INTRODUCCIÓN

La ciencia moderna, analizando y estudiando los efectos terapéuticos de las plantas, quiere conocer los principios activos responsables de sanar las enfermedades, determinar su estructura química, procurar su síntesis, proponer modificaciones estructurales en busca de una mayor actividad. Es entonces de gran importancia localizar los principios activos en las diferentes partes de las plantas, para luego aislarlos.

Diversos autores especifican que el contenido de los principios activos en los tejidos vegetales es determinado por la edad de la planta, su desarrollo, la época de recolección y las condiciones climatológicas (Trease G. 1994).

Una investigación fitoquímica se inicia con la marcha fitoquímica preliminar, que consiste en la extracción de fitoconstituyentes químicos con solventes apropiados de acuerdo a la solubilidad y estabilidad de las sustancias a extraer y posteriormente con la aplicación de pruebas de coloración y precipitación.

Estudiar una planta es definir su identidad, conocer su origen, forma de producción, factores que puedan hacer variar su composición química, así como su actividad farmacológica.

Teniendo en cuenta que hay por lo menos 250 000 especies de plantas superiores en la Tierra, es lógico asumir que muchas más drogas útiles serán encontradas en el reino vegetal, si la búsqueda de éstas entidades se efectúa de una manera lógica y sistemática.

Nuestro país tiene el privilegio de contar en su territorio con numerosas plantas medicinales, entre ellas la familia Piperácea que comprende unas 1300 especies. La especie

Piper aduncum, es oriunda de América del Sur, abunda en el Perú, Ecuador, Bolivia,

Paraguay, Brasil y norte de Argentina. Crece particularmente en lugares húmedos a orillas de riachuelos y de fangos. Es un arbusto de 2 – 3 m. de altura, la hoja entera es ampliamente

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aovada y acorazonada en la base, con el ápice terminal en punta, de color gris verdoso, pubescente por el envés, olor aromático que recuerda un poco a la menta, sabor cálido amargo no desagradable. (Savev I. 1985.).

Se le conoce con el nombre de matico, cordoncillo y hierba del soldado y en idioma shipibo-conibo, los nativos lo conocen con el nombre de “potoima rao”. En este idioma, potoima significa empacho y rao, remedio, resultando la traducción en remedio para el empacho. La especie Piper aduncum, crece como silvestre en muchos lugares del Perú, siendo aprovechada por menos del 5% de la población, por desconocimiento de sus propiedades medicinales o por no tener confianza en la planta natural y tener preferencia por los productos sintéticos.

En la actualidad, su uso etnomedicinal es múltiple y variado siendo empleado en infusión para aliviar y curar enfermedades del tracto respiratorio (antiinflamatorio, antitusígeno y antiséptico, bueno para bronquitis, amigdalitis, otitis), en dolencias gastrointestinales (diarreas agudas o crónicas, disentería) y como vulnerario en decocto (para el lavado de heridas externas). Igualmente, la infusión de estas hojas juntamente con otras como la malva de olor es muy útil para los baños de asiento y lavados vaginales siendo empleada en los descensos fluidos y blanquecinos causados por el parásito Trichomona vaginalis. Para el empacho y enfermedades gastrointestinales, se deben soasar 2 ó 3 hojas a fuego lento y frotarse todo el estómago. Se puede utilizar en niños desnutridos para evitar la infección microbiana. (Kozel C. 1986)

Los microorganismos más comunes causantes de amigdalitis, bronquitis y otitis son las bacterias estafilococos, estreptococos y los bacilos difteroides, entre otros. Bacterias potencialmente perjudiciales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus-hemolítico y Klebsiella pneumoniae son muchas veces parte de la flora

normal de la nasofaringe de individuos sanos. (Brook G. 1999). Los estafilococos pueden presentar cuadros graves e incluso necrotizantes de faringitis, amigdalitis, sinusitis, otitis o flemones retrofaríngeos. (Koneman E. et al. 1992).

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Cuando debe indicarse un agente antimicrobiano, el objetivo es elegir una droga que sea selectiva para el microorganismo infeccioso y que tenga el menor potencial posible para causar toxicidad o reacciones alérgicas en la persona que lo usa. Para el tratamiento de bronquitis se emplea penicilina G, cefalosporina o clindamicina. En la amigdalitis y otitis se elige penicilina G, eritromicina o vancomicina. Para las diarreas sanguinolentas los más adecuados son trimetroprim-sulfametoxazol, ampicilina o tetraciclina. (Goodman A. 1989).

El acceso a estos antimicrobianos sintéticos es en ciertos casos costoso, además de los efectos secundarios que producen. Se presenta como alternativa el uso de productos naturales por su bajo costo y fácil accesibilidad.

Por estos considerandos, el presente trabajo de investigación tiene el propósito de determinar la actividad antibacteriana in vitro de los extractos de hojas de Piper aduncum, sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. Mediante este estudio se pretende verificar las propiedades terapéuticas que la medicina popular atribuye a dicha especie vegetal y canalizar la posibilidad de su utilización en el tratamiento de infecciones de las vías respiratorias.

En el presente trabajo se plantea el siguiente problema: ¿tienen los extractos de hojas de Piper

aduncum actividad antibacteriana in vitro sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes?.

Constituyen objetivos del presente trabajo:

1.- Identificar los metabolitos secundarios presentes en los extractos de hoja de Piper

aduncum.

2.- Determinar el porcentaje de flavonoides presentes en el extracto acuoso seco y en el polvo de hoja de Piper aduncum.

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3.- Identificar los metabolitos secundarios con actividad antibacteriana sobre cultivos de

Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, contenidos en las hojas de Piper aduncum.

4.- Determinar la actividad antibacteriana “in vitro” de los extractos de la hojas de Piper

aduncum, sobre cultivos de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.

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II. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. MATERIALES

2.1.1. MATERIAL BOTÁNICO

Se utilizaron 500 g de hojas de Piper aduncum, que fueron recolectadas en la Provincia de San Marcos Departamento de Cajamarca durante el mes de febrero del 2006. La identificación de la especie se realizó en el Herbario Truxillensis de la Universidad Nacional de Trujillo.

IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA

Piper aduncum "matico", especie motivo del presente trabajo, está clasificada siguiendo el

sistema Filogenético de Adolf Engler.

Reino : Plantae Subreino : Fanerógamas División : Angiospermae Clase : Dicotyledoneae Sub clase : Archychlamydeae Orden : Piperales

Familia : Piperaceae Género : Piper

Especie : Piper aduncum

NOMBRE COMÚN  Matico

 Cordoncillo  Hierba del soldado  Potoima rao

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2.1.2. CEPAS BACTERIANAS

Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, fueron proporcionadas por el cepario

del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UNT, donde han sido identificadas y mantenidas en condiciones adecuadas hasta su uso.

2.1.3. MEDIOS DE CULTIVO - Agar nutritivo. - Agar BHI 2.1.4. REACTIVOS - Acetato de etilo. - Acido acético - Ácido clorhídrico. - Ácido sulfúrico. - Agua destilada. - Anhídrido acético - Amoniaco - Cinta de magnesio - Cloroformo. - Cloruro férrico - Diclorometano - Etanol 96º. - Gelatina - Hexano - Hidróxido de sodio al 5% - Metanol. - Propanol - Yodo

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POSGRADO

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2.1.5. REVELADORES

- Ácido sulfúrico (general) - Amoniaco (flavonoides) - Borntranger (antraquinonas) - Cloruro férrico (fenoles) - Dragendorff (alcaloides)

- Gelatina – cloruro de sodio (taninos) - Lieberman-Burchard (esteroides) - Mayer (alcaloides)

- Shinoda (flavonoides)

2.1.6 MATERIAL DE VIDRIO El de uso común en el laboratorio

2.1.7 MATERIAL CROMATOGRÁFICO

- Cromatofolios de silica gel 60 (Merck) 20 x 20 cm. - Silica gel para cromatografía flash

2.1.8. EQUIPOS

- Balanza analítica Sartorius, modelo BP301S, serie 13005198 - Bomba de vacío General Electric, modelo 5KH33DN68

- Espectrofotómetro Infrarrojo FT-IR Perkin – Elmer, Spectrum One. - Espectrofotómetro UV – VIS de arreglo de diodos HP 8452

- Espectrómetro RMN Brucker 250 MHz - Estufa Memmert, modelo U40, serie 840197

- Rotavapor Heidolph Laborota 4003 control, serie 120601 368. - Lámpara ultravioleta Desaga, serie 72307

- Refrigerador Electrolux, serie 734498

- Sistema Acoplado de Cromatografía de Gases – Espectrometría de Masas GC/MS, Hewlett Packard, modelo HP-5971.

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2.2. MÉTODOS

2.2.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Después de recolectar las hojas maduras y seleccionar las mejores, se les dejó secar a temperatura ambiente bajo sombra por 2 días. Seguidamente, se continúo con el secado en estufa a 40º C por 24 horas. La muestra seca fue molida usando un mortero con pilón y almacenada en frascos de color ámbar.

2.2.2. MARCHA FITOQUÌMICA

Basada en la separación por disolventes de diferente polaridad y la identificación cualitativa con reactivos de coloración. Prueba de la gota. (Lock O. 1994).

Se pesó 1 g de polvo del material en estudio al cual se agregó 10 mL de solvente. Luego se sometió a reflujo controlado por 10 minutos a baño maría. Se dejó enfriar y se filtró, realizándose luego el ensayo que corresponde según el extracto obtenido.

Para la identificación de los diferentes metabolitos secundarios se hizo uso de diferentes reactivos de coloración o de precipitación; entre estos tenemos:

- Espuma Para determinar Saponinas. - Gelatina Para determinar Taninos

- Tricloruro férrico Para grupos fenólicos en general - Shinoda Para determinar Flavonoides - Bortranger Para determinar Quinonas

- Rosenheim Para determinar leucoantocianidinas - Draggendorf Para determinar alcaloides

- Mayer Para determinar alcaloides - Bouchardat Para determinar alcaloides

Para ello se realizaron cuatro tipos de extracciones:

Extracto diclorometánico. Se realizó las pruebas Liebermann-Bouchardat y Bortranger.

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Extracto metanólico. Se hizo las pruebas Liebermann-Bouchardat, Shinoda, Gelatina, Draggendorf, y Mayer.

Extracto acuoso ácido. Se efectuó las pruebas Draggendorf y Mayer.

Extracto acuoso. Fue sometido a las pruebas Shinoda, Rosenheim, Espuma y Gelatina.

2.2.3. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO

Después de pulverizar las hojas secas de Piper aduncum, se pesó 5 g de este polvo y se procedió a extraer los metabolitos secundarios con 125 mL de cada uno de los siguientes solventes: agua, metanol, cloroformo y diclorometano, mediante el método Soxhlet. (Voigh R. 1982). Los extractos se llevaron a sequedad en rotavapor y luego en estufa a 40ºC, para obtener el extracto seco.

2.2. 4. HIDRÓLISIS DEL EXTRACTO

El extracto acuoso fue hidrolizado para liberar las agliconas. Se hirvió a reflujo durante 2 horas en 200 mL de ácido sulfúrico al 10 % y 200 mL de etanol al 50%. Se enfrió a temperatura ambiente y se filtró al vacío. El residuo se lavó con etanol al 50% y el filtrado se evaporó en baño de agua hasta la mitad del volumen inicial. Se enfrió en la nevera por 1 hora hasta formación de precipitado y luego se filtró, lavando el precipitado formado con 4 porciones de 50 mL de agua destilada fría (10 ºC).

