i
ANTAGONISMO DE Bacillus subtilis SOBRE HONGOS
FITOPATÓGENOS Y SU EFECTO EN Capsicum spp.
TESIS
Que presenta:
Armando Ismael Bacab Pérez
Como requisito parcial para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias en Horticultura Tropical
Director de tesis:
Dr. Arturo Reyes Ramírez
Conkal, Yucatán, México
Septiembre, 2019
iv
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán, y los docentes por brindarme los conocimientos necesarios para mi formación profesional.
A la división de Estudios de Posgrado e Investigación (DEPI) por darme la oportunidad de cursar mis estudios de maestría.
Al consejo nacional de ciencia y tecnología (CONACYT) por la beca otorgada durante mis estudios de posgrado.
Al Dr. Arturo Reyes por sus oportunas recomendaciones para mejorar mi trabajo, apoyo y amistad brindada durante mi formación académica.
Al Dr. Pinzón López por su disposición, recomendaciones, apoyo y confianza brindado en mi formación.
Al Dr. Jairo por sus sugerencias y recomendaciones en la redacción de la tesis, así la amistad brindada durante este tiempo.
Al Dr. José Alfredo Noh Medina por sus valiosas recomendaciones brindadas en el establecimiento del cultivo, así como facilitar el uso de equipos de laboratorio.
A mis compañeros de generación por los momentos compartidos y por hacer más ameno este proceso en el que nos embarcamos juntos.
v
DEDICATORIAS
A Dios por permitirme cumplir este objetivo y darme fuerzas para seguir adelante en los momentos difíciles de mi vida.
A mis padres José Pascual e Hilda Margarita por haberme inculcado valores que me distingue como persona y por su apoyo incondicional.
A mis hermanos Héctor, Imelda y Roberto por todo su cariño y consejos brindados.
Al Ing. Martín por su amistad brindada todos estos años, por sus consejos brindados y su apoyo incondicional.
vi
CONTENIDO
I.CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN GENERAL……….... 1
1.1. INTRODUCCIÓN………..……... 1
1.2. ANTECEDENTES……...……… 3
1.2.1. Enfermedades ocasionadas por hongos fitopatógenos en los cultivos agrícolas………..…….. 3
1.2.2. Característica de las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR)………..… 4
1.2.3. Generalidades de Bacillus subtilis……….…...… 4
1.2.4. Potencialidad de Bacillus spp. como biocontrol de hongos fitopatógenos... 5
1.2.5. Efecto de Bacillus subtilis en la promoción del crecimiento vegetal……...… 8
1.3. HIPÓTESIS……….….. 10 1.4. OBJETIVOS…...………...… 10 1.4.1. Objetivo general……….……….….... 10 1.4.1. Objetivos específicos……….…..… 10 1.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL………... 11 1.6. LITERATURA CITADA………... 12
II. CAPÍTULO 2. ANTAGONISMO DE Bacillus subtilis CONTRA HONGOS FITOPATÓGENOS Y PRESENCIA DE GENES DE LA BIOSÍNTESIS DE LIPOPÉPTIDOS……….… 17
RESUMEN………....… 17
2.1. INTRODUCCIÓN……….…….... 18
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS………..… 19
Microorganismos utilizados……….... 19
Antagonismo in vitro contra hongos fitopatógenos………... 20
Caracterización de genes de la síntesis de lipopéptidos en Bacillus subtilis…...….... 20
Detección del gen fenD de la Fengicina D………...…...… 21
Detección del gen bamC de la Bacilomicina D………..…. 21
Detección del gen ituC de la Iturina A……….... 22
Detección del gen srfA de la Surfactina………..………….... 22
Detección del gen ZmaR de la Zwittermicina A………..…….…... 22
vii
2.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………….………...….. 23
2.4. CONCLUSIONES……….….. 28
2.5. LITERATURA CITADA……….... 29
III. CAPÍTULO 3. EFECTO DE Bacillussubtilis EN LA GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO DE Capsicum spp……….………...… 34
RESUMEN……….. 34
3.1. INTRODUCCIÓN…….………... 35
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS……….……….... 36
Microorganismos utilizados……….... 36
Pruebas de germinación en Capsicum spp. ……… 36
Efecto de B.subtilis en la promoción de crecimiento de Capsicum spp………….... 37
Extracción de clorofila……….... 38
Análisis de datos………. 38
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……….………. 39
3.4. CONCLUSIONES……….……...… 48
3.5. LITERATURA CITADA………... 49
IV. CONCLUCIONES GENERALES……… 54
viii
Índice de cuadros
II. CAPITULO 2.
Cuadro 1. Iniciadores utilizados para la detección de lipopéptidos en las cepas
bacterianas……….... 21
Cuadro 2. Inhibición del crecimiento micelial de hongos fitopatógenos por B. subtilis
CBRF8 y B. subtilis CBRF12……… 24
Cuadro 3. Halo de inhibición (mm) en los hongos fitopatógenos por efecto de B.
subtilis CBRF8 y B. subtilisCBRF12……….. 25 Cuadro 4. Genes detectados en B. subtilis……… 27 Cuadro 5. Proteínas hipotéticas correspondiente a los genes de la síntesis de
lipopéptidos en B. subtilis CBRF8……….. 27 III. CAPÍTULO 3.
Cuadro 1. Efecto de B. subtilis en la germinación de semillas de Capsicum spp…... 40 Cuadro 2. Efecto de B. subtilis en la altura, diámetro y número de hoja en Capsicum
spp……….... 42
Cuadro 3. Efecto de B. subtilis en las variables volumen radical, biomasa seca de
hojas, tallo y raíz en Capsicum spp……….. 44 Cuadro 4. Contenido de clorofila a los 15, 30, 45, 60 y 75 días después del
trasplante en Capsicum spp……….. 47
Índice de figuras
I. CAPÍTULO 1
Figura 1. Mecanismos del efecto benéfico de Bacillussubtilis en las plantas……….. 8 III. CAPÍTULO 3
Figura 1. Efecto de B. subtilis en el crecimiento radicular de Capsicum spp………... 41 Figura 2. Correlación entre unidades SPAD y cantidad de clorofila total en plantas
1
I. CAPÍTULO1. INTRODUCCIÓN GENERAL
1.1. INTRODUCCIÓN
El género Capsicum es de gran utilidad en la agroindustria alimenticia, farmacéutica y cosmetológica. México ocupa el segundo lugar a nivel mundial en la producción de chile con un volumen de producción de 2.3 millones de toneladas anuales; China es el mayor productor seguido por Indonesia, Turquía, España, EE.UU.AA, Egipto y Nigeria (SIAP, 2017). El chile es una hortaliza que se cultiva en la mayor parte del territorio nacional, el 80 % de la producción se consume internamente como alimento por aportar minerales y vitaminas, como condimento está presente en la mayoría de los platillos mexicanos, por lo que tiene una demanda en sus presentaciones; fresco, seco y procesado (Ramírez, 2007). El cultivo de las diversas especies de chiles constituye una actividad social y económica importante; genera aproximadamente 50 mil empleos que van desde la producción de plántulas en viveros, producción en campo, cosecha, transporte, procesamiento, empaque y comercialización.
En relación con el chile habanero producido en la Península de Yucatán, sus características organolépticas, así como su vida de anaquel y picor, se le considera de mejor calidad a los que se cultivan en otras partes del mundo (Medina et al., 2008). Sin embargo, como cualquier especie bajo condiciones de monocultivo, es afectado por diversos factores que limitan su productividad, entre los que se encuentra la poca fertilidad de los suelos y las enfermedades causadas por hongos fitopatógenos que afectan en distintas etapas fenológicas de su cultivo.
En la mayoría de los sistemas de producción se utilizan paquetes tecnológicos que requieren grandes cantidades de compuestos de síntesis química para hacer frente a esta problemática, lo que ha originado consecuencias sobre la contaminación del suelo, aire y agua, alterando el equilibrio de los ecosistemas (Avalos, 2009), además de residualidad en los productos agrícolas y la inducción de patógenos resistentes (Aciego, 2006).
Ante esta problemática, una alternativa emergente es la utilización de comunidades microbianas de la rizosfera como promotores de crecimiento (Lucy et al., 2004). Las
2
bacterias del género Bacillus presentan mecanismos de acción que promueven el crecimiento vegetal y reducen las enfermedades ocasionadas por los hongos fitopatógenos mediante competencia por espacio y nutrientes, así como antibiosis (Chaves, 2007; Rodríguez y Hernández, 2009), estos mecanismos están relacionados con la capacidad de inducir enzimas de defensa, que reducen de la incidencia y severidad de enfermedades en los cultivos (Saravanakumara et al., 2007); además, presentan potencial como agentes de biocontrol de hongos fitopatógenos como Fusarium spp., debido a la producción de metabolitos secundarios con actividad antibiótica como iturina, surfactina, fengicina y bacilomicina (Ramarathnam et al., 2007).
