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Polimorfismos no gene NAT2 (N‐acetiltransferase 2) em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico

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(1)

w w w . r e u m a t o l o g i a . c o m . b r

REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Artigo

original

Polimorfismos

no

gene

NAT2

(N-acetiltransferase

2)

em

pacientes

com

lúpus

eritematoso

sistêmico

Elaine

Cristina

Lima

dos

Santos

a

,

Amanda

Chaves

Pinto

a

,

Evandro

Mendes

Klumb

b

e

Jacyara

Maria

Brito

Macedo

a,∗

aUniversidadedoEstadodoRiodeJaneiro(UERJ),DepartamentodeBioquímica,RiodeJaneiro,RJ,Brasil bUniversidadedoEstadodoRiodeJaneiro(UERJ),DisciplinadeReumatologia,RiodeJaneiro,RJ,Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem10dejunhode2015 Aceitoem23dejulhode2016

On-lineem28desetembrode2016

Palavras-chave:

Lúpuseritematososistêmico N-acetiltransferase2 Polimorfismogenético Fenótipoacetilador Fenótiposclínicos

r

e

s

u

m

o

Objetivo:Investigar potenciais associac¸ões de quatro substituic¸ões do gene NAT2

(N-acetiltransferase2)edofenótipoacetiladordeNAT2comolúpuseritematososistêmico (LES)eosfenótiposclínicos.

Métodos:Aanálisemoleculardassubstituic¸ões481C>T,590G>A,857G>Ae191G>Ado geneNAT2foifeitacomatécnicadePCR-RFLP,usandoDNAextraídodeamostrasdesangue periféricoobtidasdepacientescomLES(n=91)econtroles(n=97).

Resultadoseconclusões:Ogenótipo857GAfoimaisprevalenteentrepacientescomLESnão brancas(OR=4,01,IC95%=1,18-13,59).Oalelo481Tapresentouassociac¸ãopositivacomas alterac¸õeshematológicasqueenvolvemmecanismosautoimunes,especificamenteanemia hemolíticaautoimuneoutrombocitopeniaautoimune(OR=1,97;IC95%=1,01-3,81).

©2016PublicadoporElsevierEditoraLtda.Este ´eumartigoOpenAccesssobuma licenc¸aCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Polymorphisms

in

NAT2

(N-acetyltransferase

2)

gene

in

patients

with

systemic

lupus

erythematosus

Keywords:

Systemiclupuserythematosus N-acetyltransferase2

Geneticpolymorphism Acetylatorphenotype Clinicalphenotypes

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective:ToinvestigatepotentialassociationsoffoursubstitutionsinNAT2geneandof acetylatorphenotypeofNAT2withsystemiclupuserythematosus(SLE)andclinical phe-notypes.

Methods:Molecularanalysisof481C>T,590G>A,857G>A,and191G>Asubstitutionsinthe

NAT2genewasperformedbyPCR-RFLPtechnique,usingDNAextractedfromperipheral bloodsamplesobtainedfrompatientswithSLE(n=91)andcontrols(n=97).

Resultsandconclusions:The857GAgenotypewasmoreprevalentamongnonwhiteSLE pati-ents(OR=4.01,95%CI=1.18-13.59).The481T alleleshowed apositive associationwith

Autorparacorrespondência.

E-mails:jacyara@uerj.br,jacyarauerj@gmail.com(J.M.Macedo).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2016.07.007

0482-5004/© 2016 Publicado por Elsevier Editora Ltda. Este ´e um artigo Open Access sob uma licenc¸a CC BY-NC-ND (http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

(2)

hematologicaldisordersthatinvolveautoimmunemechanisms,specificallyautoimmune hemolyticanemiaorautoimmunethrombocytopenia(OR=1.97;95%CI=1.01-3.81).

©2016PublishedbyElsevierEditoraLtda.ThisisanopenaccessarticleundertheCC BY-NC-NDlicense(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduc¸ão

Olúpuseritematososistêmico(LES)éumasíndrome autoi-mune, crônica e sistêmica. O acometimento de diversos tecidoseórgãoséresultantedeprocessosinflamatórios crôni-cosgeradospeladeposic¸ãodeimunocomplexosdecorrentes daproduc¸ão elevadadeautoanticorpos.Emboraaetiologia doLESaindanãoestejacompletamenteesclarecida,estudos apontamparaumacomplexainterac¸ãoentredeterminantes genéticos e ambientais.1 Irradiac¸ão ultravioleta,

medica-mentos,agentes infecciosos, tabagismo ediversos agentes químicostêmsidodescritoscomopotenciaisfatoresderisco paraessadoenc¸a.2Estudosemdiversaspopulac¸ões

demons-traramqueohábitotabágicotemassociac¸ãopositivacomo LES,comrazõesdechancesentre1,6e6,6.2–7Alémde

influ-enciarodesenvolvimentodeLES,ohábitotabágicotambém temsidoassociadoàmanutenc¸ãodeatividadedadoenc¸aea menorrespostaaotratamentocomantimaláricos.4,8