A continuación, se eliminó el filtrado y los lavados; el residuo tanto del filtro como del recipiente se disolvió con 150 mL de etanol al 96% calentado previamente a 50ºC, Posteriormente se dejó evaporar a temperatura ambiente hasta sequedad, obteniéndose un producto siruposo amarillento oscuro. Este paso se repitió por diez veces hasta obtener 0.4536 g. El producto obtenido fue luego fraccionado por cromatografía flash.

2.2.5. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

2.2.5.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

La cromatografía en capa delgada (Skoog D. 2001.) se empleó para la identificación de los metabolitos y para el monitoreo de de la cromatografía flash. Se utilizaron cromatofolios

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de silica gel 60 sobre soporte de aluminio (Merck). Como fase móvil se emplearon soluciones de acetato de etilo/hexano en diferentes proporciones.

2.2.5.2. FRACCIONAMIENTO POR CROMATOGRAFÍA FLASH

Mediante cromatografía flash se fraccionó los 0.4536 g del extracto, utilizando silica gel como fase estacionaria, mediante una elución isocrática con 250 mL del sistema hexano: acetato de etilo (7:3 v/v).

Seguidamente se realizó cromatografía en capa fina con cada una de las fracciones, los cromatogramas se llevaron a la lámpara UV, luego se les sometió a los vapores de NH3 y

yodo con la finalidad de evidenciar la separación; las fracciones con igual Rf se reagruparon en una sola y se llevaron a sequedad en rotavapor.

2.2.6. CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA Y CROMATOGRÁFICA DE

LAS FRACCIONES

Las fracciones reagrupadas se analizaron mediante espectroscopia UV-VIS, IR, RMN de

1

H, y por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa (GC-MS). (Hesse M. 1995; Skoog D. 2001).

Los espectros UV-Vis fueron realizados en un instrumento UV – VIS de arreglo de diodos HP 8452 utilizando etanol como solvente. Los espectros IR se registraron como pastas en nujol en un instrumento FT-IR Perkin – Elmer, Spectrum One. Los cromatogramas de gases de las fracciones y los espectros de masas fueron obtenidos en un cromatógrafo GC-MS de la firma Hewlett Packard, modelo HP-5971. Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear fueron realizados en un espectrómetro Bruckert de 250 MHz.

2.2.7. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

La evaluación de la actividad antibacteriana in vitro de los extractos y fracciones de la especie Piper aduncum se efectuó por el método de Kirby-Bauer de difusión en agar (Brook G. 1999; Koneman E. et al. 1992). Se realizó en las siguientes etapas:

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2.2.7.1. PREPARACIÓN DEL INÓCULO

Empleando solución salina estéril, se preparó suspensiones de cada una de las cepas jóvenes con una turbidez equivalente al tubo Nº 1 del nefelómetro de MC-Farland (3 x 108 bacterias por mL.)

2.2.7.2. CULTIVO DE MICROORGANISMOS

A los medios de cultivos se les hizo cuatro perforaciones cilíndricas. El inóculo de

Staphylococcus aureus se sembró en agar nutritivo y Streptococcus pyogenes en agar BHI, la

siembra se realizó en superficie en placas petri.

2.2.7.3. DOSIFICACIÓN Y APLICACIÓN DE LOS EXTRACTOS

Los extractos secos se disolvieron con un volumen de 10 mL del respectivo disolvente y a partir de éstos se colocó 10, 20, 30 y 40 μL en cada una de las perforaciones de los medios de cultivo inoculados con el microorganismo.

Todos los cultivos se incubaron a 37 ºC por 24 horas.

2.2.7.4. MEDICIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Después de la incubación se procedió a medir con una regla milimetrada el diámetro del halo de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano

2.2.8. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA

Los resultados del ensayo antibacteriano se evaluaron mediante Anova, para comprobar la diferencia entre dosis. (Miller J. 1993).

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III. RESULTADOS

3.1. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR

Usando disolventes de diferente polaridad y reactivos de coloración y precipitación se identificó los metabolitos secundarios presentes en los diferentes extractos de las hojas de

Piper aduncum los cuales se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1: Marcha fitoquímica para los metabolitos secundarios contenidos en los extractos de las hojas de Piper aduncum.

Ensayo Metabolito secundario Extracto Acuoso Extracto Acuoso Acido Extracto Metanó-lico Extracto Cloro-fórmico Extracto Dicloro-metánico Tricloruro Férrico Grupos Fenólicos +++ +++ ++

-

-Espuma Saponina + + Gelatina Taninos

-

-

-Shinoda Flavonoides +++ +++ ++ Bortranger Quinonas

-

-

-

-

-Rosenheim Antocianidina

-

-

-Draggendorf Alcaloides +++ + + + Mayer Alcaloides +++ + + + Lieberman-Bouchard Triterpenoides + ++ ++

Leyenda: Reacción positiva moderada (+); Reacción positiva intensa (++); Reacción Positiva muy intensa (+++), Negativo (

-)

3.2. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS SECOS

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Los extractos obtenidos de las hojas de Piper aduncum se llevaron a sequedad en evaporador rotatorio y luego en estufa a 40 ºC, para obtener extractos secos. En el Cuadro 2 se presenta el peso de cada uno de los extractos.

Cuadro 2: Peso de extracto seco de los extractos de las hojas de Piper aduncum.

3.3. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

Con la finalidad de monitorizar la fase móvil más adecuada que permita una separación adecuada de los metabolitos secundarios contenidos en el extracto acuoso de las hojas de

Piper aduncum se usó cromotafolios de silica gel de 1 cm de ancho por 7.5 cm de largo. Los

resultados de tal monitorización se presentan en los cuadros 3 y 4.

Cuadro 3: Cromatografía de capa delgada. Sistema de eluyentes para separación de metabolitos secundarios de extracto acuoso.

SISTEMAS ELUYENTE

Metanol: Agua

Cloroformo: Acetato de etilo Hexano: Acetato de etilo (7:3) V/V

No adecuado No adecuado Adecuado

Solvente Extracto seco

(g) Diclorometano Cloroformo Metanol Agua 1.2842 1.1875 1.3694 1.5653

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Cuadro 4: Relación entre el color de la mancha del eluato del extracto acuoso a la luz

UV, NH3y yodo con el posible tipo de metabolito secundario.