Sin embargo, en algunos casos cepas nativas de Bacillus presentan un comportamiento contrario a la promoción del crecimiento vegetal, al disminuir la germinación de semillas de chile habanero (Sosa et al., 2019). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de dos cepas de Bacillus subtilis; CBRF12 (con actividad promotora de crecimiento en chile habanero) y CBRF8 (como antagonista de Fusarium solani) contra hongos fitopatógenos foliares y de raíz, y en la germinación y crecimiento de chile habanero, chile (Capsicum chinense), dulce (C. annuum) y chile x’catik (C. annuum).
3
1.2. ANTECEDENTES
1.2.1. Enfermedades ocasionadas por hongos fitopatógenos en los cultivos agrícolas.
Debido a las condiciones ambientales y a un mal manejo, los cultivos de chile son afectados por un gran número de hongos fitopatógenos que generan pérdidas de producción ya que afectan el crecimiento y desarrollo de la planta, reducen el rendimiento y calidad de frutos. Las especies del género Fusarium son fitopatógenos importantes que ataca al cultivo de chile, producen toxinas, fumonisinas y sustancias causantes de enfermedades, además, están asociados a síntomas como marchitez vascular, pudrición de raíz, clorosis, marchitez de hojas y defoliación (Agrios, 2013). Los primeros síntomas comienzan con una ligera clorosis del follaje superior, a los pocos días progresa a una marchitez permanente de las hojas y daña el sistema vascular de la planta, tallo y raíces primarias. En la parte baja del tallo causa coloración café obscura, además, achaparramientos, infectan al hospedero por la penetración de la hifa a través de las raíces, principalmente por la zona meristemática y por la epidermis de la zona de elongación y maduración de la raíz; también a través de heridas causadas por factores físicos y biológicos (Dixon, 1981). El micelio avanza intracelularmente, para luego entrar en los tubos del xilema, dentro del cual el patógeno puede colonizar el tallo; provocar que los tubos se llenen con micelio y tilosas, y producir taponamiento de los tejidos conductores (Melhus y Kent, 1979). Otro hongo de importancia económica es Colletotrichum sp., causante de la antracnosis considerada, la principal enfermedad postcosecha de papaya (Carica papaya L.). Durante la colonización se presentan dos fases, la fase inicial o biotrófica en la cual el hongo se alimenta de las células vivas de la planta y la segunda fase necrotrófica en donde los recursos se obtienen de las células muertas. Los síntomas inicialmente se presentan en forma de exudados gomosos y luego pequeñas lesiones de diámetro de color café con halo amarillo que tienden a hundirse en el borde (Rojo-Báez et al., 2017), a medida que el fruto madura se presenta ablandamiento de la epidermis y aumento de la colonización del patógeno. Helminthosporium speciferum y Curvularia
spp., son hongos fitopatógenos foliares que producen manchas foliares con halo de color amarillo, reducen la superficie de las hojas fotosintéticamente activas y en consecuencia disminuyen la producción de foto-asimilados para la formación y desarrollo del fruto. Además, interfiere en la traslocación de agua y nutrientes induciendo la muerte de tejidos
4
infectados. Asimismo, con la caída de hojas quedan los frutos expuestos a la luz solar, originando quemaduras, reducción de la calidad y rendimiento (Kimati et al., 1995).
1.2.2. Característica de las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR)
Kloepper et al. (1980), propusieron por primera vez el uso del término rhizobacterias promotoras del crecimiento vegetal o Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR, por sus siglas en inglés) para nombrar las bacterias que habitan en la rizosfera y que presentan la propiedad de estimular el crecimiento y la salud vegetal. Entre las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal se encuentran diversas especies de los géneros: Bacillus, Rhizobium,
Azospirillum y Pseudomonas (Santoyo et al., 2012).
De acuerdo con Smith y Goodman (1999), las PGPR, tienen las siguientes características: No requieren de la invasión interna de tejidos de las plantas ni de la formación de
estructuras especializadas.
Presentan la capacidad de persistir en el suelo después de la inoculación y una densidad poblacional elevada en la rizosfera después de la inoculación. Ya que una población que disminuye rápidamente en la rizosfera tiene una baja capacidad competitiva con la microflora del suelo.
Presentan una colonización efectiva en la superficie de la raíz para tener un efecto significativo sobre el crecimiento de la planta.
No producen daño al hombre ni a otros microorganismos benéficos
1.2.3. Generalidades de Bacillus subtilis
El género Bacillus fue descrito por primera vez por Cohn en 1872, son Gram positivos, en forma de bastón con un tamaño entre 3 y 4 μm de largo por 1 μm ancho, poseen flagelos perítricos, son catalasa positiva, aerobios estrictos o anaerobios facultativos, hidrolizan la mayoría de los sustratos derivados de plantas y animales, incluyendo celulosa, almidón, pectina, proteínas, agar, hidrocarburos y otros. Además, producen metabolitos con efecto antibiótico, su pared celular posee múltiples capas y produce endosporas con morfología oval
5
o cilíndrica que le permite resistir a condiciones desfavorables en el ambiente (Khan y Ahemad, 2011).
Bacillus son bacterias abundantes, con capacidad de colonizar la rizosfera y el interior de la planta, así como desarrollar su acción benéfica promoviendo el crecimiento vegetal y está relacionada con la capacidad de inducir enzimas de defensa, como peroxidasas, polifenol oxidasa, quitinasas y β-1,3 glucanasa, que pueden tener efecto en la reducción de la incidencia y severidad de enfermedades en los cultivos. Bacillus subtilis presenta un efecto directo mediante la producción de fitohormonas, solubilización de fósforo, retención de hierro por sideróforos y fijación de nitrógeno. El efecto indirecto consiste en la movilización de nutrientes solubles, seguido por el mejoramiento de la absorción de plantas y la producción de antibióticos para hongos y bacterias. Esta especie presenta tres principales modos de acción: competencia, antibiosis y la inducción de la resistencia sistémica en plantas (Saravanakumara et al., 2007).
1.2.4. Potencialidad de Bacillus spp. como biocontrol de hongos fitopatógenos
Los microorganismos antagonistas tienen la capacidad de ejercer un efecto de control sobre diversos patógenos y se han empleado para controlar enfermedades en frutos y hortalizas. Bacillus subtilis presentan un alto grado de tolerancia a factores ambientales y ha sido utilizado como biocontrol de muchos hongos fitopatógenos. A pesar de que la antibiosis es el mecanismo antagónico más utilizado por los microorganismos biocontroladores para inhibir a los hogos fitopatógenos, no es el único. Los principales mecanismos de acción para controlar el desarrollo de patógenos pueden ser resultado de la competencia por espacio o nutrientes, interacciones directas con el patógeno (micoparasitismo y lisis enzimática), producción de bacteriocinas y otros compuestos antagonistas derivados del metabolismo secundario como los péptidos que presentan actividad antimicrobiana o antifúngica y la inducción de resistencia en las plantas (Claus et al., 1986).
Competencia por espacio y nutrientes. La Competencia por espacio impide el establecimiento ydesarrollo de los patógenos sobre el área que está ocupada por la bacteria.
6
disminuye la posibilidad de que un patógeno pueda establecerse e interactuar con las raíces de la planta. Este tipo de antagonismo es favorecido por las características del agente de control biológico como la plasticidad ecológica, velocidad de crecimiento y desarrollo. La competencia por nutrientes, consiste en el uso de un requerimiento en común por dos especies, con la diferencia que uno de ellos es más eficiente en el uso del recurso que el otro, limitando la cantidad disponible y generando un evento desigual. Un factor esencial para que exista competencia es que haya escasez de algún elemento esencial. La competencia más común puede ser por nitrógeno, carbohidratos no estructurales (azúcares y polisacáridos como almidón, celulosa, quitina, pectinas, entre otros) y microelementos esenciales e indispensables para el desarrollo de las funciones vitales (reproducción, nutrición, respiración y metabolismo) (Pathma et al., 2011).