A associac¸ão entre fatores genéticos e lúpus, especifi-camente o lúpus induzido pela hidralazina, foi avaliada primeiramente em 1970. Foi observada uma relac¸ão entre a enzimaN-acetiltransferase 2 (NAT2),capaz de acetilaro medicamento,eolúpus,comumamaiorproporc¸ãodo fenó-tipo acetilador lento entreos portadores da doenc¸a.9 Uma

dosecumulativamenordeprocainamidatambémsemostrou capazde induzirlúpusempacientes comfenótipo acetila-dorlentoquandocomparadoscompacientes comfenótipo acetiladorrápido.10Emoutroestudo,noqualseconsiderou

ohábitotabágicoeofenótipodaenzimaNAT2,envolvidana acetilac¸ãodecomponentesdafumac¸adocigarro,omaiorrisco (2,26vezes)de desenvolvimentodeLESatribuídoa pacien-tesfumantesemrelac¸ãoaosnãofumantesfoiaindamaior (6,44 vezes) quando o fenótipo lento da enzima NAT2 foi observado.2

As enzimas N-acetiltransferases (NATs) participam da segundafasedometabolismodexenobióticoseareac¸ãode acetilac¸ãopodeocorrerporduasviasdistintas:pormeioda O--acetilac¸ão,apósaac¸ãodaenzimadeprimeirafasecitocromo P450 (CYP450), e pela N-acetilac¸ão, quando a enzimaatua sobreocompostoemumaetapaanterioràac¸ãodaCYP450. Ambasasviaspodemresultarnaformac¸ãodeadutodeDNA.11

Existemduasisoformasde enzimasN-acetiltransferases humanas,NAT1eNAT2,que sãodiferentementeexpressas deacordocomotecidoequeapresentamespecificidadepara substratosdistintos.11–13Aacetilac¸ãodecompostos

aromáti-coseaminasheterocíclicas,comoo4-aminobifenil,presente nafumac¸adocigarro,14pormeiodatransferênciadogrupo

acetildeumamoléculadeacetil-CoAparaogrupoaminolivre docomposto,épromovidapreferencialmentepelaNAT2.14

Aisoforma NAT2écodificadapelo geneNAT2, queestá localizado no cromossomo 8 (8p22), juntamente com o geneNAT1eopseudogeneNATP.OgeneNAT2éaltamente

polimórfico e a diversidade dosalelos descritos resulta da combinac¸ão de mutac¸ões pontuais de bases seleciona-das (SNPs – Single Nucleotide Polymorphisms).15 O fenótipo

da enzima pode ser determinado por SNPs existentes na região codificadora do gene, que influenciam a afinidade pelo substrato,aatividade catalíticae/ouaestabilidade da proteína resultante.16 Dentre as alterac¸ões nucleotídicas

comumente usadas para inferir o fenótipo acetilador de NAT2,destacam-se481C>T(rs1799929),590G>A(rs1799930), 857G>A(rs1799931)e191G>A(rs1801279).2,17,18

Devidoàimportânciadotemaemquestãoeàausência de pesquisas brasileiras,neste estudo foi feita aavaliac¸ão dapresenc¸adequatrosubstituic¸õesnogeneNAT2(481C>T, 590G>A,857G>Ae191G>A)edofenótipodaenzimaNAT2 empacientescomlúpuseritematososistêmicoresidentesno RiodeJaneiro.Nossapopulac¸ãodeestudofoiestratificadade acordocom ohábitotabágico ecaracterísticasétnicas. Nas nossasanálises,foramconsideradasaindaalgumas caracte-rísticasclínicasdadoenc¸a.

Material

e

métodos

Populac¸ãodeestudo

Apopulac¸ãodeestudofoiselecionadaapartirdeumgrupo demulheresparticipantesdeumestudoanterior,queincluiu sequencialmente pacientes com LES(conforme os critérios de classificac¸ão do Colégio Americano de Reumatologia), acompanhadasregularmentenaDisciplinadeReumatologia da UERJ, e mulheres sem lúpus, que haviam compare-cido para consulta ginecológica de rotina em umsetor da mesmauniversidade.19,20

Aspectos clínicos e sociodemográficos, incluindo informac¸ões sobre cor da pele/etnia da participante e de seus pais, por autodeclarac¸ão, e hábito tabágico foram obtidos por meio da aplicac¸ão de um questionário semi-estruturado. Os pacientes e controles foram classificados comobrancosquandooindivíduoeseuspaiserambrancos por autodeclarac¸ão e como não brancos quando o indiví-duo e/ou pelomenos umdospais era pardoou negropor autodeclarac¸ão. Dadosclínicos específicos foram obtidos a partirderevisãodeprontuário.

OprojetofoiaprovadopeloComitêdeÉticaemPesquisa do Hospital Universitário PedroErnesto (HUPE/UERJ #321e #909) etodasaspacientesforam incluídassomente apósa assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido previamenteaprovado.

AnálisemoleculardospolimorfismosdeNAT2

O DNA genômico foi extraído a partir das amostras de sangue periférico de acordo com Vargas-Torres et al.