Color de la mancha a la luz UV

Vapores de Yodo Sin NH3 con NH3

Púrpura Sin cambio Amarillo oscuro

3.4. CROMATOGRAFÍA FLASH

Mediante cromatografía flash se fraccionó el extracto etanólico de consistencia siruposo y de color amarillento oscuro,se realizó una elución isocrática utilizando silica gel como fase estacionaria y 250 mL de sistema hexano: acetato de etilo (7:3 v/v) como fase móvil. Las fracciones obtenidas se presentan en los Cuadros 5 y 6.

Cuadro 5: Cromatografía flash, fraccionamiento de 0.4536 g de extracto acuoso por elusión isocrática con hexano:acetato de etilo (7:3 v/v).

Número de fracciones Volumen (mL) Color de fracción eluída 1 9 Incoloro 2 9 Incoloro 3 9 Incoloro 4 9 Incoloro 5 9 Incoloro 6 9 amarillo débil 7 9 amarillo débil 8 9 amarillo débil 9 9 Incoloro 10 9 Incoloro 11 9 Incoloro

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Cuadro 5: Cromatografía flash, fraccionamiento por elución isocrática eluyente hexano: acetato de etilo (7:3 v/v).

(Continuación) Número de fracciones Volumen (mL) Color de fracción eluída 12 9 verde tenue 13 9 verde tenue 14 9 verde tenue 15 9 verde tenue 16 9 verde tenue 17 9 verde tenue 18 9 verde tenue 19 9 verde tenue 20 9 verde tenue 21 9 verde tenue 22 9 verde tenue 23 9 verde tenue 24 9 incoloro 25 9 Incoloro 26 9 Incoloro 27 9 Incoloro 28 9 Incoloro 24 9 incoloro 25 9 Incoloro 26 9 Incoloro 27 9 Incoloro 28 9 Incoloro

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Cuadro 6: Reagrupación de fracciones de extracto etanólico con igual Rf

Fracción Nº de Fracciones Rf

A 6-7-8 0.66

B 12-13-14-15-16-17-18-19-20-21-22-23 0.33

3.5. CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA UV – VIS DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS DE LAS FRACCIONES A y B

Mediante espectroscopia UV-VIS se analizaron las fracciones reagrupadas, con la finalidad de identificar el metabolito secundario presente en la fracción A y B, obteniéndose los espectros que se presentan en las figuras 1 y 2 respectivamente.

Wav elength (nm) 250 300 350 400 450 500 Ab so rb an ce (A U) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 21 6 24 8

Figura 1: Espectro UV – VIS de la Fracción A; λ=216 nm., Abs.=0,83244; λ=248 nm, Abs.=0,43996

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Wavelength (nm) 250 300 350 400 450 500 Ab so rb an ce (A U) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 22 0 25 4

Figura 2: Espectro UV–VIS de la Fracción B; λ=220 nm, Abs.=1,2642; λ= 254 nm Abs.=0,78934

3.6. CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA IR DE LOS

METABOLITOS SECUNDARIOS DE LAS FRACCIONES A Y B

Las fracciones reagrupadas se analizaron mediante espectroscopia IR, para poder identificar los diferentes grupos funcionales que forman parte del metabolito secundario presente en las fracciones A y B. Los espectros se muestran en las figuras 3 y 4 respectivamente.

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Figura 3: Espectro IR de la Fracción A

Figura 4: Espectro IR de la Fracción B

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3.7. CARACTERIZACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS DE LA FRACCIÓN “A” MEDIANTE GC/MS Y1H-RMN

La fracción A, se analizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa (GC/MS), presentados en las figuras 5 a 7 y por1H-RMN, el espectro se muestra en la figura 8

Figura 5: GC fracción A

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Figura 6: MS componente 1 de la fracción A

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Figura 8:1H-RMN de la fracción A

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3.8. CARACTERIZACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS DE LA FRACCIÓN “B” MEDIANTE GC/MS Y1H-RMN

La fracción B, se analizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa (GC-MS), presentados en las figuras 9 al 13 y por1H-RMN, el espectro se muestra en la figura 14.

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Figura 10: MS componente 1 de la fracción B

Figura 11: MS componente 2 de la fracción B

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(31)

Figura 12: MS componente 3 de la fracción B

Figura 13: MS componente 4 de la fracción B

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Figura 14:1H-RMN de la fracción B

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3.9. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

Para evaluar la actividad antibacteriana in vitro de los extractos y fracciones de la especie

Piper aduncum, se midió el diámetro de inhibición del crecimiento bacteriano empleando el

método de Kirby-Bauer (Brook G. 1999) de difusión en agar. Los resultados, expresados en mm., para los extractos y fracciones se presentan en los Cuadros 7 y 8, respectivamente.

Cuadro 7: Inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes , por acción de los extractos de hojas de Piper aduncum

BACTERIAS GRAM POSITIVAS EXTRACTO Volu men (μl)

ACUOSO METANÓLICO CLOROFOR MICO DICLORO-METANICO Diámetro de inhibición (mm) Staphylococcus aureus 10 30 20 14 10 20 35 25 17 12 30 37 27 19 13 40 40 28 20 14 Streptococcus pyogenes 10 28 15 10 11 20 33 18 12 12 30 35 20 14 13 40 38 22 15 14

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DE

POSGRADO

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Cuadro 8: Inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogene , por acción de la fracción A y B del extracto acuoso de Piper aduncum

BACTERIAS GRAM POSITIVAS Volumen de fracción A (3.68 μg/μL) Volumen de fracción B (3.68 μg/μL) 40 μL 40 μL Diametro de inhibición (mm) Staphylococcus aureus 18 28 Streptococcus pyogenes 12 17

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DE

POSGRADO

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IV. DISCUSIÓN

4.1. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR

Al analizar los resultados de la caracterización de los metabolitos secundarios de los extractos de las hojas de Piper aduncum presentados en el Cuadro Nº 1, se puede observar que existen saponinas, flavonoides, alcaloides y triterpenoides; los que fueron identificados por reacciones de coloración y precipitación, mediante ensayos a la gota.

