O efeito do plasma rico em plaquetas no reparo de lesões musculares em ratos

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Artigo

original

O

efeito

do

plasma

rico

em

plaquetas

no

reparo

de

lesões

musculares

em

ratos

夽

Marcelo

Luiz

Quarteiro

∗

,

João

Ricardo

Filgueiras

Tognini,

Everton

Lucas

Flores

de

Oliveira

e

Izabelli

Silveira

UniversidadeFederaldeMatoGrossodoSul,CampoGrande,MS,Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo: Recebidoem2dejunhode2014 Aceitoem12desetembrode2014 On-lineem17dejaneirode2015 Palavras-chave: Músculos/lesões

Plasmaricoemplaquetas Ratos

r

e

s

u

m

o

Objetivo:Anecessidadedeopc¸õesterapêuticasparalesõesmusculares,cadavezmais fre-quentesentre os esportistas,fundamentou este estudoexperimental, cujoobjetivo foi avaliarosefeitoshistológicosdoplasmaricoemplaquetas(PRP)noreparodotecido mus-cularderatos.

Métodos:OPRPfoiobtidoporduplacentrifugaçãodosanguedecincoanimais.Em30ratos, foiproduzidoumtraumanoterçomédiodoventredomúsculogastrocnêmiodecada mem-brotraseiro.Essaslesõesnãoreceberamtratamentoemseisratos(12patas).Em24ratos, injeçõesintralesionaisdesorofisiológicoa0,9%edePRPforamaplicadasnaspatas esquer-dasedireitas,respectivamente.Amostrasdotecidotratadoenãotratadoforamavaliadas histologicamentesetee21diasapósosprocedimentos.

Resultados:AquantidadedecolágenonaslesõestratadascomPRPfoisignificativamente menordoqueadasdemaislesõesnaavaliaçãofeitasetediasapósoprocedimento,masse equiparouàdosdemaisgruposnaavaliaçãofeitano21◦dia.Houveaumentosignificativo (p<0,001)naquantidadedecolágenodosétimoparao21◦dianaslesõestratadascomPRP, oquenãoocorreunaslesõestratadasdeoutraforma.Oprocessoinflamatóriosemostrou maisintensonaslesõestratadascomPRPemcomparaçãocomaslesõesdosoutrosgrupos detratamentonaavaliaçãofeitasetediasapósoprocedimento;todavia,osaspectos mor-fológicosdessaslesõessemostraramsimilaresaodaslesõesnãotratadas21diasapóso procedimento.

Conclusão:OPRPpromoveucompletarestituic¸ãotecidualentreosétimoeo21◦diaemlesões muscularesexperimentais.

夽_Trabalho_feito_no_Laboratório_de_Fisiologia_Animal,_Universidade_Federal_de_Mato_Grosso_do_Sul,_Campo_Grande,_MS,_Brasil.

∗ _Autor_para_{correspondência}_.

E-mail:marceloquarteiro@terra.com.br(M.L.Quarteiro). http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2014.09.002

(2)

The

effect

of

platelet-rich

plasma

on

the

repair

of

muscle

injuries

in

rats

Keywords: Muscles/injuries Platelet-richplasma Rats

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective: Theneedfortherapeuticoptionsformuscleinjuries,whichareincreasingly fre-quentamongsportspractitioners,wasthemotivationforthisexperimentalstudy,which hadtheaimofevaluatingthehistologicaleffectsofplatelet-richplasma(PRP)onrepairsto muscletissuesofrats.

Methods: PRPwasobtainedbymeansofdoublecentrifugationofbloodfromﬁveanimals. In30rats,aninjurywasproducedinthemiddlethirdofthebellyofthegastrocnemius muscleofeachhindlimb.Theseinjuriesdidnotreceiveanytreatmentinsixrats(12legs). In24rats,0.9%physiologicalserumwasinjectedintotheinjuryintheleftlegandPRPinto theinjuryintherightleg.Samplesfromthetreatedanduntreatedtissuewereevaluated histologicallysevenand21daysaftertheprocedures.