(3)

(2014).21 A análise das substituic¸ões 481C>T, 590G>A,

857G>A e 191G>A do gene NAT2 foi feita com a téc-nica de reac¸ão de polimerase em cadeia-polimorfismo de comprimento de fragmentos de restric¸ão – PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Poly-morphism),deacordocomHuangetal.(1999),17comalgumas

modificac¸ões. A amplificac¸ão do DNA genômico foi feita comosseguintesiniciadores:5-GGAACAAATTGGACTTGG-3 e5-TCTAGCATGAATCACTCTGC-3 (Life Technologies).Após a amplificac¸ão, alíquotas do produto de PCR foram dige-ridas separadamente com as enzimas de restric¸ão KpnI (481C>T)eBamHI(590G>A),seguidadeanáliseeletroforética emgeldeagarose,eMspI(857G>A)eTaqI(191G>A),seguida deanáliseporeletroforeseemgeldepoliacrilamida.Apósa eletroforese,osgéisforamcoradoscombrometodeetídeoe osprodutosdasdigestõesforamvisualizadossobluzUV.Para avaliac¸ãodareprodutibilidadedatécnica,10%dasamostras foramselecionadasaleatoriamenteereavaliadas.

Classificac¸ãofenotípica

Nestetrabalho,foi usadaaclassificac¸ão bimodal,17 emque

osfenótiposintermediárioerápidosãoagrupadosemuma única categoria. Assim, a presenc¸a e a ausência do alelo WT (ausência das quatro substituic¸ões de NAT2, 481C>T, 590G>A, 857G>A e 191G>A) definem os fenótipos rápido elento,respectivamente.Na prática,amostrassemalguma das quatro alterac¸ões ou heterozigotas para apenas uma das substituic¸ões foram consideradas como tendo fenóti-pos acetiladores rápidos. Já as amostras homozigotas em apenas uma das substituic¸ões foram classificadas como fenótipos acetiladoreslentos. Adefinic¸ão dosfenótipos de amostras apresentando duas ou mais alterac¸ões foi feita considerando-se todas as combinac¸ões possíveis de alelos everificando suafrequênciananossapopulac¸ão,conforme a análise de estimativa de haplótipos feita a partir das frequênciasdassubstituic¸õesindividuais,comodescrito pos-teriormente. Combinac¸ões com pelo menos um haplótipo raro,comfrequênciaestimadamenordoque0,01,foram con-sideradasimprováveiseforamdescartadas.

As amostras sem resultado para uma das quatro substituic¸õesanalisadascujogenótipofaltantenão interferi-rianofenótipodefinidopelasoutrastrêssubstituic¸õesforam incluídasnoestudo.

Análiseestatística

OtestetdeStudentfoiusadoparaanalisarasdiferenc¸asentre médiasedesviospadrãoefoifeitocomosoftwareGraphPad Prismversão6.05(GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CA).

Apopulac¸ãodeestudofoitestadaemrelac¸ãoaoprincípio deHardy-Weinbergpelotestedequi-quadrado(␹2),

admitiu--segraudeliberdadeiguala1,pormeiodosoftwareSNPStats (InstitutCatalàd’Oncologia,Barcelona,Spain).22

Asdiferenc¸asentreasfrequênciasgenotípicasealélicas dosgruposdecasosedecontrolesforamavaliadaspeloteste de␹2outesteexatodeFisher.Asrazõesdechances(ORodds

ratio)eosintervalosdeconfianc¸a(IC95%)foram determina-dosparaestimaramagnitudedaassociac¸ãodassubstituic¸ões de NAT2 com a presenc¸a de lúpus eritematoso sistêmico,

usando,quandopossível,osmodelosgenéticoscodominante, dominanteerecessivo.Oalelomaisfrequenteeogenótipo homozigotodessealeloforamconsideradoscomoreferências. EssestestesforamfeitoscomosoftwareGraphPadPrism ver-são6.05(GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CA).

Asanálisesdeinterac¸õesentregenótiposoufenótiposde

NAT2,hábitotabágico,característicasétnicaseodiagnóstico deLES,possíveisassociac¸õesentregenótiposoufenótiposde

NAT2ediversascaracterísticasclínicasdoLES,assimcomoa estimativadehaplótiposapartirdasfrequênciasdos genó-tiposcorrespondentesàsquatrossubstituic¸ões,foramfeitas comosoftwareSNPStats(InstitutCatalàd’Oncologia, Barce-lona,Spain).22Foramconsideradossignificativosvaloresdep

menoresdoque0,05.

Resultados

Nossapopulac¸ãodeestudofoicompostapor188 participan-tes,91pacientescomLES(grupodecasos)e97mulheressem LES(grupocontrole).Asmédiasdeidade(±desviopadrão) daspacientescomLES(40,6±11,1anos;20-69anos)edos con-troles(36,9±10,8anos;17-66anos),nomomentodeinclusão no estudo, foram significativamente diferentes (p=0,0214). Embora as distribuic¸ões por faixa etária nos dois grupos tambémtenhamsemostradodiferentes(p=0,0168), aproxi-madamente60%dasmulherespertencentesaosdoisgrupos apresentaramidadeentre30e49anos.Opercentualde mulhe-resnão brancassemostrou diferente entreos dois grupos deestudo,com valordepmarginal(p=0,0539).As caracte-rísticasclínicasmaisimportantesobservadasnaspacientes portadorasdeLESpodemserobservadasnatabela1.