Con respecto a la presencia de grupos fenólicos y flavonoides, existe una diferencia respecto a la cantidad de metabolitos en estudio; los que se encuentran en mayor proporción en los extractos acuoso y acuoso ácido respecto al metanólico. Dicha diferencia se debe a que los flavonoides son compuestos muy hidroxilados, y por lo tanto serán más solubles en solventes polares como el agua.

Los alcaloides están en mayor proporción en el extracto acuoso en medio ácido, debido a que en forma de sales son solubles en solventes polares. En el extracto diclorometanico existen en menor cantidad, debido a que solamente solubilizan aquellos que están en forma de base. La diferencia de proporciones se evidenció por la intensidad de la coloración de las reacciones y por la cantidad de precipitado formada.

Por lo tanto, en el extracto diclorometánico y clorofórmico hay sustancias de muy baja polaridad; en el metanolico, sustancias de polaridad muy variada y en al acuoso sustancias de alta polaridad.

4.2. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS SECOS

Los resultados presentados en el cuadro Nº 2 evidencian que el agua extrae la mayor cantidad de metabolitos en comparación a los otros solventes usados, lo cual indica una mayor concentración de substancias polares.. El peso de extracto seco se determinó con la

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los cultivos de bacterias. Así, para los extractos clorofórmico, diclorometánico, metanólico y acuoso es de 0.11875 mg/μL, 0.12842 mg/μL, 0.13694 mg/μL y 0.15653 mg/μL, respectivamente.

4.3. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

En el cuadro Nº 3 se muestra los resultados de cromatografía de capa fina, usando diferentes sistemas como eluyentes para la separación de los metabolitos secundarios contenidos en el extracto acuoso hidrolizado y disueltos en alcohol al 96%.

El sistema 1, metanol: agua, no es adecuado, ya que no se produce separación de los metabolitos, debido a la elevada polaridad del eluyente, lo que se evidencia por la presencia de colas que no permite la separación de los metabolitos.

El sistema 2, cloroformo: acetato de etilo, presenta separación de los metabolitos, pero no tiene una buena resolución en ninguna proporción, lo cual se debe a que la polaridad del eluyente aún es bastante elevada frente a la de los metabolitos.

El sistema 3, hexano: acetato de etilo, en la proporción 7:3 (v/v) permitió una mejor separación de los componentes del extracto acuoso, presentando mejor resolución debido a la menor polaridad del eluyente en comparación a los metabolitos.

La detección de los flavonoides en cromatografía de capa fina, puede hacerse por el color que desarrollan en el Vis o en el UV, apareciendo como manchas fluorescentes azules, rosadas, naranjas, púrpuras y otras las cuales se intensifican o cambian de color luego de su exposición a vapores de amoniaco (anexo tabla 1). Geissman y Markham reportan la relación que existe entre los colores y la posible estructura de los flavonoides (Lock 1997.)

En el cuadro Nº 4 se presenta el revelado al UV y con NH3. Cuando se revela con la

lámpara UV se observan manchas fluorescentes de color púrpura y cuando se revela con NH3

no hay cambio de color, por lo que según la literatura podría tratarse de isoflavonas,

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dihidroflavonoles y flavanonas con OH libre, flavonas o flavonoles 3-O-substituido con 5-OH, pero sin 4’-OH libre, chalcona con 2’- o 6’-5-OH, pero sin 2- o 4-OH libre. El revelado con yodo presenta manchas de coloración amarillo oscuro, lo que indica que hay presencia de instauraciones conjugadas.

4.4. CROMATOGRAFÍA FLASH

La cromatografía en columna permanece como una técnica muy usual para la purificación preliminar y para separaciones a escala preparativa de grandes cantidades de flavonoides de extractos crudos de productos naturales (Lock O. 1994).

El Cuadro Nº 5 evidencia 28 fracciones de la elusión isocrática de 0.4536 g de extracto acuoso con hexano: acetato de etilo (7:3 v/v), las diferentes coloraciones obtenidas durante la elusión nos permiten sostener que se ha producido separación de los metabolitos secundarios, esto se corrobora monitoreando las fracciones por cromatografía en capa fina con la finalidad de evaluar la calidad del aislamiento de los polifenoles.

En el Cuadro Nº 6 se observa que las fracciones 6,7 y 8 tienen un Rf de 0.66, las cuales se reagrupan obteniéndose la fracción A; las fracciones 12 al 23 dan un Rf de 0.33, reagrupándose en la fracción B. Ambas fracciones, luego de ser secadas en rotavapor y en estufa, rindieron 0.0345 g de A de color amarillo claro y 0.0646 g de B de color verde oscuro ambos de consistencia siruposa, respectivamente.

4.5. CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA UV – VIS DEL METABOLITO SECUNDARIO DE LAS FRACCIONES A y B

El método más usual para un análisis preliminar de la estructura de un metabolito es la absorción UV- Vis. Esta técnica es usada tanto para identificar el tipo de flavonoide como el modelo de oxigenación. El espectro típicamente consiste de dos máximos de absorción en los rangos de 240-285 nm (Banda II, anillo A) y 300-550 nm (Banda I, anillos C y B) (anexo tabla 2). La variación de estos rangos depende del modelo de hidroxilación y del grado de

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substitución de los hidroxilos. La oxigenación adicional, causa un desplazamiento batocrómico de la banda correspondiente; la metilación o glicosilación, especialmente de 3,5,7 y 4’-OH, causa desplazamiento hipsocrómico de las bandas; la acetilación tiende a nulificar el efecto del grupo hidroxilo fenólico en el espectro. (Lock, 1994).