Results: ThequantityofcollagenintheinjuriestreatedwithPRPwassignificantlylower thanthatintheotherinjuries,intheevaluationmadesevendaysaftertheprocedure,but itbecameequaltotheothergroupsintheevaluationdoneonthe21st_day._There_was_a significantincrease(p<0.001)inthequantityofcollagenfromthe7th _to_the₂₁st_day_in theinjuriestreatedwithPRP,butthiswasnotseenintheinjuriestreatedinother man-ners.Theinflammatoryprocesswasshowntobemoreintenseintheinjuriestreatedwith PRPthanintheinjuriesoftheothertreatmentgroups,intheevaluationdonesevendays aftertheprocedure.However,themorphologicalaspectsoftheseinjurieswereseentobe similartothoseoftheuntreatedinjuries,21daysaftertheprocedure.

Conclusion: PRPpromotedcompletetissuerestitutionbetweenthe7th _and₂₁st _days_in experimentalmuscleinjuries.

Introduc¸ão

Lesõesmuscularessãodefinidascomoalterações, morfológi-casouhistoquímicas,quepromovemdisfunçãodoaparelho locomotor.1 Podem ser causadas por dois mecanismos: os traumasdiretos,comocontusõeselacerações,eostraumas indiretos,comoisquemia,denervaçãoeestiramentos.2

Cercade30%daslesõesdiagnosticadaspormédicostêm relaçõescomosistemamuscular3_e_a_lesão_muscular_é_um_dos traumasmaiscomunsocorridosnapráticaesportiva,causa de10%a55%detodasaslesões.2_As_lesões_desportivas pare-cemserresultadodeexercíciosfeitosdemaneiraextenuante ou,ainda,inadvertidaouinapropriada.Aprevalênciaea inci-dênciadessesepisódiossãosubestimadasdevidoàausência denotificaçãonouniversoesportivo.4_Tem_sido_relatada inci-dênciadelesõesnosmúsculosisquiotibiaisnaordemde12% emjogadoresdefutebol,5_50,9%_em_atletas_velocistas6_e_42% emnadadoresdepeito.7

Adependerdaseveridadeedalocalizaçãodalesão, dife-rentesmanejosterapêuticossãousados,desdeotratamento conservadoremedicamentosoaocirúrgico.8_Exceto_para_os casosderupturasmuscularescompletas,avulsõesemiosite ossificante,otratamento-padrãousadoparalesões muscula-resagudasérepouso,proteção,gelo,compressãoeelevação; além desses princípios, não existe consenso claro sobre o tratamentoda lesão muscular aguda.9 _Portanto,_ainda per-manecem questionamentos especialmente em relação aos efeitoseresultadosdeváriostratamentoscomumenteusados paraestimularoprocessodereparodomúsculo.

Oplasmaricoemplaquetas(PRP)éumprodutodosangue autólogoquevemsendopropostodesde1990,porpromover forteestímuloaoreparotecidual.10_É_obtido_da_{centrifugação} do sangue periférico e a concentração de plaquetas deve idealmente sersuperiora338%daconcentraçãodosangue periférico.11 _O_PRP _tem _propriedades_curativas_atribuídas _a concentrações aumentadas de fatores autólogos de cresci-mento tecidual eproteínas emnível celular.A expectativa équeessesfatores,quandointroduzidosnolocalda lesão, aumentem orecrutamento,aproliferaçãoeadiferenciação dascélulasenvolvidasnareparaçãotecidualepromovamo reparoaceleradoecommelhordiferenciaçãotecidual.12

Diversos usos clínicos do PRP vêm sendo estudados, incluindoreparodelesõescondrais13_e_tendíneas;14_reparo_de lesõeseregeneraçãoóssea;15_tratamento_de_fasceíte_plantar16 edeúlcerascrônicasempédiabético.17_O_reparo_das tendino-patiascrônicasdotendãodeAquilescominjeçãointralesional dePRPtemmostradoresultadospromissoresnahistologiae namorfologiadotecidoneoformado.18_Estudos_tanto experi-mentaisquantoclínicosvêmrevelandoosefeitosdainjeção intralesionaldePRPemlesõesmuscularese,demodogeral,os achadosdessesestudosreportammelhorregeneração muscu-lar,aumentodeneovascularizaçãoereduçãodefibrose.19–25

A se levar em conta a crescente incidência de lesões musculares e a necessidade de opções terapêuticas que promovamregeneraçãomuscularmaisrápidaeeficazmente, esteestudoexperimentalfoifeitoparaverificaçãodoefeito doPRPhomólogonoreparodelesõesmusculares decorren-tes deimpacto induzidoemratos,apartirda avaliaçãoda deposiçãodecolágenoedaanálisemorfológicamicroscópica

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Tabela1–Quantiﬁcac¸ãodeplaquetas(10 ˆ3/uL)observadanasquatroamostrasdesangueextraídasdecincoratosparao preparodoPRP

Amostras

1 2 3 4

Sangueantesdopreparo 236 214 250 249

Plasmaricoemplaquetas 1.195 808 928 1.145

Plasmapobreemplaquetas 148 141 138 182

qualitativadoprocessodereparac¸ãotecidualsetee21dias após

tratamento.