Foramavaliadas188amostrasdeDNA,correspondentesà nossapopulac¸ãodeestudo,emrelac¸ãoàsquatrosubstituic¸ões deNAT2.Osperfisdedigestãorepresentativosdecadauma dasanálisespodemservisualizadosnafigura1.

Tabela1–Característicasclínicasdaspacientes portadorasdelúpuseritematososistêmicoavaliadas noestudo

Dadosclínicos

Idadeaoiníciodossintomas(MD±DP) 27,8±10,9 Tempodecorridoentreoiníciodossintomase

odiagnósticodeLES(MD±DP)(meses)

20,0±28,3 CritériosdoColégioAmericanodeReumatologia(ACR)(%)

Eritemamalar 78,0 Lesõesdiscoides 15,4 Fotossensibilidade 72,5 Úlceraoral 53,8 Artrite 84,6 Pleurite 33,0 Pericardite 28,6 Alterac¸õeshematológicasa 39,6 Anemiahemolítica 44,6 Psicose 14,3 Convulsão 5,5

Alterac¸õesrenais(proteinúria) 78,0

FANpositivo 60,4

a Foiagrupadacomoalterac¸ãohematológicaareduc¸ãode

(4)

1

A

B

D

C

1.092 bp bp bp bp 1.031 1.092 bp 396 bp 316 bp 226 bp 170 bp 900 800 700 600 500 400 300 200 100 bp 1.031 900 800 700 600 500 400 300 200 100 8.000 6.000 5.000 4.000 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 1.031 900 800 700 600 500 400 300 200 100 80 658 bp 434 bp 1.092 bp 1.042 bp 949 bp 1.092 bp 810 bp 282 bp 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6

Figura1–Análisemoleculardequatrosubstituic¸õesnogeneNAT2.(A)Fotografiadeumgeldeagarose2%combrometode etídeoparaanálisedasubstituic¸ão481C>T.Linha1–controlenegativodareac¸ãodedigestão(ampliconíntegro);Linha2– amostrarepresentativadogenótipoNAT2481CC(doisaleloscomsítioderestric¸ãodaKpnI);Linha3–amostrarepresentativa dogenótipoNAT2481CT(apenasumdosaleloscomsítioderestric¸ãodaKpnI);Linha4–amostrarepresentativado

genótipoNAT2481TT(doisalelossemsítioderestric¸ãodaKpnI);Linha5–padrãodepesomolecular(GeneRulerTM100bp DNALadder,readytouse–Fermentas).(B)Fotografiadeumgeldepoliacrilamida6%coradocombrometodeetídeopara análisedasubstituic¸ão590G>A.Linha1–controlenegativodareac¸ão(ampliconíntegro);Linha2–amostrarepresentativa dogenótipoNAT2590GG(doisaleloscomsítioadicionalderestric¸ãodaTaqI);Linha3–amostrarepresentativadogenótipo

NAT2590GA(apenasumdosaleloscomsítioadicionalderestric¸ãodaTaqI);Linha4–amostrarepresentativadogenótipo

NAT2590AA(doisalelossemsítioadicionalderestric¸ãodaTaqI);Linha5–padrãodepesomolecular(GeneRulerTM100bp DNALadder,readytouse–Fermentas).(C)Fotografiadeumgeldeagarose1%coradocombrometodeetídeoparaanáliseda substituic¸ão857G>A.Linha1–controlenegativodareac¸ãodedigestão(ampliconíntegro);linhas2e5–amostras

representativasdogenótipoNAT2857GG(doisaleloscomosítioadicionalderestric¸ãodaBamHI);Linhas3e4–amostras representativasdogenótipoNAT2857GA(apenasumdosaleloscomosítioadicionalderestric¸ãodaBamHI);Linha6– padrãodepesomolecular(GeneRulerTM100bpDNALadder,readytouseFermentas).(D)Fotografiadegeldepoliacrilamida 5%coradocombrometodeetídeoparaanálisedasubstituic¸ão191G>A–.Linha1–amostrarepresentativadogenótipo

NAT2191GA(apenasumdosaleloscomsítioderestric¸ãodaMspI);Linhas2e3–amostrasrepresentativasdogenótipo

NAT2191GG(doisaleloscomsítioadicionalderestric¸ãodaMspI);Linhas4–controlenegativodareac¸ãodedigestão (ampliconíntegro);Linha5–padrãodepesomolecular(GeneRulerTM1kpDNALadder,readytouseFermentas).

OgrupocontroleobedeceuaoprincípiodeHardy-Weinberg com respeito às substituic¸ões analisadas (tabela 2). As distribuic¸õesgenotípicasealélicascorrespondentesàs qua-trosubstituic¸õesdogeneNAT2,assimcomoasdistribuic¸ões fenotípicasdeNAT2(tabela2)easfrequênciasdos haplóti-pos(tabela3)nãoapresentaramdiferenc¸asestatisticamente significativasentrecasosecontroles.

A populac¸ão de estudo foi subdividida, de acordo com ascaracterísticasétnicas,emdoissubgrupos,brancasenão brancas.Nãofoiobservadadiferenc¸asignificativanasanálises relacionadasàssubstituic¸ões481C>T,590G>Ae191G>Aou

ofenótipodeNAT2.Noentanto,comrelac¸ãoàsubstituic¸ão 857G>A, o genótipo GA foi mais prevalente no grupo de pacientes com LES emrelac¸ão aos controles apenas entre as participantes não brancas(OR=4,01,IC 95%=1,18-13,59; p=0,023)(tabela4).