En las Figuras 1 y 2 se muestra el espectro UV – VIS de las fracciones A y B respectivamente, registrados en un espectrofotómetro de arreglo de diodos HP 8452. Se pudo determinar en ambas fracciones del extracto acuoso la posible existencia de isoflavonas por la presencia de la banda en el rango 245 – 275 nm; teniendo la banda de importancia de la fracción A un λmax de 248 nm. y la de la fracción B un λmax de 254 nm. Esto confirma la

relación entre el color de la macha purpura en la CCD observada a la luz UV (anexo cuadro 1). Al comparar los espectros de ambas fracciones, la fracción B tendría un desplazamiento batocrómico con respecto a la fracción A, lo que indicaría que posee mayor grado de oxigenación. Dichos resultados son coherentes con los obtenidos en cromatografía de columna con el mismo eluyente, hexano: acetato de etilo (7:3 v/v), donde primero salen los metabolitos menos polares y luego los más hidroxilados.

4.6. CARACTERIZACION ESPECTROSCÓPICA IR DEL METABOLITO SECUNDARIO DE LAS FRACCIÓNES A Y B

En la Fig. 3, que corresponde al espectro IR de la fracción A se puede observar los siguientes grupos funcionales: -OH 3416 cm-1, -C = C 3010 cm-1, estiramiento -C- C 2929 cm

-1

del CH3y del CH2, estiramiento –C = O 1718 cm-1, flexión - C = C 1603 y 1464 cm-1, flexión

–C- O entre 1195 y 1029 cm-1, flexión fuera del plano de aromático 772 cm-1, la presencia de estos grupos funcionales indica la presencia de flavonoides caracterizados por los grupos carbonilo, hidroxilos, señales de dobles enlaces y de aromáticos, De otro lado, los estiramientos correspondientes a los enlaces carbono – oxígeno se pueden asignar a las señales de éteres alquil – aromáticos correspondientes a los substituyentes del tipo metoxilo, que pueden estar presentes en ambos anillos aromáticos.

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En la fig. 4 del espectro IR de la fracción B se observa la presencia del estiramiento del –OH entre 3500 y 2500 cm-1, una región del sobretono del –OH entre 2800 y 2200 cm-1, -C = C 3010 cm-1, estiramiento -C- C 2926 cm-1del CH2, estiramiento –C = O 1683 cm-1,

estiramiento anillo aromático 1604 cm-1,combinación estiramiento y flexión de C-O 1300 a 1200 cm-1, flexión del –C-O del fenol 1202 cm-1, la presencia de estos grupos funcionales nos da un indicio de que se trataría de un compuesto aromático.

4.7. CARACTERIZACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS DE LA

FRACCIÓN “A” MEDIANTE GC/MS Y1H-RMN

A pesar de que los resultados de la cromatografía de capa fina muestran una sola señal para la fracción A, el cromatograma de gases de dicha fracción indica que, se trata de una mezcla de compuestos de polaridad bastante similar, que no pueden ser resueltos por CCD.

El cromatograma de gases de la fracción A (fig. 5) muestra la presencia de tres componentes principales que eluyen entre 17,3 y 20,3 min. Así mismo, se observa la presencia de componentes minoritarios en esta fracción.

El espectro de masas del componente que eluye a TR= 17,763 min. (fig. 6) presenta un

pico del ion molecular muy débil a m/e = 330. Tal relación masa/carga corresponde a un flavonoide que contiene tres grupos hidroxilo y dos metoxilos. El componente mayoritario a un TR= 20,325 min. (fig. 7) igualmente muestra un débil ion molecular a m/e = 390. Dicho

valor corresponde a un flavonoide portando tres grupos hidroxilo y cuatro grupos metoxilo. La espectrometría de masas no puede aportar información sobre la ubicación de dichos grupos dentro de las moléculas de flavonoide.

El espectro 1H-RMN de la fracción A (fig. 8) indica así mismo que se trata de una mezcla compleja de substancias. Se observan señales correspondientes a grupos metilo correspondientes a grupos metoxilo entre 3 y 4 ppm, así como a protones aromáticos y

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fenoles se encuentran en el rango entre 2 y 4 ppm. La presencia de estas señales es un indicio claro de la presencia de compuestos flavonoides. Las señales alifáticas entre 0,90 y 2 ppm posiblemente corresponden a restos de solventes hidrocarbonados.

4.8. CARACTERIZACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS DE LA

FRACCIÓN B MEDIANTE GC/MS Y1H-RMN

El cromatograma de gases de la fracción B (fig. 9) indica que también se trata de una mezcla de compuestos, consistente de tres componentes mayoritarios, que eluyen entre y 18,563 y 19,254 min. Además se observan varios componentes en concentraciones mucho menores que abandonan la columna cromatográfica a valores de TR cercanos a los de los

componentes principales.

La fracción minoritaria que eluye a TR = 18,036 min. (fig. 10) muestra una señal de

intensidad mediana que corresponde a su ion molecular a m/e = 318. Tal masa corresponde a un flavonoide substituido por un grupo hidroxilo y seis metoxilos.

El compuesto con TR= 18,563 min. (fig. 11) presenta un ion de intensidad moderada a

un valor máximo de m/e = 323. Es difícil que dicha señal corresponda al ion molecular, ya que su relación masa/carga tiene un valor impar, lo cual no es de esperarse en el caso de flavonoides, ya que estas substancias no pueden contener un número impar de átomos de nitrógeno. Es probable que la señal a m/e = 323 corresponda a (M – 1), por pérdida de un átomo de hidrógeno, por lo que el valor de M debe corresponder a m/e = 324. Dicha masa molecular corresponde a la estructura de un flavonoide conteniendo 2 grupos hidroxilo y 3 metoxilos.

El compuesto que eluye a TR = 18,914 min. (fig. 12) muestra un ion molecular

medianamente débil de m/e = 334. Dicho valor indica un flavonoide substituido por siete grupos hidroxilo.