Materiais

e

métodos

EsteestudofoiaprovadopelaComissãodeÉtica,sobo proto-colo334/2011.Oexperimentofoifeitonolaboratório,deabrila julhode2012.Foramusados35ratosWistar(Rattusnorvegicus albinus),machos,isogênicos,com12semanasdeidadeepeso médiode320±20gramas,delinhagemEPM-1,origináriosdo BiotérioCentraldaUFMS.

Inicialmente, ao longo de 30 dias, os animais foram

submetidos a um período de adaptac¸ão e ganho de peso,

duranteoqualforammantidosemcaixas-padrãoparacinco animais,feitas depolipropileno ecom tampametálica

gal-vanizada.O ambiente foi climatizado com temperatura de

22±3◦C, iluminac¸ão artiﬁcial com ciclos claro/escuro de

12 horas e umidade do ar de 56±13%. Os animais eram

alimentadoscom rac¸ãoNuvilab® _CR1_(Nuvital _Alimentos_e

ProdutosVeterináriosLtda®_,_Curitiba,_PR,_Brasil)_e_água_ﬁltrada àvontade.

Foramformadosquatrogruposdeestudodemaneira ale-atória:

Grupo1:cincoratossubmetidosàcoletadesangueparao preparodoPRP;

Grupo2:patasesquerdasde24ratoscujaslesõesmusculares foramtratadascomsoroﬁsiológico(SF)0,9%.

Grupo3:patasdireitasde24ratoscujaslesõesmusculares foramtratadascomPRP.

Grupo4:patasdireitaseesquerdas(12patas)deseisratos cujaslesõesmuscularesnãoforamtratadas.

Protocoloparaproduc¸ãodalesãoexperimental

Foram usados o mesmoaparelho ea mesma técnica para

produc¸ão da lesão experimental descritos por Nogueira.26 Para a feitura da lesão muscular, usou-se aparelho desen-volvidoporSene,27 _que _consiste_em_duas_hastes _metálicas telescopadas ajustáveis, pelas quais é possível graduar a altura de 30cm, e uma base plástica com área de 272,5 cm2_._Sobre_essa _base,_foi _acoplada_uma_superfície_metálica

retangularcomáreade12,25cm2_,_que_serviu_de_apoio_para

a queda do peso e fixaçãoda pata traseirado animal em localdemarcado,centrandoopesonaregiãocentraldapata. Napartesuperiorfinaldas hastesmetálicasfoifixadauma estruturametálicaqueproporcionaestabilidade,bemcomo suportaumaroldanapelaqualumfio-guiafixaopesoaser liberado.Foiconfeccionado,emacrílicotransparente,umguia

entreashastesparaconduziropesoduranteaquedalivrede 30cmdealtura,paraevitardesvioseoscilac¸õesdopeso.

Oaparelhoparaproduçãodalesãoporimpactofoifixado, comgrampos,àmesacirúrgica,comoformadeestabilização, demodoaevitarqueocorressequalqueroscilaçãonaqueda dopeso.Paraquealesãoocorressesemprenamesmaregião, acargaliberada deumaalturade30cmfoiconduzidapelo guiaemacrílicoeporumfiofixadodiretamentesobreopeso lançadocentralmentepormeiodeumaroldanaposicionada nashastesdoequipamento.

Os animais foram previamente anestesiados com clori-dratode cetamina(60mg/kg)exilazina(15mg/kg)e,então, submetidos aumúnicotraumaemcada membro,noterc¸o médiodoventremusculardomúsculogastrocnêmico,e sepa-rados de acordocom o grupo experimentalde que fariam parte.Os24animaiscujaspatasformaramosGrupos2e3 sofreramlesãocontusanaspatastraseiras.Naregiãocentral posteriordaspatasesquerdasfoiadministrado0,1mldeSFa 0,9%e,naspatasdireitas,0,1mldePRP.