A populac¸ãodeestudofoi aindaestratificada deacordo com o hábito tabágico (fumantes ou ex-fumantes e não fumantes). Não foi observada qualquer associac¸ão dessa variável,juntamentecomosgenótiposdeNAT2ouofenótipo acetiladordaenzima,comodiagnósticodadoenc¸a(dadosnão mostrados).

(5)

Tabela2–Distribuic¸õesgenotípicasealélicasrelativasacadaumadasquatrosubstituic¸õesdogeneNAT2eofenótipo acetiladornosgruposdecasos(pacienteslúpicas)econtroles

Substituic¸ão/Fenótipoacetilator Genótipo/alelo/fenótipo Casos(n=91) Controlesa(n=97) Casosvs.controles

n(%)ou(f) n(%)ou(f) OR(IC95%) NAT2481C>T CC 40(44) 34(35) 1,00 CT 39(43) 46(48) 0,72(0,39–1,35) TT 12(13) 16(17) 0,64(0,27–1,53) CT+TT 51(56) 62(65) 0,70(0,39–1,26) C 119(0,65) 114(0,59) 1,00 T 63(0,35) 78(0,41) 0,77(0,51–1,18) NAT2590G>A GG 53(59) 66(68) 1,00 GA 32(36) 27(28) 1,48(0,79–2,76) AA 5(6) 4(4) 1,56(0,40–6,09) GA+AA 37(41) 31(32) 1,49(0,82–2,71) G 138(0,77) 159(0,82) 1,00 A 42(0,23) 35(0,18) 1,38(0,84–2,29) NAT2857G>A GG 70(84) 88(93) 1,00 GA 13(16) 7(7) 2,34(0,88–6,17) AA 0 0 N/A GA+AA 13(16) 7(7) 2,34(0,88–6,17) G 153(0,92) 183(0,96) 1,00 A 13(0,08) 7(0,04) 2,22(0,86–5,71) NAT2191G>A GG 87(96) 81(91) 1,00 GA 4(4) 7(8) 0,53(0,15–1,89) AA 0 1(1) N/A GA+AA 4(4) 8(9) 0,47(0,14–1,61) G 178(0,98) 169(0,95) 1,00 A 4(0,02) 9(0,05) 0,42(0,13–1,40) Fenótipoacetilador Rápido 45(53) 48(53) 1,00

Lento 40(47) 43(47) 1,00(0,56–1,82) f,frequênciaalélica;n,n◦depacientes;N/A,nãoseaplica.

OtotaldeamostrascomdadosrelativosaosquatropolimorfismosdeNAT2eaofenótipoacetiladorpodemdiferirdototaldeamostrasanalisadas, devidoàexistênciaderesultadosinsatisfatórios.

a TestedeequilíbriodeHardy-Weinberg:NAT2481C>T(p=1,00);NAT2590G>A(p=0,50);NAT2857G>A(p=1,00);NAT2191G>A(p=0,19)

(SNPStats).

As análises mencionadas anteriormente foram feitas apenas no grupo de pacientes com lúpus considerando as seguintes características clínicas: presenc¸a de eritema malar,lesõesdiscoides,fotossensibilidade,úlceraoral,artrite, pleurite, pericardite, anemia hemolítica autoimune, trom-bocitopenia autoimune, psicose, convulsão, proteinúria e FAN positivo. O alelo 481T se mostrou mais prevalente empacientescomalterac¸õeshematológicas(anemia hemo-lítica autoimune ou trombocitopenia autoimune) quando

comparadascomaquelasquenãoapresentavamessa carac-terística (OR=1,97; IC 95%=1,02-3,82; p=0,0477). Não se observouqualquerassociac¸ãoentreasdemaissubstituic¸ões deNAT2ouofenótipodeNAT2eascaracterísticasclínicas daspacientes(dadosnãomostrados).Naanálisequeincluiu o hábito tabágico, o grupo de pacientes com LES foi sub-divididoemfumantes atuaisenão fumantes,incluindoos ex-fumantes. O hábito tabágico, isoladamente, mostrou-se associado àslesõesde lúpusdiscoide(OR=8,62,IC 95%=2,

Tabela3–Distribuic¸õesdehaplótiposdogeneNAT2nosgruposdecasos(pacienteslúpicas)econtroles

HaplótipodeNAT2 Casos(f) Controles(f) Casosvs.controles

481C>T 590G>A 857G>A 191G>A OR(IC95%) T G G G 0,3231 0,3990 1,00 C G G G 0,3595 0,3405 1,25(0,76-2,06) C A G G 0,2170 0,1653 1,67(0,94-2,95) C G A G 0,0476 0,0360 1,89(0,61-5,88) C G G A 0,0139 0,0435 0,63(0,18-2,12) T G A G 0,0231 0 N/A

f,frequênciahaplotípica;N/A,nãoseaplica.