Antibiosis. La antibiosis como un proceso de interacción entre organismos en el cual uno o más metabolitos son excretados (enzimas hidrolíticas, metabolitos secundarios y pequeñas moléculas tóxicas) por un organismo y son capaces de afectar el crecimiento de las células de los microorganismos fitopatógenos (Michel-Aceves, 2001; Pérez, 2004). B. subtilis posee genes relacionadas en la biosíntesis de moléculas bioactivas de naturaleza química que tienen actividad antibiótica y antifúngica que actúan en bajas concentraciones. Estos metabolitos secundarios son compuestos de bajo peso molecular producidos durante la idiofase del crecimiento bacteriano que no tiene un rol directo en el crecimiento o reproducción, algunos presentan propiedades antimicrobianas y reguladores de crecimiento en plantas. Algunos de estos compuestos antibióticos son la zwittermicin-A, kanosamina (Ongena y Jacques, 2008), péptidos antimicrobianos, polipéptidos, lipopéptidos cíclicos, policétidos, lantibióticos, bacteriocinas, lactonas, fosfolípidos, sideróforos y volátiles (Pathma et al., 2011).
De estos grupos, los lipopéptidos son los compuestos más estudiados por su potencial biotecnológico y las aplicaciones de biocontrol (Chen et al., 2008). Los lipopéptidos son los compuestos que presentan mayor actividad antimicrobiana debido a sus propiedades tensioactivas o biosurfactantes (Ongena y Jacques 2008). Bacillus spp., secretan tres principales familias de lipopéptidos: surfactina, iturina A, B, C y fengicinas que presentan un gran potencial para aplicaciones biotecnológicas y biofarmacéuticas, debido a que son
7
biosurfactantes activos de membrana con actividad antimicrobiana potente (Peng et al., 2008). Estos compuestos presentan actividad antifúngica, que inhiben la germinación y crecimiento micelial de fitopatógenos;Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia, Septoria y Verticillium (Ramarathnam et al., 2007).
La surfactina se identificó por primera vez como un inhibidor de la formación del coágulo de fibrina, pero también exhibe funciones antimicrobianas, antifúngica, antitumorales y antivirales; e inhibe la formación de biopelículas de otras bacterias al inferir con la unión de las células a las superficies (Mireles et al., 2001). El gen que codifica la producción de este polipéptido es srfA, que contiene cuatro marcos de lectura abiertos (ORFs), srfA-A, srfA-B/, srfA-C y srfA-Te, respectivamente (Niran et al., 2011). La familia Iturina comprende la bacilomicina, iturina y micosubtilina los cuales son lipoheptapeptidos cíclicos unidos por un residuo β-aminoácido. Los miembros de esta familia tienen una fuerte propiedad antibiótica y una moderada actividad surfactante (Roongsawang et al., 2002). El grupo de genes de bacilomicina D (bam/bmy), micosubtilina (myc), y iturina A (itu) tiene cuatro marcos de lectura abiertos (ORFs), y codifican enzimas multifuncionales de ácidos grasos sintasa, aminotranferasa y péptidos sintetasa (Hansen et al., 2007). La fengicina es un antifúngico que inhibe hongos filamentosos pero es inefectivo contra levaduras y bacterias, contiene cinco subunidades no ribosomales de péptidos sintetasas (NRPS): FenC (287kDa), FenD (290 kDa), FenE (286 kDa), FenA (406 kDa), y FenB (146 kDa) (Wu et al., 2007).
Inducción de resistencia. La inducción de resistencia sistémica inducida (RSI) es un estado fisiológico que aumenta la capacidad defensiva, donde las defensas innatas de la planta son potenciadas contra subsecuentes desafíos bióticos (posterior ataque de patógenos). Esto hace que la planta sea capaz de defenderse de futuros ataques de patógenos a nivel de raíz y en toda la planta en general. La activación de las defensas de las plantas se inicia con el reconocimiento del patógeno, posteriormente se incrementa la expresión de los genes de defensa que influyen en el fortalecimiento físico de las paredes celulares debido a la producción de lignina, se intensifica la producción de fitoalexinas y se induce la producción de proteínas antimicrobianas como las quitinasas, β-1,3-glucanasas o peroxidasas, y proteínas relacionadas con la patogénesis (García et al., 2013). También induce resistencia
8
sistémica a través de la liberación de compuestos volátiles como acetoína y 2,3-butanodiol (Kobayashi et al., 2014).
1.2.5.Efecto de Bacillus subtilis en la promoción del crecimiento vegetal
Al colonizar las raíces de la planta, B. subtilis estimula diversos mecanismos de promoción de crecimiento, favorece la síntesis de fitohormonas como las giberelinas, citocininas y las auxinas que promueven la diferenciación de tejido vascular, división y elongación celular, estimula el desarrollo de abundantes raíces laterales, densidad y longitud de los pelos radicales, permitiendo una mayor capacidad de absorción de agua y nutrientes, favorece el incremento en la producción de biomasa y puede favorecer la fijación de nitrógeno, movilización de fosfatos y fosfatasas (Figura 1). La evaluación del efecto promotor se ve reflejada en los parámetros biométricos, como el peso seco del follaje, raíz y fruto, área foliar, numero de hojas, altura de la planta, entre otros (Kloepper et al., 2004).
9
En las plantas, la auxina más abundante es el ácido indolacético (AIA) este compuesto principalmente se sintetiza a partir del triptófano en el meristemo apical y en hojas jóvenes de donde se transporta a través del floema al resto de los tejidos vegetales. La concentración de auxinas es crítica para la respuesta fisiológica, las auxinas secretadas por cepas PGPR pueden funcionar como fuente exógena para la planta (Glick et al., 1999).
De acuerdo con Shigueru-Okumura et al. (2013), la aplicación de inoculantes líquidos directamente en las semillas promueve cambios bioquímicos, fisiológicos y morfológicos en la célula vegetal, reduce el tiempo de germinación, mejora la emergencia de las plántulas e incrementa el potencial de crecimiento y rendimiento de los cultivos. Por su parte, Di Barbaro
et al. (2005), indicaron que la inoculación con rizobacterias en semillas de pimiento beneficia a la planta desde la germinación, hasta un desarrollo posterior.
Hernández et al. (2014), realizaron un estudio sobre el efecto de Bacillus en el crecimiento y rendimiento del chile habanero, encontraron que los tratamientos que recibieron las cepas de Bacillus tuvieron un incremento en la altura de 28 % en comparación al tratamiento químico, y de 34.5 % en relación con el testigo. En cuanto al peso de los frutos, registró 70 g de fruto por planta, mientras que el tratamiento químico y el testigo tuvieron un peso de 11 y 18 g por planta, respectivamente. La aplicación de Bacillus incrementó el rendimiento de 536 y 473 %.
10
1.3. HIPÓTESIS
La cepa Bacillus subtilis CBRF8 que posee genes que codifican la producción de compuestos antibióticos e inhibe en un 60 % el crecimiento de Fusarium equiseti y F. solani
aislados de Capsicum chinense, también, inhibeun 60 % del crecimiento en F. circinatum, Helminthosporium speciferum, Colletotricum spp., y Curvularia lunata además, su inoculación en semillas de Capsicum spp. no afecta su germinación y favorece su crecimiento.
1.4. OBJETIVOS
1.4.1 Objetivo general
Evaluar el antagonismo de Bacillus subtillis sobre hongos fitopatógenos y su efecto en la germinación y crecimiento de plantas de Capsicum spp.
1.4.2. Objetivos específicos
1. Evaluar el efecto de B. subtilis sobre la inhibición del crecimiento micelial de hongos fitopatógenos.
2. Caracterizar los genes de B. subtilis relacionados a la síntesis de lipopéptidos.
3. Determinar el efecto de B. subtilis en la germinación y crecimiento de Capsicum chinense (chile habanero) y C. annuum (chile dulce y xcatik).
11
1.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
METODOLOGÍA
PRIMERA ETAPA SEGUNDA ETAPA
Evaluación de antagonismo
Evaluación del efecto en la germinación y crecimiento de
Capsicum spp.
Reactivación cepas bacterianas (CBRF8,
CBRF12)
Confrontación directa dual:
Fusarium equiseti F. circinatum Helminthosporium speciferum Colletotrichum truncatum C. capsici y Curvularia lunata. Extracción DNA (bacterias) Evaluación: inhibición crecimiento micelial y halos de inhibición Caracterización de genes (lipopéptidos) Amplificación DNA por PCR Inoculación semillas de chile dulce, xcatik, habanero Comparación de secuencia en la base de datos NCBI Establecimiento y trasplante de plántulas Evaluación de variables de germinación Inoculación con esporas Bacillus subtilis Evaluación de variables agronómicas
12
1.6. LITERATURA CITADA
Aciego J. 2006. Efecto en la rizosfera del cultivo de maíz sobre algunas poblaciones microbianas y características químicas de un suelo tropical. Revista Venesuelos. 6:39-45.