Preparoeaplicac¸ãodoplasmaricoemplaquetas

Pormeiodepunc¸ãocardíacafeitacomagulhade0,70×25mm, marca BD (22gX1”), acoplada a uma seringa descartável de 20ml Viet Jet® _(Labor _Import _Comércio, _{Importac¸ão} _e

Exportac¸ãoLtda.,Osasco,SP,Brasil)contendo1mLdecitrato de sódio a 10% (Bioclin®_, _Quibasa _Ltda., _Lote _0067/2011),

foramobtidasquatroamostrascontendo8mldesanguecom anticoagulantedoscincoratosquecompuseramoGrupo1. O sangue anticoagulado foi imediatamente submetido à contagem de células em aparelho automatizado Sysmex XE-2100D. Realizada a primeira centrifugação foi sepa-rado o plasma do concentrado de hemáceas. Na segunda centrifugação,eliminou-seaporçãosobrenadante,deforma querestasseapenasaproximadamente1mLdocentrifugado demaiorpeso.EssafraçãodenominamosdePRPou concen-tradodeplaquetas.OPRPhomogenizadoeoplasmapobreem plaquetasforamsubmetidosanovacontagemautomatizada decélulas,conformedemonstradonatabela1.

Eutanásia

Após acoletadesangue(Grupo1)edosperíodosdesetee 21diasapós alesão adotadosparaavaliação(Grupos2,3e 4),osanimaissofrerameutanásiapormeiodeinjeçãoletal com aassociaçãodesoluçãoinjetávelde cloridratodeS(+) cetamina(CristáliaProdutosQuímicoseFarmacêuticosLtda., Campinas,SP),tiopentalsódico(CristáliaProdutosQuímicos eFarmacêuticosLtda.,Campinas,SP)epóestérildiluídoem soluçãofisiológicadecloretodesódioa0,9%emconcentração

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de 100mg/ml. Após a dissecc¸ão e coleta do músculo para análise,odescartedosanimaisfoifeitoporincinerac¸ãoem ambienteapropriado.

Formasdeavaliac¸ão

O gastrocnêmio de cada animal foi retirado por meio de incisão posterior nas patas traseiras dos animais posicio-nados emdecúbito ventral, com dissecção romba de pele e tecidos moles. A integridade do músculo foi preservada mantendoaorigemeainserção(fêmur-músculo-calcâneo). Fixadascomalfinetesemsuperfíciesólidaeacondicionadas emformaldeídoa10%,aspeçasforamenviadasparaanálise histológica,ocasiãoemquereceberamtratamentorotineiro comdesidrataçãoprogressivaemálcool,inclusãoemblocos deparafina,cortesagitalelongitudinalde5␮memmicrótomo noterçocentraldoventremuscular,easlâminasforam cora-dascompicrosiriusredehematoxilinaeosina(HE).Oexame dascaracterísticashistológicasedaquantidadedecolágeno foifeitonoLaboratóriodeToxicologiaePlantasMedicinaisda UniversidadeAnhanguera(Uniderp).

Comousodemicroscópioópticoacopladoacomputador, asimagensdaslâminasforamdigitalizadasecapturadaspelo sistemadeprocessamentoeanálisedeimagensImageLabTM_.

Essesistemafoidesenvolvidoparaanálisesmorfométricase subtraçãode imagensepodeserusadopara espécimesde escalamacroscópicaemicroscópica.Existemváriossistemas deconversãodeunidades,filtrosdecorreçãodeimagens, inú-merosformatos de exportação e comunicação com outros programas.O sistemaapresenta, natela docomputador, a imagemoriginaldigitalizadaa partirda lâminahistológica e, ao lado, três histogramas de frequência das intensida-desR (vermelho),G(verde) eB(azul) da imagem. Apartir da representaçãodesses histogramas,o sistemacalcula as quantificaçõesdesejadasetodos osdadosrelativosaesses cálculossãoapresentadosemplanilhaprópriadoprograma, aqualpodeserconvertidaparaplanilhadoMicrosoftOffice Excel4.0.

Osprincipaisinstrumentoseprocedimentosdoestudose encontramrepresentadosnaﬁgura1.