(6)

Tabela4–Análisedeinterac¸ãoentreosgenótiposrelativosàssubstituic¸õesnogeneNAT2ouofenótipodeNAT2,a origemétnicanosgruposdecasos(pacienteslúpicas)econtroles

Substituic¸ão/fenótipo acetilador

Cordapele/etnia Genótipo/fenótipo Casos n(%) Controles n(%) Casosvs.Controles OR(IC95%) NAT2481C>T Branca C/C 12(36) 6(27) 1,00 C/T 19(58) 11(50) 0,86(0,25-2,95) T/T 2(6) 5(23) 0,20(0,03-1,35) Nãobranca C/C 28(48) 28(38) 1,00 C/T 20(35) 35(47) 0,57(0,27-1,22) T/T 10(17) 11(15) 0,91(0,33-2,48) NAT2590G>A Branca G/G 18(55) 17(77) 1,00 G/A 14(42) 4(18) 3,31(0,91-12,06) A/A 1(3) 1(5) 0,94(0,05-16,34) Nãobranca G/G 35(61) 49(65) 1,00 G/A 18(32) 23(31) 1,10(0,52-2,33) A/A 4(7) 3(4) 1,87(0,39-8,87) NAT2857G>A Branca G/G 27(90) 19(86) 1,00 G/A 3(10) 3(14) 0,70(0,13-3,87) A/A 0 0 N/A Nãobranca G/G 43(81) 69(95) 1,00 G/A 10(19) 4(5) 4,01(1,18-13,59)a A/A 0 0 N/A NAT2191G>A Branca G/G 32(97) 20(95) 1,00 G/A 1(3) 1(5) 0,62(0,04-10,57) A/A 0 0 N/A Nãobranca G/G 55(95) 61(90) 1,00 G/A 3(5) 6(9) 0,55(0,13-2,32) A/A 0 1(1) N/A Fenótipoacetilador Branca Rápido 17(55) 11(52) 1,00 Lento 14(45) 11(48) 1,21(0,41–3,63) Nãobranca Rápido 28(52) 37(54) 1,00

Lento 26(48) 32(46) 0,93(0,46–1,90) n,n◦depacientes;N/A,nãoseaplica.

Brancas, mulhereseseuspais brancos por autodeclarac¸ão.Nãobrancas,mulherese/oupelo menosum dospais pardoounegro por autodeclarac¸ão.

Resultadosignificativoseencontraemnegrito.

a TestedeFisher:p=0,0230.

40-30,96;p=0,0011)eproteinúria(OR=0,17,IC95%=0,05-0,59; p=0,0056).Noentanto,aanáliseconjuntadosgenótiposde

NAT2, oufenótipoacetilador,eo hábitotabágico não reve-louqualquerassociac¸ãocomas característicasclínicas das pacientesportadorasdeLES(dadosnãomostrados).

Discussão

e

conclusão

AsvariantesdeNAT2(N-acetiltransferase2)têmsido ampla-menteestudadasparaavaliar:asuadistribuic¸ãoentregrupos étnicos distintos, o que pode estar relacionado também à exposic¸ãoadiferentesfatoresambientais;esuaassociac¸ão com uma vasta gama de doenc¸as, incluindoas de origem autoimune.Nestetrabalho,avaliamosapossívelexistênciade associac¸ãoentreospolimorfismos481C>T,590G>A,857G>A e191G>AdogeneNAT2eolúpuseritematososistêmico.

Osestudosdeassociac¸ãoentreNAT2eoLESdescritosna literatura,emgeral,consideramofenótipoacetilador,enão ospolimorfismosdeNAT2isoladamente.Considerandoque assubstituic¸õesanalisadas nestetrabalhopodeminterferir nosníveisdeexpressãogênicapormeiodemecanismosde

regulac¸ãopós-transcricionais(481C>T),alteraraestabilidade da enzima(590G>Ae191G>A)oumodificar aseletividade eaatividade catalítica(857G>A),16 aanálisedeassociac¸ão

foifeita tambémcom cadaumadassubstituic¸õesdemodo isolado.Entretanto,nossosresultadosrevelaramausênciade associac¸ãoentreasquatrosubstituic¸õesdeNAT2ouofenótipo acetiladordeNAT2eadoenc¸a(tabela1).Aestimativade hapló-tipos também não revelou qualquer associac¸ãocom o LES (tabela2),emboratenhaauxiliadonaclassificac¸ãofenotípica das amostras,como mencionado anteriormente. Trabalhos recentestambémtêmusadoesserecursoparainferiros fenó-tiposdeNAT2apartirdosdadosdegenotipagem.23,24

Os polimorfismosno gene NAT2 analisadosapresentam distribuic¸ões alélicas diferentes entre diversas populac¸ões. Sabbaghetal.(2011)fizeramumlevantamentodasfrequências dediversospolimorfismosdeNAT2,etambémdeseufenótipo, em todo o mundo.25 A distribuic¸ão mundial da

frequên-cia dos polimorfismos avaliados neste estudo encontra-se na tabela 5. As frequências observadas no grupo controle seassemelhamàquelasencontradasemdiversos continen-tes.OaleloNAT2191Aapresentoufrequênciade0,02,igual à observada na América, enquanto a frequência do alelo

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Tabela5–FrequênciasdosalelosmenosfrequentesdeNAT2(481T,590A,857A,191A)observadasemdiversas populac¸ões

Populac¸ão Substituic¸ãodeNAT2

857G>A 481C>T 590G>A 191G>A Áfricaa 0,04 0,30 0,25 0,09 Europaa 0,03 0,44 0,27 0,01 Ásiaa 0,12 0,18 0,27 0 Américaa 0,20 0,25 0,11 0,02 Oceaniaa 0,04 0,04 0,32 0 Esteestudob 0,08 0,35 0,23 0,02

a Sabbaghetal.,2011.Dadosdecontrolesespecíficosparacadaumdosmodelosdedoenc¸aincluídonogrupodecasos. b Pacientesdogrupocontrole.