Agrios G. 2013. Plant Pathology. 7a edition. Elsevier Academic Press, London. 929 p., ISBN0-12-044565-4.
Avalos C. 2009. El polémico Uso de los Agroquímicos. Ecología, Revista Generación, número 134.13.
Chaves-Méndez, N. P. 2007. Utilización de bacterias y hongos endofíticos para el control biológico del nematodo barrenador Radopholus similis (Cobb) Thorne. Tesis presentada en opción al Título Académico de Magister Scientiae en Agricultura Ecológica. Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE). Turrialba, Costa Rica. 85 p.
Chen H., Wang L., Su C., Gong G., Wang P., Yu A. 2008. Isolation and characterization of lipopeptide antibiotics produced by Bacillus subtilis. Letters in Applied Microbiology 47, 180-186.
Claus D., and Berkeley R. 1986. In Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, vol.2. Edited by Sneath, Mair N., Sharpe and Holt. Baltimore: William and Wilkins p.1105.
Cohn. 1872. Untersuchungen uber Bakterien. Details. Beiträge zur Biologie der Pflanzen, 1:24-224.
Di Barbaro, G., Pernasetti S., y Stegmayer A. 2005. Evaluación del efecto de Azospirillum brasilensis en la germinación y emergencia del pimiento pimentonero (Capsicum annuum L. var. trompa de elefante). Revista del CIZAS 6:74-85.
13
Dixon, G. R. 1981. Vegetable crop diseases. AVI. Publishing Co. Conn. USA. 404 p.
Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera.2017. https:// www.gob.mx/siap.
García G., L., Zeriouh H., Romero D., Cubero J. and Pérez G., A. 2013.The antagonistic strain Bacillus subtilis UMAF6639 also confers protection to melon plants against cucurbit powdery mildew by activation of jasmonate- and salicylic acid-dependent defense responses. Microbial Biotechnology 6(3):264-74.
Glick, B. R., Patten C. L., Holguin O. and Penrose D. M. 1999. Biocontrol mechanism. Chapter 7. in: Biochemical and genetic mechanism used by plant growth promoting bacteria. Ontario Canada. Imperial Collagge Press. pp. 215-248.
Hansen D., B., Bumpus S., B., Aron Z., D., Kelleher N., L. and Walsh C., T. 2007. The loading module of mycosubtilin: an adenylation domain with fatty acid selectivity. Jornal of the American Chemical Society.129:6366-6367.
Hernández F., Lira R., Gallegos G., Hernandez M., y Solis S. 2014. Biocontrol de la marchitez del chile con tres especies de Bacillus y su efecto en el crecimiento y rendimiento. Phyton (B. Aires) vol.83 no.1 Vicente López.
Khan M., S. and Ahemad M. 2011. Functional Aspects of Plant Growth Promoting Rhizobacteria: Recent Advancements. Insight Microbiology 1(3):39-54.
Kimati H., Bergamin Filho, A., y Amorim L. 1995. Manual de Fitopatología. Principios e conceitos.V.1. 3a ed. Sao Paulo. Ceres. 919 p.
Kloepper J., W., Ryu C., M., and Zhang S. 2004. Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp. Phytopathology. 94 (11):1259-1266.
14
Kloepper J., W., Leong L., Teintze M., and Schroth M., N. 1980. Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth-promoting rhizobacteria. Nature 286:885-886.
Kobayashi K., K., Sekine K., T., and Nishiguchi M. 2014. Break down of plant virus resistance: can we predict and extend the durability of virus resistance Journal of General Plant Pathology. 80 (4):327-336.
Lucy M., Reed E., and Glick B. 2004. Aplications of free living plant growth promoting rhizobacteria. Antonie van Leeuwenhoek. 86 (1):1-25.
Medina F., Echeverría I., Pacheco R., Ruiz N., Guzmán A., and Martínez M. 2008. Influence of nitrogen and potassium fertilization on fruiting and capsaicin content in habanero pepper (Capsicum chinense Jacq.). Hort Science 43:1549-1554.
Melhus, E. I., and G. C. Kent. 1979. Elements of Plant Pathology. 4 th. Ed. McMillian Co. N.Y. USA. 493 p.
Michel-Aceves, A. C. 2001. Cepas nativas de Trichoderma spp. Euascomycetes: Hypocreales), su antibiosis y micoparasitismo sobre Fusarium subglutinans y F. oxysporum (Hyphomycetes: Hyphales). Tesis presentada en opción al Título Académico de Doctor en Ciencias: Área Biotecnología. Universidad de Colima, México. 152 pp.
Mireles J., R., Toguchi A., and Harshey R., M. 2001. Salmonella enterica serovar typhimurium swarming mutants with altered biofilmforming abilities: surfactin inhibits biofilm formation. Journal Bacteriology 183:5848-5854.
Niran Roongsawang, Kenji Washio, and Masaaki Morikawa. 2011. Review Diversity of Nonribosomal Peptide Synthetases Involved in the Biosynthesis of Lipopeptide Biosurfactants, International Journal of Molecular Sciences ISSN, 1422-0067, 12: 141-172.
15
Ongena M., and Jacques P. 2008. Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends in Microbiology. 16:115-125.
Pathma J., Rahul G., Kamaraj K., Subashri R., Sakthivel N. 2011. Secondary metabolite production by bacterial antaginists. Journal Biological Control 25:165-181.
Peng F., Wang Y., Sun F., Liu Z., Lai Q., and Shao Z. 2008. A novel lipopeptide produced by a Pacific Ocean deep-sea bacterium, Rhodococcus sp. TW53. Jornal Applied Microbiology, 105:3, 698-705.
Pérez Consuegra, Nilda. 2004. Manejo Ecológico de Plagas. La Habana, Cuba. Editorial Centro de Estudios de Desarrollo Agrario y Rural. pp 127-284..
Ramarathnam R., Bo S., Chen Y., Fernando W., Xuewen G., and De Kievit T. 2007. Molecular and biochemical detection of fengycin-and bacillomycin D-producing
Bacillus spp., antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat. Canadian Journal of Microbiology, 53:901-911.
Ramírez M. 2007. Potencial de producción del chile habanero (Capsicum chinense Jacq), en el sur de Tamaulipas. INIFAP Campo Experimental Sur de Tamaulipas. Apartado Postal No. 31, Altamira, Tamaulipas; CP 89601, México.
Rodríguez, C. V. y Martín Hernández, M. J. 2009. Aislamiento y selección de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal en cultivos de uchuva (Physalis peruviana L.) con capacidad antagónica frente a Fusarium sp. Tesis presentada en opción a los Títulos Académicos de Microbiólogo Agrícola-Veterinario y Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. 61 p.
Rojo-Báez, I., García-Estrada, R., Sañudo-Barajas, A., León-Félix, J., y Allende-Molar, R. 2017. Proceso de infección de antracnosis por Colletotrichum truncatum en papaya maradol. Revista Brasileira de Fruticultura, v.39.
16
Roongsawang N., Thaniyavarn J., Thaniyavarn S., Kameyama T., Haruki M., Imanaka T., Morikawa M., and Kanaya S. 2002. Isolation and characterization of a halotolerant
Bacillus subtilis BBK-1 which produces three kinds of lipopeptides: bacillomycin L, plipastatin, and surfactin. Extremophiles. 6:499-506.
Santoyo G., Orozco M., and Govindappa M. 2012. Mechanisms of biocontrol and plant growth-promoting activity in soil bacterial species of Bacillus and Pseudomonas: a review. Biocontrol Science and Technology.22 (8):855-872.
Saravanakumara D., Vijayakumarc C., Kumarb N., and Samiyappan R. 2007. PGPR-induced defense responses in the tea plant against blister blight disease. Crop Protection 26:556-565.
Shigueru-Okumura, R., De Cinque-Mariano, D., Dallacort R., Nogueira-De Albuquerque, A., Da SilvaLobato, A. K., SilvaGuedes, E. M., De OliveiraNeto, C. F, Oliveira -Da Conceicao, H. E., and Ruffei-Alves, G. A. 2013. Azospirillum: a new and efficient alternative to biological nitrogen fixation in grasses. Journal of Food Agriculture and Environment 11:142-1146.
Smith, K. P., and Goodman, R. M. 1999. Host variation for interactions with beneficial plant-associated microbes. Annual Review of Phytopathology. 37:473-491.