Análiseestatística

OsdadosforamtabuladosemplanilhasdoprogramaMicrosoft OfficeExcel(2010)eanormalidadedasamostrasfoiavaliada como programaBioestat5.0.Os cálculospara comparação dos dados e a elaboração dos gráficos foram feitos com o programa GraphPadPrism 4.0. As medidas das variáveis numéricasforamexpressasemmédias±desviospadrão.As comparações intragrupos foram feitas com a aplicação do testetdeStudentnasamostrasdedistribuiçãonormaledo testedeWilcoxonnasdistribuiçõesnãonormais.Asanálises intergruposforamfeitascomanálisedevariância(Anova)e posthoccomotestedeTukey nasamostras dedistribuição normalecomaaplicaçãodotestedeKruskal-Walliseposthoc comotestedeDunnsnasamostrasdedistribuiçãonão nor-mal.Anormalidadedosgruposfoiavaliadacomaaplicação dotestedeShapiro-Wilk.Adotou-sevalordep≤0,05para determinaçãodoníveldesignificânciadasdiferenças encon-tradas.

Figura1–(A)Aparelhousadoparaproduc¸ãodelesão muscularemanimais.(B)Posicionamentodacargaliberada sobrecadamembrodosanimais.(C)Administrac¸ãodeSF naregiãoposteriordapataesquerdadosanimais.

(D)AdministraçãodePRPnaregiãoposteriordapatadireita dosanimais.(E)Punçãocardíacaparaobtençãode

amostrasdesangueparapreparodoPRP.(F)Preparadoque apresentacolunadelíquidocomduasfrac¸ões

predominantes:plasmasobrenadanteeconcentradode hemáciasaofundo,separadasporumcremeleucocitário. (G)Preparadoquecontémapenasaproximadamente1mL docentrifugadodemaiorpeso(PRP),apóseliminaçãoda porçãosobrenadante.(H)Amostradogastrocnêmioíntegro fixadaemsuperfíciesólidaeacondicionadaem

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Tabela2–Médias(edesviospadrão)daquantificaçãode fibrascolágenasobservadasnaspatasdosratoscontrole edosratosquereceberamPRPeSF,setee21diasapósa lesãomuscular Grupocontrole n=12 PRP n=24 SF n=24 Setedias 34,44±6,65 30,69±4,99 35,35±5,19 21dias 38,29±6,58 38,52±6,47 35,02±6,73

Resultados

Osvaloresmédios(edesviospadrão)daquantidadedefibras colágenasdecadagrupoemcadaperíododeavaliação(sete e21dias),totalizando60patasavaliadas, encontram-sena tabela2.Naanáliseintragrupos,quandocomparadasas con-tagensfeitasnosétimoeno21◦diaapósalesão,nãohouve diferença nas quantidades médias de fibras colágenas no grupocontrole (p=0,094)nemno grupode ratos que rece-beuSF(p=0,817),conformeilustraafigura2AeC.Poroutro lado,aquantidadedecolágenoobservada21diasapósalesão foisignificativamentemaior(p=0,00021)doqueaquela obser-vadasetediasapós alesão nogrupode ratosque recebeu PRP(fig.2B).Naanáliseintergrupos,nacontagemfeitasete diasapósalesão,aquantidademédiadefibrascolágenasse mostrousignificativamentemenor(p=0,014)nosratos trata-doscomPRPemcomparaçãocomostratadoscomSF,masnão emcomparaçãocomogrupocontrole.Jánacontagemfeita21 diasapósalesão,nãohouvediferençaentreosgruposcom relaçãoàquantidademédiadefibrascolágenas(fig.3).

Com relação aos achados morfológicos, aos sete dias observou-sepresençademacrófagoscircunstanciaisnotecido intersticial do músculo esquelético no grupo controle. As fibrasmuscularesnesseperíodosemostravamcomaspecto normal. Observou-se, ainda, aparecimento de mioblastos entre as fibras musculares (fig. 4). No mesmo período de setedias,observou-se,nogrupoderatostratadoscomPRP, evidente processo inflamatório por mononucleares, hemá-ciascomaspectonormaleaparecimentodemiotubosentre as fibras musculares (fig.5). János ratos tratados com SF, observaram-semiotubos,macrófagosehemáciascomaspecto normal(fig.6).Aos21dias,asfibrasmusculareseosvasos san-guíneosjáapresentaramaspectonormaldotecidoemratos controleeemratostratadoscomPRP(figs.5e6).Nosratos tratadoscomSF,observaram-sefocosdemacrófagosealguma formaçãodemiotubos(fig.7).