NAT2590AfoisimilaràobservadanaÁfrica(0,23e0,25, res-pectivamente). Já os alelos NAT2 481T (0,35)e NAT2 857A (0,08)apresentaram frequências intermediáriasem relac¸ão àsencontradasnaÁfricaenaAmérica.Apopulac¸ãodoRio de Janeiro, assimcomo a populac¸ãobrasileira emgeral, é resultantedamisturadegruposétnicos,emparticular afri-canos,europeuseameríndiosnativos.Estudosdemonstram quea populac¸ãodoRiode Janeiroapresenta, aproximada-mente,31%demarcadoresdeancestralidadecaracterísticos deafricanos,55%deeuropeuse14%deameríndios.26Nessa

mesmapopulac¸ão,foiobservadoqueindivíduosbrancos,por autodeclarac¸ão, apresentavam 86%de ancestralidade euro-peiae 13% de ancestralidade africana ou ameríndia. Jáos indivíduos autodeclarados não brancos, pardos ou negros, tinham24% e49% deancestralidade africanae67% e43% deancestralidadeeuropeia,respectivamente.27 Essesdados

evidenciamomaiorgraudemiscigenac¸ãopresenteem par-dosenegrosautodeclarados.Oaltograudeheterogeneidade étnicadanossapopulac¸ãodeestudopoderiaexplicaros valo-respróximos,masnãoiguais,àquelesobservadosemoutras populac¸ões.

Na literatura, existem relatos sobre a associac¸ão de polimorfismos de NAT2 com diversas doenc¸as, tais como diferentes tipos de câncer,28 periodontite29 e doenc¸as

autoimunes,3,30,31 quetêmo hábitotabágicocomo fatorde

riscoambiental.29,32foiobservadaumaassociac¸ãoentreo

fenótipoacetiladordeNAT2,otabagismoeoLES.2Entretanto,

napopulac¸ãobrasileiranãoháestudoacercadaassociac¸ão dospolimorfismosnogeneNAT2e/oudofenótipoacetilador comessadoenc¸a,especialmenteemfumantes.Embora diver-sos autoresconsiderem quea exposic¸ão aos componentes do tabaco possa constituir um “gatilho” para o desenvol-vimentodo LES,2–7 tivemos acessoàs informac¸ões sobreo

hábito defumar porocasiãoda coleta das amostras bioló-gicas,enãoàépocadeaberturada doenc¸a.Porisso,nossa populac¸ãodeestudofoi subdivididaemdois subgruposde acordocom ohábito tabágico, fumantes ouex-fumantes e não fumantes. Nossos resultados não revelaram qualquer associac¸ãoentreessasvariáveiseadoenc¸a(dadosnão mos-trados). É importante ressaltar que no momento em que uma paciente é diagnosticada recebe a orientac¸ão de não fumar,oquepodetercriadoumviésnaanálise.Defato,um númeromenordefumanteseex-fumantesfoiobservadono grupodecasos,oquenãoestárelacionadoaumaprotec¸ão dohábitotabágicoemrelac¸ãoaodesenvolvimentodadoenc¸a.

Cabedestacarquedadosadicionaisdetabagismo,incluindoo tempodeexposic¸ãoeaquantidadedemac¸osdecigarro/dia, nomomentodoprimeirosinaldemanifestac¸ãodadoenc¸a, poderiam contribuirparaasanálisesfeitas,considerandoa possibilidadedediversoscomponentesdafumac¸adocigarro serem diferencialmentemetabolizadosemfunc¸ão do fenó-tipoacetilador.Porém,omomentodoiníciodadoenc¸aéum aspectocomplexodeserestabelecido.Éfrequenteumperíodo demuitosmesesentreoiníciodossintomaseodiagnóstico dadoenc¸a.