Sosa-Pech, M., Ruíz-Sánchez, E., Tun-Suárez, J., Pinzón-López, L., y Reyes-Ramírez A. 2019. Germinación, crecimiento y producción de glucanasas en Capsicum chinense
Jacq. inoculadas con Bacillus spp. Ecosistemas y Recursos Agropecuarios.
Wu C., Y., Chen C., L., Lee Y., H., Cheng Y., C., Wu Y., C., Shu H., Y., Gotz F., and Liu S., T. 2007. Nonribosomal synthesis of fengycin on an enzyme complex formed by fengycin synthetases. Journal of Biological Chemistry. 282: 5608-5616.
17
II. CAPÍTULO 2. ANTAGONISMO DE Bacillus subtilis CONTRA HONGOS
1
FITOPATÓGENOS Y PRESENCIA DE GENES DE LA BIOSÍNTESIS DE LIPOPÉPTIDOS
2
Armando Ismael Bacab-Pérez, Jairo Cristóbal-Alejo, Luis Leonardo Pinzón-López y Arturo 3
Reyes-Ramírez. 4
Tecnológico Nacional de México. Instituto Tecnológico de Conkal. Avenida Tecnológico s/n, 5
Conkal, Yucatán, México C.P. 97345. Autor responsable Email: [email protected] 6
7
RESUMEN
8
Los hongos fitopatógenos causan el 60 % de las enfermedades en los cultivos y son uno de los 9
principales factores limitantes en la producción agrícola, ya que disminuyen los rendimientos, 10
aumentan los costos de producción y afectan el desarrollo fisiológico de las plantas. El empleo de 11
rizobacterias antagonistas como Bacillus subtilis presenta potencial como agente biocontrol, 12
debido a la presencia de genes que codifican la producción de antibióticos. El objetivo de este 13
trabajo fue evaluar el efecto de las cepas de B. subtilis CBRF8 y CBRF12 sobre el crecimiento 14
micelial de hongos fitopatógenos foliares y de raíz, y caracterizar la genes relacionados a la síntesis 15
de lipopéptidos con actividad antifúngica. Se realizaron confrontaciones directas dual en medio de 16
cultivo PDA contra Fusarium equiseti (ITC17), F. circinatum (FS5), Curvularia lunata (ITC26), 17
Colletotrichum capsici (ITC28), C. Truncatum (ITC29) y Helminthosporium speciferum (ITC18). Se 18
extrajo el DNA de las cepas y se realizó la amplificación utilizando iniciadores específicos para detectar 19
la presencia de genes que codifican la producción de los antibióticos bacilomicina D, iturina A, 20
surfactina y zwitermicina A. La cepa CBRF8 presentó los mayores porcentajes de antagonismo contra 21
todos los hongos confrontados, la mayor inhibición se presentó contra C. lunata (ITC26), C. Truncatum
22
(ITC29) y F. equiseti (ITC17) en un 64, 66 y 69 %, respectivamente, además, esta cepa amplificó para 23
la presencia de los genes bamC, ituC, srfA y ZmaR. Por lo que la actividad antagónica observada de ésta 24
cepa es debida a la presencia de éstos genes relacionados a la síntesis de lipopétidos. 25
18
2.1. INTRODUCCIÓN
1 2
Los cultivos agrícolas son afectados por hongos fitopatógenos que causan el 60 % de las 3
enfermedades, constituyen el principal factor limitante en la producción, ya que disminuyen los 4
rendimientos, aumentan los costos de producción y afectan su desarrollo fisiológico (Moo-koh et
5
al., 2014). Los hongos fitopatógenos son organismos heterótrofos sexuales o asexuales formados 6
por un cuerpo micelial con paredes celulares de quitina, cuentan con mecanismos y estrategias 7
biológicas que les han permitido subsistir, infectar y producir daños en raíces, follaje y frutos. 8
Pasan su ciclo de vida en la planta y residuos vegetales, además, pueden alojarse en semillas 9
provocando la muerte del embrión, bajos porcentajes de germinación, plántulas deformes y 10
susceptibles al ataque a otros patógenos (Araujo et al., 2018). Los daños producidos en la planta 11
pueden ser en tejidos específicos o en todos los órganos de la planta, provocan necrosis y 12
disminución de crecimiento. Las especies del género Fusarium son de los principales patógenos 13
que afectan los cultivos, producen metabolitos que inhiben el crecimiento de raíces, provocan 14
pudrición de raíz, marchitez vascular, clorosis, y defoliación (Manici et al., 2017). Colletotrichum
15
sp. es un fitopatógeno que afecta hojas, tallos y frutos, causan la antracnosis; la principal 16
enfermedad postcosecha en papaya (Carica papaya L.), genera pérdidas de producción de al menos 17
el 50 % s (Rojo et al., 2017). Por otra parte, Curvularia sp. y Helminthosporium sp. son hongos 18
del follaje que reducen la superficie fotosintéticamente activa de las hojas disminuyen la 19
producción de foto-asimilados (Kimati et al., 1995). Para combatir estos patógenos se utilizan 20
paquetes tecnológicos que implican la aplicación de productos de síntesis química, sin embargo, 21
éstos tienen un corto periodo de efectividad, por lo cual es recurrente la aplicación de fungicidas 22
cada vez más tóxicos. Su uso constante ha originado consecuencias edáficas contaminación del 23
aire, de aguas subterráneas y alteraciones en el ecosistema (Avalos, 2009), daños a organismos 24
19
benéficos, residualidad en los productos e inducción de patógenos resistentes (Aciego, 2006). Una 1
alternativa para reducir el impacto negativo de los productos químicos y controlar hongos 2
fitopatógenos es el empleo de rizobacterias antagonistas como Bacillus subtilis; agente 3
biocontrolador, debido a la presencia de genes que codifican la producción de metabolitos 4
secundarios entre los que se inlcuyen: lipopéptidos como surfactina, fengicina, iturina, 5
bacilomicinas y zwittermicina; que tienen un papel primordial en el antagonismo ya que inhiben el 6
crecimiento micelial y la germinación de esporas contra Fusarium, Pythium, Phytophthora,
7
Rhizoctonia, Sclerotinia, Septoria y Verticillium (Naorska and Bikowski, 2007). El objetivo de este 8
trabajo fue evaluar el efecto de dos cepas de Bacillus subtilis sobre el crecimiento micelial de 9
hongos fitopatógenos foliares y de raíz, y caracterizar la presencia de genes relacionados a la 10
síntesis de lipopéptidos con actividad antifúngica. 11
12
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS
13 14
Microorganismos utilizados. Se utilizaron dos cepas de Bacillus subtilis, la CBRF8, 15
antagonista de Fusarium solani y F. equiseti (Mejía et al., 2016) y la CBRF12 con actividad 16
promotora de crecimiento en Capsicum chinense (Sosa et al., 2019). Los hongos fitopatógenos 17
utilizados fueron F. equiseti (ITC17), F. circinatum (FS5), Helminthosporium speciferum(ITC18), 18
Colletotrichum truncatum (ITC29), C. capsici (ITC28) y Curvularia lunata (ITC26) de la 19
colección del Instituto Tecnológico de Conkal. La reactivación de las cepas bacterianas se realizó 20
en medio de cultivo agar nutritivo y se mantuvieron a 28 0C, los hongos se reactivaron en medio 21
de cultivo agar dextrosa-papa (PDA). 22
20
Antagonismo in vitro contra hongos fitopatógenos. Se realizaron confrontaciones directas 1
duales en medio de cultivo PDA contra los fitopatógenos en estudio. Se colocaron discos de 5 mm 2
de diámetro de micelio de cada hongo fitopatógeno en el centro de la caja petri con medio de cultivo 3
PDA, a las 24 horas se inoculó con las cepas bacterianas a una distancia de 2.5 cm del disco central 4
y se incubaron a 28 ˚C durante siete días (Li et al., 2011). Se midió los halos de inhibición, el 5
diámetro de crecimiento micelial de cada hongo fitopatógeno y se calculó el grado de inhibición 6
del crecimiento radial (RGI) con la formula, RGI = (C - T) / C × 100 (Landa et al., 1997). 7
8
Donde: 9
T= es el diámetro promedio del crecimiento micelial en presencia de Bacillus subtilis, C es el 10
diámetro promedio del crecimiento micelial sin muestras bacterianas. 11
12
Caracterización de genes de la síntesis de lipopéptidos en Bacillus subtilis. Las cepas 13
bacterianas se cultivaron en matraces de 250 mL con caldo nutritivo e incubado durante 24 horas 14
a 28˚C en agitación constante a 150 rpm. La extracción de DNA se realizó con el kit de extracción 15
Quick-DNATM Fungal/Bacterial Minipred kit y se verifico la integridad del DNA mediante 16
electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Como control se utilizó la amplificación del gen 16s rDNA. 17
Se realizó la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en un termociclador (Techne TC-312) 18
con iniciadores específicos para la amplificación de fragmentos y detectar los genes que codifican 19
la producción de lipopéptidos con actividad antifúngica (Cuadro 1). 20
21 22 23 24
21
Cuadro 1.Iniciadores utilizados para la detección de lipopéptidos en las cepas bacterianas.