Discussão

Háevidênciasdequefatoresdecrescimentoexercempapel fundamental no processo de cicatrizaçãodos tecidos;28 _no entanto,alémdousoisoladodemuitosfatoresdecrescimento ainda serimpossível naprática clínica, nãoestão comple-tamente esclarecidos os mecanismos de ação de todos os diferentesfatoresnesseprocesso.Apartirdoconhecimento de que os grânulos-alfa das plaquetasconcentram grande quantidade de fatores de crescimento específicos, como o PDGF e o TGF-beta, foi proposta técnica para a obtenção dealtasconcentraçõesdefatoresdecrescimento,pormeio

A

Grupo controle 7 dias 21 dias 20 25 30 35 40 45 50 55 Fibras colágenas Teste t de student; p = 0,0949

B

Grupo PRP 7 dias 21 dias 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Fibras colágenas Teste de wilcoxon; p = 0,00021

C

Grupo SF 7 dias 21 dias 20 25 30 35 40 45 50 Fibras colágenas Teste t de student; p = 0,8179

Figura2–Representaçãográficadasmédiasedesvios padrãodaquantidadedefibrascolágenassetee21dias apósaslesõesprovocadasnosratosdogrupo-controle(A), tratadoscomPRP(B)ecomSF(C).

do preparo de PRP autólogo.11 _Essa _técnica _consiste, basi-camente, no sequestro ena concentrac¸ãode plaquetasdo plasmasanguíneo,queresultaemprodutoaseraplicadona áreadalesãoemcicatrizac¸ão.29

ApesardousodisseminadodePRPnotratamentodelesões muscularesdeatletasedealgunsestudosteremdemonstrado que o PRP podeabreviaro tempode retornoàs atividades esportistas após a lesão,14,19,24 _ainda _há _poucos _estudos experimentaisvoltadosparaapadronizac¸ãodoqueéoPRP eparaacompreensãodosmecanismosenvolvidosnousodo PRP,especiﬁcamenteemlesõesmusculares,motivopeloqual poucassãoasevidênciaspassíveisdeserdiscutidasapartir

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07 dias Controle PRP SF 20 25 30 35 40 45 50 55

*

Fibras colágenas Kruskal-wallis; p = 0,0145; *PRP versus SF: p < 0,05 21 dias Controle PRP SF 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Fibras colágenas ANOVA; p = 0,1806

Figura3–Representaçãográficadasmédiasedesvios padrãodaquantidadedefibrascolágenassetee21dias apósaslesõesprovocadasnosratosdostrêsdiferentes gruposdeestudo.

dos resultados deste trabalho. De toda forma, em modelo experimentaldecontusãotambémnomúsculogastrocnêmio deratos,emcujaslesõesfoiinjetadosoroautólogoricoem plaquetas, Wright-Carpenter et al.19 _observaram _ativação acelerada de células-satélite após 30 a 48 horas da lesão e aumento de diâmetro das miofibras em regeneração na primeirasemanaapósalesão.Osautoresobservaram,ainda, concentrações aumentadasdeFGF-2 (460%)edeTGF-beta1 (82%)aoElisaesugeriramquepoderiam,pelomenos parci-almente, ter sido responsáveis pelaregeneração acelerada, devidoàssuascaracterísticasproliferativasequimiotáticas.

Emdistensõesimportantesproduzidasemmúsculotibial anteriorderatosetratadascomPRPouplacebo,Hammond etal.20_observaram_tempo_de_{regeneração}_muscular significa-tivamentemenornogrupotratadocomPRPesugeriramque aaceleraçãodamiogêneseprovavelmentesejaomecanismo responsávelporesseefeitodoPRP,devidoàsconcentrações maisaltasdediferentesfatoresdecrescimentocontidasno produto.

Harrisetal.22_injetaram_PRP_ou_SF_em_diferentes_tecidos muscularesde coelhossadios (sem lesões), cujasamostras foram histologicamente avaliadas duas, seis e 12 semanas após o procedimento. Observaram, após seis e 12 sema-nas,infiltradoinflamatóriopersistente,emboradecrescente, nos sítiosquereceberam PRP,masnãonos quereceberam SF.Do mesmomodo,apenasnasáreas focais detecido de cicatrizaçãodaspatasquereceberamPRPobservaram fibro-blastos,formaçãodecolágenoeneovascularização,oquenão foiobservadoemnenhumsítioemqueseaplicouSF.Os auto-resconcluíramqueoPRPpromoveurespostainflamatóriaem tecidosmolesnormaisdecoelho,assertivaquesustentaatese defendidanesteestudodequeoPRPpromove,inicialmente,a intensificaçãodeprocessoinflamatórioemlesõesmusculares. Por outro lado, Gigante et al.23 _não _observaram quais-quer diferenças relativas ao processo inflamatório quando

A

B

C

D

fml

mi

vs

Figura4–Fotomicrograﬁadeamostrasdogrupocontroleaossetedias.Observam-semacrófagos(setas),ﬁbramuscular emcortelongitudinal(fml),mioblastos(mi)evasossanguíneos(vs).HE/200×.