Além da diferenc¸a na frequência dos polimorfismos de

NAT2emdiferentespopulac¸ões,aincidênciadeLESémaior em pacientes etnicamente miscigenados.5 Por isso, neste

estudo avaliamos se havia associac¸ão entre a distribuic¸ão dospolimorfismosdeNAT2eoLESempacientescomessa característicaétnica.Usamosaautodeclarac¸ãoeinformac¸ões sobreacor de peleparental(paiemãe) paradefinira ori-gemétnicadaspacientes,comoreportadonaliteratura,21mas

reconhecemos queoutrosmétodospoderiam seapresentar maisadequados.Resultadossignificativosforamobservados apenasemrelac¸ãoaopolimorfismoNAT2857G>A.Ogenótipo

NAT2857GArepresentoupotencialderiscoparaadoenc¸aem mulheresnãobrancas(tabela4).Asubstituic¸ãoNAT2857G>A tem como consequência, na proteína, a troca do aminoá-cidoglicina porglutamato (G286E).Essa alterac¸ãomodifica oacessoaosítioativodaenzima,oqueresultaemdiminuic¸ão da seletividade e da capacidade catalítica.16 Portanto,

o polimorfismo NAT2 857G>A está relacionado à reduc¸ão nometabolismodeaminasaromáticaseheterocíclicas.16A

substituic¸ão857G>Aestápresenteem11alelosdeNAT2,dos quaisdoisapresentamfenótipoacetiladorlentoeosdemais aindanãotiveramseusfenótiposdefinidos.33Ofenótipo

ace-tiladorlentopoderiaconferirmaiorriscoparaoLES,umavez queoorganismopermaneceriapormaistempoexposto,por exemplo,acomponentesdafumac¸adocigarro.

Cabedestacarqueasvariáveisorigemétnicaegenótipos deNAT2857G>Anãosemostraramisoladamenteassociadas aoLES.Entretanto,aliteraturaapontaparaumamaior inci-dênciadeLESemindivíduosetnicamentemiscigenados,1e,

emumapopulac¸ãodeIlhéus(Bahia/Brasil),ogenótipo857GA semostroumaisprevalenteemnegros,quandocomparados combrancoseameríndios.34Aancestralidadedapopulac¸ão

doRiodeJaneiroseassemelhaaosvaloresestimados para apopulac¸ãodoNordestebrasileiro.26,35Entretanto,temsido sugerido que os grandes centros urbanos, como o Rio de

(8)

Janeiro,apresentampadrõesdemisturasétnicasaindamais diversos.26

Osórgãosacometidoseaintensidadedasmanifestac¸ões clínicasempacientescomLEScaracterizamagravidadeda doenc¸aedealgumaformadirecionamaselec¸ãodoesquema terapêutico. O único resultado significativo na análise de interac¸ãodospolimorfismosdeNAT2oudofenótipo acetila-dorcomcaracterísticasclínicasdoLESfoiamaiorprevalência doalelo481Tempacientes com alterac¸õeshematológicas, especificamenteanemiahemolíticaautoimuneou tromboci-topeniaautoimune(dadosnãomostrados).Areduc¸ãodesses tipos celulares pode estar associada à imunossupressão, geradapelagravidadedadoenc¸aoupelousode medicamen-tosimunomoduladores.36Atéomomentonãoindíciosdo

modocomoosgenótiposcomoalelo481TdeNAT2possam influenciarnareduc¸ãodessascélulassanguíneas. Necessita--se,semdúvida,demaioresinvestigac¸ões.

Noentanto, ao se considerar apenas o hábito tabágico, foi observada correlac¸ão com a presenc¸a de lúpus dis-coide (OR=8,62;IC 95% 2,40-30,96; p=0,0011) eproteinúria (OR=0,17;IC95%0,05-0,59;p=0,0056).Emdiversosestudos, asalterac¸õesdermatológicaspresentesempacientescomLES foramassociadasaotabagismoe,comocitadoanteriormente, otratamentodessaslesõesemfumantespareceexigirdoses maisaltasdeantimaláricos,emcomparac¸ãocomaquelesque nãofumam.37–39Nonossoestudo,onúmeroreduzidode

paci-entescomLESefumantes(n=7)nãonospermitiuinferirse ohábito tabágicodefatoinfluenciounaabordagem farma-cológica.Ohábitotabágicoéassociadotambémaalterac¸ões renais,comoaproteinúriaeanefropatia.40Noentanto,neste

estudo,das 71pacientescomproteinúriaapenasseteeram fumantes atuais,13 eram ex-fumantes eamaioria nunca fumou.

Napopulac¸ãobrasileira,sãopoucososestudossobreas distribuic¸õesgenotípicasealélicasdeNAT2,alémdenãohaver relatosarespeitodaassociac¸ãodepolimorfismosemNAT2

eoLES.Nossotrabalhoépioneironessaárea eo entende-moscomoformuladordahipótesedeumpotencialpapeldos polimorfismosde NAT2como fatorassociado àdoenc¸a em nossopaíseeventualassociac¸ãocomfenótiposclínicos espe-cíficos.Entretanto, maisestudos queenvolvam populac¸ões maiores sãonecessários paraconfirmar aassociac¸ão entre opolimorfismo NAT2 857G>A eolúpus eritematoso sistê-mico emmulheresbrasileiras autodeclaradas nãobrancas, incluindoidealmenteacaracterizac¸ãoétnica comousode marcadoresdeancestralidade.

Financiamento

ConselhoNacional deDesenvolvimento Científicoe Tecno-lógico(CNPq)(476116/2009-0),Fundac¸ãoCarlosChagasFilho deAmparoàPesquisadoEstadodoRiodeJaneiro(FAPERJ) (E-26/170.922/2004 e E-26/111.334/2011), Universidade do EstadodoRiodeJaneiro(UERJ)eCentrodeEstudosem Reu-matologiaPedroErnesto(CERPE).

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

r

e

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Referencias

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