1
Lipopéptido Iniciador Secuencia Tm
(˚C) Tamaño (pb) Referencia Bacilomicina D BACC1F BACC1R GAAGGACACGGCAGAGAGTC CGCTGATGACTGTTCATGCT 60 875 Ramarathnam et al., 2007 Fengicina D FEND1D FEND1R TTTGGCAGCAGGAGAAGTTT GCTGTCCGTTCTGCTTTTTC 62 964 Ramarathnam et al., 2007 Iturina A ITUD1F ITUD1R GATGCGATCTCCTTGGATGT ATCGTCATG TGCTGCTTGAG 60 647 Ramarathnam et al., 2007 Surfactina SUR3F SUR3R ACAGTATGGAGGCATGGTC TTCCGCC ACTTTTTCAGTTT 57 441 Ramarathnam et al., 2007 Zwitermicina A ZWITF2 ZWITR1 TTGGGAGAATATACAGCTCT GACCTTTTGAAATGGGCGTA 57 779 Athukorala et al., 2009 Tm: temperatura de alineamiento 2 3
Detección del gen fenD de la Fengicina D. Para detectar la presencia del gen de la fengicina 4
se utilizó un volumen de reacción de 50 μl. Se utilizó buffer PCR 1x; 2 mM checar de MgCl2; 200 5
μM de dNTP; 20 pmol del iniciador directo FEND1D y del iniciador reverso FEND1R y 0.5 U de 6
Taq DNA polimerasa. Las condiciones para la PCR fueron de una temperatura inicial de 7
desnaturalización de 94 ˚C por 3 minutos, con 45 ciclos a una temperatura de desnaturalización de 8
94 ˚C por 1 minuto, alineamiento a 62˚C por 1 minuto, extensión a 72˚C por 1.45 minutos y una 9
extensión final a 72˚C por 6 minutos. 10
11
Detección del gen bamC de la BacilomicinaD. Se utilizó solución amortiguadora de PCR 12
1x; 1.75 mM de MgCl2; 200 μM de dNTP; 20 pmol del iniciador directo BACC1F y del iniciador 13
reverso BACC1R y 0.5 U de Taq DNA polimerasa. Las condiciones para la PCR fueron una 14
22
temperatura inicial de desnaturalización de 94 ˚C por 3 minutos, 35 ciclos a una temperatura de 1
desnaturalización de 94 ˚C por 1 minuto, alineamiento a 60 ˚C por 30 segundos, extensión a 72˚C 2
por 1.45 minutos y una extensión final a 72˚C por 6 minutos. 3
4
Detección del gen ituC de la Iturina A. Se utilizaron 0.5 mM del iniciador directo ITUD1F 5
e iniciador reverso ITUD1R, buffer 1x, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de dNTP, y 0.5 U of Taq DNA 6
polimerasa en un volumen de 50 μl. Las condiciones para la PCR fueron de una temperatura inicial 7
de desnaturalización de 94 ˚C por 3 min, 40 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 94 8
˚C por 1 min, temperatura de alineamiento de 60 ˚C por 1 min, extensión de 72 ˚C por 1 min y 9
extensión final a 72 ˚C por 10 min. 10
11
Detección del gen srfA de la Surfactina. Se utilizó el iniciador SUR3F e iniciador reverso 12
SUR3R para la amplificación del gen de la surfactina. Se utilizó solución amortiguadora 1x, 0.2 13
mM de dNTP, 1 μM de cada iniciador, 1.5 mM de MgCl2 y 2 U de Taq DNA polimerasa. Las 14
condiciones de PCR fueron de una temperatura inicial de desnaturalización de 94 ˚C por 3 min, 40 15
ciclos con temperatura de desnaturalización de 94 ˚C por 1 min, temperatura de alineamiento a 57 16
˚C por 1 min, 72 ˚C por 1 min de extensión y extensión final a 72 ˚C por 10 min. 17
18
Detección del gen ZmaR de la Zwittermicina A. Se utilizó 1 μM cada iniciador (directo 19
ZWITF2 y reverso ZWITR1), solución amortiguadora 1x, 0.2 mM de dNTP, 1.5 mM de MgCl2 y 20
2 U de Taq DNA polimerasa. Las condiciones fueron de una temperatura inicial de 21
desnaturalización de 94 ˚C por 3 min, 40 ciclos con temperatura de desnaturalización de 94 ˚C por 22
1 min, temperatura de alineamiento a 57 ˚C por 1 min, 72 ˚C por 1 min de extensión y extensión 23
final a 72 ˚C por 10 min. 24
23
Análisis de datos. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con tres 1
tratamientos y cinco repeticiones por cada hongo fitopatógeno. Los datos de porcentaje se 2
transformaron previamente con arcoseno√ y se sometieron a un análisis de varianza y una 3
comparación de medias por el método Tukey (P≤0.05). 4
5
2.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6 7
El análisis de varianza indicó diferencias estadísticas significativas (P≤0.01) entre las cepas 8
de B. subtilis, la cepa CBRF8 presentó mayor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial en 9
los hongos fitopatógenos confrontados. Para F. equiseti (ITC17) elporcentaje de inhibición fue de 10
69.1 %, mientras que la cepa B. subtilis CBRF12 presentó un 12.7 %. Para F. circinatum (FS5) la 11
cepa CBRF8 fue estadísticamente superior con un 34.9 % de inhibición, mientras que la cepa 12
CBRF12 únicamente inhibió el 5.8 %. La cepa CBRF8 para C.lunata (ITC26) inhibió el 64.8 % 13
del crecimiento micelial,en C. capsici (ITC28)de 50.1 %, C. truncatum (ITC29) de 66.7 % y para 14
H. speciferum (ITC18) fue de 38.8 %. La cepa CBRF12 presentó menores porcentajes de inhibición 15
en relación a la cepa CBRF8 en todos hongos confrontados (Cuadro 2). 16 17 18 19 20 21 22
24
Cuadro 2.Inhibición del crecimiento micelial de hongos fitopatógenos por B. subtilis CBRF8
1 y B. subtilis CBRF12. 2 Inhibición micelial (%) Tratamiento F. equiseti (ITC17) F. circinatum (FS5) C. lunata (ITC26) C. capsici (ITC28) C. truncatum (ITC29) H. speciferum (ITC18) B. subtilis CBRF8 69.1 ± 4.6 a 34.9 ± 2.1 a 64.8 ± 3.3 a 50.1 ± 9.5 a 66.7 ± 1.9 a 38.8 ± 1.4 a B. subtilis CBRF12 12.7 ± 3.8 b 5.8 ± 1.9 b 12.3 ± 3.1 b 25.5 ± 3.7 b 33.7 ± 3.7 b 25.3 ± 3.0 b Testigo 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c Medias con literal diferente en la misma columna son estadísticamente diferentes (Tukey, P≤0.05), 3
n=5. Los datos fueron transformados previamente con arcoseno √. 4
5
El porcentaje de inhibición en Fusarium spp. por Bacillus ha sido reportado en un rango entre 6
20 y 90 % (Badia et al., 2011; Rojas et al. (2017). En otros estudios contra F. equiseti, hubo 7
inhibiciones entre un 21.28 y 71.70 % (Mejía et al., 2016). En este trabajo se obtuvieron resultados 8
similares para este género en confrontación con la cepa B. subtilis CBRF8, sin embargo, la cepa B.
9
subtilis CBRF12 no mejoró la efectividad de otros reportes. Tejera et al. (2012) evidenciaron una 10
inhibición del crecimiento fúngico entre 35 y 80 % para Curvularia sp., la capacidad de inhibición 11
sobre especies de este género fue demostrada en plantas de soya (Basha et al., 2002). La actividad 12
de la cepa B. subtilis CBRF8 obtenida en este trabajo para C. capsici (ITC28) y C. truncatum
13
(ITC29) fue una inhibición del crecimiento de 50.1 y 66.7 %, respectivamente. Baños-Guevara et
14
al. (2004) reportaron para C. gloeosporioides porcentajes de inhibición de 69.1 % en confrontación 15
25
con B. firmus a las 96 h, por su parte Ruiz-Sánchez et al. (2014) obtuvieron una inhibición de 63 a 1
80 % de inhibición por B. subtilis.