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Además, el componente con TR = 19,254 min. (fig. 13) presenta un pico molecular

casi imperceptible a una relación masa/carga de 372, lo cual indica la posibilidad de un flavonoide substituido por cinco grupos metoxilo.

El espectro 1H-RMN de la fracción B (fig. 14) es similar al de la fracción A. Se observa que también se trata de una mezcla compleja de flavonoides, conteniendo residuos de solventes tipo hidrocarburo. En el rango entre 3 y 4 ppm aparecen absorciones asignables grupos metilo unidos a oxígeno. Se observa así mismo, protones aromáticos y vinílicos entre 7 y 8 ppm. Las señales correspondientes a los protones hidroxílicos de los fenoles se encuentran en el rango entre 2 y 4 ppm. La presencia de estas señales es igualmente un indicio claro de la presencia de compuestos flavonoides.

4.9. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

4.9.1. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS EXTRACTOS

Los resultados del ensayo de la actividad antibacteriana de los extractos de la hojas de

Piper aduncum, presentados en el cuadro Nº 7, indican que al difundir el extracto en el medio

produce un gradiente de concentración, suprimiendo el crecimiento bacteriano en una zona circular alrededor de la perforación, la medida del diámetro del halo se considera como poder inhibidor del extracto contra las bacterias.

La medida del diámetro de los halos de inhibición del crecimiento bacteriano de los extractos, cuando se compara con el de los antibióticos Amoxicilina y Cefotaxima según la tabla de Kirby-Bauer (anexo tabla 3 y 4) se puede considerar como resistente, intermedio y sensible.

En el cuadro Nº 7 se evidencia que Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes son sensibles al extracto acuoso, tienen sensibilidad intermedia al extracto metanólico y son resistentes a los extractos diclorometánico y clorofórmico. A medida que se incrementa la cantidad de extracto acuoso aplicado a los cultivos, se aprecia que el halo de inhibición del

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metanólico, que presenta un incremento moderado en relación al volumen aplicado. De otro lado, en los extractos clorofórmico y diclorometánico el halo de inhibición del crecimiento no muestra una relación directa con las cantidades aplicadas. Cuando se compara el efecto del extracto acuoso sobre ambos gérmenes, se observa que Staphylococcus aureus es más sensible que Streptococcus pyogenes.

Al comparar los resultados de los diferentes extractos, se evidencia que el mayor efecto antibacteriano lo ejerce el extracto acuoso sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus

pyogenes. Esto es debido a que el agua extrae mayor cantidad de flavonoides, y son éstos los

que tienen la actividad biológica porque tienen propiedades bactericidas, bacteriostáticas, antisépticos y además se le atribuye actividad antifúngica.

4.9.2. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LAS FRACCIONES A Y B

En el cuadro Nº 8 se aprecia que la fracción B del extracto presenta mayor halo de inhibición del crecimiento bacteriano que la fracción A. Al comparar el efecto antibacteriano de cada una de las fracciones con los resultados del cuadro Nº 7 del extracto total es notorio que mayor acción presenta éste último posiblemente porque existe sinergismo entre las dos fracciones, o porque los flavonoides están en forma de glicósidos, también puede deberse a la presencia de ciertas sustancias que se han ido eliminando en el proceso de fraccionamiento.

Además cuando se compara el diámetro de inhibición del crecimiento bacteriano de cada una de las fracciones con la sensibilidad a la amoxicilina de la tabla de Kirby-Bauer, se evidencia que Staphylococcus aureus tiene una sensibilidad intermedia a la fracción B y es resistente a la fracción A, mientras que Streptococcus pyogenes es resistente a las dos fracciones; pero comparados con la sensibilidad a la Cefotaxima, Staphylococcus aureus es muy sensible a la fracción B y tiene sensibilidad intermedia a la fracción A, por otra parte

Streptococcus pyogenes tiene sensibilidad intermedia a la fracción B y es resistente a la fracción A

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CONCLUSIONES

1. En el estudio fitoquímico de la especie Piper aduncum se identificaron los siguientes metabolitos secundarios: saponinas,flavonoides, alcaloides y triterpenoides.

2. Las fracciones A y B del extracto acuoso, correspondientes a flavonoides, significan el 0.22 % y 0.41 % en peso del extracto acuoso seco y tan sólo 0.07 % y 0.13 % en relación al polvo de hoja de Piper aduncum, respectivamente.

3. El espectro UV-Vis. de las fracciones A y B muestra absorciones a unamáx248 y 254

nm., lo que indica la presencia de isoflavonas.

4. El espectro IR de las fracciones A y B presenta las bandas de absorción características de los grupos carbonilo, hidroxilo, éter y anillos aromáticos, lo que indica la presencia de flavonoides.

5. La espectrometría de masas de los componentes de la fracción A proporciona indicios que se trata de flavonoides que se diferencian en el número y ubicación de grupos metoxilos.

6. La espectrometría de masas de los componentes de la fracción B brinda señales que se trata de flavonoides que se diferencian tanto en el número de grupos hidroxilos como en el de metoxilos.

7. El extracto acuoso de Piper aduncum tiene mayor efecto antibacteriano sobre

Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes que los extractos metanólico,

diclorometánico y clorofórmico de esta especie.

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8. La fracción B tiene mayor efecto antibacteriano sobre Staphylococcus aureus y

Streptococcus pyogenes que la fracción A.

9. El efecto antibacteriano de la fracción B es mayor sobre Staphylococcus aureus que sobre Streptococcus pyogenes.

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RECOMENDACIONES

1. Continuar el fraccionamiento cromatográfico del extracto acuoso de la especie Piper

aduncum, con el objeto de purificar los componentes de las fracciones A y B, utilizando

los reactivos de desplazamiento para identificar las posiciones de los grupos hidroxilo y metoxilo.

2. Realizar estudios farmacológicos y toxicológicos del extracto acuoso de la especie Piper

aduncum con la finalidad de recomendar su uso en la medicina alternativa como

antibacteriano para el tratamiento de infecciones de las vías respiratorias, causadas por los gérmenes Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.