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A

fm

tc

vs

fm

ca

fml

fm

B

C

D

E

F

Figura5–FotomicrografiaderatostratadoscomPRPaossetedias.Observam-seprocessoinflamatóriopormononucleares (setascontínuas),fibramuscularemcortetransversal(fm),fibramuscularemcortelongitudinal(fml),miotubos(setas serrilhadas),vasossanguíneos(vs),célulasadiposas(ca)etecidoconjuntivo(tc).HE/200×.

comparadas lesões produzidas no músculo longo de ratos tratadas com PRP e não tratadas, embora, nas lesões tra-tadas, tenha se observado melhor regeneração muscular, neovascularizaçãoaumentadaelevereduçãodefibrose.

Deve-seressaltarqueasconcentraçõesdediferentes fato-resdecrescimentonoPRPobtidodediferentesespécies(ratos, coelhos,ovelhasehumanos)apresentamvariação significa-tiva,oqueinfluenciadiretamentetantoestudos experimen-taisquantoensaiosclínicos.30_Daí_a_necessidade_de_protocolos padronizadosparaque seamplie,defato, oconhecimento sobreosefeitosdoPRPnotratamentodelesõesmusculares.

OusodoPRPparaaregeneraçãodeossosetecidosmoles vemsendofocodaatençãodeclínicosepesquisadores,assim comovemsendorelatadaasuaaplicaçãoemdiferentes espe-cialidadescirúrgicas.Desdeatécnicainicialmenteproposta para produçãode PRP autólogo, cujométodo de separação celular descontínua exigia grande quantidade de sa-ngue, diversos protocolos propostos vêm contribuindo para a evoluçãoda técnica original, incluindo necessidade de menor quantidade de sangue, uso de centrífugas de bancada,baixocustoemenortempodeprodução,facilidade de aplicação em ambiente ambulatorial e menor estresse sobre o sistema cardiovascular do paciente. Os protocolos

aparentementemaisseguroseeﬁcazessereferemàstécnicas de dupla centrifugac¸ão adotada paraa feitura dopresente estudo.29

Algunsestudosdemonstraramqueconcentraçõesde pla-quetas 338% maiores doque asnormalmenteencontradas nosanguepotencializamacicatrizaçãodeossoedetecidos molesemsereshumanos.11_Outros_autores_defendem_a_tese dequeosefeitosesperadosdoPRPsóserãoalcançadosquando asconcentraçõesdeplaquetasforemoitovezesmaioresdo que as concentrações do sangue circulante. Neste estudo experimental, nas quatro amostras de sangue extraído de cincoratosparaaproduçãodePRP,obtivemosconcentrações médiasdeplaquetascercadequatroacincovezesmaioresdo queasconcentraçõesobservadasnosangue.

PRP assimproduzidofoiinjetado emlesões traumáticas (contusões) produzidas no terço médio do ventre muscu-lardogastrocnêmiodaspatastraseirasdireitasde24ratos, enquantoasmesmaslesõesnaspatasesquerdasforam tra-tadascomSFa0,9%.Osachadosevidenciaramque,nogrupo delesõestratadascomPRP,aquantidademédiadecolágeno semostrou significativamente menordoqueadosdemais grupos(controleetratamentocomSF)naavaliaçãofeitano sétimodiaapósalesão,masquehouveaumentosignificativo

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A

B

fml

fm

vs

C

D

Figura6–FotomicrograﬁaderatostratadoscomSFaossetedias.Observam-seﬁbramuscularemcortelongitudinal(fml) etransversal(fm),miotubos(setascontínuas),macrófagos(setasserrilhadas)evasossanguíneos(vs).HE/200×.

nessaquantidadedecolágenodosétimoparao21◦diaapósa lesãoapenasnogrupodelesõestratadascomPRP,que,nessa últimaavaliac¸ão,mostraramquantidademédiadecolágeno similaràdosdemaisgrupos.