2 3
En los halos de inhibición se encontró diferencia estadística significativa (P≤0.01) y se 4
observaron en un rango de 3 a 11.9 mm. La cepa CBRF8, tuvo mayor halo de inhibición contra de 5
C. lunata (ITC26), mientras que para la cepa CBRF12 formó halos de inhibición de 0 a 1.7 mm, la 6
mejor inhibición se presentó contra H. speciferum (ITC18)(Cuadro 3). La formación de halos de 7
inhibición ha sido evidenciada en confrontaciones directas con B. subtilis y B. cereus (Sadfi et al., 8
2002). Mejía et al., (2016) obtuvieron halos de inhibición de 3.76 a 6.37 mm contra F. equiseti.
9
Chung et al., (2008) y Kim et al., (2010)mencionaron que el antagonismo de B. subtilis ese debe 10
a la producción de lipopéptidos como la surfactina, la fengicina, la iturina A, B, y C, las 11
bacilomicinas y la zwittermicina.. 12
13
Cuadro 3. Halo de inhibición en los hongos fitopatógenos por efecto de B. subtilis CBRF8 y
14
B. subtilis CBRF12.
15
Medias con literal diferente en la misma columna son estadísticamente diferentes (Tukey, P≤0.05). 16 17 Halo de inhibición (mm) Tratamiento F. equiseti (ITC17) F. circinatum (FS5) C. lunata (ITC26) C. capsici (ITC28) C. truncatum (ITC29) H. speciferum (ITC18) B. subtilis CBRF8 3.0 ± 0.7 a 5.9 ± 0.0 a 11.9 ± 1.6 a 3 ± 0.8 a 9.1 ± 0.7 a 4.9 ± 0.5 a B. subtilis CBRF12 0.7 ± 0.12 b 0.0 ± 0.0 b 0.4 ± 0.14 b 1.1 ± 0.4 b 1.4 ± 0.6 b 1.7 ± 0.3 b Testigo 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c
26
La amplificación de fragmentos por PCR para detectar los genes que codifican la producción 1
de lipopéptidos con actividad antifúngica solo la cepa B. subtilis CBRF8 amplificó para 2
bacilomicina D, iturina A, surfactina y zwitermicina A. (Cuadro 4), los productos obtenidos 3
tuvieron los tamaños esperados respectivamente (875 pb, 647 pb, 441 pb, 779 pb). Las secuencias 4
obtenidas de la secuenciación fueron comparadas en la base de datos del NCBI y se obtuvo las 5
proteínas hipotéticas responsables de la codificación de los antibióticos (Cuadro 5), Ramarathnam 6
et al. (2007) reportó la amplificación del gen fenD y bamC en cepas de B. subtilis, con un tamaño 7
de 964 y 875 pb. En este género se han reportado al menos160 aislados que poseen el gen que 8
codifica la producción de la bacilomicina D, 79 del gen de la iturina, 111 surfactina (Stanković et
9
al., 2012). El grupo de genes de iturina A y bacilomicina han sido reportados con una propiedad 10
antifúngica con cuatro marcos de lectura abiertos (Tsuge et al., 2001) y codifican enzimas 11
multifuncionales de ácidos grasos sintasa aminotranferasa y péptidos sintetasa (Hansen et al., 2007; 12
Wu et al., 2007). Athukorala et al. (2009), detectó la presencia de bacilomicina D en B. 13
subtilis 3057, B. amyloliquefaciens BS6 y B.mycoides 4079, así como el gen de la fengicina en B.
14
subtilis H-08-02, B. subtilis 3057, B. amyloliquefaciens BS6 y B. mycoides 4079, el gen 15
zwittermicina A en B. mycoides S-07-01, B. thuringiensis BS8 y B. amyloliquefaciens BS6, al 16
mismo tiempo estas cepas presentaron el gen de la surfactina e iturina. La surfactina ha sido 17
reportada con funciones antimicrobianas, antitumorales y antivirales e inhiben la formación de 18
biopelículas de otras bacterias al interferir con la unión de las células a las superficie de la planta, 19
el gen que codifica la producción de este lipopéptido posee cuatro marcos de lectura abiertos; srfA-20
A, srfA-B/, srfA-C, y srfA-Te (Niran et al., 2011). La presencia de estos genes en B. subtilis están 21
relacionados en la inhibición de crecimiento radial, halos de inhibición e inhibición de germinación 22
de conidios en F. oxysporum y F. solani (Chung et al., 2008), además, son supresores de Pythium,
23
Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia, Septoria y Verticillium (Naorska y Bikowski, 2007). 24
27
Cuadro 4. Genes detectados en B. subtilis.
1
Cepa Gen
bamC fenD ituC srfA ZmaR B. subtilis CBRF8 + - + + + B. subtilis CBRF12 - - - - - 2 3
Cuadro 5. Proteínas hipotéticas correspondiente a los genes de la síntesis de lipopéptidos en
4
B. subtilis CBRF8.
5
Gen Proteína Lipopéptido Accesión
bamC Proteína con dominio de ácido amino adenilasa
Bacilomicina D WP_127069653.1
ituC ACP S-malonyl transferasa Iturina A WP_060561613.1
srfA Biosíntesis de surfactin thioesterasa SrfAD
Surfactina WP_012116775.1
ZmaR ACP S-malonyltransferasa Zwitermicina A WP_102956566.1 6 7 8 9 10 11 12 13
28
2.4. CONCLUSIONES
1 2
Las cepas de Bacillus subtilis presentaron actividad antagónica frente a los hongos 3
fitopatógenos confrontados aislados de Capsicum chinense (chile habanero), Capsicum annuum
4
(chile dulce), Pinus greggii y Eustoma grandiflorum. La cepa B. subtilis CBRF8 inhibió el 5
crecimiento micelial en un rango de 34.9 a 69.1 %. La mayor inhibición observada fueron para 6
Fusariumequiseti (ITC17), C. truncatum (ITC29) y C. lunata (ITC26), mientras que F. circinatum
7
(FS5), H. speciferum (ITC18) y C. capsici (ITC28) presentaron inhibición por debajo del 50 %. La 8
cepa CBRF12 presentó valores más bajos de inhibición en un rango de 5.8-33.7 %, presentando la 9
mayor inhibición para C. truncatum (ITC29), C. capsici (ITC28) y H. speciferum (ITC18). La 10
actividad antagónica observada en la cepa B. subtilis CBRF8 es debida a la presencia de los genes 11
que codifican la producción de compuestos antifungicos como la iturina A, bacilomicina D, 12
surfactina y Zwitermicina A que tienen efecto en la inhibición de crecimiento micelial y halos de 13 inhibición. 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
29
2.5. LITERATURA CITADA
1 2
Aciego J. 2006. Efecto en la rizosfera del cultivo de maíz sobre algunas poblaciones microbianas y 3
características químicas de un suelo tropical. Revista Venesuelos. 6: 39-45. 4
5
Athukorala S., N., Dilantha W., G., and Rashid K., Y. 2009. Identification of antifungal antibiotics 6
of Bacillus species isolated from different microhabitats using polymerase chain reaction 7
and MALDI-TOF mass spectrometry. Canadian Journal of Microbiology 55: 1021-1032. 8
9
Avalos C. 2009. El polémico Uso de los Agroquímicos. Ecología, Revista Generación, Número 10
134.13. 11
12
Badia, M. R., Hernández, B. T., Murrel, J. A., Mahillon J., y Pérez, M. H. 2011. Aislamiento y 13
caracterización de cepas de Bacillus asociadas al cultivo del arroz (Oryza sativa L.). 14
Revista Brasileira de Agroecología. 15
16
Baños-Guevara, P. E., Zavaleta-Mejía, E., Colinas-León, M. T., Luna-Romero, I. y Gutiérrez-17
Alonso, J. G. 2004. Control biológico de Colletotrichumgloeosporioides (Penz.) Penz. y 18
Sacc. en papaya Maradol Roja (Carica papaya L.) y fisiología postcosecha de frutos 19
infectados. Revista Mexicana de Fitopatología. 22:198-205. 20
21
Basha S., and Ulaganathan K. 2002. Antagonism of Bacillus species (strains BC121) towards 22
Curvularialunata. Current Sciences. 82(12):1457-1463. 23
30
Chung S., Kong H., Buyer J., S., Lakshman D., K., Lydon J., Kim S., D., and Roberts D., P. 2008. 1