3. Ampliar el estudio de Piper aduncum en relación a su utilización en medicina popular como antiinflamatorio, antidiarreico, hemostático y antiparasitario contra Tricomonas

vaginales, con la finalidad de aislar los metabolitos activos y verificar su actividad

terapéutica.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

Tabla 1 Relación entre el color de la mancha y la estructura del flavonoides

Color de la mancha a la luz UV Posible tipo de Flavonoide

Sin NH3 Con NH3

Púrpura

Amarilla, amarilla verdosa o verde

Sin cambio o con pequeños cambios

Celeste, roja o naranja

- 5-OH flavonas o flavonoles - 5-OH flavanonas

- Flavonas o flavanoles 3-O-substituidos, con 5-OH pero sin 4’-OH libre.

- 6- ó 8-OH Flavona y 3-O-substituidos flavonoles con 5-OH.

- Isoflavonas, dihidroflavonoles y flavanonas con – 5-OH. - Chalcona con 2’- ó 6’-OH, pero sin 2- ó 4-OH libre.

- 5-OH flavanona.

- Chalcona con 2- y/o 4-OH.

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Tabla 2 Valores de absorción para las BI y BII de los diferentes tipos de flavonoides.

Banda II, nm Banda I, nm Tipo de Flavonoide

250 – 280 250 – 280 250 – 280 245 – 275 275 – 295 230 – 270 (baja intensidad) 230 – 270 (baja intensidad) 270 – 280 310 – 350 330 – 360 350 – 385 310 – 330 h 300 – 330 h 340 – 390 380 – 430 465 – 560 Flavonas

Flavonoles (3-OH substituido Flavonoles (3-OH libre

Isoflavonas (5-deoxi-6,7-dioxi) Isoflavonas, dihidroflavonoles Chalconas

Auronas

Antocianidinas, antocianinas

Tabla 3 Diámetro de los halos de inhibición de la amoxicilina.

Bacterias

Peso de amoxicilina en el disco

Diámetro de Zona de Inhibición(mm)

Resistencia Intermedio Sensible

gram positivas 25µg < 20 21-28 > 29

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DE

POSGRADO

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Tabla 4 Diámetro de los halos de inhibición de la Cefotaxima

Bacterias

Peso de Cefotaxima en el disco

Diámetro de Zona de Inhibición(mm)

Resistencia Intermedio Sensible

gram positivas 30µg < 14 15-22 > 23

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DE

POSGRADO

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Pruebas post hoc

Comparaciones múltiples

Variable dependiente: Diámetro

(I) Extracto (J) Extracto Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior DMS Acuoso Metanólico 9,750(*) ,800 ,000 8,17 11,33 Diclorometánico 22,600(*) ,800 ,000 21,02 24,18 Clorofómico 17,325(*) ,800 ,000 15,75 18,90 Metanólico Acuoso -9,750(*) ,800 ,000 -11,33 -8,17 Diclorometánico 12,850(*) ,800 ,000 11,27 14,43 Clorofómico 7,575(*) ,800 ,000 6,00 9,15 Diclorometánico Acuoso -22,600(*) ,800 ,000 -24,18 -21,02 Metanólico -12,850(*) ,800 ,000 -14,43 -11,27 Clorofómico -5,275(*) ,800 ,000 -6,85 -3,70 Clorofómico Acuoso -17,325(*) ,800 ,000 -18,90 -15,75 Metanólico -7,575(*) ,800 ,000 -9,15 -6,00 Diclorometánico 5,275(*) ,800 ,000 3,70 6,85 Diámetro N Media Desviación típica Error típico Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo Límite inferior Límite superior Acuoso 40 34,88 5,580 ,882 33,09 36,66 10 42 Metanólico 40 25,13 3,314 ,524 24,07 26,18 19 29 Diclorometánico 40 12,28 1,648 ,261 11,75 12,80 9 15 Clorofómico 40 17,55 2,511 ,397 16,75 18,35 13 21 Total 160 22,46 9,234 ,730 21,01 23,90 9 42 ANOVA Diámetro

Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Inter-grupos 11563,069 3 3854,356 301,450 ,000 Intra-grupos 1994,625 156 12,786 Total 13557,694 159

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POSGRADO

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Pruebas post hoc

Comparaciones múltiples

Variable dependiente: Diámetro

(I) Extracto (J) Extracto Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior DMS Acuoso Metanólico 14,750(*) ,605 ,000 13,56 15,94 Diclorometánico 21,100(*) ,605 ,000 19,91 22,29 Cloroformico 20,825(*) ,605 ,000 19,63 22,02 Metanólico Acuoso -14,750(*) ,605 ,000 -15,94 -13,56 Diclorometánico 6,350(*) ,605 ,000 5,16 7,54 Cloroformico 6,075(*) ,605 ,000 4,88 7,27 Diclorometánico Acuoso -21,100(*) ,605 ,000 -22,29 -19,91 Metanólico -6,350(*) ,605 ,000 -7,54 -5,16 Cloroformico -,275 ,605 ,650 -1,47 ,92 Cloroformico Acuoso -20,825(*) ,605 ,000 -22,02 -19,63 Metanólico -6,075(*) ,605 ,000 -7,27 -4,88 Diclorometánico ,275 ,605 ,650 -,92 1,47

* La diferencia entre las medias es significativa al nivel .05. Diámetro N Media Desviación típica Error típico Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo Límite inferior Límite superior Acuoso 40 33,65 3,873 ,612 32,41 34,89 27 39 Metanólico 40 18,90 2,818 ,445 18,00 19,80 14 23 Diclorometánico 40 12,55 1,358 ,215 12,12 12,98 10 15 Cloroformico 40 12,83 2,111 ,334 12,15 13,50 9 16 Total 160 19,48 9,000 ,711 18,08 20,89 9 39 ANOVA Diámetro

Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Inter-grupos 11737,569 3 3912,523 535,222 ,000 Intra-grupos 1140,375 156 7,310 Total 12877,944 159

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