Sabe-sequeadegradaçãodocolágenoiniciaprecocemente e tem atividade intensa no processo inflamatório, evento queocorrenaprimeirafasedacicatrização.Defato,exceto naslesõestratadascomSF,foiobservadamenorquantidade médiadecolágeno naavaliaçãofeita nosétimo diaapós a lesão doquenaquela feita no 21◦ dia. Noentanto, na pri-meiraavaliação(setedias),aquantidademédiadecolágeno foisignificativamentemenornaslesõestratadascomPRPdo quenaslesões-controleenastratadascomSF.Esseachado pareceratificar a tesesegundo aqual o processo inflama-tórioseja provavelmentealterado na presença de PRP, ora reduzindooperíododeinflamaçãodalesão,oraalterandoa liberaçãodecitocinas.20_Os_resultados,_então,_permitem agre-garnovahipóteseasertestada,sugeremprolongamentoou maiorintensidadedafaseinflamatóriae,porisso,degradação maisintensa docolágeno na primeira faseda cicatrização

muscular.Todasessashipóteses,porém,carecemdeestudos queastestemmaisrigorosamente.

Por outro lado, nas fases de reparo e de remodelação, adeposiçãodecolágenodemaneiraorganizadaegraduada éacaracterísticamaisimportantepara quehaja equilíbrio entrealisedamatrizcelularantigaeasíntesedanovamatriz, condição imprescindívelpara o sucessoda regeneração do tecido muscular lesionado.Além disso, o colágeno inicial-mente produzidoémais finodoque o colágeno dotecido saudável; esse colágeno inicial é, então, reabsorvido eum colágeno maisespessoéproduzidoaolongodas linhas de tensão,oqualsecorrelacionapositivamentecomoaumento da resistência tênsil.Neste estudo,pôde-se observarquea quantidademédiadecolágenoaumentousignificativamente dosétimo parao21◦ dia após ainjeçãode PRP,o quenão ocorreunaslesõesnãotratadasnemnaquelastratadascom SF. O aumentodo colágeno do sétimoao 21◦ dia nos ani-maisquereceberamoPRPpareceterauxiliadonoequilíbrio degradação-deposiçãodecolágeno,pormecanismosque pre-cisamserelucidados.

A

B

vs

fml

Figura7–Fotomicrografiaderatoscontroleaos21dias.Observam-sefibramuscularemcortelongitudinal(fml),núcleos dasfibrasmusculares(setas)evasossanguíneos(vs).HE/200×.

(9)

Naslesões tratadascomPRP, oprocesso inflamatóriose mostroumaisevidentedoquenosdemaisgruposdoestudona avaliaçãofeitasetediasapósoprocedimento.Essaobservação pareceratificarqueoPRPpodeintensificaroprocesso infla-matório.

Naavaliaçãofinalcom21dias, osachadosmorfológicos daslesões-controleedaslesõestratadascomPRPforam seme-lhantes,oqueindicaboaregeneraçãodomúsculolesionado emambososgrupos.AadministraçãodePRPparecenãoter demonstradodiferenças nosaspectos morfológicoscom 21 dias,nofimdoprocessodereparodalesãomuscular,quando comparadacomogrupocontrole,jáqueasmesmas caracte-rísticasforamobservadasnaslesõesnãotratadas.Poroutro lado,naslesõestratadascomSF,otecidoaindanãomostrava plenaregeneração,comfibrasmuscularesaindaemformação ecomausênciadevascularização.

Estaanálisedescritivamorfológicacorroboraosachados quantitativosdadeposiçãodefibrascolágenasnascicatrizes musculares, pois mostra que no grupo em que fora apli-cadosorofisiológicoapenas,ainda em21dias haviareação inflamatória, enquanto nos outros dois grupos o tecido já haviaserecompostototalmente,oquesugere,talvez,melhor organizaçãodoprocessodereparomuscularnogrupoemque forausadooPRP.

Nesteestudo,acontribuiçãoselimitaàobservaçãodeque oPRPativousignificativamenteoprocessoinflamatóriosete diasapósserinjetadoemlesõescontusasproduzidasno mús-culogastrocnêmioderatos,razãopelaqualpareceterhavido maiordegradaçãodecolágenonesseperíodo.Poroutrolado, resultouemaumentosignificativodecolágenoentreosétimo eo21◦diaapósoprocedimento,oquesugereumacompleta restituiçãotecidual.

Conﬂitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconﬂitosdeinteresse.

r

e

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n

c

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s

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