Isolation and partial characterization of Bacillus subtilis ME488 for suppression of soil 2
borne pathogens of cucumber and pepper. Applied Microbiology and Biotechnology. 3
80:115-123. 4
5
Araujo F., E., Luiz Mauri, A., Ribeiro Amaro, H., Henriques Da Silva, D., and Fernandes dos 6
Santos, Dias D. 2018. Physiological and sanitary quality of organic tomato seeds treated 7
with clove basil extracts. Comunicata Scientiae. 9(1):6-33. 8
9
Hansen, D. B., Bumpus, S. B., Aron, Z. D., Kelleher, N. L., and Walsh, C. T. 2007. The loading 10
module of mycosubtilin: an adenylation domain with fatty acid selectivity. Journal of the 11
American Chemical Society 129:6366-6367. 12
13
Kimati H., Bergamin Filho, A., y Amorim L. 1995. Manual de Fitopatología. Principios e 14
conceitos. 3a edición. Editoral: Sao Paulo: Agronomica Ceres. 919 p. 15
16
Kim P., I, Ryu J., Kim Y., H., and Chi Y., T. 2010. Production of biosurfactant lipopeptides iturin 17
A, Fengycin, and Surfactin A from Bacillus subtilis CMB32 for control of Colletotrichum
18
gloeosporioides. Journal of Microbiology and Biotechnology 20:138-145. 19
http://dx.doi.org/10.4014/ jmb.0905.05007. 20
21
Landa B., Hervas A., Bettiol W., y Jiménez R., 1997. Antagonistic activity of bacteria from the 22
chickpea rhizosphere against Fusarium oxysporum f. sp.ciceris. Phytoparasitica. 25(4): 23
305-318. 24
31
Li L., Ma J., Li Y., Wang Z., Gao T., and Wang Q. 2011. Screening and partial characterization of 1
Bacillus with potential applications in biocontrol of cucumber Fusarium wilt. Crop 2
Protection. Volume35:29-35. 3
4
Manici L., M., Caputo F., and Saccà M., L. 2017. Secondary metabolites released into the 5
rhizosphere by Fusariumoxysporum and Fusarium spp. as underestimated component of 6
nonspecific replant disease. Plant and Soil. 415:85-98. 7
8
Mejia-Bautista, M. A., Reyes-Ramírez, A., Cristóbal-Alejo, J., Tun-Suárez, J. M., Borges-Gómez, 9
L., y Pacheco-Aguilar, J. R. 2016. Bacillus spp. en el control de la marchitez causada por 10
Fusarium spp. en Capsicum chinense. Revista Mexicana de Fitopatología. 34:3 208-222. 11
12
Moo-Koh, A., Cristobal-Alejo, J., Reyes-Ramírez, A., Tun-Suárez, J. M., Sandoval-Luna, R., y 13
Ramírez-Pool, J. 2014. Actividad in vitro del extracto acuoso de Bonelliaflammea contra 14
hongos fitopatógenos. Agrociencia. 48:833-845. 15
16
Naorska K., and Bikowski M. 2007. Multicellular behaviour and production of a wide variety of 17
toxic substances support usage of Bacillussubtilis as a powerful biocontrol agent. Acta 18
Biochimica Polonica. 54:495-508. 19
20
Niran Roongsawang, Kenji Washio, and Masaaki Morikawa. 2011. Review diversity of 21
nonribosomal peptide synthetases involved in the biosynthesis of lipopeptide 22
biosurfactants, International Journal of Molecular Sciences ISSN 1422-0067. 12:141-172. 23
32
Ramarathnam R., Bo S., Chen Y., Fernando W., Xuewen G., and De Kievit T. 2007. Molecular 1
and biochemical detection of fengycin and bacillomycin D producing Bacillus spp., 2
antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat. Canadian Journal of Microbiology 3
53: 901-911. 4
5
Rojas M., Sánchez D., Rosales K., y Lugo D. 2017. Antagonismo de Bacillus frente a hongos 6
fitopatógenos de cultivos hortícolas. Revista Protección Vegetal, Vol.32, no.2. La Habana 7
mayo-agosto. 8
9
Rojo-Báez, I., García-Estrada, R., Sañudo-Barajas, A., León-Félix, J., y Allende-Molar, R. 2017. 10
Proceso de infección de antracnosis por Colletotrichum truncatum en papaya maradol. 11
Revista Brasileira de Fruticultura. v.39. 12
13
Ruiz-Sánchez, E., Mejía-Bautista, M., Cristóbal-Alejo, J., Valencia-Botín, A., y Reyes-Ramírez, A. 14
2014. Actividad antagónica de filtrados de Bacillus subtilis contra Colletotrichum
15
gloeosporioides (Penz.). Revista Mexicana Ciencia Agrícola. vol.5, n.7, pp.1325-1332. 16
ISSN 2007-0934. 17
18
Sadfi N., Cherif M., Hajlaoui, M. R., Boudabbous A., and Belanger R. 2002. Isolation and partial 19
purification of antifungal metabolites produced by Bacillus cereus. Annals of 20
Microbiology. 52:323-338. 21
33
Stanković, S., Mihajlović S., Draganić V., Dimkić I., Vukotić G., Berić T., and Fira D. 2012. 1
Screening for the presence of biosynthetic genes for antimicrobial lipopeptides in natural 2
isolates of Bacillus sp. Archives of Biological Sciences. 64(4):1425-1432. 3
4
Sosa-Pech, M., Ruiz-Sánchez, E., Tun-Suarez, J., Pinzón-López, L., y Reyes-Ramírez, A. 2019. 5
Germinación, crecimiento y producción de glucanasas en Capsicum chinense Jacq. 6
inoculadas con Bacillus spp. Ecosistemas y Recursos Agropecuarios. 7
8
Tejera B., Heydrich M., y Rojas M. 2012. Antagonismo de Bacillus spp. frente a hongos 9
fitopatógenos del cultivo del arroz (Oryza sativa L.). Revista de Protección Vegetal. 10
11
Tsuge K., Akiyama T., and Shoda M. 2001. Cloning, sequencing, and characterization of the iturin 12
A operon. Journal of Bacteriology. 183(21), 6265-6273. 13
14
Wu, C. Y., Chen, C. L., Lee, Y. H., Cheng, Y. C., Wu, Y. C., Shu, H. Y., Gotz F., and Liu, S. T. 15
2007. Nonribosomal synthesis of fengycin on an enzyme complex formed by fengycin 16
synthetases. Journal of Biological Chemistry. 282:5608-5616. 17
34
III. CAPÍTULO 3.
1
EFECTO DE Bacillus subtilis EN LA GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO DE Capsicum
2
spp.
3
Armando Ismael Bacab-Pérez1, Jairo Cristóbal-Alejo1, Luis Pinzón López1, José Alfredo Noh-4
Medina2 y Arturo Reyes-Ramírez1 5
1Tecnológico Nacional de México. Instituto Tecnológico de Conkal. Avenida Tecnológico s/n, 6
Conkal, Yucatán, México C.P. 97345. 2Tecnológico Nacional de México. Instituto Tecnológico de 7
Tizimín Final aeródromo Copul s/n, Tizimín, Yucatán, México. CP. 97700. Autor responsable 8 Email: [email protected] 9 10 RESUMEN 11
Las bacterias colonizadoras de las raíces conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento 12
vegetal ejercen efectos benéficos en el crecimiento y salud vegetal, además tienen la capacidad de 13
ejercer control sobre el crecimiento de otros organismos. Las bacterias del género Bacillus son de 14
las más abundantes y pueden incrementar el crecimiento de las plantas a través de mecanismos 15
como la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfato, la producción de fitohormonas, 16
producción de sideróforos y la inducción de la resistencia sistémica. El objetivo de este trabajo fue 17
evaluar el efecto de dos cepas de Bacillussubtilis en la germinación y crecimiento de chile dulce 18
(Capsicumannuum), chile x’catik (Capsicumannuum) y chile habanero (Capsicumchinense). Las 19
semillas inoculadas con B. subtilis no afectaron la germinación en los genotipos, sin embargo, 20
favorecieron la reducción del tiempo medio de germinación e incrementaron las tasas de 21
germinación, además, favorecieron un incremento en la longitud radicular de 7-10 mm, y 22
presentaron efectos benéficos en las variables de crecimiento. 23
24 25 26
